Professional Documents
Culture Documents
Makalah Elektroforesis
Makalah Elektroforesis
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena
kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi
murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik
akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang
Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah
metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian
yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul
yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam
Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia
Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung
berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi
hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel
elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
1
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada
1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang
berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda
elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di
sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.
B. Tujuan
2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk
pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam
amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.
keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,
2010)
medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya
buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit
dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik
diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung
molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai
bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan
mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.
sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik diterapkan.
3
Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)
Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan
yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis
pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi
karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit
hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran.
pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang lebih
kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran
yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al,
2010)
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik ini
Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase
tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai
4
atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukan mobilitas
elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat
spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara
boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum
proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan
memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal
pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan
kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu
medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan
temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap
kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin,
penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat
dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal
dan interferensi anomali paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah
terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar,
2008).
bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub
positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub
negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
5
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya
serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan
memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996 ektroforesis adalah suatu cara analisis
medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium
penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya
muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika
kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi
mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh
6
Ute U ,V
d= qk = L (persamaan 2.1)
Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang ditempuh (Kopkar,
2008).
elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas Manz,
et.al, 2010)
a. Mobilitas elektroforesis
diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik diterapkan.
Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode negative
(katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda negative (anoda).
Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul menengah. gaya ini
berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi elektroforesis, Vep serta
7
Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan gaya
listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan konstan, Vep
(persamaan 2.5).
Fef = Ffr (persamaan 2.4)
Vep = q.E (persamaan 2.5)
6. ἠ.π.r
Mobilitas elektroforesisμep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan migrasi Vep
atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering digunakan daripada VEP
elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti yang disebutkan
sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas dasar rasio q / r, ketika
mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam medan listrik. perubahan pH
penyangga mengubah muatan suatu analit dan dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas
Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti kaca, menyatu
silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan yang paling bioanalitik, pH
buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-
SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler
menjadi negatif . Ini menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi
8
Dalam penerapan medanlistrikkationdilapisandifusbergerak menujukatodadan
dalamelektroforesisgelphenomenonofEOFjugadisebut sebagaielectroendoosmosis.
denganviskositasbufferpemisahan.
ε . ᶊ. E
VEOF = ( persamaan 2.7)
4.π .ἠ
μ EOF = VEOF / E (persamaan 2.8)
tekananalirandidorongdigunakan dalamChromatografycair.di
Kontrol EOF
Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh: 1). beroperasi pada pH rendah, 2).
permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya dengan
9
lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas, dan potensial zeta.
1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan ata pH cukup rendah untuk
protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pH di mana banyak
mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan hidrofilik, diperoleh dengan
modifikasi kimia adalah bahwa stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah.
3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan polimer seperti
polietilena glikol (PEG) ke buffer run. lapisan polimer kental terbentuk pada dinding
mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik seperti asetonitril
metahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau meningkatkan viskositas masing-
2010)
10
μapp = μep + μEOF (persamaan 2.9)
menentangarahμEOF.
nyatanya , μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8). kekuatan medan, E,
adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L. Karena itu v, dapat dijelaskan
sebagai:
L2
μapp . V
Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat velocitynya dan
lebih cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran pita utamanya disebabkan
11
ileh difusi longitudinal. Distribusi peak τ2
berbanding lurus dengan koefisien difusi, D dari
2 . D. L2
τ=2
2.D.t = (persamaan 2.12)
μapp. V
Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:
μapp . V
N = L2 / τ=
2
(persamaan 2.13)
2. D
Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan. Tegangan
yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat. Dalam teori jutaan
pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis membuat teknik ini unggul
dari LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam
prakteknya, bagaimanapun, plat nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis.
pelebaran pita disebabkan oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan
Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas
elektroforesis antara dua spesies, ∆μep (yaitu selektivitas pemisahan), tegangan pemisahan,V,
Rs = ∆μep . √ V .
√ 1
μ app
. 1
4 . √2 D
(persamaan 2.14)
12
Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah untuk
buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis. meningkatkan tegangan pemisahan,
juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi untuk molekul besar seperti ini memiliki
telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai
a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving
boundary)
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu
protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai
fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang.
- Elektroforesis Kertas
- Elektroforesis gel
13
Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan
mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat
terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium
yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan
komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas
atau konformasi.
2. Elektroforesis Kertas
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia
di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis.
Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA
terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang
menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis
tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa
hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu
dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki
kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di
atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi
tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur
molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
14
2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini
terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel
dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat
terlarut.
Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer.
Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari
suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua
ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan
komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.
15
Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar, 2008)
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
16
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna
"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah
proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita
yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul
yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang
biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
17
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan
untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka
tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium
listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-
sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
18
a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui
b. DNA Fingerprinting
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
tertentu.
plasmid
tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi seperti
19
DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat
dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,
hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak bermigrasi
melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis gel adalah agak lambat
dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium
sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk sixe rasio.
Gel Media
digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu : mudah atau
20
cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya
menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan
dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik
elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai
adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun
menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel
dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah
model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan
sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
21
Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang dapat
diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer
yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis.
pada pendinginan gelasi terjadi. pori-pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm
konsentrasi 1% (10 mg mL-1) sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1).
pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam
linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat
pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C%
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia
2. Konsentrasi gel.
melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati
gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.
4. Densitas muatan
22
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul
dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume
molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,
sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi
adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik
bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan
kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju
elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju
anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
23
Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas
atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa
campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah
satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub
negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau
batang karbon dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen
ketika arus listrik searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak
bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak
Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain
kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat dari noda-noda
tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak
dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk
melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan
dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan
untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih
komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan
24
konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada
elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan
bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju
anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion
menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan
dalam gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam
Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber:
Aliran elektroosmotik.
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas
atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai
pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam
air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika
dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-
kation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan
25
kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler
tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke
katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam
aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik
yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation)
bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran
elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling
kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau
molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat
dianalogikan sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan
26
sebagai ikan yang sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan
sebagai ikan yang sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai
ikan mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh
V= μ ef E+ μ eo E (persamaan 2.15)
2006).
kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu
peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
27
( μef + μeo)E
N= 2D (persamaan 2.16)
tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D,
2006).
koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien
pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis
sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D
besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N)
dalam elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil
koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan
semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya
pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan
harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang
konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang
C. Instrumentasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel
28
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan
dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke
bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel
vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan
panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat
dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam
tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang
dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya
digunakan.
kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper
reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan
sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam
29
Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue
memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir
panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan
waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada
30
Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c.
maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel
yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa
berkisar dari L ke Ml
dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan
adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi
pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh
jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1.
pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip
dengan protografhy
31
Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran
protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen
anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan
protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing
ᵝ
seperti mercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan
tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino
protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan
pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose
Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian
yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan
terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau
asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil
dalam operasi.
32
Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari
beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar
Pipa Kapiler.
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 μ m dan
panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata
mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan
33
Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis
kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada
gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak
efisien.
34
Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut
tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan
arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena sutu molekul dapat bermuatan
positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat
menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan
Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam
elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt
seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan
listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler
35
dilakukan mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa
kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat
dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masing-
∆ pπ 4 tC
Q= 8 ηL (persamaan 2.17)
μef + μeo
Q= ¿ (persamaan 2.18)
¿
¿
Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa
kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah
konsentrasi cuplikan, η adalah visikositas, μ ef dan , μ eo, kuata rus, dan L adalah
panjangh pipa kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan
gaya kapilaritas cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan
di antara kedua ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali
ke dalam larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa
saat ketika salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah
cuplikan akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi
36
Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl
leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu
kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat
diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah
(seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan
37
amperometri). Detektor UV diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini
memungkinkan pendeteksian aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak
perlu mengganggu aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15
dapat digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector
maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh
38
Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
D. Aplikasi Elektroforesis
Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada
gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualisasi asam nukleat.
Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel.
Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder.
Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan
39
Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic
Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada
molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC
40
Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada
pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate.
Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak
0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan
jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi
1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang
memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki
keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama,
dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat
arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan
tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan
noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
41
tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis
42
BAB III
KESIMPULAN
untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat,
oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif
(anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative
(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
4. Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel poliakrilamida
5. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :di
bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap
43
DAFTAR PUSTAKA
Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial College Press,
London
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi +
175 hlm.
Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin heidelberg: 278 pp.
Hlm.
S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.
file:///D:/Kelebihan%20Dan%20Kekurangan%20Elektroforesis.htm. Sumber:Dr.Endang
Saepuddin dan Dra. Siswati Setiasih Msi.Apt. 2009.Handout Kuliah Bioteknologi, Diaccess
pada tanggal 15 Mei 2013.
44