PRACTICA N°1

EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCION
El Laboratorio de Biología Molecular, es un área o ambiente en donde el principal objeto
de estudio son las proteínas, Ácidos nucleicos y células, debe contar con un stock de
reactivos base para preparar otro tipo de soluciones, contar con los equipos e
instrumentales necesarios para la manipulación de Ácidos nucleicos, proteínas y células,
finalmente, debe contar con cajas o recipientes especiales para el manejo de residuos.
En el presente protocolo se muestra los requerimientos básicos para el funcionamiento
de un laboratorio de Biología Molecular.

OBJETIVOS:
1) Listar los reactivos stock
2) Describir la función y el cuidado de los principales equipos e instrumentación de
un laboratorio de Biología Molecular.

REACTIVOS STOCK:
Antes de listar las soluciones stock, es importante recordar algunos datos de Soluciones
que se aprendieron en cursos de Bioquímica, pero OJO! no confundir con la masa
molecular relativa MR, que aunque coincide numéricamente con M no lleva unidades
de masa, sino que, justamente es relativa y nos dice cuántas veces más pesada es una
molécula de una sustancia respecto de la unidad de masa atómica (u.m.a.), ó de 1 Dalton
(Da), que corresponde al átomo hidrógeno. Así, la Mr. del agua es 18 u.m.a. o 18 Da, o
bien, 18 veces más pesada que un átomo de hidrógeno.

 Las unidades de concentración que utilizaremos serán:

o % p/p: Porcentaje masa en masa, g de soluto por cada 100 g de solución
(SN) (soluto + solvente).
o % p/v: Porcentaje masa en volumen, g de soluto por cada 100 cm3 o 100
ml de SN.
o % v/v: Porcentaje volumen en volumen, ml de soluto por cada 100 ml de
SN.
 o M: Molaridad, Nº de moles de soluto por cada 1 litro o 1000 cm3 de
Solución.
o m: Molalidad, Nº de moles de soluto por cada 1 Kg de solvente.
o N: Normalidad, Nº de equivalentes de un ácido o de una base por cada 1
litro de Solución.

Ejemplo:
Una solución 2 M de HCl es lo mismo que una solución 2 N, mientras que una solución 4
M de ácido sulfúrico será lo mismo que una solución 8 N para este ácido.
Todas las soluciones deben de prepararse con agua des-ionizada y guardar en
condiciones que indican los manuales.
Los estudiantes deben averiguar los pesos moleculares de los reactivos listados y deben
hacer los cálculos para la preparación de las soluciones que se les solicitan; deben buscar
en manuales de biología molecular los procedimientos sugeridos para preparar las
soluciones que les solicitan.

Son un total de 11 reactivos que serán utilizados en las practicas durante todo el curso,
cada reactivo es suficiente para todo el grupo:

1. Preparar 200 mL de TAE 50 X

2. Preparar 200 mL de agarosa al 0.7 % en TAE 1 X
3. Preparar 20 mL de NaCl 5N
4. Preparar 50 mL de Tris-HCl pH 7.5, 1 M
5. Preparar 20 mL de MgCl2 1 M
6. Preparar 50 mL de EDTA 0.5 M, pH 8.0
7. Preparar 50 mL de NaOH 2 N
8. Preparar 50 mL de Acetato de potasio 5 M
9. Preparar 50 mL de glucosa 1 M
10. Preparar 20 mL de SDS 10 %
11. Preparar 50 mL de HCl 2 N
12. Preparar 20 mL de Acetato de sodio 3 M pH 5.2
Ejercicio, escriba las recetas para las 12 soluciones stock:
1. Preparar 200 mL de TAE 50 X

2. Preparar 200 mL de agarosa al 0.7 % en TAE 1 X

3. Preparar 20 mL de NaCl 5N

4. Preparar 50 mL de Tris-HCl pH 7.5, 1 M

5. Preparar 20 mL de MgCl2 1 M

6. Preparar 50 mL de EDTA 0.5 M, pH 8.0

7. Preparar 50 mL de NaOH 2 N

8. Preparar 50 mL de Acetato de potasio 5 M

9. Preparar 50 mL de glucosa 1 M

10. Preparar 20 mL de SDS 10 %

11. Preparar 50 mL de HCl 2 N

12. Preparar 20 mL de Acetato de sodio 3 M pH 5.2

EQUIPOS E INSTRUMENTAL BÁSICO:
 PCRs convencionales y de gradiente
 PCR cuantitativa en tiempo real
 Concentrador de DNA (Speed-vac)
 Microcentrífugas, centrífuga de rotor angular y de rotor oscilante.
 Campana de flujo laminar
 Campanas de PCR
 Equipos de electroforesis de DNA
 Agitadores convencionales y de balanceo
 Incubador-agitador
 Horno de hibridación
 Equipos de electroforesis de proteínas (vertical i IEF)
 Equipos para cuantificación de DNA, RNA y proteínas (Espectrofotómetro y
fluorímetro)
 Equipo de documentación de geles
 Sonicador
 Equipos de refrigeración (+4ºC, -20 ºC y -80ºC)

Equipos generales de laboratorio: pH-metro, balanza, autoclave, bombas de vacío,

baños termostáticos, homogeneizadores y micropipetas.

Se debe prestar mucha atención al último instrumento, Las Micropipetas, que son la
herramienta de primera en el laboratorio:

Las micropipetas son empleados para absorber y transferir pequeños volúmenes de

líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes
captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales,
denominados p2, p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 2, 20, 200 y 1000 μl,
respectivamente.

El uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato;
para ello, se emplean puntas desechables (o tip), de plástico, que habitualmente.
Algunas consideraciones generales sobre su uso:

Las micropipetas tipo Gilson tienen en la parte superior del émbolo su identificación:
P20, P200, P1000, etc.

Los volúmenes mínimos y máximos de las pipetas tipo Gilson son los siguientes:

Pipeta: Vol. mínimo - Vol. máximo

 P20: 2 – 20.
 P100: 10 – 100.
 P200 : 20 – 200.
 P1000: 200 - 1000.

Para ajustar el volumen que se desea utilizar, debe girarse la rueda que se encuentra
detrás del visor que indica el volumen. La rueda debe ser girada suavemente, NUNCA
FORZARLA. NUNCA EXCEDER LOS VALORES ESTABLECIDOS EN EL PUNTO 1, YA QUE SE
DESCALIBRA O SE ROMPE.

El valor de estas pipetas es aproximadamente $ 400 Dependiendo la marca y el modelo,

los volúmenes se indican de distinta manera, para las pipetas tipo Gilson:

Para P20 los dos superiores indican la decena y la unidad en microlitros “μl”, el tercer
número (que está en otro color) indica la primera cifra después de la coma.

Para la P200 los tres números indican centena, decena y unidad en μl respectivamente.

Para la P1000 que solo tienen tres cifras en el visor, el primer número (en otro color)
corresponde a la unidad de mil μl, los otros dos la centena y la decena.

Otros modelos tienen los cuatro dígitos correspondientes al millar, centena, decena y
unidad.

PRINCIPALES TÉCNICAS QUE SE MANEJAN EN EL LABORATORIO:

  Extracción, Cuantificación y Amplificación DNA/RNA.
 Clonación, confección de librerías de DNA/RNA.
 Hibridación in situ (CARD-FISH).
 Hibridación in situ con sondas de RNA.
 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE).
 Análisis de polimorfismos: microsatélites, T-RFLP’s.
 Extracción y Cuantificación de proteínas.
 Electroforesis nativa.
 Electroforesis SDS-PAGE (1-D, 2-D).
 Isoelectrofocusing (IEF).
 Western blot.
 Inmunofluorescencia.
 Bioinformática.

ACTIVIDADES:

 Describa los principales equipos de BGM presentes en el laboratorio de

prácticas. (foto, uso, cuidado)

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 Discutir y resumir 4 de los métodos que serán ______________________
utilizados en la primera fase del
curso:
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PRACTICA N°2

USO DE MICROPIPETAS

INTRODUCCION

Cuando los científicos necesitan entregar con precisión volúmenes más

pequeños de un líquido, usan una pipeta, un tubo de vidrio calibrado en el que
se extrae el líquido y luego se libera.

Las pipetas de vidrio y plástico han sido pilares de los laboratorios de química y
biología durante décadas, y se puede confiar en que dispensan volúmenes de
hasta 0.1 ml.

Los biólogos moleculares frecuentemente usan volúmenes mucho más

pequeños de líquidos en su trabajo, incluso trabajando a 0.1 μL (es una diez
milésima de mililitro, o una diez millonésima de litro).

Para tales volúmenes pequeños, necesitan usar una micropipeta.

Independientemente del fabricante, las micropipetas funcionan según el mismo

principio: el pulgar presiona el émbolo y, cuando se libera, el líquido se introduce
en una punta de plástico desechable. Cuando se presiona nuevamente el
émbolo, se dispensa el líquido (Diamantine Institute. 2017).

NOTA: Las micropipetas se llaman de muchos nombres diferentes, la mayoría de

los cuales se basan en las empresas que fabrican. Por ejemplo, es posible que los
escuche llamar "Gilsons", ya que una gran cantidad de estos dispositivos
utilizados en laboratorios son fabricados por esta compañía.
PUNTAS O TIPS

Las puntas son una parte importante de la micropipeta y permiten que el mismo
dispositivo se use para diferentes muestras (siempre que cambie su punta entre
muestras) sin lavarlas.

Vienen en diferentes tamaños y colores, según la micropipeta con la que se

utilicen y el volumen que se debe dispensar. Las puntas más utilizadas son:

Azul grande – 200-1000µL

Pequeño amarillo – 2-200µL

Pequeño blanco - <2µL

NOTA: El color de las puntas puede variar según fabricante.

GRADILLAS, CAJAS DE PUNTAS O RACKS

Las puntas se cargan en cajas de punta que a menudo se esterilizan para evitar
la contaminación. Por esta razón, las cajas de punta deben mantenerse cerradas
si no están en uso.

Las puntas se cargan en el extremo de la micropipeta empujando el extremo del

dispositivo en la punta. Una vez utilizados, las puntas se expulsan en un
contenedor de objetos cortopunzantes utilizando el botón de expulsión de la
punta.

Nunca toque la punta con los dedos, ya que esto representa un riesgo de
contaminación.
POSICIONES PARA EL USO DE LAS MICROPIPETAS

EXTRACCION DE LÍQUIDO
DEPOSITO DEL LÍQUIDO

Sujete la micropipeta de manera que el extremo de la punta que contiene la

punta esté dentro del recipiente al que desea entregarlo.

Cuando entregue volúmenes más pequeños en otro líquido, es posible que

necesite poner el extremo de la punta debajo de la superficie del líquido
(recuerde cambiar la punta después si hace esto para guardar el material
contaminante).

Para volúmenes más pequeños, es posible que también necesite sostener la

punta contra el costado del contenedor.

CAMBIANDO EL VOLUMEN

Algunas micropipetas ofrecen volúmenes fijos, sin embargo, la mayoría son

ajustables. Cada marca usa un método ligeramente diferente para hacer esto:
los Gilson tienen una rueda ajustable, otros tienen un mecanismo de bloqueo y
giran el émbolo para ajustar el volumen.
Todas tienen una lectura que le dice cuánto se está entregando y un rango de
volúmenes que se pueden dispensar.

Tratar de disminuir menos que el valor más bajo del rango dará como resultado
mediciones inexactas.

Tratar de dispensar sobre el rango superior llenará completamente la punta y

permitirá que el líquido ingrese al cuerpo de la pipeta.

No sobrepase el ajuste de volumen, ya que esto afecta la calibración de la

micropipeta.

NOTA: La forma de interpretar la lectura depende de la micropipeta utilizada.

A. Calculo de la Exactitud (E%) y del Coeficiente de Variación (CV%)
 Cálculo del volumen medio:
Los valores de las pesadas del control gravimétrico son sólo la masa
del volumen dosificado.

Para obtener el volumen real se debe efectuar un cálculo corrector:

El cálculo corrector se realiza por multiplicación del valor medio de

los valores de las pesadas (x) con el factor Z (mL/g que es lo mismo
que µl/mg), que toma en consideración la densidad del agua, la
temperatura de control y la presión atmosférica.

Z es igual a 1,0032 µl/mg, referido a 21,5 ° C, 1013 mbar (hPa) y a la

utilización de agua destilada o z es igual a 1,0029 µl/mg, referido a 20
5 ° C y 1013 mbar (hPa).

El factor Z es igual a 1/densidad.

Valores del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032).
Volumen controlado Vo (µl): 200,0000.
Valor nominal (mg) = Volumen controlado/Z.
Valor nominal (mg): 199,3620.

Ejemplo de 5 medidas:

 x1 =200,2000
 x2=199,6000
 x3= 199,4900
 x4= 199,7000
 x5= 199,7000
 Exactitud (E%) :

 Desviación Estándar:

 Coeficiente de variación:
I. MATERIAL Y REACTIVOS

A) Material instrumental
 Micropipetas de 20, 200 y 1000 ul.
 Tips Azules (1000 ul).
 Tips Amarillos (200 ul).
 Tips Blancos (20 ul).
 Gradillas con 5 Tubos de vidrio 5ml.

B) Reactivos
 Agua Destilada.
 Buffer Laemmli.
 HCl 1 N.

II. PROCEDIMIENTO

A) Exactitud (E%) y el Coeficiente de Variación (CV%):

Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el
coeficiente de variación (CV%) en todo el rango usando al menos dos
volúmenes diferentes.
 Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.
 Colocar un trozo de papel parafilm (2x2 cm) en la balanza y tarar a
cero.
 Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo
sobre el parafilm. Anote el peso del agua añadido. La densidad del
agua es 1 g/mL a 25 º C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde
aproximadamente a una masa de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g,
60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a 0.003 g.
 Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.
 B) Errores en la Medición:
Otro de los factores que influyen en el manejo es la forma correcta de
pipetear.
 Prepare una gradilla con 5 tubos Eppendorf conteniendo 1 ml de
Agua.
 Anadir a cada uno de los tubos 5 ul de buffer Laemmli 4X.
 Mezclar los tubos, por inversión.

Repetir el experimento, esta vez utilizando HCl 1N.

 Prepare una gradilla con 5 tubos Eppendorf conteniendo 1 ml de
Agua.
 Anadir a cada uno de los tubos 10 ul de HCl 1N.
 Mezclar los tubos, por inversión.
III. RESULTADOS
A) Exactitud (E%) y el Coeficiente de Variación (CV%):

 Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µL y 1000

µL.

Volumen (ul) Peso (mg) Volumen (ul) Peso (mg)

1000 300
1000 300
1000 300
1000 300
1000 300

 Para P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 µL.

Volumen (ul) Peso (mg) Volumen (ul) Peso (mg)

60 200
60 200
60 200
60 200
60 200
  Para P20 revisar 3 y 10 µL.

Volumen (ul) Peso (mg) Volumen (ul) Peso (mg)

3 10
3 10
3 10
3 10
3 10

B) Errores en la Medición
 Buffer Laemmli 4X
- Anotar la absorbancia o intensidad de color usando
símbolos.
- Dibuje el experimento.
 HCl 1N
- Anotar el pH de cada uno de los tubos.
- Dibuje el experimento.

IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

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V. CONCLUSIONES

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VI. CUESTIONARIO
A) Dibuje por separado cada micropipeta utilizada, anote sus partes

B) Haga los cálculos para encontrar el porcentaje de exactitud (E%) y el

coeficiente de variación (CV%). Cuál es el estado de cada una de las
micropipetas utilizadas
PRACTICA N°3

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CELULAS PRIMARIAS DEL

INTESTINO DE RATA

INTRODUCCION:
Células epiteliales del intestino delgado (CEID) han sido difíciles de mantener en cultivo,
permaneciendo viable por sólo horas a varios días.

Aunque cultivos por mucho más tiempo de CEI derivado de ratas han dependido de su
inmortalización por transección con el virus 40 de simio para que siga siendo viable.

Cultivo con éxito CEID depende de muchos factores tales como el método de la digestión
y la disociación; un buen tratamiento y aplicación del suero, y tratamiento de las placas
de cultivo.

Intestino delgado de ratas de recién nacido (prefieren 14-16 días) o adulto produce un
gran número de células (5-10 x 107), con un 30-40% de eficiencia de plaqueo. Este
protocolo se desarrolló para la fijación y el crecimiento de células epiteliales de Intestino
delgado de ratas recién nacidas o adultas.

OBJETIVO:
Aislar células epiteliales a partir de Intestino Delgado de rata.

MATERIAL Y REACTIVOS:
 Tripsina 0.1% en PBS.
 PBS.
 Medio de Cultivo DMEM.
 Antibióticos Ampicilina /Streptomicina.
 Antimicóticos Anfotericina.
 Suero Bovino Fetal.
 Kit de disección estéril.
  Alcohol 70%.
 Placas Petri para cultivo de células.
 Placas “six well” para cultivo de células.
 Pipetas 10 ml estéril.
 Intestino de rata Hielo.
 Tubos de ensayo 10x15.
 Tubos Falcon de 15 y 50 ml.
 Pipetas Pasteur.
 Centrifuga clínica.

PROCEDIMIENTO:
- Aislamiento del intestino:

1. Las ratas se sacrifican mediante narcosis por CO2 o un método que sea
aprobado por la institución Universitaria o de Investigación.

2. Lavar el abdomen con alcohol 70%, luego de orear unos 5 minutos, Abrir el
abdomen y localizar el intestino delgado.

3. Una vez que el intestino es aislado, las muestras de tejido deben colocarse
inmediatamente en una placa petri que contiene 5-10 ml de PBS frio, a partir
de este paso se tiene 1 hora para el aislamiento de células.

4. Hacer dos lavados con 5 ml de PBS y cortar el Intestino en trozos de 1 cm de

longitud y dejar en 5 ml de PBS.

5. Abrir los trozos en forma longitudinal, usando tijeras, pinzas y escalpelos

estériles.

6. Raspe con bisturí la superficie interna del intestino para obtener el tejido
epitelial.

7. Eliminar el resto (grasa y musculo).

 8. Recoger tejido mediante centrifugación suave (1000 RPM por 5 minutos) y
proceder a la disociación.

9. Dibuje el procedimiento.

- Disociación del Tejido:

1. Colocar el tejido epitelial en una placa y adicionar 5 ml de tripsina mas 5 ml de

PBS.

2. Incubar por 10 minutos a 37 C.

3. Abrir la placa y con la ayuda de una tijera, trozar todo el tejido en trocitos más
pequeños (1 mm), agitar manualmente.

4. Observar que la solución se torne “TURBIA”

5. Seguir agitando, y retirar la solución turbia en un nuevo tubo (falcon 15 ml).

6. Centrifugar la solución turbia, el sobrenadante devolver a la placa para

continuar separando células del tejido.

7. El pellet celular se resuspende con 1 ml de medio competo DMEM.

8. Repetir los pasos 5, 6 y 7 por tres veces, para obtener un mayor número de
células.

9. Juntar los pellet celular y hacer el recuento para sembrar 500.000 células por
pozo.

10. Añadir a los pozos 5 ml de medio completo DMEM.

11. Incubar a 37 C, Humedad y CO2 5%.

12. Dibuje la observación microscópica de las células en el momento del recuento.

 13. Dibuje los materiales utilizados para el cultivo.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué son células primarias?

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2. Caracterice la composición y preparación de los medios RPMI 1640 y DMEM:

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3. ¿Qué es un medio completo?

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4. Dibuje los siguientes materiales de cultivo: 1 Dishe cultura, 1 six well plate y 1
flask culture.

REFERENCIAS:

1. Spottl T, Hausmann M, Gunckel M, Herfarth H, Herlyn M, Schoelmerich J, Rogler G.

A new organotypic model to study cell interactions in the intestinal mucosa. Eur J
Gastroenterol Hepatol. 2006 Aug;18(8):901-9.

2. Slorach EM, Campbell FC, Dorin JR. A rat model of intestinal stem cell function and
regeneration. J Cell Sci. 1999 Sep;112 Pt 18:3029-38.

3. Perreault N, Beaulieu JF. Primary cultures of fully differentiated and pure human
intestinal epithelial cells. Exp Cell Res. 1998 Nov 25;245(1):34-42.
PRACTICA N°4

RECUENTO CELULAR EN BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCIÓN:

El recuento Celular es un método muy utilizado en Biología Molecular para calcular la

población de células con las que se va a trabajar.

Para hacer el recuento celular, se utiliza la cámara de Neubauer.

La cámara de Neubauer consiste en una lámina porta-objeto graduada en forma de

cuadricula, (como se observa en el dibujo de abajo).

El área cuadriculada cubre 9 mm cuadrados, las líneas límites de la cámara son las líneas
del centro del grupo de tres.

El cuadrado central milimetrado es dividido en 25 grupos de 16 pequeños cuadrados,

cada grupo separado por una triple línea y la del medio vendría a ser el límite de cada
división.
El volumen de cada uno de los 16 pequeños cuadrados es 0.00025 mm cúbicos, por lo
que para el cálculo se utiliza la siguiente formula:

# de células por ml = # de células contadas por mm cuadrado x 10 x 1000

 1ml = 1000 mm cúbico.

 1ul = 1 mm cúbico.

OBJETIVOS:
 Aprender el manejo de la cámara de recuento celular.
 Preparar una suspensión celular con un número determinado.

MATERIAL Y REACTIVOS:
- Suspensión celular.
- Cámara de Neubauer.
- Micropipetas.
- Tips.
- Pipetas de Pasteur.
- Buffer fosfato pH 7.4.
- Hielo.
PROCEDIMIENTO:
1. En un tubo de eppendorff resuspender 50 ul de células de levadura (S. cerevisiae)
en 800 ul de buffer fosfato, mezclar por pipeteo 5 veces.
2. Centrifugar 5 minutos.
3. Decantar el sobrenadante por inversión del tubo.
4. Resuspender las levaduras en 100 ul de buffer fosfato pH 7.4
5. Homogenizar la suspensión a través de pipeteo suave, por 10 veces, para lograr una
completa separación de las células.
6. Colocar el cubreobjetos sobre la cuadricula de la cámara
7. Cargar la cámara con 10 ul de suspensión celular
8. Llevar al microscopio para hacer el recuento utilizando objetivo de 20X.
RESULTADOS:
1. Dibujar y anotar los resultados.

2. Hacer los cálculos para preparar 200 ul de una suspensión que contenga 1000
células por ml.

3. Sembrar 100 células en una placa que contiene medio de cultivo YPD-Adenina
e incubar a 30 °C por 4 – 7 días.
CUESTIONARIO:

1. ¿Cuántas células hay en 5 ml de una suspensión si en el recuento encontramos 48

células por mm cuadrado?
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2. ¿Cuántas células hay en 5 ml de una suspensión si en el recuento de una dilución

1:10 encontramos un promedio de 4 células por cuadrado pequeño, de los 16 que
contiene un mm cuadrado de una esquina, de la cámara de Neubauer?
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3. Si la concentración de glóbulos rojos en sangre es 5 millones/ml, si hacemos una

dilución 1:10, ¿cuántas células esperamos encontrar por mm cuadrado, y cuantas
por cada cuadrado pequeño en un cuadrante de una esquina?
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