“Año del Buen Servicio al Ciudadano​”

LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA
PRÁCTICA Nº4
EFECTO DE LA TEMPERATURA
MESA 5
Código Introduc Procedimient Cálculos Discusiones Conclusiones
o- Recomendaciones
Resultados

Barbagelat 2014101 100% 50% - 100% -

a Chalco 1
Norma
Eliana

Cordero 2014101 - 50% - - -

Flores 7
José

Garavito 2013009 - - 100% -

Mena Jhon 0
Jhosef -

Bustamant 2014101 - - - - 100 %

eLoreño, 4
Junior

2017- I
​
I.-INTRODUCCIÓN

La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por
encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a
que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se
desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos . De
ahí la conocida importancia biológica de los sistemas tampón. En la mayor parte de los
casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular,
pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH del medio en el que
habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos
próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por último existen algunos enzimas a los
que el pH no afecta en absoluto.
Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura.

La variación de la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos enzimas a

otros en función de la barrera de energía de activación de la reacción catalizada. Sin
embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones químicas, en las reacciones
catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza
una temperatura crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la desnaturalización
térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. Si representamos gráficamente la
variación de la actividad de los enzimas en función de la temperatura da la impresión de
que existe una temperatura "óptima" análoga al pH óptimo estudiado anteriormente; hay
que resaltar que esa aparente temperatura óptima no es más que el resultado de dos
procesos contrapuestos:
1) el incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura y 2) la
desnaturalización térmica del enzima.
II.-MATERIALES Y MÉTODOS

- Manual de prácticas de enzimología ( VII edición, Agosto 2016)

Blanco Muestra

BAPNA 40 mg% 1.0 ml 1.0ml

Buffer Fosfato 1.0 ml 1.0 ml

Pre Incubación 37°C x 5 min

Solución Trabajo de ------- 0.25ml

Tripsina

Incubación x 10 min

Ácido Acético 35% 0.25 ml 0.25 ml

Solución Trabajo de 0.25 ml ---------

Tripsina
III.-RESULTADOS

M3 M4 M5

BLANCO (T,A,F12) 0.016 0.022 0.543

ACETATO 5 0.024 0.024 0.030

FOSFATO 7,2 0.155 0.142 0.144

TRIZ 8,2 0.200 0.185 0.188

CARBONATO 10 0.102 0.095 0.087

FOSFATO 12 0.635 0.605 0.592

IV.-CÁLCULOS

Se restará el blanco para Tris, Acetato y Fosfato 12

M3 M4 M5

ACETATO 5 0.002 0.002 0.008

FOSFATO 7,2 0.155 0.142 0.144

TRIZ 8,2 0.184 0.169 0.172

CARBONATO 10 0.102 0.095 0.087

FOSFATO 12 0.092 0.062 0.049

Se realizará el promedio para determinar la velocidad de reaccion

pH Promedio

ACETATO 5 0.004

FOSFATO 7,2 0.147

TRIZ 8,2 0.175

CARBONATO 10 0.095
 FOSFATO 12 0.068

Usando el coeficiente de extinción de la p-nitroanilina: 7760 L.mol-1.cm-1

A= a.b.c
Hallamos la concentración:

pH Concentración µmol/L

ACETATO 5 0.5155

FOSFATO 7,2 18.9433

TRIZ 8,2 22.5515

CARBONATO 10 12.1993

FOSFATO 12 8.7199

La actividad enzimática se dio durante 10 minutos

10min=600 seg 0.5155​µmol/L
1seg 0.000859 ​µmol/(L.seg)

Llenando la tabla

pH Velocidad µmol/(L.s)

ACETATO 5 0.000859

FOSFATO 7,2 0.031572

TRIZ 8,2 0.037585

CARBONATO 10 0.020332

FOSFATO 12 0.014533
 
La respectiva gráfica

V.- DISCUSIONES

El conjunto de las enzimas proteolíticas está constituido de dos grupos: las endopeptidasas,
que cortan enlaces peptídicos en el interior de las cadenas proteícas y las exopeptidasas,
que cortan los enlaces peptidicos aminoterminales, carboxiterminales y los dipeptidos.
(Cruz, et al 1996).

La tripsina, endoproteasa de la familia de las serin-proteasas, se caracteriza por un

mecanismo catalítico común, implicando tres residuos aminoacidicos (histidina, ácido
aspártico y serina) hidrolizando el enlace peptídico del lado carboxilico de la arginina o de la
lisina. (Wormhoudt, et al 1999). Para evaluar la velocidad de tripsina, se utiliza el
hidrocloruro de N-alfa-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BApNA), un sustrato sintético
(Gamboa, 2001).

Este sustrato sintético, posee características proteicas y posee una especificidad de

reconocimiento por parte de la Tripsina muy elevada, lo que permite un correcto análisis de
las propiedades cinéticas de está enzima. El mecanismo de acción de BApNA es su
analogía con el sustrato verdadero a nivel de las estructuras peptidicas, su extremo amino
es bloqueado por el grupo radical Benzoil y en su extremo carboxilo se une a un grupo
cromógeno, que en la práctica es la p - nitroanilida la cual es hidrolizada a nivel de su
enlace en el BApNA debido a la acción de la tripsina, la p - nitroanilida será llevada a
medición en el espectofotométro a una longitud de onda de 410nm ​(Battaner, 2000)

Debe trabajarse con soluciones amortiguadoras que contengan CaCl2, lo que promueve
una actividad y estabilidad óptima de la enzima, debido a que esta es sensible a procesos
de autolisis si no se manejan las variables adecuadas en su incubación ya que los sitios
amino y carboxilo terminales son flexibles de acuerdo a la estructura terciaria de la enzima y
a condiciones no fisiologicas ​(Félix et al., 2005)​.

La catálisis enzimatica de las reacciones es esencial para los sistemas vivos , pues en
condiciones biológicas las reacciones no catalizadas por una enzima suelen ser muy lentas.
La función de una enzima es acelerar la velocidad de la reacción de un sustrato específico .
La velocidad de una reacción enzimatica viene determinada por la concentración de reactivo
y por una constante de velocidad, donde tambien depende de constantes como el pH,
Temperatura, concentración de enzima, presencia de inhibidores o cofactores, etc., lo cual
se deriva en una tasa de cambio en la formación de producto por unidad de tiempo
(Lehninger​, ​2009). La actividad enzimatica se expresa en micromoles de producto por
minuto de reaccion (µmP/min), lo cual es el patrón estandar de la medicion de unidades
enzimaticas (UE).

Para la práctica, las constantes mencionadas anteriormente deben mantenerse a

condiciones constantes, salvo la concentración de sustrato que es la variable utilizada para
el estudio de la actividad enzimatica de tripsina en las diferentes muestras incubadas. Por lo
tanto, a concentraciones bajas de sustrato y según la relación establecida por Michaelis -
Menten, la velocidad de reacción será directamente proporcional a la concentración de
sustrato siempre y cuando la cinética corresponda al primer orden, donde [S] <0.01Km;
luego mientras la concentración de sustrato va aumentando, la velocidad de reacción sigue
un patrón diferente al de la cinética de primer orden, donde no es posible establecer
concluciones; finalmente el analisis concluye hasta alcanzar una velocidad de reacción
constante y máxima que determina una cinética de orden cero, donde [S] > 100Km lo cual
indica la saturación de la enzima con el sustrato correspondientes

VI.- CONCLUSIONES

● Cada enzima posee un determinado rendimiento en distintos factores como

temperatura y pH.
● La intensidad máxima de la actividad enzimática se alcanza en un determinado pH y
temperatura, siendo estas las óptimas y son propias de cada enzima.
VII.- RECOMENDACIONES

● El tener una organización previa y un entendimiento correcto de los pasos a realizar

en el laboratorio, nos garantiza la obtención de datos mas precisos.

● No aglomerarse todo el grupo al momento de verter los compuestos cuando están

en baño maria, ya que dificulta la correcta práctica de otros compañeros que
necesitan hacer lo mismo, solo se debería acercar la persona encargada de ese
procedimiento.

● Tener más conocimiento del manejo de las micropipetas para evitar daños costosos.

BIBLIOGRAFIA

❖ Conceptos bioquímicos, Robert W Mc Gilvery , Barcelona , Editorial Revertre 1997

pag 465 - 478.

❖ Catálisis y acción enzimática Myron L Bender; Lewis J Brubacher . Barcelona :

Editorial: Editorial Reverté, 1977. pag 123- 143

❖ Estructura y mecanismo de los enzimas Alan Fersht . Editorial: Barcelona [etc.] :

Reverté, D.L. 1980. Serie:Biología Fundamental, n. 6
❖ Fundamentos de bioquímica : la vida a nivel molecular Donald Voet; Judith G Voet;
Charlotte W Pratt; María Inés Gismondi Editorial:Buenos Aires, Argentina : Médica
Panamericana, 2007.

❖ Bioquímica Antonio Peña Editorial:México ; Puerto Rico : Limusa, 1988 Serie:

Temas básicos., Area Química.