CROMATOGRAFIA LÍQUIDA D’ALTA RESOLUCIÓ (HPLC) (I): SIMULACIÓ

DE SEPARACIONS A L’ORDINADOR

1 **ACCÉS AL SIMULADOR online

- Obriu el navegador d’internet i entreu al web:

http://www.hplcsimulator.org/simulator.php

- “Cliqueu” a Launch HPLC Simulator

- Accepteu els missatges que surtin per pantalla fins que aparegui el simulador
excepte actualitzar JAVA.
- En el cas que JAVA bloquegi l’aplicació: Inicio->Tots els programes->Java-
>Configurar Java->Pestanya Security->Exception Site List: afegir
http://jogamp.org

2 **DESCRIPCIÓ DE LES CARACTERÍSTIQUES DEL SIMULADOR

La finestra del simulador té 3 seccions:

A: controls del cromatògraf, B: cromatograma, i C: mostra analitzada

A: controls del cromatògraf

Composició fase Opcions gràfiques Característiques del Propietats generals Característiques de

mòbil cromatògraf la columna
 Composició fase
mòbil

Dissolvent A: aigua
Dissolvent B: acetonitril o metanol
Mode elució: isocràtic o gradient
% v/v dissolvent B: 0-100%
Mode elució: isocràtic o gradient
Fraccions de temps i % B.
Volum de pre-columna amb i sense mescla.
Volum d’espera (Total dwell volume): (non-mixing volume + mixing volume)
Temps d’espera (Dwell time): (non-mixing volume + mixing volume) / flow rate

Característiques del
cromatògraf

Temperatura columna HPLC (ºC)

Volum injecció (μL)
Cabal (mL/min)
Velocitat lineal del cabal (cm/s)
HETP: Alçada equivalent plat teòric (cm)
Número de plats
Pressió de columna

Propietats generals
Viscositat de la fase mòbil (cP)
Coeficient de difusió mitjà (cm2/seg)
Time constant: ajusta la freqüència de mostreig del detector
Signal offset: ajusta la línia base del cromatograma
Noise: ajusta la desviació estàndard del soroll del detector
Initial/final time: rang cromatograma
Data points: número de punts del cromatograma

Característiques de
la columna

Una única opció de columna C18

Longitud i diàmetre columna en mm
Mida de partícula del rebliment de columna en micres
Void fraction: en tant per u: fracció de volum dins la columna que no és ocupada per
les partícules i si per la fase mòbil.
Void volume/time: volum que ocupa la fase mòbil dins la columna i temps que triga en
eluir una fracció de solvent per la columna
Termes A B C reduïts de Van Deemter: h = A + B/v + Cv, on h: alçada reduïda de plat
teòric, v: velocitat lineal reduïda de fase mòbil.

B: cromatograma
En una escala 2D es representa la senyal mesurada pel detector respecte el temps
d’anàlisi. A mesura que modifiqueu els paràmetres A, el cromatograma s’actualitzarà
automàticament amb el resultat de la simulació.
C: mostra analitzada
Components de la mostra

Concentració analit (micromolar, μM)

k’: factor de retenció
tR: temps de retenció (s)
total: amplada de pic (s)
W: quantitat d’analit injectada (micro molar, μM)
3 **DESENVOLUPAMENT DE LA SIMULACIÓ

Els objectius d’aquesta simulació d’un cromatògraf HPLC són:

a. Entendre totes les parts d’un cromatògraf HPLC així com les diferents configuracions
que es poden modular.
b. Descriure totes les possibles relacions de causa-efecte que es poden donar entre les
configuracions de l’HPLC i un anàlisi cromatogràfic.
c. Esbrinar una configuració de l’HPLC que permeti una correcta separació
cromatogràfica d’una mostra problema.

El programa simula dues columnes comercials de les cases Agilent i Waters. Cada columna ve
acompanyada amb un problema (barreja de productes) diferent. L'objectiu final és el c. En
classe i amb l'ajuda del professor es resoldrà un dels problemes i el treball consistirà a resoldre
l'altre.

El simulador ho suporta tot, cosa que no passaria al laboratori en realitat. Es poden fer moltes
combinacions, però ha de quedar clar el que serien les condicions estàndard (i.e. comercials
actualment):
. Mida particulars: 1.8, 3 i 5 µm
. Longitud de columna: 5,10,15, 20, 25 cm
. Pressió màxima de columna: 300 bars
. Temperatura: 20-50 ºC

El límit més important ve donat per la pressió màxima que pot suportar cada columna. Poden
assajar-se valors que produeixin una pressió superior però la solució final ha d'estar per sota
d'aquest límit.

En anar variant els diferents paràmetres és important detectar el que està passant, però més
important és entendre per què passa.

La vista (gràfica del cromatograma) pot ser enganyosa. Cal fixar-se en les unitats dels eixos per
a una correcta interpretació.

Per poder considerar que dos pics cromatogràfics estan ben separats (ben resolts) la resolució
(Rs) ha de ser superior a 1.5. L'objectiu ideal seria que la resolució entre pics adjacents fos
com a mínim de 2; que no hi hagués temps llargs en què no es elueixi cap compost; i que la
durada total del cromatograma fos la menor possible.

𝒕𝒓𝟐 − 𝒕𝒓𝟏
𝑹𝒔 =
𝟏/𝟐(𝒘𝟐 + 𝒘𝟏 )

Tr: temps de retenció

W:amplada pic a la base. Assumint pics gaussians se iguala a 4σ
Exercici 1:

L'objectiu d'aquest exercici és avaluar l'efecte de canvis en els paràmetres

cromatogràfics sobre el temps d'elució i la resolució del cromatograma. Per a això es
seleccionarà la columna Agilent i una mida de partícula de 5 µm. Per defecte
apareixen seleccionats 5 compostos que s'han de separar correctament. Aquest
exercici es farà a l'aula informàtica amb l'ajuda del professor.

a) Elució isocràtica

La temperatura de columna es fixarà inicialment a 25 ºC i el cabal a 1.5 mL/min

. Es seleccionarà inicialment metanol com a dissolvent B.

Es variarà progressivament la composició de la fase mòbil (des de 0% B, fins a 100%
B) i s'anotaran els canvis observats. Es repetirà el procés usant acetonitril. ¿Que
diferència hi ha entre tots dos dissolvents? ¿a quina proporció de dissolvent orgànic
s’obté la millor separació?

. Escollint el dissolvent que sembli millor, s'estudiarà primer l'efecte del canvi de
mida de la partícula de la fase estacionària i després el del canvi de temperatura.

. Quin es l’efecte de variar la temperatura? ¿Que passa al variar el cabal?

L'objectiu és separar tots els components amb una correcta resolució (Rs > 1.5) i en el
menor temps possible ¿S'ha aconseguit?

b) Gradient d’elució

Si es considera que es pot millorar, fixar temperatura a 25ºC i la mida de partícula que
es consideri millor, i procedir a una elució per gradient, primer utilitzant metanol com a
dissolvent B i posteriorment acetonitril. Establir el que es consideri com a condicions
òptimes d'elució.

Exercici 2:

Repetir l'exercici 1, utilitzant la columna Waters i els 9 compostos que

apareixen per defecte. Aquest exercici es farà sense ajuda del professor

L'informe consistirà en una descripció detallada dels fets observats en l'exercici

1, raonant les respostes (pot ser necessari consultar bibliografia) i de forma
molt més breu l'exercici 2, mostrant les millors condicions de separació tant en
condicions isocràticas com de gradient de elució.

La longitud màxima del informe serà de 6 planes (excloent la portada),

espaiat1.5 i lletra (mida mínima) calibri o arial 11 .