REVISTA CIENTIFICA, FCV-LUZ / Vol. XI, N° 1, 53-59, 2001 CINETICA DE LA PRODUCCION DE ACIDO LACTICO POR FERMENTACION SUMERGIDA CON LACTOSUERO COMO SUSTRATO Kinetic of the Lactic Acid Production by Submerged Fermentation with Whey as Substrate Miguel Jakymec, Héctor Morén, Gisela Péez, José R. Ferrer, Zulay Marmol y Eduardo Ramones Laboratorio de Tecnologia de Alimentos, Escuela de Ingenieria Quimica, Facultad de Ingenieria, Universidad del Zulia. Apartado 4011-A 526. Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. E-mail: gpaez@luz.ve RESUMEN Se estudié la cinética de produccién del dcido lactic, a partir del suero de leche, utilizando Lactobacillus bulgaricus, mediante fermentacién por carga. El suero de leche fue desproteinizado (bajando el pH a 4,5, calentando durante 20 min) y suplementa- do con 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona trips!- ca de caseina y 1 g/L de Tween 80 como antiespumante. La fermentacién se llevd @ cabo @ 42°C y @ 100 rpm de agitaci6n en un fermentador New Brunswick modelo Biotlo 4000, a tres concentraciones iniciales de lactosa diferentes: 27,98 g/L, 49,89 g/L y 90,64 g/L. El maximo rendimiento de Acido ldctico fue 10%, para una concentracién inicial de lactosa de 49,89 g/l. La cinética de la produccién de biomasa fue ajustada por el modelo logistico, obteniéndose en la mejor simulacién un valor dé Umax = 0,884 h", la de produccién de Acido léctico por la ecuacién de Luedekin y Piret, obteniéndose en la mejor simulacién los si- guientes coeficiontes u = -1,348'107 y {= 1,29°10%, y la de ‘consumo de sustrato por la ecuacién de Hanson y Tsao, obte- niéndose en la mejor simulacién un coeficionte Ks = 1,27710%, Palabras clave: Fermentacién ldctica, lactosuero, produccién de Acido lactico, cinética. ABSTRACT Kinetic of the lactic acid production in batch fermentation was studied from whey, using Lactobacillus bulgaricus. Whey was deproteinized (by adjusting the pH to 4,5, heating for 20 min) ‘and supplemented with 20 g/L yeast extract, 10 g/L tripsic ca~ sein peptone and 1 g/L Tween 80 as antifoam. The fermenta- tion was performed at 42°C and agitation speed 100 rpm in a Recibido: 03/11/1989. Aceptado: 28/11 / 2000. New Brunswick Fermentor mode! Biotlo 4000, at three different initial lactose concentrations: 27.98 g/L, 49.89 gL and £0.64 g/L. Maximum lactic acid yield was 10%, at an intial lac- tose concentration of 49,89 g/L. Biomass production kinetics ‘was adjusted by a logistic model (imax = 0.884 h”’ for the best modelling}, lactic acid production by the Luedekin and Piret ecuation (x = -1.348°10 and [b= 1.42910" for the best mo- delling) and sustrate consumption was adjusted by the Hanson and Taao ecuation (Ks = 1.2710" for the best modelling). Key words: Lactic acid fermentation, whey, lactic acid produc- tion, kinetic INTRODUCCION El suero es el liquido residual de la transformacién de la leche en queso. Es el subproducto mas abundante en las in- dustrias lcteas, El suero es un producto muy utlizado en el campo de la alimentacién animal (hasta un 20% en peso del alimento), en la fabricacion de algunos tipos de bebidas y de alimentos enriquecidos para el hombre. Desde el punto de vis ta nutricional la proteina presente en el suero es el componen- te més valioso, contiene también las vitaminas y minorales no retenidos en el proceso de coagulacién de la leche y lactosa, {de gran uso en la industria farmacéutica y alimenticia. Sin em- bargo la cantidad de suero que se aprovecha es muy poca comparada con su produccién. La produccién de suero en la regién Zuliana fue para 1997, 162.987 toneladas [6]. A través de procesos de bioconversién pueden obtener- se de! suero productos con un alto valor comercial, uno de estos productos es el acido lactico, utilizado en las industrias alimenticia, farmacéutica, texti, como materia prima en la produccién de polimeros biodegradables, en el procesamien- to del papel y en la sintesis de bamices y pinturas. El acido 53Cinética de la produccién de dcido ldctico por fermentacién / Jakymec, M. y col. lactico puede ser obtenido por fermentacién del suero con bacterias del género Lactobaoilus, entre estas el Lactobaci- lus bulgaricus. La medicién del crecimiento del microorganis- mo, el consumo del sustrato y la produccién del acido funda- menta la determinacién de los parametros que describen el bioproceso. Existen varios modelos que permiten una descripcién adecuada de procesos de fermentacién con lactosa como sustrato, como una via sencilla de conversién en acido lactico asumiendo que la produccién de este dcido esta parcialmente asociada con el crecimiento microbiano. La simulacién de los datos experimentales de un cultivo de Lactobacillus bulgari- cus en suero de leche correlaciona el bioproceso con estos modelos, El objetivo de esta investigacién fue estudiar la produc- cién del acido léctico empleando suero de leche como sustra- to, estableciendo el modelo cinético de la fermentacién. METODOLOGIA EXPERIMENTAL Microorganismo Se trabajé con Lactobacillus bulgaricus, obtenido lofi ‘ado del Chr. Hansen’s Laboratorium A/S de Dinamerca, EI microorganismo lioflizado se reactive en leche, duran- te 2 dias a 40°C. De los tubos de reactivacién, se tomé 1 mL, transfiriéndose a tubos con 9 mL de agar de leche descrema- da. Se dejé crecer durante 24 hy; refrigerandose a 4°C para su conservacién. Medio de cuttivo El suero de leche, de Ia titima etapa de produccién de queso ricota, fue suministrado por la empresa Venelacteos ubicada en Maracaibo, estado Zulia. Se caracteriz6 midiendo los sélidos totales, cenizas, ritrégeno, proteinas, fésforo y lac- tosa y desproteinizé bajando el pH a 4,5 con Acido fosferico y calentando a 90°C durante 20 minutos. Se enfriéy fiteé en pa~ pel Whatman nimero 42. EI medio empleado en las fermentaciones fue el siguien- te; suero desproteinizado, diluido con agua destilade para ob- tener una concentracién de 27,98 g/L; suero desproteinizado ‘con adicién de lactosa hasta una concentracién de 90,64 g/L y suero desproteinizado con 49,89 g/L de lactosa (concentracién de lactosa en el suero fresco). En todos los casos el medio se suplement6 con 20 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de peptona tripsica de caseina 1; el pH inicial se ajusté a 5,9, con tna solucién de NaOH al 10%. Fermentacién Se realizaron fermentaciones por carga y por duplicado en el fermentador New Brunswick modelo Bioflo 4000 (New Brunswick, New Jersey, USA), con 3 L de medio de cultivo, previamente esterilizados a 118°C durante 20 minutos, sin ai- reacién, sin control de pH, manteniendo Ia temperatura a 42°C y la agitacién a 100 rpm, con Tween 80 (1 g/L) como lantiespumante, La inoculacién se realizé bajo condiciones asépticas. Inéculo El inéculo fue un 10% del volumen total de medio, a par- tir de cultivo bacteriano refrigerado. Se dejé adaptar y reprodu- cir durante 12 horas en estufa a 42°C sin agitacién, para cada fermentacién. ‘A cada inéculo preparado se le realiz6 un contaje en pla- cas para garantizar entre 10° y 10° unidades formadores de colonias por mL. de inéculo. Métodos de anal Lactosa: Se determiné utiizando e! método espectroco- lorimétrico de Dubois [4] Sélidos totales y cenizas: Se determinaron empleando los métodos de la A.A. [3]. Nitrégeno: Se determiné por el método de Kjeldaht (3) Proteinas: Se determinaron como porceniaje de nitrége- ‘no muttiplicado por 6,38 (3) Fésforo: Se determiné por el método espectrocolorimé- ‘rico del molibdo-vanadato de amonio [3] Biomasa: Se determind turbidimétricamente midiendo la absorbancia de! medio @ una longitud de onda de 490 nm en un Spectronic 20, Bausch & Lomb (Rochester, New York USA) [8] Acido Iéetico: La concontracién de cide lactico fue de- terminada por cromatograffa en fase gaseosa, empleando un cromatégrafo Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut USA), equi- pado con una columna capilar Carbowax, para acidos grasos, de 15 m de longitud y 0,25 mm de diémetro. La temperatura en el puerto de inyeccion fue de 200°C, la del hore fue 190°C y la del detector fue 250°C [11]. Se empie6 ritrégeno como gas de arrastre a una presién de 14 psig. El volumen inyecta- do por andisis fue de 1 pL. Para calibrar el equipo se uliliz6 un estdndar de 1% ply, el cual tuvo un tiempo de retencién de 1,267 min. Como tratamiento previo a la inyeccién en el cromaté- grafo, las muestras fueron centritugadas @ 5000 rpm durante 30 minutos y fitradas usando papel milipore de 0,2 m, para prevenir la obstruccién de la columna. Cinética Se ajustaron los datos experimentales a las ecuaciones cinéticas propuestas para la produccién de biomasa, écido léc- tico y el consumo do sustrato.Biomasa Entre las ecuaciones descritas para la produccién de Biomasa [2, 7, 11] se tienen’ Ky 8 a a ee) o % .4,-me) (Eason deLuedeiny Pre) @) 7 (Motel onsen ® o 1 (Een deAmmae y Pager) Produccién de acide lactico Los modelos disponibles que describen la produccién de Acido lactico [2, 7, 11] son: dP ox aa 6 in sencil Pao (Ecvacién de produccién sencilla) (5) oP ox Fg My (Eouacién de Luedekin y Pir nooo (Ecuaci kiny Piret) (6) a. = Kosx (Ecuacién de Hanson y Tsao) (7) @ pli. ® -pol1- (Modelo Logi ® Pol 1-5 (Modelo Logistice) ® Consume de sustrato Las eovaciones usaias con mayor fecuandia pare sl ite eat 7.77] at a8 x nag [Fouacién de Mono any (Eeuacién de Monod) ) (Ecuacién de Hanson y Tsao) (10) (Ecuacién de Yeh y col) (11) 1 mx (Eouacién de Aborhey ye y Williamson) (12) donde: X= Biomasa (g/L). Xo= Concentracién inicial de biomasa (g/L). Xrnax= Maxima concentracién de biomasa alcanzada en la fermentacién (g/L). Tiempo (h). = Velocidad especitica de crecimiento (ht), Umax = Maxima velocidad especifica de crecimiento (h"). Revista Ciettica, FOV-LUZ / Vol. XI, |. 53-59, 2001 TABLA COMPOSICION DEL SUERO Suero Suero Fresco Desproteinizado Lactosa (g/L) 45,95 46,94 Sélidos Totales, (g/L) 525 610 Cenizas (g/L) 45 30 Nitrégeno (%6) 0,147 0,005, Proteinas (%) 0,94 0,03 pH 51 - Fosforo 0,957 : S= — Concentracién de sustrato (g/L) Y¥,= Rendimiento, gramos de biomasa/gramos de sustrato Yp= _ gramos de biomasa /gramos de producto. q= —_ Cociente metabdiico (h') P= Concentracién de producto (Acido lactico) (g/L). Conceniracién nical de acd lictico (gL) Maxima concentracién de Acido lactico alcanzada en la fermentacién (gIL). Ks= Constante de saturacién de sustrato (Ligh 6h"). m= Coeficiente de mantenimionto celular (h") h= Coeficiente de inhibicién de la ecuacién de Luedekin - Piret (Ug h). Coeficientes constantes de la ecuacién de Amrane-Pri- gent (hr), Kp= Constante de inhibicién por producto (Lig h 6 h"). a= Constante asimensional B= Constante de produccién (h"). RESULTADOS Y DISCUSION La caracterizacién de! suero se muestra en la TABLA | E| suero desproteinizado tiene una composicién ligeramente superior en lactosa, sélidos totales y cenizas que el suero sin desproteinizar. El pH del suero (5,11) lo define como un suero Acido. La desproteinizacién fue efectiva, ya que se bajé el con- tenido de proteinas de 0,94% a 0,03%, es decir, se precipitan 21 96,8% de las proteinas remanentes. En la FIG.1 se muestra el maximo crecimiento microbia- no a las & horas, independientemente de la concentracién it ial de lactosa [1, 2, 7]. Se obtuvo una mayor cantidad de bio- masa y una mayor velocidad de crecimiento a la mayor con- ccontracién inicial del sustrato, sin embargo los rendimientos de biomasa expresados en gramos de biomasa producida por gramos de sustrato consumido fueron de 2,65; 2,23 y de 1,23, 55Cinética de la produccién de dcido lactico por fermentacién / Jakymec, M. y col. 60 a a 40 E> 2 0 0 2 4 —+—S0=27.98 g/L —#—S 6 Tiempo (h) 10 12 = 49.89 gL —t—So = 90.64 g/L FIGURA 1. CINETICA DE CRECIMIENTO DE L. bulgaricus A DISTINTAS CONCENTRACIONES DE LACTOSA. FERMENTACION EN EL BIOFLO 4000 . T: 42°C Y 100 RPM. 3 a 22 g 3 3 1 < 0 oO 2 4 $0 27,98 g/L ES 6 8 10 Tiempo (h) 4989 g/L tk So= 90,64 g/L FIGURA 2. CINETICA DE LA PRODUCCION DE ACIDO LACTICO. para concentraciones inicialos do sustrato de 27,98; 49,89 y 90,64 g/L respectivamente. El rendimiento disminuyé al au- mentar la concentracién inicial de lactosa. La FIG. 2 muestra la produccién de dcido lactico. Estas curvas muestran que la mayor concentracién de acido se ob- tiene para el suero desproteinizado suplementado sin adicién de lactosa, el rendimiento de Acido lactico fue de un 10,9%, ‘expresado como gramos de dcido lactico producido por gra- mos de sustrato consumido; el rendimiento en el suero despro- teinizado suplementado con lactosa a 90,64 g/L fue de 5,2% y el del suero desproteinizado diluido fue de 1.3%. En la FIG. 3 se puede observar que a mayor valor de concentracién inicial de sustrato, mayor es la cantidad consu- mida y también mayor es la velocidad de consumo de sustra- to. 56 La ecuaci6n que mejor ajusté las diferentes curvas de biomasa vs tiempo resulté ser ia del modelo logistico, con un coeficiente de regresién de 0,996. Donde: — max para 27,98 g/L (lactosa) = 0,553 ht — max para 49,89 g/L (lactosa) = 0,884 h* 723 1 — imax para 90,64 g/L (lactosa) = En la FIG. 4 se observa ol ajuste de los puntos logrado por esta ecuacién. La linea continua es la representacién del modelo de los datos experimentales. El modelo logistico fue ‘capaz de modelar el crecimiento desde el inicio hasta el final de la fermentacién, ventaja que no presentan algunas ecuacio- nes comunes, las cuales sélo pueden modelar el periodo de crecimiento exponencial100 80 60 40 Lactosa (g/L) 20 Rovista Cientiica, FOV-LUZ / Vol. XI, N® 1, 53-59, 2001 6 8 10 12 Tiempo (h) + So= 27,89 g/L. 8 $0=49,89 g/L a So= 90,64 g/L. FIGURA 3. CINETICA DE CONSUMO DE LACTOSA. 60 40 20 Biomasa (g/L) © Datos experimentales So= 29,98 g/L | Datos experimentales So= 49,89 g/L 10 ‘Tiempo (h) ad —*— Simulacién del modelo ‘A. Datos experimentales So= 90,64 g/L. FIGURA 4, SIMULACION POR EL MODELO LOGISTICO DE LOS DATOS DE BIOMASA. El pmax Que da la ecuacion para cada caso, representa la maxima velocidad especitica de cracimionto del microorganis- mo a esas condiciones de crecimiento (7) E| modelo de Monod no presenté ajustes individuales satisfactorios para cada curva de biomasa vs tiempo. La eouacién de Luedekin y Piret fue exitosa en represen tar los datos de una fermentacién individual, dando una buena correlacién (Coeficiente de correlacién igual a 0,999) para la fermentacién con So = 27,98 giL. Esta ecuacién mostré sor aplicable s6lo en la zona de crecimiento exponencial. La ecuacién de Amrane y Prigent no dio un resultado sa~ tisfactorio, En relacién a los datos de produccién de acide léctico vs tiempo, la ecuacién que aljusté mejor los datos fue la de Lue- ekin y Piet. Esta ecuacién, al igual que la ecuacién que ajus- 1a la produccién de biomasa propuesta por los mismos auto- res, sélo es valida en el periodo de produccién exponencial de Acido lactico, P= ulX-%o)+p] Xeats Po Donde: = Para So =27,98 gil u = — Para So = 49,89 g/L « = Para So = 90,64 gil 855°107 yf =1,8354107 348"10 y = 1,429"10 624°107y f= 2,401"10° En esta eouacién, el término [! X(¢)dt fue evaluado nu- rméricamente, Para todos los ajustes el coefciente de correla- cién fue mayor 0,999. En la FIG. 5 so observa el ajuste de los puntos logrado por la ecuacién de Luedekin y Piret. La linea continua repre- senta convenientemente las curvas de acido léctico vs tiempo. 57Cinética de la produccién de Acido lactico por fermentacién / Jakymec, M. y col._ Acido léctico (g/L) © Datos experimentales Si A Datos experimentales S Tiempo,(s)" 7 . : ’ Datos experimentales So-2 —e— simulacién del modelo FIGURA 5, SIMULACION DEL MODELO DE LUEDEKIN Y PIRET DE LOS DATOS EXPERIMENTALES DE PRODUCCION DE AciDO LAcTIco. 120 0 Ss i a 30 ° Tiempo (h) © Datos experimentales So= 27,89 g/L A. Ditos experimentales So= 90,54 g/l. —#—Simulacién éel modelo FIGURA 6. SIMULACIGN DEL MODELO DE HANSON Y TSAO PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO. La ecuacién ajusta bien la zona exponencial de produccién de Acido, pero no es muy efectiva para ajustar la produccién en la fase de adaptacién y en la etapa estacionaria. En los modelos de produccién de dcido lactico sencillo y de Hanson y Tsao fueron efectivos en la zona de produccién exponencial de Acido, al igual que le ecuacién de Luedekin y Piret, pero esta ultima presenté un mejor coeficiente de corre- laci6n. El modelo logistico para la produccién de dcido léctico se desplazé en ol tiempo, Este modelo no tiene un pardmetro para representar ol tiempo de adaptacién, sin embargo ajusté bien la produccién de biomasa, porque el periodo de adapta- clén fue de una sola hora, mientras que para acido léctico fue de dos horas. En cuanto a la parte de consumo de sustrato, la ecua- cién que mejor ajusté los datos de concentracién de sustrato vs tiempo fue el modelo propuesto por Hanson y Tsao. Sin 58 ‘embargo, las curvas més comunes, con la excepcién del mo- delo de Monod, ajustaron relativamente bien los datos experi- mentales, dando resultados particularmente buenos para la concentraciGn inicial de sustrato de 49,89 g/L, 98 63x (Goan Hanson y Ten) von: = Para So = 27,98 g/L Ks = 9,420 Ligh = Para So = 49,89 g/L Ks = 1,270 Ligh — Para So = 90,64 gil. Ks = 1,3910° Ligh En a FIG. 6 se observa el ajuste que realiza la ecuacién de Hanson y Tsao a los puntos de concentracién de sustrato vs tiempo. En esta ecuacién, el término nuevamente fue eva- luado numéricamente.Revista Cientifica, FOV-LUZ / Vol. XI, N° 1, 83-59, 2001 Los modelos obtenidos simulan efectivamente los datos cexperimentales, sin embargo la simulacién es particularmente buena para el suero sin suplementar con lactosa y sin diluir (So = 49,89 g/L), y considerando que los rendimientos en aci do y en biomasa son mejores para oste caso que para el suero suplementado con lactosa, podemos asegurar que tal suple- mentacién no fue necesaria. También se observe que cuando 1 proceso de crecimiento termina, cesan también el consumo de lactosa y la produccién de acido léctico. CONCLUSIONES Se obtuvo un méximo rendimionto de Acido Iéctico (10,3%) para el suefo de leche desproieinizado sin suplemen- tar con lactosa. La produccién del acido ldctico crigina una disminucién del pH en el medio; este bajo pH alecta el crecimiento, el con- sumo y la misma produccién, lo que explica el comportamiento del Lactobacillus bulgaricus durante la fermentacion. La concentracién inicial de lactosa no afecta la duracién de la fermentacién. El Lactobacillus bulgaricus crecié con un alto rendi- miento en el suero de leche. Este rondimionto disminuy6 al incrementar la concentraci6n de lactosa en el medio. El mi- croorganismo no fue capaz de consumir totalmente la lactosa del medio. Las ecuaciones que mejor representan el proceso de fermentacién de suero de leche fueron: — Modelo Logfstico para produccién de biomasa. Para So = 27,98 /L, Umax = 0,553" Para So = 49,69 IL, bax = 0,884 hy" Para So = 90,64 lL, Hnax = 0,728 h" = Luedekin y Piret para produccién de acide lactico. oP _ x PX 5x a at! Para So =27.98 glt « Para So = 49,89 g/l. « =-1,848"10 y fi = 1,429°107 624107 y = 2.40110 Para So = 90,64 g/l «= '— Hanson y Tsao para consumo de sustrato. 1 ia} B) 4) 6) (6) it) 8) 1] [10] (11) ‘SSX Para So = 27,98 g/L Ks = 9,42"10° Ligh Para So = 49,89 g/L Ks = 1,27°10° Lig h Para So = 90,64 g/L Ks = 1,39°10° Lig h REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS AMRANE, A.; PRIGENT, Y. lafiuence of Media Composi- tion on Laetie Acid Production rate fro Whey by Lactoba- cillus helveticus. Biotechnol. Lett. 15 (3): 239-244. 1993, AMRANE, A.; PRIGENT, Y. Mathematical Model for Lac- tic Acid Production from Lactose in Batch Culture: Mode! development and simulation. J. Chem. Tech. Biotech- nol. 60: 241-246, 1994. AOAC. Official Methods of Analysis. 15" edition. As- sociation of Official Analytical Chemists. Arlington, Vir- ginia, 1990, DUBOIS, M,; GILLES, A; HAMILTON, J.K; REBERS, P.A.; SMITH, F. Colorimetric Method for determination of sugars and related substances. Anal. 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