Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù

(Chromatography)

PGS.TS. Nguyeãn Ñöùc Tuaán

Boä moân Hoùa Phaân Tích – Kieåm Nghieäm
Khoa Döôïc – Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù

Muïc tieâu

- Trình baøy ñöôïc ñònh nghóa saéc kyù, caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình
saéc kyù, phaân loaïi saéc kyù, hai yeáu toá chuû yeáu quyeát ñònh quaù trình
taùch saéc kyù, nguyeân taéc cuûa saéc kyù haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi ion,
raây phaân töû, aùi löïc

- Giaûi thích ñöôïc yù nghóa cuûa caùc thoâng soá saéc kyù

- ÖÙng duïng ñöôïc caùch ñònh tính, ñònh löôïng baèng phöông phaùp saéc kyù

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù

Daøn baøi
- Lòch söû - Ñònh nghóa
- Quaù trình saéc kyù
- Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
- Söï taùch saéc kyù vaø saéc kyù ñoà
- Caùc thoâng soá ñaëc tröng cuûa saéc kyù
- ÖÙng duïng cuûa saéc kyù

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Lòch söû - Ñònh nghóa
Ether daàu hoûa  1906: Mikhail Tswett – saéc kyù loûng
haáp phuï treân coät
Saéc toá  1938: Izmailov & Schraiber – xaây
TV döïng phöông phaùp SKLM
 1958: Stahl – hoaøn thieän phöông
Chlorophyl
phaùp SKLM
Xanthophyl
CaCO3
 1941: Martin & Synge – ñaët neàn taûng
cho saéc kyù phaân boá: SKG vaø SKK
 1952: Martin & James – baøi baùo ñaàu
tieân veà SKK
 Cuoái naêm 1960: saéc kyù loûng cao aùp
ra ñôøi
 1937 – 1972: 12 giaûi Nobel veà saéc kyù
 Ñaàu naêm 2005: saéc kyù loûng sieâu aùp
t0 t1  2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu năng
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Lòch söû - Ñònh nghóa
 Qui trình trong ñoù chaát tan ñöôïc taùch rieâng ra bôûi quaù trình dòch chuyeån
khaùc nhau veà ñoäng löïc hoïc cuûa chuùng trong moät heä thoáng hai hay nhieàu
pha. Moät trong caùc pha naøy chuyeån ñoäng moät caùch lieân tuïc theo moät höôùng
nhaát ñònh vaø trong pha naøy caùc chaát rieâng bieät theå hieän linh ñoä khaùc nhau laø
do coù söï khaùc nhau veà phaân boá, haáp phuï, ñieän tích, kích thöôùc phaân töû, ñoä
hoøa tan vaø aùp suaát hôi
 Saéc kyù ñoøi hoûi hai pha:
 Pha ñoäng: loûng, khí, loûng sieâu tôùi haïn
 Pha tónh: coá ñònh trong coät hay treân beà maët chaát mang raén trô hoùa hoïc
 Chaát raén hay chaát loûng ñöôïc taåm, haáp phuï hay lieân keát hoùa hoïc
chaát mang
 Töông taùc vôùi chaát tan theo caùc cô cheá haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi
ion, aùi löïc
 Phöông phaùp saéc kyù ñöôïc aùp duïng trong caùc ngaønh khoa hoïc khaùc nhau
 Ngaønh Döôïc: nghieân cöùu, phaân tích, kieåm nghieäm thuoác
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
SAÉC KYÙ LOÛNG HIEÄU NAÊNG CAO

Hôïp chaát B

Hôïp chaát A

A
B
Quaù trình saéc kyù
 Ñöa hoãn hôïp leân pha tónh
 Khai trieån saéc kyù F

 Saéc kyù khai trieån X

 Saéc kyù röûa giaûi: A

 Quaù trình röûa giaûi

 Dung moâi röûa giaûi (eluent) O x x x

 Dung dòch röûa giaûi (eluate)

 Phaùt hieän caùc chaát
 Maøu cuûa chaát
Maãu
 Ñeøn töû ngoaïi
 Phun thuoác thöû
 Ñaàu doø (detector) Trieån khai saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
 Theo baûn chaát vaät lyù caùc pha
Teân kyõ thuaät Pha tónh Loaïi caân baèng
Saéc kyù loûng (liquid - Chaát loûng ñöôïc haáp - Phaân boá giöõa hai pha
chromatography): pha phuï treân 1 chaát raén loûng
ñoäng laø chaát loûng (chaát mang) - Phaân boá giöõa pha loûng vaø
- Pha lieân keát beà maët pha lieân keát
- Chaát raén - Haáp phuï
Saéc kyù khí (gas - Chaát loûng ñöôïc haáp - Phaân boá giöõa pha khí vaø
chromatography, GC): phuï treân chaát raén pha loûng
pha ñoäng laø chaát khí - Pha lieân keát - Phaân boá giöõa pha khí vaø
pha lieân keát
- Chaát raén - Haáp phuï
Saéc kyù loûng sieâu tôùi - Pha lieân keát - Phaân boá giöõa pha loûng
haïn (supercritical fluid sieâu tôùi haïn vaø pha lieân keát
chromatography, SFC):
pha ñoäng laø chaát loûng
sieâu tôùi haïn

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
 Theo phöông caùch cho pha ñoäng đi qua pha tónh
 Saéc kyù khai trieån
 Saéc kyù röûa giaûi
 Theo phöông caùch löu giöõ pha tónh
 Saéc kyù coät
 Saéc kyù lôùp moûng
 Saéc kyù giaáy

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
 Theo baûn chaát cuûa quaù trình saéc kyù
 Saéc kyù haáp phuï  Saéc kyù raây phaân töû
 Saéc kyù phaân boá  Saéc kyù aùi löïc
 Saéc kyù trao ñoåi ion  Sắc ký cặp ion

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
 Thoâng thöôøng
 Saéc kyù coät (Column Chromatography, CC)
 Saéc kyù giaáy (Paper Chromatography, PC)
 Saéc kyù lôùp moûng (Thin Layer Chromatography, TLC)
 Saéc kyù khí (Gas Chromatography, GC)
 Saéc kyù loûng hieäu naêng cao (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC)
 Saéc kyù loûng sieâu “hieäu naêng” (Ultra Performance Liquid
Chromatography, UPLC), UHPLC hoặc UFLC (Ultra Fast
Liquid Chromatography)
 Sắc ký hội tụ siêu “hiệu năng” (Ultra Performance
Convergence Chromatography, UPCC, UPC2)
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Cô cheá taùch – Phaân boá

Chaát phaân tích K

S1 (pha 1) <====> S2 (pha 2)
hoøa tan trong
pha tónh loûng [S ]
bao treân beà K  2 K: heä soá phaân boá
[S ]
maët chaát mang 1
raén trô

KD 
 C B
KD: heä soá phaân boá
C A bieåu kieán

Pha Chaát
tónh phaân
Chaát tích
mang
raén

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Cô cheá taùch – Haáp phuï

Chaát tan haáp

phuï treân beà
maët pha tónh

S2 : phaân töû chaát tan trong pha ñoäng

S1 : phaân töû chaát tan bò haáp phuï
S2 + nM1  S1 + nM2
M2 : phaân töû pha ñoäng
[ S1 ][ M 2 ]n M1 : phaân töû pha ñoäng bò haáp phuï
K
[ S 2 ][ M 1 ]n : beà maët hoaït ñoäng cuûa pha tónh
n: soá mol pha ñoäng bò thay theá töø beà maët
- Pha ñoäng luoân chaïy theo moät chieàu nhaát ñònh neân luoân xaûy ra quaù trình
haáp phuï vaø phaûn haáp phuï
- Caùc chaát tan seõ bò keùo theo pha ñoäng vaø coù aùi löïc khaùc nhau vôùi pha tónh
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion
Pha tónh laø caùc chaát trao ñoåi ion. Goàm 2 loaïi:
 Nhöïa trao ñoåi cation (cationit): Ñieän tích
coá ñònh
Ion
Cationit acid maïnh -SO3-H+ phaân
Cationit acid yeáu -COO-H+ tích Ionit

 Nhöïa trao ñoåi anion (anionit):

Anionit base maïnh -N(CH3)3+OH- Ion traùi
daáu
Anionit base yeáu -NH3+OH-
Quaù trình trao ñoåi ion
Tieán trình trao ñoåi: (Mx+ vaø Ax-: ion chaát tan)
Cation: xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+
Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx-+ xOH-
- Pha ñoäng thöôøng laø caùc dung dòch ñeäm coù pH vaø chaát ñieän ly thích hôïp.
- Pha ñoäng coù theâm moät soá dung moâi höõu cô nhö MeOH, EtOH,…ñeå laøm
taêng ñoä hoøa tan hay ñoä choïn loïc cho chaát tan  caùc ion chaát tan caïnh
tranh treân maïng ion
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion

Sử dụng nhựa trao đổi ion để khử khoáng nước

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Cô cheá taùch – Raây phaân töû
- ÔÛ traïng thaùi caân baèng: Cs  Cm
Cs, Cm: noàng ñoä chaát tan trong pha tónh vaø pha ñoäng
Heä soá K ñöôïc tính theo phöông trình:

Cs VR Vm
K 
Cm Vs
Trong ñoù:
Vm: toång theå tích cuûa pha ñoäng naèm trong caùc loã xoáp
cuûa caùc haït pha tónh
VS: theå tích dung moâi giöõa caùc loã
VR: theå tích bò löu giöõ cuûa chaát tan

- Saéc kyù raây phaân töû = Saéc kyù loïc qua gel = Saéc kyù thaåm thaáu gel.
- Duøng trong sinh hoùa ñeå taùch caùc protein, caùc carbohydrat,…

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Cô cheá taùch – Aùi löïc
- Môùi vaø coù tính choïn loïc cao
Moät phaân töû
- Döïa vaøo töông taùc ñaëc hieäu giöõa moät töông taùc vôùi
loaïi phaân töû chaát tan vôùi moät phaân töû thöù phaân töû lieân keát
coäng hoùa trò vôùi
hai lieân keát coäng hoùa trò vôùi pha tónh pha tónh

Ví duï: phaân töû lieân keát coäng hoùa trò vôùi Caùc phaân töû
khaùc ñöôïc röûa
pha tónh laø moät khaùng theå cuûa moät khoûi coät
protein. Khi cho hoãn hôïp goàm haøng ngaøn
protein qua coät, chæ coù moät pretein phaûn
Saéc kyù aùi löïc
öùng vôùi khaùng theå ñöôïc giöõ laïi treân coät,
caùc protein coøn laïi ñöôïc röûa khoûi coät.
Protein bò giöõ laïi treân coät seõ ñöôïc taùch ra
khoûi khaùng theå baèng caùch thay ñoåi pH
hay noàng ñoä ion trong pha ñoäng.

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Quaù trình taùch saéc kyù

Noàng ñoä
chaát tan taïi
AB caùc daõi A vaø
A B B treân coät

t1 t2

Hai caùch
taùch hai chaát
xen phuû

Söï taùch saéc kyù vaø

saéc kyù ñoà

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Caùc thoâng soá ñaëc tröng trong saéc kyù

Ñeå taùch saéc kyù ñöôïc toát:

 Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc
chaát tan
 Hieän töôïng giaõn pic
 Pic heïp vaø caân ñoái

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng
Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá Rf (Retardation factor)
dR v Ñöôøng
Rf   ===> 0  Rf  1
d M V0 dung
moâi
- Rf = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån, naèm
taïi ñieåm xuaát phaùt
- Rf = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dM
dung moâi
- dR: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch
- dM: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi dR
- v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch
- V0: vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi x x
1 2

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
 Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
Thôøi gian löu tR (phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi
tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho pic treân saéc kyù ñoà (tính töø
luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa pic).

 tM (hoaëc to): thôøi gian löu cuûa

moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn
goïi laø thôøi gian cheát cuûa coät.
 tR caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ
caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån
cuûa noù caøng nhoû. Thể tích chết của cột (mL)
 Thôøi gian löu hieäu chænh t'R ñöôïc vM  0,5 x 10-3 x L x d2
tính theo coâng thöùc: L: chiều dài cột (mm)
t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)
d: đường kính trong của cột (mm)
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Maùy HPLC
1. Nguoàn heli
2. Bình dung moâi
1

3. Ñaàu phun
8 4. Ñaàu loïc
5. Van tyû leä dung moâi
6. Bôm
6
9
10 7. Van kieåm tra vaøo
8. Van kieåm tra ra
9. Khöû xung
7
11
2
10. Ñaàu thaûi
3
4

11. Van xaû

12 12. Moài bôm
13. Loïc dung moâi
14. Ñieàu hoøa aùp suaát
5

detector ngöôïc
18 17 15 14 13 15. Chuyeån ñoåi aùp suaát
16. Van tieâm maãu
17. Coät baûo veä + coät
saéc kyù
16

18. Tôùi detector.

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
Thôøi gian löu
t’R = tR – tM
Diện tích pic, chiều cao pic

Heä soá dung löôïng k’

tR = tM (1 + k’)
k’: baûn chaát caùc pha, chaát tan, nhieät ñoä, ñaëc ñieåm coät
2 < k’ < 10 (coù theå chaáp nhaän ñeán 1 < k’ < 20)
K B k ' B t ' R,B
Heä soá choïn loïc  =  
K A k ' A t ' R, A
B löu giöõ maïnh hôn A neân  > 1
1,05 <  < 2,00

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic

Ñöôøng cong phaân boá

chuaån Gaussian

BC
Heä soá ñoái xứng AF  (0,8 < AF < 1,5)
AC
BC: nöûa chieàu roäng phía sau cuûa pic ñöôïc ño ôû
1/10 chieàu cao cuûa pic.
AC: nöûa chieàu roäng phía tröôùc cuûa pic ñöôïc ño ôû
1/10 chieàu cao cuûa pic.
Heä soá keùo ñuoâi As  AC  BC (1/20 chieàu cao)
2 AC
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic

BC
Heä soá ñoái xứng AF  (0,8 < AF < 1,5)
AC

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến
2
 tR 
2
 
N
L
 16   5,54 t R 
W  W
H    1/ 2 
N: soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến
H: chieàu cao ñóa lyù thuyeát
W: chieàu roäng cuûa pic ôû ñaùy pic
W1/2: chieàu roäng cuûa pic ño ôû nöõa chieàu cao
N toát khi N gaàn baèng Nmax
L
N max  4000
dp
L: chieàu daøi coät (cm)
dp: ñöôøng kính haït pha tónh (m)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến

Saéc kyù ñoà minh hoïa caùch tính N

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Söï giaõn pic (peak spreading) – môû roäng daûi (band broadening)

 Hieän töôïng ñaëc bieät trong saéc kyù

 Nghieân cöùu qua thuyeát veà ñóa vaø thuyeát ñoäng hoïc
 Laø keát quaû di chuyeån nhanh chaäm khaùc nhau cuûa caùc phaân töû cuøng moät
chaát khi qua coät
 Pic ra muoän tuø hôn pic ra sôùm
 Coät saéc kyù toát (hieäu löïc cao) seõ cho pic nhoïn (ít bò giaõn)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc

Moái lieân quan cuûa H vôùi caùc yeáu toá ñoäng hoïc
trong quaù trình röûa giaûi: a

 Khueách taùn chaát tan khi di chuyeån trong coät

Khueách taùn xoaùy A
 Thieát laäp caân baèng theo töông taùc: chaát tan
– pha ñoäng – pha tónh
b
 Toác ñoä cuûa caùc quaù trình töông taùc dieãn ra
trong coät
Khueách taùn doïc B
Phöông trình Van Deemter

B
H  A   Cu c e

u d

Chuyeån khoái C

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc
Phöông trình Van Deemter

B
H  A   Cu
u

A
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Söï môû roäng daûi do caùc nguyeân nhaân khaùc
Doøng chaûy taàng

Hex: yeáu toá aûnh höôûng ñeán H do nguyeân

r u 2 nhaân khaùc
H ex  r (cm): baùn kính caùc oáng noái caùc boä phaän
24 D M cuûa maùy HPLC
u: toác ñoä doøng cuûa pha ñoäng
DM: heä soá khueách taùn trong pha ñoäng

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Aûnh höôûng cuûa toác ñoä doøng leân hieäu löïc coät

(a) saéc kyù loûng

(b) Saéc kyù khí - loûng

H
H (mm)
(mm)

Toác ñoä doøng (cm/s)

Toác ñoä doøng (cm/s)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Aûnh höôûng cuûa kích thöôùc haït nhoài coät

f ( d 2 p , d 2 c, u )
CM u  u
DM

Chieàu cao
ñóa lyù
thuyeát H
(mm)

Toác ñoä doøng (cm/giaây)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Aûnh höôûng cuûa côõ maãu leân hieäu löïc coät

Coät Spherisorb ODS

Phaân boá k’ = 4,3

HETP (mm)

Phaân boá k’ = 2,3

Haáp phuï
Pha ñaûo k’ = 4,3

Pha ñaûo k’ = 2,2

Pha ñaûo k’ = 1,2
Phaân boá k’ = 1,0

g maãu/g chaát nhoài coät

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Ñoä phaân giaûi

2(t R ) B  (t R ) A 
Rs 
WA  WB
Rs = 0,75: hai pic khoâng taùch toát, coøn xen
phuû nhau nhieàu.
Rs = 1,0 : hai pic taùch khaù toát, coøn xen
phuû nhau 4%.
Rs = 1,5 : hai pic taùch hoaøn toaøn (chæ
xen phuû 0,3%).

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Moái lieân quan giöõa Rs – tR – H vaø k’

Rs là hàm
số của
k’(1+k’)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät leân ñoä phaân giaûi
Gia taêng hieäu löïc coät

a) a)

t t

b) b)

t t

Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät
leân ñoä phaân giaûi trong tröôøng
hôïp heä soá choïn loïc khoâng ñoåi
(a) Hieäu löïc coät thaáp
(b) Hieäu löïc coät cao
Hieäu löïc coät cao vaø heä soá choïn loïc giaûm
(a) Hieäu löïc coät toái ña vôùi heä soá choïn loïc
thaáp
(b) Gia taêng heä soá choïn loïc vaø vaãn giöõ
hieäu löïc coät toái ña

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Ñoä phaân giaûi

N      k ' B 
Rs    
4    1 k'B 
Taêng Rs:
- Taêng N: baèng caùch duøng coät daøi hôn (aùp suaát, thôøi gian vaø ñoä roäng cuûa
pic cuõng taêng theo) hoaëc pha tónh coù kích thöôùc haït nhoû hôn. Cuõng coù
theå giaûm toác ñoä doøng pha ñoäng.
- Taêng k'B: baèng caùch thay ñoåi thaønh phaàn pha ñoäng (saéc kyù loûng), nhieät
ñoä (saéc kyù khí). k’B taêng seõ taêng thôøi gian phaân tích. Ñeå dung hoøa Rs vaø
thôøi gian röûa giaûi : 2 < k’B < 5.
- Taêng  baèng caùch thay ñoåi loaïi pha tónh hoaëc thaønh phaàn pha ñoäng, keå
caû pH. Vieäc taêng  coù aûnh höôûng maïnh ñeán Rs.

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
 Ñònh tính vaø thöû tinh khieát
 SKG & SKLM
Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá Rf (Retardation factor)
dR v Ñöôøng
Rf   ===> 0  Rf  1
d M V0 dung
moâi
- Rf = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån,
naèm taïi ñieåm xuaát phaùt
- Rf = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dM
dung moâi
- dR: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch
- dM: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi dR
- v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch
- V0: vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi x x
1 2

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
 SKG & SKLM
- Söû duïng chaát ñoái chieáu
F
OX
R f ( X ) OF OX X
Rs ( X )   
R f ( A) OA OA A

OF
* Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù Rf vaø O x x x

Rs baèng nhau.
* Hai chaát phaûi coù cuøng löôïng chaám nhö nhau Saéc kyù ñoà saéc
kyù ñoái chöùng
vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
 Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
Thôøi gian löu tR (phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi
tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho peak treân saéc kyù ñoà (tính töø
luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa peak).

 tM (hoaëc to): thôøi gian löu cuûa

moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn
goïi laø thôøi gian cheát.
 tR caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ
caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån
cuûa noù caøng nhoû.
 Thôøi gian löu hieäu chænh t'R ñöôïc
tính theo coâng thöùc:
t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
 Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
* Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù tR vaø t’R baèng nhau
* Hai chaát phaûi coù cuøng theå tích tieâm maãu nhö nhau vaø
ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù

Neáu treân truïc hoaønh cuûa saéc kyù ñoà söû duïng ñôn vò ño laø theå
tích dung moâi:
- theå tích löu VR
- theå tích löu hieäu chænh V'R
- theå tích cheát cuûa coät VM (theå tích roãng Vo): theå tích dung
moâi töø nôi tieâm trong coät ñeán detector

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
 Ñònh löôïng
Nguyeân taéc chung: döïa treân söï so saùnh chieàu cao hoaëc dieän tích cuûa
pic trong maãu thöû vôùi moät hay nhieàu maãu chuaån.
 Pic heïp vaø ñoái xöùng: ño chieàu cao cuûa pic
 Pic tuø hay leäch phöông: ño dieän tích cuûa pic

 Phöông phaùp ñònh löôïng

 Xaây döïng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)
 So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)
 Theâm chuaån
 Noäi chuaån
 Chuaån hoùa dieän tích

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù

 Duøng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)

 Pha caùc dung dòch chuaån coù noàng ñoä khaùc nhau
 Tieán haønh saéc kyù caùc maãu chuaån
 Veõ ñöôøng chuaån ñoä bieåu dieãn söï phuï thuoäc chieàu cao hay dieän tích pic
theo noàng ñoä
 Tieán haønh saéc kyù maãu thöû. Döïa vaøo ñöôøng chuaån suy ra noàng ñoä maãu
thöû

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù

 So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)

 Phaân tích baèng chieàu cao cuûa pic:

hx
Cx  Co ho: Chieàu cao pic chuaån, hx: Chieàu cao pic thöû
ho

 Phaân tích baèng dieän tích pic:

Sx
Cx  Co So: Dieän tích pic cuûa chuaån, Sx: Dieän tích pic cuûa thöû
So

C0 vaø Cx caøng gaàn nhau keát quaû caøng chính xaùc

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Phương pháp định lượng bằng HPLC
 Phương pháp nội chuẩn
 Kết quả phân tích không lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (xử
lý mẫu phức tạp, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm mẫu không
lặp lại)
 Nguyên tắc
 Thêm cùng hàm lượng một chất chuẩn khác (chuẩn nội) với chất cần
định lượng vào mẫu thử và chuẩn
 Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn một trong các chất làm chuẩn nội
 Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội là thông số được sử
dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C)
 Yêu cầu của chuẩn nội
 Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác
 tR của chuẩn nội phải gần với tR của chất phân tích
 Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần bằng nồng độ chất phân tích
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp định lượng bằng HPLC
 Phương pháp nội chuẩn
 Độ nhạy phát hiện của chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau
 Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs của chuẩn nội và chất phân tích
 Sử dụng dung dịch chuẩn tinh khiết

- Cs: nồng độ của dung dịch chuẩn ngoại

S i  Cs
Fs  - Ci: nồng độ của dung dịch chuẩn nội
S s  Ci - Ss: diện tích đỉnh của chuẩn ngoại
- Si: diện tích đỉnh của chuẩn nội

 Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích đỉnh Sx

Sx
Cx  Ci Fs
Si

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Phương pháp định lượng bằng HPLC

 Phương pháp thêm chuẩn

 Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử
 Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích pic là Sx
 Thêm C vào làm tăng S

C
Cx  S x
S
 Áp dụng khi có ảnh hưởng của chất phụ

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Phương pháp định lượng bằng HPLC

 Phương pháp qui về 100% diện tích pic

 Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết của hoạt chất
 Yêu cầu
 Mọi cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích đều phải được rửa giải, phát
hiện và tách hoàn toàn
 Sự đáp ứng của đầu dò trên các cấu tử là như nhau

Ax 100 - % X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z

%X  - Ax, Ay, Az: diện tích pic của cấu tử X, Y, Z
Ax  Ay  Az

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN

Định lượng dược liệu và HCTN – Không có chất chuẩn

 Áp dụng phương pháp qui về 100% diện tích (xác định độ tinh khiết sắc ký)
 Yêu cầu: tất cả các chất trong mẫu thử đều phải được tách và phát hiện
 Giả định: mỗi chất trong hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho 1 pic duy nhất
 Khối lượng của chất trong mỗi pic được tìm thấy
[S1/(S1 + S2 + … + Sn)] x M
M: tổng khối lượng chất tan trong mẫu tiêm
 Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần
 Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các HCTN có độ tinh khiết cao
 Pic dung môi và pic chính tương ứng với chất phân tích
 Tỷ lệ % của diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối của chất
 Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN

Xác định độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết ginsenosid-Rg1 trước và sau khi tinh chế
Cột Supelcosil LC-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); Pha động: MeOH – H2O (60:40);
F = 0,9 ml/phút; Đầu dò PDA: 203 nm

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi lên độ phân giải

30% 40% 50%

MeOH MeOH MeOH

70% MeOH
60% MeOH

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Ảnh hưởng của dung môi lên độ phân giải

50% MeOH 32% THF 25% THF

50% H2O 68% H2O 17% MeOH
58% H2O

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Ảnh hưởng của pha tĩnh lên độ phân giải

Cột C18 Cột phenyl

Cột cyano

A. cortison; B. dexamethason; C. corticosteron; D. orthonitrophenol;

E. flourobenzen. Bước sóng phát hiện: 254 nm

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

ÖÙng duïng cuûa saéc kyù

 Phương pháp nội chuẩn  Phương pháp chuẩn hóa

diện tích pic
Thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ Các dẫn chất nitro benzen

1. Methyl parathion
2. Ciodrin
3. Parathion
4. Dyfonat
5. Diazinon
6. EPN
7. Ronnel
8. Trithion (nội chuẩn)

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM