ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Docente: ramón Lozada

Alumnos: Sindy Perez

Yessica Jaramillo

Carlos Avendaño

Licenciatura en biología y química

Universidad del atlaantico

Semestre VI

Barranquilla-Atlántico

INTRODUCCIÓN
Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción,
endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas. Pertenecen a este grupo una
gran diversidad de endodesoxirribonluceasas, descubiertas como enzimas propias de
distintas bacterias. Se dispone hoy comercialmente de un gran número de ellas con
elevada especificidad, estabilidad y pureza. Las enzimas de restricción son nucleasas que
cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico.
Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción. Las enzimas de
restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular, ingeniería genética y
biotecnología. Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan el ADN cuando
reconocen un patrón de secuencia específico. Se nombran con tres letradas del género y
especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra
más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un
número romano que las identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado
varias enzimas con distinta especificidad. La importancia de las enzimas de restricción
radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e
hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma posición. Cada
enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o
secuencia diana. Los fragmentos de DNA resultantes son útiles para iniciar la clonación
celular o acelular, para el análisis del DNA, para elaborar mapas físicos de restricción o
para la detección de polimorfismos. Las diversas enzimas de restricción se agrupan en
tres familias, de acuerdo con sus propiedades: Tipo I, Tipo II y Tipo III.

Se descubrieron en los años 60 y su uso en biología molecular empezó en los 70

permitiendo el desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante. Las enzimas de
restricción tienen actividad endonucleasa y cortan enlaces fosfodiéster en las dos
cadenas del ADN. Reconocen ciertas secuencias en el ADN. Las enzimas de restricción
de Tipo I y III reconocen una secuencia específica pero cortan a una distancia variable del
sitio de reconocimiento (sitio de restricción). Las enzimas de restricción de Tipo II
reconocen una secuencia específica conocida como secuencia diana y siempre cortan
entre los mismos nucleótidos. De ahí que generen siempre los mismos fragmentos de
restricción. La secuencia diana es de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6 nucleótidos, y
con frecuencia es parcialmente palindrómica. Algunas enzimas de restricción cortan
generando extremos llamados romos mientras que otras cortan generando extremos
llamados cohesivos.

Las enzimas de restricción son una herramienta básica en Biología molecular: en

laboratorios de PCR, creación de sondas para hibridación, laboratorios de secuenciación
de ADN, ingeniería genética, procesos de clonación, manejo de genotecas y en muchas
otras áreas de genómica.

Las enzimas de restricción

La clave de la transgénesis, la obtención de un organismo genéticamente modificado,

está en extraer genes de interés de un organismo e introducirlos en otro, de modo de
obtener un producto con características mejoradas. Pero ¿cómo se hace para "cortar"
ADN de un organismo e insertarlo en otro? Los genetistas necesitaban herramientas para
hacerlo, y así descubrieron las enzimas de restricción, las “tijeras moleculares” que cortan
el ADN. De esta forma, es posible extraerlo del genoma de un organismo. También
descubrieron las enzimas ligasas que "pegan" el fragmento de ADN aislado dentro del
ADN del nuevo organismo. Las enzimas son proteínas que cumplen una función esencial
en el metabolismo celular: son catalizadores biológicos (aceleradores de reacciones
químicas) que hacen posible que las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado
a las necesidades vitales del organismo (ver Cuaderno Nº 30). Entre sus características
fundamentales se encuentra la de ser específicas, es decir que cada tipo de enzima actúa
sobre un sustrato particular o una secuencia particular de una molécula, y no sobre otra.
Esta especificidad enzimática resulta fundamental en la actividad de las enzimas de
restricción que cortan secuencias particulares y determinadas del ADN.

Nomenclatura

 Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia
coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del
nombre se escriben en cursiva.

 La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli )

 En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa

aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.

 Todas deberían llevar adelante una R de restricción o un M de metilasa según la

función de la enzima, pero generalmente se omite.
De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría de la
siguiente manera:
Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria

Co coli Especie de la bacteria

R RY13 Cepa de la bacteria

La primera enzima Orden de identificación de

I
identificada la enzima en la bacteria

Así mismo, las enzimas HaeII y HaeIII provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII
de Moraxella bovis, etc.

Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se
podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica.
Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que
reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada
enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se
posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.
Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:

• Enzimas que generan “extremos romos” (parejos)

• Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos “colgantes”
de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la
secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas
cadenas se denominan ligasas.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan

generando extremos romos extremos cohesivos.

Los extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la enzima
ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada recombinante.

El origen de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, conocidas también como endonucleasas, sólo cortan el ADN
si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Estas enzimas fueron
descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran sólo en organismos
procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de
donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restricción que se descubrieron en la
bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que
se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan
letras y números romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco “erre” “uno”). Así, el sitio de
restricción para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustración anterior. Una
vez que la enzima encontró ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el
corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos
de enzimas de restricción distintas y cada una reconoce una región específica.
Estas enzimas fueron descubiertas en la década del ’70 y hasta la fecha existen más de
250 enzimas de restricción. Se cree que la función natural de estas enzimas en las
bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podrían ingresar en sus células. De esta
manera, la bacteria utiliza estas “tijeras moleculares” para cortar en pedacitos el ADN viral
que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene “protegido” contra
sus propias

Sistemas de restricción-modificación (M-R)

El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para
protegerse de ataques de DNA exógenos (normalmente víricos) que ingresen en la
bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre
deleción por parte de las enzimas de restricción del organismo que las produce, puesto
que previamente ha sido modificado por metilación a través de la acción de
una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina
(SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie
de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las
llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:

Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para

evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente
a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida
de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción
a los DNA exógenos que ingresen a la bacteria.

Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases

dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por
una metilasa específica.
Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales
destacan el tipo I y el tipo II:

M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo característico de los sistemas M-R de
tipo I es que las actividades de modificación y las de restricción están producidas por un
complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas características
son:

 Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías.

 La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de
reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecíficos.
 La restricción requiere de ATP.
 La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como
donador de los grupos metilo.

M-R tipo II: Aquí cada subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en
cada una de las partes especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar
específico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad
del palíndromo. Más de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un
sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados
en plásmidos. Algunas características que tiene este mecanismo son:

 Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no forman complejos
multiproteicos.
 No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como
donador de metilos.
 Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia
específica de ADN.
 El sitio de reconocimiento consta de 4 ó 6 pb que constituyen una secuencia
palindrómica.
 La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en
una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro del sitio
de reconocimiento.
 La enzima de restricción suele ser una proteína formada por dos subunidades del
mismo tipo, ensambladas simétricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o
extremos romos. Algunas enzimas de restricción dejan extremos sobresalientes 5',
mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'.
Tipos de enzimas de restricción
Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y
modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios
distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte deja
extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente),
además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El
corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es
resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación
de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias
conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas.
Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del
sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de
reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP,
Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.
Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E.
coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una
secuencia específica, y que además metila.

En esta tabla se presentan algunas enzimas de restricción, con su respectivo origen

bacteriano y sitio de reconocimiento.
Sitio de
Enzima Origen Bacteriano Resultado del Corte
Reconocimiento

5'GAATTC 5'---G AATTC---3'

EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'

Bacillus 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'

BamHI
amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'

CH3 CH3

| |

5'GATC 5'---GA TC---3'

DpnI* Diplococcus pneumoniae
3'CTAG 3'---CT AG---5'

| |

CH3 CH3

5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'

HindIII Haemophilus influenzae
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'

5'TCGA 5'---T CGA---3'

TaqI Thermus aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'

5'GCGGCCGC 5'---GC GGCCGC---3'

NotI Nocardia otitidis
3'CGCCGGCG 3'---CGCCGG CG---5'

5'GANTC 5'---G ANTC---3'

HinfI Haemophilus influenzae
3'CTNAG 3'---CTNA G---5'
 5'GATC 5'--- GATC---3'
Sau3A Staphylococcus aureus
3'CTAG 3'---CTAG ---3'

5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3'

PovII* Proteus vulgaris
3'GTCGAC 3'---GTC GAC---5'

5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'

SmaI* Serratia marcescens
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'

5'GGCC 5'---GG CC---3'

HaeIII* Haemophilus egytius
3'CCGG 3'---CC GG---5'

5'AGCT 5'---AG CT---3'

AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'

5'GATATC 5'---GAT ATC---3'

EcoRV* Escherichia coli
3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'

5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'

KpnI1 Klebsiella pneumonia
3'CCATGG 3'---C CATGG---5'

5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3'

PstI1 Providencia stuartii
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5'

Streptomyces 5'GAGCTC 5'---GAGCT C---3'

SacI1
achromogenes 3'CTCGAG 3'---C TCGAG---5'

5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3'

SalI1 Streptomyces albue
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5'

Streptomyces 5'GCATGC 5'---G CATGC---3'

SphI1
phaeochromogenes 3'CGTACG 3'---CGTAC G---5'

XbaI1 Xanthomonas badrii 5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'

 3'AGATCT 3'---AGATC T---5'

* = ADN queda con extremos romos

Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas

Gracias a las enzimas de restricción somos capaces de diagnosticar ciertas
enfermedades genéticas, bien sean debidas a una variación en el material genético
(duplicación, deleción, etc) o bien sean debidas a una mutación en una base puntual. El
procedimiento para dicho diagnóstico consistiría en amplificar por PCR una región
concreta del cromosoma donde sepamos que debería estar o no ese cambio genético y
añadir la enzima o enzimas de restrición para que así se realicen los cortes pertinentes.
Tras realizar dichos cortes, correremos nuestras muestras en un gel de electroforesis y
veremos las diferencias de tamaños que existen. Si la mutación genera una deleción, al
correr en la electroforesis observaremos un fragmento menor al que esperaríamos de un
paciente sano, de tal manera que lo podríamos diagnosticar. Si la mutación, por el
contrario, genera una mutación puntual, podremos aprovecharla para utilizar una enzima
en ese punto y que así, si no existe dicha mutación, ese corte no se producirá y
obtendremos un fragmento mayor en el gel de electroforesis.

Usos de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en
investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología
moderna:

1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con

varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de
corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.
2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos
después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por
tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Por
ejemplo: para la técnica de Southern blotting (ver cuaderno Nº 67) o en las usadas para
identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos (RFLP, ver cuaderno Nº 69).
3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear
ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el
mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con
ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante.
Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de
interés clonado (si se usó un vector de expresión con el promotor adecuado) o puede
usarse simplemente para tener clonado (“guardado”) ese fragmento de ADN de interés.
Por ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas.
Bibliografía

http://rebase.neb.com

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=34

Molecular cell biology. Lodish, Harvey F. 5. ed. : - New York : W. H. Freeman and Co.,
2003, 973 s. b ill. ISBN 0-7167-4366-3