Contents

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................................................... 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN. ................................................................................................... 2
1.2. OXYTOCIN................................................................................................................................. 5
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin. [5] ................................................................................... 5
1.2.2. Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6]. .............................................................................. 6
1.2.3. Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người. ........................................................................... 6
1.2.4. Tác dụng dược lý của oxytocin. ......................................................................................... 7
1.3. PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN. ...................................................................................... 8
1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin ............. 8
1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin ................................................................. 9
1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại. .................................................................................................. 10
1.3.4. Bột khô công thức .................................................................................................................... 10
1.3.5. Các phương pháp liên hợp với Oxytocin. ....................................................................... 10
1.4. PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA. ............................................................................................. 11
1.4.1. Polyethylen glycol..................................................................................................................... 11
1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng. ....................................................... 12
1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin. .................................................................................................................. 15
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN. ............................ 19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM .................................................................... 21
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ ....................................................................................................... 21
2.1.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................................................... 21
2.1.2. Dụng cụ máy móc ..................................................................................................................... 21
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................................................. 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ....................................................................................................... 22
2.3.1. Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin................................................................................ 22
2.3.2. Xác định sự có mặt của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di . .. 24
2.3.3. Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ bộ đánh giá hiệu quả hình thành và tinh chế hợp
chất liên hợp Oxytocin-PEG ............................................................................................................... 25
2.3.4. Phương pháp định lượng Oxytocin và hợp chất liên hợp. ........................................................ 26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................................................... 28
3.1. LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH HỢP CHẤT LIÊN HỢP 28
3.1.1. Tổng hợp Oxytocin-PEG .......................................................................................................... 28
3.1.2. Kết quả điện di .......................................................................................................................... 29
3.1.3. Xây dựng phương trình tương quan giữa logarit khối lượng phân tử protein và thể tích rửa giải
(Ve) trong sắc ký lọc gel ..................................................................................................................... 30
3.1.4. Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp trong phản ứng Pegyl hóa bằng sắc ký lọc gel
............................................................................................................................................................ 33
3.1.5. Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở hai pH sau sắc ký lọc gel ...... 35
3.2. Đánh giá ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG
trong dung dịch sau sắc ký lọc gel........................................................................................................... 36
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................................................................... 39
4.1.Về điều kiện của phản ứng Pegyl hóa Oxytocin ........................................................................... 39
4.2. Xác định khối lượng của các protein sau phản ứng liên hợp........................................................... 39
4.3. Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel .............................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 42
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................................... 43
 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Oxytocin là một hormone nonapeptide cyclic (Cys-Tyr-Ile-GLN-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-

NH 2 ) tiết ra từ thùy sau tuyến yên gây co thắt tử cung. Ngày nay, người ta đã tổng hợp được nó
để làm thuốc phổ biến được sử dụng trong sản khoa. Trên lâm sàng, oxytocin là thuốc lựa chọn
đầu tiên để được chỉ định để khởi phát chuyển dạ và ngăn ngừa xuất huyết tử cung .Tuy nhiên,
Oxytocin không bền đối với các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình từ sinh tổng hợp đến sử dụng
làm giảm tác dụng điều trị của thuốc. Oxytocin dễ bị tiêu hủy bởi enzym trong đường tiêu hóa,
do đó phải được bào chế dưới dạng thuốc tiêm hoặc dạng xịt mũi. Một vấn đề lớn trong sử dụng
các chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin kém ổn định trong bảo quản. Đặc biệt phổ biến ở các
nước đang phát triển, ví dụ ở Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latinh, nơi khí hậu nhiệt đới thường có
nhiệt độ ban ngày vượt quá 40 ° C nhiệt độ cao, Oxytocin mất hoạt tính sinh học. Do lợi ích
trong việc giảm tử vong mẹ liên quan đến băng huyết sau sinh, nhiều nhà khoa học trên thế giới
đã nỗ lực để phát triển ổn định công thức oxytocin.

Để khắc phục nhược điểm trên , các nhà khoa học đã tìm ra các giải pháp cho vấn đề bảo vệ cấu
trúc oxytocin. Một trong số đó là kỹ thuật pegyl hóa: gắn polyethylen glycol (PEG) vào phân tử
protein. Pegyl hóa mang lại nhiều ưu điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cường
tác dụng điều trị, giảm tính sinh miễn dịch của thuốc protein đối với cơ thể. Hiện nay, kỹ thuật
pegyl hóa thật sự đã chứng minh được tính ưu việt của nó, thể hiện ở số lượng chế phẩm protein
dược dụng được gắn PEG đang không ngừng tăng trên thị trường dược phẩm.

Nhằm mục đích bào chế dạng đường uống và tăng cường độ bền phân tử trong quá trình bào chế
đền bảo quản, đồng thời triển khai được kỹ thuật Pegyl hóa vào việc cải biến một số protein dược
dụng ở Việt Nam , chúng tôi tiến hành đề tài “ Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức
hợp Oxytocin-PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh” với các mục tiêu sau:

1. Gắn kết được Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phực hợp Oxytocin-PEG.

2. Xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG.

 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.TỔNG QUAN VỀ PROTEIN.
 Khái niệm
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít
amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi
polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu
trúc không gian khác nhau của protein.(1) (2)(3).
 Các bậc cấu trúc của protein
Người ta phân biệt ra 4 bậc cấu trúc của protein.1,2,3
 3

Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các axit
amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự
các axit amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide,
từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của
protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc
và tính chất của protein.1,2,3
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi
polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp
β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như
keratin, Collagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu
có nhiều nếp gấp β hơn.1,2.
Cấu trúc bậc ba: là cấu dạng 3 chiều của toàn bộ chuỗi polypeptid. Chỉ mối tương tác
không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch polypeptid, và là dạng cuộn lại trong
không gian của toàn mạch polypeptid. Cấu trúc này được ổn định nhờ các tương tác yếu: lực Van
der Walls, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của các acid amin, đặc biệt là
tương tác kỵ nước của các nhóm acid amin không phân cực trong trung tâm protein. Mỗi protein
cầu có cấu trúc bậc III khác nhau tương ứng với chức năng sinh học riêng biểu hiện ở tỷ lệ phần
trăm cấu dạng α và β 1,2
Cấu trúc bậc bốn: là chỉ mối quan hệ không gian của nhiều chuỗi polypeptid kết hợp chặt
chẽ với nhau [1]. Mỗi chuỗi này gọi là một “tiểu đơn vị”. Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết
hydro, lực Van der Walls giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các chuỗi polypeptid [2]. Ví
dụ: hemoglobin… Phân tử protein cấu trúc bậc IV có thể phân ly thuận nghịch thành các tiểu
đơn vị. Khi phân ly hoạt tính sinh học có thể bị thay đổi.

 Phân loại protein theo chức năng sinh học.

Loại
Chức năng Ví dụ
protein
Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền của mô liên
Protein cấu kết, dây chẳng, gân. Keratin tạo nên cấu trúc chắc của da,
Cấu trúc, nâng đỡ
trúc lông, móng. Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững của
tơ nhện, vỏ kén
Xúc tác sinh học: Các Enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn,
Protein tăng nhanh, chọn lọc Enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín,
Enzyme các phản ứng sinh Enzyme Pepsin phân giải Protein, Enzyme Lipase phân giải
hóa Lipid
Hormone Insulin và Glucagon do tế bào đảo tụy thuộc tuyến
Protein Điều hòa các hoạt
tụy tiết ra có tác dụng điều hòa hàm lượng đường Glucose
Hormone động sinh lý
trong máu động vật có xương sống
 4

Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa trong hồng cầu động vật

Protein vận
Vận chuyển các chất có xương sống có vai trò vận chuyển Oxy từ phổi theo máu
chuyển
đi nuôi các tế bào
Tham gia vào chức
Protein vận Actinin, Myosin có vai trò vận động cơ. Tubulin có vai trò
năng vận động của
động vận động lông, roi của các sinh vật đơn bào
tế bào và cơ thể
Cảm nhận, đáp ứng
Protein thụ Thụ quan màng của tế bào thần kinh khác tiết ra (chất trung
các kích thích của
quan gian thần kinh) và truyền tín hiệu
môi trường
Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho
Protein dự Dự trữ chất dinh phôi phát triển. Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp Acid
trữ dưỡng Amin cho con. Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ
cần cho hạt nảy mầm

Bảng 1.1: Phân loại protein theo chức năng.

 Một số tính chất hóa lý của protein

- Sự biến tính của protein

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác
nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... gây phá hủy hoàn toàn cấu trúc không
gian (các liên kết bên trong phân tử trừ liên kết peptid) và làm giảm hay mất những tính chất ban
đầu của protein (tính chất lý hóa, độ tan và tính chất sinh học) .Đó là hiện tượng biến tính
protein. Ví dụ: Albumin trứng bị đông vón ở nhiệt độ cao và không thể hòa tan trở lại khi làm
lạnh [1].

Trong những điều kiện nhất định, protein bị biến tính có thể trở về trạng thái ban đầu tùy
theo mức độ. Hiện tượng đó được gọi là sự biến tính thuận nghịch [1].

- Tính lưỡng tính:

Trong phân tử protein chứa các gốc aa acid (Glu, Asp) mang điện âm và các gốc aa
kiềm (Lys, Arg, His) mang điện dương. Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của môi trường.
Ở một pH nào đó mà tổng điện tích âm và điện tích dương bằng không ,gọi là pI (điểm đẳng
điện) protein trung hòa về điện ,dễ dàng kết tụ vào nhau và không di chuyển trong điện trường.
Mỗi protein có một pI đặc trưng nên có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp bằng điện di
trong huyết thanh [2].
 5

- Tính chất hòa tan và kết tủa:

Protein có khả năng hòa tan trong dung dịch muối loãng.Protein dạng sợi tan trong
dung dịch muối đậm đặc.Albumin tan được cả trong nước. Khi hòa tan, protein tạo thành các
dung dịch keo do protein có lớp áo nước bao quanh và do protein mang điện tích cùng dấu nên
đẩy nhau. Khi làm mất 2 yếu tố hòa tan trên, protein sẽ tích tụ lại và gây tủa [4].

Một số phản ứng hóa học của protein.

1.2. OXYTOCIN
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin. [5]
Oxytocin là một peptid gồm 9 aminoacid (một nonapeptide ) trong chuỗi cysteine-
tyrosine-isoleucine-glutamine-asparagine-cysteine-proline-leucine-glycine-amit

, có một cầu nối disulfide nối các

phân tử cysteine có công thức phân tử C43H66N12O12S2, khối lượng phân tử là 1007,193
Da.

Hình 1.2.1. Công trúc không gian của oxytocin

Với cấu trúc của protein bậc I, phân tử Oxytocin có chứa các liên kết peptid của các acid
amin và một cầu nối disulfur trong phân tử. Giữa các phân tử còn liên kết với nhau bằng các liên
kết hydro hay liên kết ion. Cách sắp xếp của acid amin trong chuỗi polypeptid quyết định cấu
trúc không gian và tính chất sinh học của Oxytocin.

Một số vị trí trên cấu trúc Oxytocin dễ bị suy thoái là các acid amin Cys1, Gln4, Asn5 và
Gly9 dễ bị oxy hóa, thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và ánh sáng thông qua sự hình
thành các chất trung gian.Do các acid amin này có chứa N bậc một dễ tham gia phản ứng hóa
 6

học và thủy phân trong môi trường phân ly và điều kiện không phù hợp [1], [2]. Ngoài ra, liên
kết disulfid Cys1-Cys6 là vị trí hay gây ra sự suy thoái, đa số các quá trình suy thoái cấu trúc xảy
ra sau khi loại bỏ liên kết ở cacbon β ở Cys1, tạo ra enamin N và cysteine persulfid. Tạo điều
kiện cho sự hình thành trisulfid và tetrasulfid Oxytocin hoặc thúc đẩy sự hình thành dimer
Oxytocin và các sản phẩm khác [5].

Hình 1.2.1. Sự hình thành disulfid từ Oxytocin

1.2.2. Tính chất hóa lý của Oxytocin [5], [6].

- Oxytocin là bột vô định hình trắng hoặc gần như trắng.
- Dễ hút ẩm, rất dễ tan trong nước, acid acetic, butanol và ethanol.
- Khi nung nóng để phân huỷ, nó phát ra hơi độc của sulfur oxid và nitric oxid.
- Điểm đẳng điện của oxytocin là pI = 5,51.
- Để định tính và định lượng Oxytocin dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
với detector UV ở 280 nm.
- Thêm một số phản ứng màu của protein vào nhé
1.2.3. Sự tổng hợp Oxytocin trong cơ thể người.
Các oxytocin peptide được tổng hợp từ một protein tiền chất ‘precursor protein ’ không
hoạt động từ gen oxytocin [7] [8] [9] Protein tiền chất này cũng bao gồm các protein vận chuyển
oxytocin neurophysin I [10]. Protein tiền chất không hoạt động được thủy phân dần thành các
mảnh nhỏ hơn (một trong số đó là neurophysin I) thông qua một loạt các enzyme. Sự thủy phân
cuối cùng giải phóng oxytocin nonapeptide hoạt tính được xúc tác bởi peptidylglyxin alpha-
amidating monooxygenase[11]. Ở vùng dưới đồi, oxytocin được tạo thành trong các tế bào thần
kinh trung và được lưu trữ trong thân Herring tại các đầu cuối sợi trục ở tuyến yên sau. Sau đó
nó được đưa vào trong máu từ thùy sau của tuyến yên. Bên ngoài não, các tế bào chứa oxytocin
được tìm thấy trong một số mô bao gồm ở nữ giới trong thể vàng [12] [13] và nhau thai [14]; ở
nam giới trong tế bào kẽ hạch của Leydig [15]; và ở cả hai giới tính trong võng mạc, [16] tuyến
thượng thận, [17] tuyến ức (18) và tuyến tụy [19].
 7

1.2.4. Tác dụng dược lý của oxytocin.

- Trên cơ tử cung: làm tăng co bóp cơ trơn tử cung theo nhịp, tần số và cả biên độ co bóp
sinh lý. Tính cảm thụ của cơ trơn tử cung với Oxytocin tăng dần trong suốt thời kỳ có thai, phụ
thuộc nhiều vào sự có mặt của Estrogen [20]. Receptor của Oxytocin trên tử cung người đã được
xác định. Khi gắn với Oxytocin, các receptor sẽ hoạt hóa phospholipase C làm giải phóng Ca++
nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca++ nhạy cảm với điện thế, làm tăng nhập Ca++ vào tế bào.
Do đó, Oxytocin thể hiện tác dụng đôi là điều hòa sự co bóp của các tế bào cơ tử cung và kích
thích tế bào nội mạc, tế bào màng rụng sản xuất prostaglandin [21]. Khi oxytocin được sử dụng
với liều quá mức, kích thích quá mức tử cung, với các cơn co cứng hoặc kéo dài, có thể dẫn đến
vỡ tử cung, sẹo cổ tử cung và rò rỉ âm đạo, xuất huyết sau sanh, lưu lượng máu tử cung bị suy
giảm, thuyên tắc nước ối, và chấn thương bào thai bao gồm xuất huyết nội sọ,các rối loạn nhịp
tim khác, tổn thương thần kinh trung ương hoặc tổn thương não, và tử vong do ngạt.

Sự co lại của tử cung: Điều quan trọng đối với sự giãn nở cổ tử cung trước khi sinh, oxytocin gây
co thắt trong giai đoạn thứ hai và thứ ba của chuyển dạ . Việc phóng thích Oxytocin trong thời
gian cho con bú gây ra những cơn co thắt nhẹ nhưng thường đau trong vài tuần đầu của chu kỳ
sữa. Điều này cũng giúp phục hồi tử cung với tác dụng làm cầm máu sau đẻ [22].

- Ở những bà mẹ đang cho con bú sữa mẹ, oxytocin hoạt động ở tuyến vú, Oxytocin gây
co giật các tế bào niêm mạc bao quanh các tuyến dẫn sữa của vú. Điều này ép sữa từ các kênh
các xoang lớn hơn, và do đó tạo điều kiện cho việc đẩy sữa.Với sự chuyển tiếp từ vùng dưới đồi
qua thần kinh cột sống đến tuyến vú sẽ làm tăng bài xuất sữa khi trẻ sơ sinh bú. Sự kích thích
gây ra ở nơron tạo Oxytocin từ các đầu cuối sợi thần kinh thần kinh của tuyến yên [23].

- Do nó tương tự như vasopressin, nó có thể làm giảm bài tiết nước tiểu một chút. Ở một số
loài, oxytocin có thể kích thích bài tiết natri từ thận. Ở người, liều cao có thể dẫn đến nồng độ
natri thấp (hạ natri máu).

- Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng đến huyết áp. Ở
mức liều cao gây giãn mạch rõ ràng và tạm thời làm hạ huyết áp, tăng nhịp tim do phản xạ và
nóng mặt. Oxytocin và thụ thể của nó cũng được tìm thấy trong tim ở một số loài gặm nhấm, và
hormon này có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi của tim bằng cách thúc
 8

đẩy sự khác biệt về tế bào cơ tim [24], [25]. Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oxytocin hoặc thụ thể
của nó ở chuột nhắt không gây ra tình trạng thiếu máu tim[26].
- Chuẩn bị các nơ-ron bào thai sinh nở: Chuyển qua nhau thai, oxytocin ở người mẹ đến
não bào thai và kích hoạt chuyển đổi trong hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh GABA từ
kích thích đến ức chế trên nơ-ron vỏ não thai nhi. Điều này sẽ làm êm dịu não bộ của thai nhi
trong thời gian sinh và giảm khả năng bị tổn thương do hypoxic [27].

- Điều chỉnh hoạt động của tuyến thượng thận - tuyến yên - thận: Oxytocin gián tiếp ức
chế sự giải phóng hormon adrenocorticotropic và cortisol, trong những trường hợp đó có thể coi
nó là một chất đối kháng của vasopressin [28].

1.3. PHƯƠNG PHÁP TĂNG ĐỘ BỀN OXYTOCIN.

1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin: carbetocin và desamino-oxytocin
Các chất này đã được đánh giá liên quan đến việc duy trì hoạt động tử cung trong khi tăng
cường độ ổn định [29], [30]. Các nhà khoa học đã tìm ra hai chất phổ biến là desamino-oxytocin
và carbetocin. Cả hai đều có ái lực trên cùng mộ thụ thể với Oxytocin và gây ra cơn co thắt cùng
một cơ chế. Đặc biệt thời gian bán thải trong máu của hai chất này đều cao hơn nhiều so với
Oxytocin do sự thay đổi cấu trúc [31]. Desamino-oxytocin và carbetocin khác với Oxytocin là
trong cấu trúc thiếu nhóm amino tự do ở cuối. Phân tử carbetocin cũng thay thế một trong số các
sulfur tại cầu disulfide bằng nhóm CH2.

Hình : Cấu trúc của Desamino-oxytocin và Carbetocin

Cả hai chất tương tự oxytocin này đều có thời gian bán hủy kéo dài với sự duy trì một số hoạt
động co bóp tử cung cho thấy nhóm amino trong oxytocin không cần thiết cho hoạt động sinh
 9

học. Đối với carbetocin, tăng thời gian bán thải là 4- 10 lần so với oxytocin, nên chỉ dùng một
lần tiêm thay vì truyền kéo dài. Carbetocin được chấp thuận sử dụng cho y tế và thú y ở nhiều
quốc gia khác nhau [32].

1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfide trên oxytocin
Vì vị trí chính của sự thoái hoá trên peptide là ở liên kết disulfid nên các nghiên cứu đã tạo ra các
chất tương tự oxytocin khác nhau bằng cách được thay thế bằng một phần ở liên kết này với các
nguyên tử khác. Nhằm mục đích để tránh loại bỏ liên kết trong cacbon β ở Cys 1 và vì liên kết
disulfid Cys1-Cys6 không phải là một trong những vị trí liên quan trực tiếp đến thụ thể và tác
dụng sinh học của oxytocin [33].

Điều này đã được đánh giá vào những năm 1960 và 1970, để xác định hoạt tính có duy trì nếu
một trong hai hoặc cả hai thiol trong liên kết disulfide đã được thay đổi sang thành các nhóm
CH2 như trong carbetocin . Người ta thấy rằng tác dụng sinh học vẫn được quan sát, mặc dù nó
đã được ức chế vừa phải, do đã thay đổi kích cỡ vòng của peptide. Điều này cho thấy cầu nối
disulfide không phải là một điều kiện tiên quyết cho việc duy trì hoạt động sinh học [34], [35] .

Các nghiên cứu gần đây của Alewood và các đồng nghiệp đã tập trung vào việc thay thế
disulfide bằng các cầu thioether, selenylsulfide, diselenide và ditelluride, và sự tổng hợp của
nhiều chất tương tự oxytocin có chứa các liên kết disulfid đã thay đổi (hình 3.).

Hình 1.4. Các chất tương tự oxytocin liên kết vào cầu nối disulfide của oxytocin

Kết quả nghiên cứu tác dụng trên thụ thể và sự ổn định huyết tương của các chất tương tự
Oxytocin - với sự thay thế cầu nối disulfide của Alewood cho thấy sự giảm kích thước vòng ([-
 10

S]- OT) làm giảm đáng kể ái lực với thụ thể do đó làm giảm hoat động sinh học. Mặc dù việc
thay thế nguyên tử S trong cysteine với một nhóm CH2 ([CH2- S] -OT) vẫn duy trì ái lực và hoạt
tính. Việc thay thế cystein với selenocystein hoặc tellurocystein không có ảnh hưởng lớn đến
hoạt động chức năng, mặc dù giảm ái lực kết hợp 10 lần đã được quan sát khi thay thế cả hai
cystein. Đồng thời cho thấy sự ổn định trong hyết tương của con người ở nhiệt độ cao (550C)
[36], [37].

1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại.

Oxytocin là ổn định nhất ở pH hơi acid (pH ~ 4.5). Ở pH có tính axit cao (pH <3), peptide có thể
chịu sự thủy phân, trong khi ở pH trung tính thì Oxytocin sẽ dimer hóa hoặc trimer hóa dẫn đến
mất hoạt tính.

Nghiên cứu của Avanti đánh giá độ ổn định của oxytocin trong nước bằng cách sử dụng hệ đệm
để lưu trữ (citrate, axetat hoặc aspartate, pH 4,5) kết hợp với các ion kim loại hóa trị I (Na+, K+ )
hoặc các in kim loại hóa trị II (Ca2+, Mg2+ và Zn2+). Kết quả cho thấy rằng khi bảo quản dung
dịch có chứa Ca2+ (50 mM) và Zn2+ (2-50 mM) , sự ổn định được tăng lên từ 60 % đến 100 % ở
40C, tuy nhiệt ở nhiệt đô cao không cải thiện được. Sử dụng kim loại hóa trị II và dung dịch đệm
citrate, aspartat thì cải thiện đáng kể ở nhiệt độ cao (550C), với nồng độ ion kim loai là 2mM
[38]. Người ta chứng minh rẳng ở 700C, việc phân hủy liên kết disufid giảm từ 20% - 70 % trong
dung dịch chứa ion kim loại Zn và đệm aspartate. Các chứng minh trên cho thấy liên kết disulfid
Cys 1- Cys6 được bảo vệ ở dung dịch đệm chứa ion kim loại [39], [40], [41].

1.3.4. Bột khô công thức

Tạo ra các chế phẩm oxytocin dang bột khô với kích thước nano, bột siêu mịn để sử dụng qua
đường hô hấp hoặc đường truyền tĩnh mạch thông thường bằng phương pháp phun sấy, đông
khô, hoặc kỹ thuật tạo nano. Việc sử dụng qua đường hô hấp giúp cho việc hấp thu tốt hơn đồng
thời giải quyết sự kém bền trong dung dịch. Nghiên cứu của Mc Intosh xác định thành phần chế
phẩm gồm hỗn hợp glycine, leucine và manitol tạo ra các hạt kích thước từ 1 đến 5 µ𝑚. Công
thức đã chứng minh hiệu quả tương đương dạng bột khô so với peptid tự nhiên và không gây tác
dụng co bóp ở mô khí quản. Công thức này duy trì nhiệt độ thử nghiệm khá cao (500C) [42],[43].

1.3.5. Các phương pháp liên hợp với Oxytocin.

 11

Đây là phương pháp gắn Oxytocin với các đại phân tử, nhằm mục đích tăng độ bền của phân tử,
tác dụng của Oxytocin và giảm liều sử dụng oxytocin.

Cavallaro và cộng sự đã gắn kết Oxytocin vào N-succinnyl-oxytocin đã được chức năng hóa ở
amin N –cuối với α, β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamid-poly (ethylene glycol) 2000 (
PHEA-PEG2000) kết quả tổng hợp được PHEA- PEG2000-oxytocin-succinyl. Nghiên cứu thử
nghiệm thủy phân trên in vitro cho thấy hợp chất trên ổn định ở pH 7,4 và trong huyết tương.
Đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học trên ống nghiệm cho thấy ái lực kết hợp của oxytocin với
thụ thể cải thiện đáng kể [44].

Với hướng nghiên cứu sử dụng β-cyclodextrin, olihosaccharide cyclic liên hợp với oxytocin
bằng cách sử dụng cầu nố cacboxyl (kích hoạt bằng 1-hydrobenzotriazole và
dicyclohexylcarbodiimide). Kết quả cho thấy việc liên hợp có hiệu lực trên cơ tử cung tuy nhiên
tác dụng giảm so với oxytocin và có tác dụng phụ gây ra cơn hen. Do được sử dụng làm với các
chỉ định khác [45].

Một hướng khác của Hudnut và Cook sáng chế vào năm 2004 kết hợp Oxytocin ( một số chất
tương tự) vào vi nang poly ( lactic –co-glycolide) [46].

Như vậy, các phương pháp làm tăng độ bền vững và tác dụng của Oxytocin đang được quan
tâm nhiều và đạt được một số thành tựu nhất định ,tuy nhiên còn gặp một số nhược điểm nên
chưa được ứng dụng trong điều trị lâm sàng.

1.4. PHƯƠNG PHÁP PEGYL HÓA.

1.4.1. Polyethylen glycol.

Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

Hình : Công thức cấu tạo của polyethylene glycol.

Bản chất là các chuỗi ehtylen glycol, có thể chất từ lỏng đến chất rắn như sáp, nhờn như dầu.
Với trọng lượng phân tử thường từ 500 đến 20.000 Da. PEG có đặc điểm là polymer trơ, hòa tan
trong nước, không gây độc, không gây dáp ứng miễn dịch khi vào cơ thể [47], [48]. Với những
 12

đặc tính quan trong này, PEG là chất lý tưởng để sử dụng trong y học và công nghệ dược phẩm
với nhiều ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng đơn thuần PEG trong cơ thể thì
những tính chất không được ứng dụng. Chỉ khi PEG được kết hợp với chất khác thì hiệu quả mới
được bộc lộ.

1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng.
Năm 1977, Frank Davies, Abraham Abuchowsky và các đồng nghiệp nghiên cứu sự kết hợp
PEG với albumin huyết thanh, catalase thành công đã mở ra cho khoa học thế giới một kỷ thuật
mới để bảo vệ cấu trúc protein [49]. Từ đó công nghệ Pegyl hóa được thiết lập và phát triển.

Pegyl hóa là quá trình gắn các phân tử PEG với các phân tử khác như các peptid, protein và
những đoạn kháng thể để cải thiện đặc tính và hiệu quả điều trị của thuốc [50]. Bản chất của quá
trình pegyl hóa là tạo liên kết đồng hóa trị của phân tử PEG với phân tử tham gia liên kết [ 51].

 Nguyên lý của phương pháp Pegyl hóa protein dược dụng

Quá trình pegyl hóa được quyết định bởi trung tâm ái điện tử của dẫn chất PEG. Để gắn kết PEG
với 1 phân tử, cần thiết phải hoạt hóa PEG bằng cách tạo ra các dẫn chất có một nhóm chức năng
ở một hoặc cả 2 đầu của phân tử PEG. Việc chọn nhóm chức năng dựa trên loại nhóm có khả
năng phản ứng sẵn có trên phân tử sẽ Pegyl hóa. Đối với Pegyl hóa protein, các acid amin
thường có khả năng phản ứng gồm: lysin, cystein, histidin, arginin, acid aspetic, acid glutamic,
serin, thronin, tyrosin, các vị trí protein dễ tham gia phản ứng là đầu N-tận (α-NH2) và đầu C-tận
(-COOH), nhóm thiol (gốc Cys) và nhóm hydroxyl [52].
 13

Tuy nhiên, cách thức phổ biến nhất tạo liên kết PEG-protein là hoạt hóa PEG với nhóm
chức năng thích hợp cho phản ứng với lysin (-NH2) và đầu N-tận (α-NH2) [52], [53]. Trong
trường hợp này, PEG có thể được hoạt hóa bằng nhiều con đường biến đổi hóa học khác nhau
như hình 1.6 [54].

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của những dẫn chất PEG hoạt hóa dùng cho phản ứng Pegyl hóa vào
nhóm amin

(a) là PEG-dichlorotriazin, (b) PEG-tresylat, (c)PEG-aldehyd, (d) PEG-succinimidyl succinat, (e)

PEG-imidazol carbonat, (f) PEG-phenyl carbonat, (g) PEG-succinimidyl carbonat, (h) PEG-
benzotriazol carbonat và (i) PEG hoạt hóa kiểu ester.

Dẫn chất PEG hoạt hóa phản ứng với protein trong những điều kiện xác định để tạo ra
liên kết protein-PEG. Nguyên lý tổng quát của phản ứng này như sau:
 14

R1
PEG R3 R2 R1
PH C HC NH2 P H3C CH NH R3 PEG
O

Trong đó: R1 là nhóm thế, R2 là nhóm chức tham gia liên kết, R3 là liên kết.

 Ưu nhược điểm của protein được Pegyl hóa (protein-PEG)

Trong Pegyl hóa protein dược dụng, những đặc tính đặc biệt của PEG làm thay đổi một số đặc
điểm của phân tử protein như: sự thay đổi về hình thể, tính tan, sự đáp ứng miễn dịch, có thể gây
ảnh hưởng tới ái lực liên kết của thuốc với các receptor tế bào, có thể thay đổi sự hấp thu, phân
bố thuốc trong cơ thể [54]. Điều này tạo nên những ưu điểm của protein-PEG như sau:

- Các nhóm hydroxyl của PEG kéo các phân tử nước của môi trường vào hợp chất, làm tăng
quá trình solvat hóa của protein. Mặt khác, PEG còn có phần hữu cơ nên làm tăng khả năng hòa
tan của protein trong nhiều dung môi phân cực và không phân cực. Như vậy, Pegyl hóa làm tăng
độ hòa tan và tính linh động của protein trong máu và các dịch sinh lý. Do đó hiệu quả điều trị
của thuốc protein-PEG cao hơn so với sử dụng protein tự nhiên với hàm lượng tương tự [54].

- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó đi qua mao quản
thận hơn. Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thể
lâu hơn [54], [55].

- PEG như các “cánh tay” xung quanh phân tử protein, tạo khoảng không giữa protein với
môi trường. Do đó, protein được bảo vệ tránh khỏi hiện tượng tiêu hủy do các tác nhân hóa lý
(nhiệt độ, pH…), các enzyme tiêu hóa protein, các đại thực bào và các kháng thể. Đồng thời,
tránh được sự nhận diện của hệ thống miễn dịch, do đó giảm tính sinh miễn dịch cảu protein
[55].

- Trong môi trường lỏng, một tiểu đơn vị ethylen oxid kết hợp khá bền vững với 2-3 phân tử
nước, như vậy chuỗi polymer sẽ di động và chính sự di động này làm phân tử PEG có thể tích
quét (chiếm chỗ) lớn. Thể tích quét làm cho protein Pegyl hóa tác dụng gấp 5-10 lần một protein
hòa tan có trọng lượng phân tử tương tự. Sự gia tăng thể tích này làm tăng cường tác dụng dược
động học và dược lực học của protein-PEG . Hợp chất PEG-thuốc làm giảm độc tính của thuốc,
 15

giảm khả năng gây dị ứng với cơ thể, tác dụng phụ của thuốc thấp hơn. Đặc tính của thuốc được
cải thiện, hiệu quả điều trị nâng cao [54], [55].

- PEG làm tăng kích thước phân tử protein, giúp phân tử protein-PEG khó lọt qua mao quản
thận hơn. Do vậy việc thải trừ thuốc khỏi thận bị giảm xuống, hợp chất được giữ lại trong cơ thể
lâu hơn [54].

Những ưu điểm kể trên của thuốc được Pegyl hóa làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc, làm
giảm liều dùng, tăng khoảng liều đưa thuốc vào cơ thể thuận lợi cho bệnh nhân trong quá trình
điều trị.

Hợp chất protein-PEG cũng có những nhược điểm. PEG bảo vệ cấu trúc protein, và trong
một số trường hợp nó “che kín” cả trung tâm hoạt động và vị trí kết hợp với receptor, ngăn cản
thuốc liên kết với receptor. Điều này làm giảm hoặc thậm chí mất tác dụng của thuốc. Khắc phục
nhược điểm này bằng việc điều chỉnh thay đổi vị trí Pegyl hóa ra xa phần hoạt động của protein
[54].

1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin.

 Pegyl hóa vào đầu N-tận trong phân tử Oxytocin.
- Sử dụng dẫn chất do alkyl hóa mPEG

Dẫn chất aldehyd của PEG là dẫn chất hay sử dụng

Sự ngưng tụ của aldehyd với N-tận của protein , ban đầu thông qua sự hình thành các sản phẩm
của imin (Schiff base). Các bazơ Schiff có khả năng đảo ngược dễ dàng thành các amin bậc hai
ổn định trong dung dịch có một tác nhân khử như natri borohydrid (NaBH4) hoặc natri
cyanoborohydrid (NaCNBH3), quá trình này được gọi là amination khử. NaCNBH3 thường được
sử dụng hơn do làm phản ứng xảy ra nhanh hơn và có chọn lọc làm giảm hợp chất trung gian
Schiff và không làm giảm aldehyd hoặc cacbonyl ít phản ứng khác có trong dung dịch [56], [57].

Hình 1.8. Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff
 16

pH là yếu tố rất quan trọng trong quá trình tổng hợp, trong đó tác nhân khử imin thành
amin (NaCNBH3) tốt nhất ở pH 6,5-8,5. Mặc dù điều chỉnh pH đến điều kiện acid nhẹ (pH 4,5)
là điều kiện phản ứng thích hợp của aldehyd và amin, cho phép sự kết hợp chọn lọc của amin đầu
và cuối[58], [59].

Ngoài ra, có thể dử dụng dẫn chất PEG- tresylated, và dẫn chất PEG –epoxyd thực hiện
pegyl hóa ở nhóm amino [60].

- Sử dụng dẫn chất do acyl hóa mPEG

Dẫn chất este của N- hydroxy succinid với các mPEG carboxylic acid (PEG-NHS)- đây là dẫn
chất tiêu biểu để pegyl hóa bằng cách este hóa gốc amin của Oxytocin. Các thuốc thử NHS este
phản ứng với các nucleophil (như amin nucleic), với việc giải phóng N-hydroxy succinimid dẫn
đến liên kết amid ổn định với peptid hoặc protein [61].

Hình 1.7. Phản ứng của NHS ester và một peptid

Phản ứng được tiến hành dưới điều kiện kiềm nhẹ chẳng hạn đệm bicarbonat pH từ 8,5 đến 9,5
và ở nhiệt độ thấp (4-250C) trong thời gian ngắn 1h.

Tuy nhiên, chất phản ứng NHS bị thủy phân nhanh trong nước dẫn đến khó khăn trong
hình thành nhóm succinimidyl ester, với thời gian bán thải giảm đáng kể khi gia tăng pH. Bằng
cách thêm một nhóm sulfonat, phản ứng xảy ra chậm, làm tăng khả năng hòa tan trong nước,
cho phép phản ứng ghép được thực hiện trong điều kiện nước tạo Sulfonat NHS este. Cũng có
báo cáo rằng thuốc thử succinimidyl có thể không phản ứng chọn lọc với các amin, đặc biệt phản
ứng với các amin acid như tyrosin, histidin và serin [62], [63], [64].

- Sử dụng dẫn chất acid carboxylic của PEG.

Sự liên kết của các nhóm carboxylat với các amin để tạo thành các liên kết amid. Sử dụng
các hợp chất carbodiimid như 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid.HCl (EDC) hoặc
 17

dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kích hoạt các nhóm carboxyl để thay thế bằng các amin phản
ứng . Phản ứng xảy ra trong pH acid làm giảm độ bền của protein nên hiệu suất thấp cũng như
ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm sau phản ứng tổng hợp [65].

Hình 1.9. Liên hợp với các nhóm Cacboxylic

 Pegyl hóa vào cầu nối disulfid của Oxytocin

Việc tác động vào cầu nối disulfid không phải lúc nào cũng thuận lợi để tăng lực liên kết
disulfid trong protein hoặc peptid, vì nó là yếu tố quan trọng để duy trì cấu trúc của protein hoặc
tác dụng sinh học. Gần đây đã có một số phương pháp liên hợp được báo cáo cho phép bảo tồn
được cầu nối disulfid với 2 hoặc 3 cầu disulfid cacbon và ít gây ra những thay đổi trong cấu trúc
của protein và peptid [66], [67].

- Sử dụng dibromo hoặc dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid

Dibromomaleimid là chất để tạo phức hợp với Oxytocin tại cầu nối disulfid, bằng cách
chèn thêm một cầu nối vào disulfid [68]. Phức hợp này trong các điều kiện thử nghiệm invitro
giải phóng ra và bảo tồn cấu trúc Oxytocin. Mặt khác, phức hợp này làm tăng độ bền của phân tử
Oxytocin. Sử dụng Dibromomaleimid để Pegyl hóa là một chất phản ứng thuận lợi nhưng khó
khăn trong giải phóng disulfid từ phức hợp PEG với của protein [69]. Phản ứng được tiến hành ở
pH 7,5-8,5 . Khi ở pH cao hơn ,bên cạnh phản ứng ở cầu nối disulfid còn xảy ra ở các amin.

Hình 1.10. Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid
 18

Phương pháp tạo cầu nối disulfid của Oxytocin được mở rộng khi tạo phức với hợp chất
dithiomaleimid, phản ứng xảy ra tương tự với quá trình tạo phức hợp của dibromomaleimid với
Oxytocin [70], [71].

- Phức hợp disulfid với các hợp chất asen

Phương pháp được phát triển gần đây là sử dụng các phân tử PEG có chứa asen làm các
chất kết nối với cầu disulfid. Các phản ứng dựa vào ái lực của nhóm As (III) với các thiol tạo
thành chelat khá chặt chẽ. Làm tăng lực liên kết ở cầu disulfid và tăng độ bền phân tử Oxytocin.
Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp tạo phức với các hợp chất cầu nối dibromo/
dithiomaleimid. Các phức hợp arsenic này đã được chứng minh là có thể đảo ngược trong sự
hiện diện của các dithiol khác để tạo chelat chéo, như giảm lipoic acid, cho phép cơ chế giải
phóng Oxytocin được dễ dàng. Tuy nhiên, tác dụng của các hợp chất asen giải phóng trong cơ
thể chưa được đánh giá [72].

- Liên hợp cầu nối ba nguyên tử cacbon Vinyl sulfon/ bis-sulfon

Vinyl sulfon là một nhóm các chất phản ứng ở các vị trí đặc biệt. Phản ứng thông qua bổ
sung vào các nhóm sulfhydryl lần lượt ở pH kiềm, tạo ra các liên kết β-thioether ổn định [73],
[74]. Năm 2006 một phương pháp chọn lọc để nhắm mục tiêu và tạo ra liên kết giữa mạch ba
carbon dựa trên các phản ứng của thiols với vinyl sulfon [75], [76].

Một chất phản ứng bis-sulfon được tổng hợp có thể được sử dụng để cải tiến peptid tại
một vị trí đặc hiệu, và đặc biệt trong trường hợp các liên kết disulfid yếu, theo cách tương tự như
dibromo/ dithiophenolmaleimides. Sau khi giảm lực liên kết disulfid theo quy trình, việc thêm β'-
monosulfon α, β không bão hòa được thực hiện với chất thiol đầu tiên. Điều này lần lượt tạo ra
một liên kết đôi thứ hai mà có thể trải qua bổ sung khác với thiol thứ hai. Sự liên hợp này tạo ra
một cây cầu ba cacbon qua vị trí của disulfid giữ lại cấu trúc của peptid và ngăn ngừa làm mất
hoạt tính của Oxytocin. Đây là một kỹ thuật liên hợp khó thực hiện do kỹ thuật phức tạp, và khó
tinh chế được hợp chất tinh khiết sau phản ứng [77].
 19

 Pegyl hóa vào đầu C-tận trong phân tử oxytocin.

Các dẫn chất của PEG phản ứng với nhóm acid carboxylic trong môi trường tác nhân kết hợp
như DCC và EDC trong điều kiện acid tạo ra liên kết amid. Hai dẫn chất thường sử dụng là dẫn
chất amin và dẫn chất hydrazid của PEG.Do phản ứng có thể xảy ra liên kết chéo với các amin
của protein. Để tránh liên kết chéo đó, người ta sử dụng dẫn chất PEG-hydrazid [78].

 Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin.

PEG – epoxid phản ứng với nhóm hydroxyl ở môi trường kiềm (8,5- 9,5). Cầu nối được hình
thành trong khoảng 14-25h tại 4-250C [79].
Ptpu
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU PEGYL HÓA CÁC PROTEIN VÀ OXYTOCIN.
Các nghiên cứu về PEG hóa protein đã được quan tâm từ rất lâu. Đến hiện nay, các
tác giả ngày càng quan tâm nhiều hơn lĩnh vực này đặc biệt là các ứng dụng trong nghành
Dược và sản phẩm nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc.
Ranganath năm 2015, đã nghiên cứu so sánh tác dụng của interleukin-6 và hợp chất pegyl
hóa interleukin-6 ( Peginterleukin -6). Kết quả cho thấy Peginterleukin-6 có tác dụng của
interleukin-6 và kéo dài thời gian bán thải của thuốc ở loài gặm nhậm và khỉ [80].
Kletzl và cộng sự đã thử nghiệm năm 2017 tác dụng Insulin tái tổ hợp bằng PEG trên 62
tình nguyện viên. Kết quả cho thấy thời gian bán thải của thuốc từ 14-20 giờ, không xảy ra
hạ đường huyết sau khi sử dụng [81].
Jennifer Collins và nhóm nghiên cứu năm 2016 đã thực hiện tổng hợp pegyl hóa oxytocin
và xác định độ bền của sản phẩm trong quá trình bảo quản. Kết quả cho thấy lượng
 20

Oxytocin còn lại sau 28 ngày ở 500C là 2,5 %, trong khi với hợp chất pegyl hóa thì 93,5 %
cac 86,5 % tương ứng với phức hợp Oxytocin-NHS và Oxytocin-mPEG còn lại [82].
Tại Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu quan tâm đến vấn đề pegyl hóa các
protein làm tiền thuốc. Nâng cao ổn định cũng như tác dụng điều trị của thuốc.
Thầy Nguyễn Văn Rư (2017) đã nghiên cứu tổng hợp sản phẩm pegyl hóa từ Insulin tụy
lợn và mPEG-CHO với điều kiện thích hợp, xây dựng được qui trình kỹ thuật xác định hiệu
suất gắn kết sản phẩm đạt 96,9 %. Tinh chế và đông khô thu sản phẩm dạng bột. Xác định
được khối lượng phân tử sản phẩm Insulin-mPEG là 17,8 kDa, kết quả 1 phân tử mPEG
aldehyde 12,0 kDa gắn kết vào vị trí –NH2 nhạy cảm ở đầu chuỗi β của Insulin. Khảo sát
độ bền protein ở 3 môi trường là dịch nước bọt, dịch vị và dịch tụy nhân tạo., sau 3 giờ sự
thủy phân protein trong khoảng 10-25% so với sự thủy phân Insulin tự nhiên là 100% [83].
Nghiên cứu tổng hợp Oxytocin-PEG hiện chưa có nghiên cứu được thực hiện ở Việt Nam.
Các nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện tổng hợp Oxytocin-PEG và thử nghiệm đặc tính,
độ bền trong bảo quản. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài này.
 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên vật liệu

* Nguyên liệu
- Oxytocin: dạng bột vô định hình màu trắng, độ tinh khiết trên 97%.

Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: O6379 CAS: 50-56-6

- Methoxy polyethylene glycol propion aldehyd 5 kDa: dạng bột màu gần như trắng, độ
tinh khiết 98%.

Công thức: CH3O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-CHO

Xuất xứ: Đức (hãng sigma aldrich) Code: JKA3039

* Hóa chất

- Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3), Acrylamid, Bis - acrylamide,

Tris(hydroxymehtyl) aminomethan, Sodium dodecyl sulfat, Sephadex G50, chymotrypsin, α-
amylase, pepsin, pancreatin, Alpha-lactalbumin, Chymotrypsin, Insulin, Lactoglobulin và
Cytochrome C đạt TC DĐVN4 [1] (các hóa chất nhập của hãng Sigma).

- Hydroxylamin hydrochlorid, acid acetic, ethyl acetat, aceton, toluen, acid chlohydric,
ethyl ether, natri hydrocarbonat, natri phosphat, dichloromethan, natri sulfat, ethyl natri sulfat,
dicyclohexyl carbodiimid (DCC), kali dihydrophosphat, ammonium persulfat, dithiothreitol
(DTT), glycerol, bromophenol blue, glycine, coomassie blue, acid acetic, methanol, natri
dihydrophosphat monohydrat, tetramethylethylenediamin (TEMED), natri hydroxyd, natri
carbonat được sản xuất tại Trung Quốc.

- Cồn tuyệt đối sản xuất tại Việt Nam.

2.1.2. Dụng cụ máy móc

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức)

- Bơm hút chân không KNF (Đức)

 22

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Nồi đun cách thủy HH.11-2-II (Trung Quốc)

- Máy đo quang UV- Vis UVD 2950 (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S (Thụy Sỹ)

- Cột sắc ký buret 25ml

- Máy điện di đứng Omni PAGE Mini Wide (Anh)

- Nhiệt kế thủy ngân (Trung Quốc)

- Tủ lạnh Hitachi (Nhật Bản)

- Dụng cụ thủy tinh khô và sạch: bình cầu 1 cổ loại 25ml, 50ml, 100ml; bình cầu 2 cổ loại
50ml; bình cầu 3 cổ loại 100ml, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đĩa petri, ống nghiệm, đũa thủy
tinh, …

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tiến hành phản ứng Pegyl hóa Oxytocin ở hai môi trường pH khác nhau, xác định sản
phẩm hình thành bằng phương pháp điện di
- Xác định khối lượng phân tử hợp chất Oxytocin đã được Pegyl hóa trong phản ứng bằng
sắc ký đồ lọc gel.
- Đánh giá sự ảnh hưởng pH đến tỷ lệ hợp chất Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải
sau sắc ký lọc gel so với nguyên liệu tham gia phản ứng.
- Xác định ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng đến tỷ lệ hợp chất
Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải sau sắc ký lọc gel.

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1. Tiến hành gắn PEG vào phân tử Oxytocin

* Nguyên tắc: Các mPEG aldehyd liên hợp với Oxytocin tạo thành hợp chất liên hợp
polymer hóa hình lược là một base Schiff. Sự liên hợp này được thực hiện trong môi trường đệm
 23

phosphat ở pH thích hợp. Tác nhân khử hóa NaCNBH3 có tác dụng làm giảm polymer trung gian
Schiff, tăng hiệu suất tạo thành hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG [56], [57].

Dựa trên nghiên cứu của Jennifer Collins sử dụng 2 phân tử mPEG (Mw = 2 kDa & Mw
= 5 kDa) của α-methoxy-ω-formylpoly (ethylene glycol) (aldehyde PEG) được liên hợp với
oxytocin với tác nhân khử của NaCNBH3 được tiến hành trong môi trường đệm phosphate pH
7,5,ở 10 ° C qua đêm.Đã xác định được vị trí gắn mPEG aldehyd vào nhóm -NH2 của acid amin
Cystein ở vị trí số 1 [41].

* Sơ đồ phản ứng

Phản ứng có thể xảy ra theo nhiều khả năng. Nguyên lý chung như sau:

Hình 2.2. Nguyên tắc của phản ứng liên hợp

* Mục đích: Gắn kết được phân tử mPEG aldehyd vào phân tử Oxytocin dược dụng.

* Tiến hành

- Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng Pegyl hóa Oxytocin là ở: pH 4,5 thuận lợi cho
phản ứng giữa nhóm aldehyd và amin[84] và pH 7,5 là điều kiện tốt cho hoạt động của tác nhân
khử NaCNBH3[85].

- Pha các dung dịch đệm phosphat pH 4,5 và 7,5 theo dược điển Việt Nam IV [86].

- Thực hiện phản ứng: Tỷ lệ phản ứng của Oxytocin/ mPEG aldehyd/ NaCNBH3 là 1: 1:
4. Hòa tan 8 mg Oxytocin trong 1 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5. Thêm 41 mg mPEG
aldehyd trong 10 ml dung dịch đệm phophat pH 4,5 đã hòa tan 250 mg NaCNBH3, khuấy đều
 24

trong 15 phút. Khuấy trộn đều hai dung dịch trên trong vòng 1 giờ trước khi để phản ứng xảy ra
ở 40C trong thời gian 24 giờ (qua một ngày đêm) .

- Tiến hành tương tự với các thành phần như phản ứng trên trong dung dịch đệm pH 7,5.

2.3.2. Xác định sự có mặt của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng phương pháp điện di .
* Nguyên tắc:

Có nhiều phương pháp điện di, nhưng ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp là điện di
trên gel polyacrylamid có sử dụng Natri dodecyl sulfat (SDS) được gọi tắt là SDS - PAGE. Là
một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử và tốc độ di
chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, dưới tác dụng của điện trường một
chiều. Phương pháp này còn được gọi là phương pháp điện di không liên tục và mẫu protein
được gây biến tính. SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa protein. Khi được xử lý bằng
chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disufit là DTT (dithiotheitol) đưa cấu trúc protein bậc 2, 3,
4 về bậc 1và làm tích điện âm cho protein. Điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ
lệ với khối lượng phân tử của nó [86], [87].

* Tiến hành
- Chuẩn bị các hệ đệm, gel điện di ,dung môi pha mẫu, và các thành phần đổ gel (gel cô
và gel phân tách)
- Chuẩn bị gel phân tách, tạo khuôn bản gel.

- Chuẩn bị mẫu

+ Mẫu 1: là Maker protein gồm có Oxytocin, Alpha-lactalbumin, Chymotrypsin, Insulin,

Lactoglobulin và Cytochrome C. Pha từ các chất có khối lượng nhỏ.

+ Mẫu 2: Mẫu sau phản ứng pha với dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1:1.

+ Mẫu 3: Mẫu chứa 8 mg Oxytocin và 41 mg mPEG aldehyd được pha với 10 ml dung
dịch pha mẫu. Tiến hành chạy điện di ngay sau khi pha.

-Lắp khuôn gel vào độ điện di, cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di,bơm từ 5 -
15μl mẫu vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện (150 V)
 25

- Sau khi chạy điện di Bản gel được lấy ra và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Comassie
Brillant Blue.

2.3.3. Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel để sơ bộ đánh giá hiệu quả hình thành và tinh
chế hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG
* Nguyên tắc

Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy
dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác
nhau có thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các thành phần khác nhau
của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, và ra khỏi cột lần lượt theo trình tự trọng
lượng phân tử lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau [88].

Kết quả của quá trình sắc ký lọc gel được biểu diễn trên phổ đồ sắc ký. Cho thấy sự khác
nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong
mẫu khi chúng được rửa giải ra khỏi cột gel dựa trên trật tự kích thước phân tử [89].

Ở đây chúng tôi, sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-50.

* Mục đích: Xây dựng phương trình tuyến tính liên quan giữa khối lượng và phân tử của
protein và thể tích rửa giải của chúng. Phân tách và xác định khối lượng phân tử của sản phẩm
liên hợp sau phản ứng.

* Tiến hành
+ Chuẩn bị cột sắc ký
Cột sắc ký là buret 25 ml được làm sạch và để khô trước khi tiến hành.
+ Chuẩn bị dung dịch đệm và gel

Dung dịch đệm 50 mM Tris pH khoảng 8,0. Pha 6,057 gam tris với vừa đủ 1000ml
nước[3]. Đây là đệm sử dụng làm pha động trong sắc ký lọc gel.

Tỷ lệ Sephadex G-50 và đệm được pha là 1 gam /20 ml dung dịch đệm Tris, ngâm gel
trương nở hoàn toàn.

Đánh dấu bề dày lớp gel khoảng 15 ml trên cột.

Cho một ít dung dịch đệm vào cột.
Cho một lớp giấy lọc vào đáy cột.
Để cột thật thẳng, đổ dung dịch đệm vào tới chiều cao đã đánh dấu trên cột, tránh tạo bọt.
 26

Gel đã trương nở được khấy đều và đổ vào cột bằng đũa thủy tinh. Khi được một lớp gel
đã lắng xuống khoảng vài centimet, mở khóa đáy cột cho dung dịch đệm từ từ chảy ra. Tiếp tục
đổ gel vào. Chú ý sao cho quá trình đổ luôn có 3 lớp: lớp dưới là gel đã lắng, lớp này ngày càng
cao dần; ở giữa là lớp gel đang lắng; còn phía trên là lớp dung dịch đệm trong suốt. Nếu quá
trình lắng nhanh hơn lưu lượng chảy có thể thỉnh thoảng hút bỏ lớp dung môi phía trên để có thể
tiếp tục đổ gel vào. Làm như trên cột gel sẽ đồng đều không có chỗ đặc chỗ thưa. Sao cho lớp gel
chạm vết đánh dấu trên cột .

Cho dung môi chảy trong vài giờ để ổn định cột.

+ Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chứa các protein có nồng độ xác định. Cân khoảng 2
mg lần lượt các protein: Insulin, Oxytocin, Chymotrysin, Casein hòa tan trong vừa đủ 10 ml
dung dịch đệm Tris pH 8,0 tạo thành các dung dịch chuẩn.

Mẫu sau phản ứng: Hút 2 ml các mẫu liên hợp trộn đều với vừa đủ 25 ml đệm Tris pH
8,0. Hút lấy 1 ml tiến hành sắc ký qua gel Sephadex G-50.

+ Nạp mẫu

Hút bỏ bớt phần dung dịch đệm phía trên cột gel.
Mở khóa dưới cột cho dung dịch đệm chảy tiếp tới xuống sát lớp gel.
Cho khoảng 1 ml dung dịch cần tách vào, để lớp này ngấm hết xuống.
Mẫu sắc ký được sử dụng rất nhỏ so với thể tích lớp đệm do đó thể tích rửa giải Ve sẽ
được xác định từ vị trí ban đầu của mẫu cho tới điểm cao nhất của mũi sắc ký.Cho thêm dung
dịch đệm vào cột, để lớp dung dịch này ngấm hết xuống. Đổ dung dịch đệm tới độ cao cần thiết.

+ Thu mẫu
Đánh dấu các ống nghiệm, thu từng phân đoạn 1 ml vào các ống nghiệm đã đánh số thứ
thự. Pha loãng mỗi phân đoạn với 2 ml nước cất. Đem đo quang ở bước sóng 280 nm để phát
hiện protein.

2.3.4. Phương pháp định lượng Oxytocin và hợp chất liên hợp.
Tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của Oxytocin và hợp chất liên hợp của nó với
mPEG aldehyd cho cực đại hấp thụ như nhau ở bước sóng 280 nm. Cho thấy phân tử polyethylen
 27

glycol khi gắn vào Oxytocin không ảnh hưởng tới khả năng hấp thụ ánh sáng của phân tử
Oxytocin [41].
* Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng pH và lượng mPEG aldehyd đến khối lượng ,tỷ lệ hình
thành hợp chất liên hợp trong các mẫu phản ứng sau sắc ký lọc gel.

* Tiến hành
+ Quá trình đánh giá được tiến hành ở 5 mức, thêm mPEG aldehyd vào các mẫu thử M
như sau: mẫu M0: tỷ lệ Oxytocin và mPEG aldehyd giữ nguyên như quy trình (không thêm). Các
mẫu từ M4 và M1 được gia tăng thêm và giảm bớt một lượng 20% mPEG aldehyd. Các mẫu từ
M3 và M2 được gia tăng thêm và giảm bớt một lượng 10% mPEG aldehyd. Tiến hành phản ứng
theo quy trình, sắc ký lọc gel và đo quang. Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần. So sánh, đánh
giá tỷ lệ thu hồi hợp chất liên hợp trong dung dịch sau lọc gel dựa trên kết quả trung bình trong
một mẫu thí nghiệm (ni ≥ 3).

+ Chuẩn bị mẫu chuẩn: Hòa tan chính xác 2 mg Oxytocin trong vừa đủ 10 ml dung dịch
đệm Tris pH 8,0. Cchuẩn = 0,2 mg/ml.
+ Chuẩn bị mẫu thử: Gộp các phân đoạn rửa giải VR sau khi sắc ký lọc gel của Oxytocin -
PEG, lấy mẫu tiến hành đo quang.
+ Chuẩn bị mẫu trắng: dung dịch đệm Tris pH 8,0 hiệu chỉnh mật độ quang của máy đo.
+ Đem đo quang mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng ở bước sóng 280 nm, xác định được
mật độ quang của chúng,
* Kết quả: được tính theo các công thức
- Tính được nồng độ Cthử của mẫu chứa Oxytocin - PEG theo công thức.
Dthử - Dtrắng
Cthử = Dchuẩn - Dtrắng .Cchuẩn
Trong đó: Dthử, Dchuẩn là mật độ quang của mẫu thử Cthử và mẫu chuẩn Cchuẩn.
Lượng hợp chất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel (VR) được tính theo
công thức sau:
11
m = VR. Cthử. 25.6. 2

+ Tính tỷ lệ thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG trong VR ml dung dịch sau sắc ký lọc gel so
với nguyên liệu tham gia phản ứng.
m
 28

H% = moxytocin+ mPEG .100

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. LIÊN HỢP mPEG aldehyd VỚI OXYTOCIN VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HÌNH THÀNH
HỢP CHẤT LIÊN HỢP

3.1.1. Tổng hợp Oxytocin-PEG

- Thực hiện phản ứng tổng hợp mPEG aldehyd ở hai môi trường đệm phosphat pH 4,5 và
7,5.

Cảm quan cho thấy hai mẫu phản ứng đều cho kết quả tương tự trong cốc mỏ.
Sau 24 giờ ở 40C

Trước phản ứng

Hình 3.1. Mẫu liên hợp trước và sau phản ứng

* Nhận xét:

+ Ban đầu, khi phối hợp các thành phần trong phản ứng thì dung dịch không màu.

+ Thực hiện phản ứng sau 24 giờ cả hai mẫu phản ứng đều cho dung dịch màu vàng nhạt và độ
nhớt giảm hơn so với ban đầu.
 29

3.1.2. Kết quả điện di

Để đánh giá sự tạo thành của sản phẩm liên hợp giữa Oxytocin và mPEG aldehyd tạo
thành từ phản ứng. Tiến hành điện di các mẫu là mẫu 1: là mẫu chuẩn, mẫu 2: là mẫu chuẩn bị từ
phản ứng liên hợp và mẫu 3: là mẫu chứa nguyên liệu phản ứng pha ngay trước khi chạy điện di.

Kết quả điện di các mẫu được thể hiện ở hình 3.2 và hình 3.3

kDa
25

18

14,2

12,4

5,
8
1

1 2 3 1 2 3

Hình 3.2. Kết quả điện di ở pH 7,5 Hình 3.3. Kết quả điện di ở pH 4,5

* Nhận xét:

- Kết quả điện di các mẫu thử của phản ứng giữa Oxytocin và mPEG aldehyd ở pH 7,5 và
pH 4,5 đều xuất hiện 2 vạch bắt màu. Trong đó, có một vạch cùng vị trí của mẫu chứa Oxytocin.
Như vậy, trong mẫu phản ứng có chứa thêm chất mới bắt màu giống Oxytocin và có khối lượng
phân tử lớn hơn do có vị trí các vết trong mẫu điện di cao hơn so với Oxytocin.

- Trên hình kết quả điện di cho thấy chất này có khối lượng lớn hơn Oxytocin, phân tử
khối khoảng 6 kDa.
 30

3.1.3. Xây dựng phương trình tương quan giữa logarit khối lượng phân tử protein và thể
tích rửa giải (Ve) trong sắc ký lọc gel
Tiến hành lọc gel các dung dịch mẫu chuẩn chứa protein lần lượt là Insulin,
Chymotrypsin, Casein và Oxytocin. Thu được các kết quả về thể tích rửa giải Ve như sau:

- Với dung dịch chứa Insulin: kết quả mật độ quang D được thể hiện trên đồ thị sau

D
1.2

0.8

0.6
D
0.4

0.2

0 Ve ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Hình 3.4. Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Insulin

Vậy thể tích rửa giải trên cột sắc ký lọc gel cho Ve của Insulin là 12 ml.

- Kết quả mật độ quang các phân đoạn rửa giải của Chymotrypsin được biểu diễn trên đồ
thị sau:
 31

D
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4 D
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ve ml

Hình 3.5. Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Chymotrypsin

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của Chymotripsin là Ve = 7 ml.

- Sắc ký đồ lọc gel của Casein

D
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
D
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ml

Hình 3.6 Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Casein
 32

Kết quả rửa giải (Ve) trên cột sắc ký lọc gel của Chymotripsin là 8 ml.

- Tiến hành sắc ký lọc gel dung dịch Oxytocin và xác định độ hấp thu ánh sáng ở bước
sóng 280 nm của các phân đoạn rửa giải. Kết quả thu được sắc ký đồ lọc gel của dung dịch
Oxytocin ở các phân đoạn dịch lọc như sau:

D
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
D
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930 ml

Hình 3.7. Đồ thị mật độ quang của các phân đoạn rửa giải dung dịch Oxytocin

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của Oxytocin là Ve = 18 ml.

- Xác định sự liên quan giữa logarit khối lượng và thể tích rửa giải Ve của các protein
trong phương pháp sắc ký lọc gel. Xây dựng mối liên quan tuyến tính giữa logarit khối lượng
phân tử của các protein và thể tích rửa giải Ve.

Bảng 3.1. Tổng hợp kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel

Protein MW (KDa) logMW Ve (ml)

Chymotrypsin 25,000 1,398 7

Casein 23,600 1,373 8

 33

Insulin 5,780 0,762 12

Oxytocin 1,078 0,003 18

Phương trình hồi quy đơn giản thể hiện sự phụ thuộc logMW của protein và thứ tự rửa
giải Ve trong sắc ký lọc gel.

logMW y = -0.1313x + 2.3607

1.600
R² = 0.9951
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600 logMW
0.400
0.200
0.000
-0.200 0 5 10 15 20
Ve ml

Hình 3.8. Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve

- Phương trình biểu diễn quan hệ giữa log MW của các protein và thứ tự rửa giải Ve của
chúng có dạng:

y = -0.131 x + 2.36

- Đây là một đường thẳng có hệ số tương quan > 0,99. Vì vậy có thể kết luận trong điều
kiện thí nghiệm log MW và Ve tuyến tính nghịch biến.

3.1.4. Xác định khối lượng phân tử hợp chất liên hợp trong phản ứng Pegyl hóa bằng sắc
ký lọc gel
 Kết quả rửa giải của các chất trong phản ứng liên hợp ở pH 7,5 cho sắc ký đồ lọc gel các
phân đoạn rửa giải như sau:
 34

D
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
D
0.3
0.2
0.1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829 ml

Hình 3.9. Biểu đồ mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp
Oxytocin và mPEG aldehyd ở pH 7,5

- Nhận xét:

+ Oxytocin có 1 pick ở phân đoạn 8 – 17 ml, với đỉnh ở thể tích 11 ml.

+ Hỗn hợp sản phẩm tạo thành ở pH 7.5 cho thấy có 2 pick ở các phân đoạn 8 – 15 ml và 15 –
22 ml, tương ứng với 2 đỉnh ở thể tích 12 ml và 18 ml. Pick thứ hai trùng với pick của Oxytocin.
Như vậy pick thứ nhất phải là pick của 1 chất có khối lượng phân tử lớn hơn Oxytocin và hấp thụ
UV ở 280 nm. Đó là pick của Oxytocin-PEG.

+ Theo phương trình, tính được trọng lượng phân tử của Oxytocin-PEG là khoảng 6,1 kDa. Do
đó trong phản ứng liên hợp trên một phân tử mPEG aldehyd đã gắn kết với một phân tử
Oxytocin.

 Kết quả rửa giải của các chất trong phản ứng liên hợp ở pH 4,5 cho sắc ký đồ lọc gel các
phân đoạn rửa giải như sau:
 35

D
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 ml
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Hình 3.10. Biểu đồ mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau phản ứng liên hợp
Oxytocin và mPEG aldehyd với pH 4,5

- Nhận xét: Mẫu phản ứng ở pH 4,5 cho kết quả tương tự như kết quả mẫu phản ứng ở pH 7,5.
Thu được 2 pick, trong đó pick thứ 2 là pick Oxytocin, còn pick thứ nhất là pick của oxytocin-
PEG có khối lượng khoảng 6,1 kDa. Do đó trong phản ứng liên hợp trên một phân tử mPEG
aldehyd đã gắn kết với một phân tử Oxytocin.

Sắc ký đồ lọc gel của hai mẫu phản ứng ở pH trên cho thấy lượng hợp chất Oxytocin-PEG
liên hợp được đều chứa trong phân đoạn từ 8 ml đến 15 ml sau khi sắc ký lọc gel.

3.1.5. Xác định hàm lượng Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở hai pH sau sắc ký lọc
gel
- Gộp các thể tích sau khi lọc từ 8 ml đến 15 ml, tiến hành đo quang ở bước sóng 280 nm.
Đồng thời pha các mẫu chuẩn và mẫu trắng đo quang trong cùng điều kiện. Tỷ lệ hình thành hợp
chất Oxytocin-PEG thu được trong dung dịch sau sắc ký lọc gel so với nguyên liệu tham gia
phản ứng liên hợp. Tiến hành so sánh tỷ lệ này ở phản ứng tiến hành ở pH 4,5 và pH 7,5. Kết quả
tổng hợp như bẳng sau:

Bảng 3.4. Lượng sản phẩm liên hợp thu được trong dung dịch sau lọc gel

pH 4,5 pH 7,5
 36

Chỉ số M1 M2 M3 M1 M2 M3

Cchuẩn (mg/ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Dchuẩn 3,38 3,43 3,3 3,43 3,52 3,38

Dtrắng 0,04 0,043 0,048 0,05 0,056 0,06

Dthử 0,91 0,124 0,105 0,146 0,167 0,138

Cthử (mg/ml) 0,003 0,005 0,004 0,006 0,006 0,005

Moxytocin-PEG (mg) 15,12 23,68 17,35 28,12 31,72 23,26

H% 30,35 47,54 34,84 57,86 65,27 47,86

p p < 0,05

* Nhận xét: Do p = 0,045 < 0,05 cho thấy sự khác biệt giữa lượng hợp chất Pegyl hóa ở
điều kiện phản ứng pH 7,5 so với mẫu phản ứng ở pH 4,5.Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê.
Vậy tỷ lệ thu hồi hợp chất Pegyl hóa ở pH 7,5 lớn hơn so với mẫu pH 4,5. Xác định được pH 7,5
là điều kiện phù hợp làm tăng lượng hợp chất Pegyl hóa Oxytocin trong mẫu dung dịch thu được
sau sắc ký lọc gel.

3.2. Đánh giá ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ hợp chất
Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel

- Đo quang các mẫu từ M1 đến M4, tiến hành 3 lần cho một mẫu. Kết quả mật độ quang
của các phân đoạn rửa giải qua sắc ký lọc gel như sau:
Bảng 3.5. Mật độ quang các phân đoạn rửa giải phản sau sắc ký lọc gel
M1 M2 M3 M4
P 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Đ
4 0,05 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,05 0,03
0 0 6 8 4 8 8 8 0 7 6 6
 37

5 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03
8 0 8 8 6 8 8 6 8 6 8 0
6 0,04 0,04 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03
8 8 0 8 6 8 8 6 8 6 8 7
7 0,06 0,05 0,06 0,05 0,06 0,06 0,06 0,05 0,04 0,06 0,06 0,08
0 0 0 6 7 8 5 8 8 0 0 6
8 0,07 0,06 0,06 0,06 0,07 0,07 0,06 0,06 0,07 0,06 0,06 0,10
8 0 5 6 8 2 7 3 8 8 8 8
9 0,17 0,20 0,23 0,18 0,12 0,27 0,22 0,26 0,10 0,27 0,17 0,20
8 1 2 7 5 6 8 5 5 8 6 6
10 0,40 0,37 0,48 0,46 0,47 0,30 0,48 0,50 0,45 0,45 0,47 0,47
5 8 8 5 5 5 5 2 7 5 3 5
11 0,54 0,55 0,54 0,50 0,51 0,64 0,56 0,60 0,53 0,67 0,57 0,59
0 6 9 3 8 0 6 5 4 3 6 9
12 0,85 0,81 0,72 0,80 0,88 0,80 0,87 0,80 0,82 0,90 0,84 0,89
6 5 5 6 8 2 6 9 8 6 5 5
13 0,51 0,46 0,45 0,40 0,42 0,41 0,55 0,42 0,54 0,57 0,51 0,57
4 5 1 3 3 6 4 3 4 4 2 2
14 0,30 0,24 0,10 0,07 0,21 0,20 0,30 0,20 0,33 0,30 0,31 0,34
8 4 3 7 4 2 7 4 7 0 8 8
15 0,07 0,07 0,04 0,05 0,06 0,09 0,06 0,04 0,06 0,07 0,07 0,08
7 0 8 6 8 8 0 6 5 7 0 4
16 0,24 0,22 0,28 0,28 0,23 0,16 0,17 0,12 0,26 0,17 0,21 0,16
6 1 9 8 4 8 6 6 8 8 6 3
17 0,43 0,45 0,48 0,35 0,43 0,48 0,33 0,41 0,46 0,28 0,40 0,33
1 6 7 7 6 7 1 7 3 8 2 5

Kết quả sắc ký lọc gel cho thấy ở cả 4 mẫu đều cho 2 pick trong đó có pick thứ 1 là pick
của Oxytocin,còn pick thứ 2 là pick của Oxytocin – PEG. Ve thể tích rửa giải của hợp chất liên
hợp trong các mẫu phản ứng đều là 12 ml, thay vào phương trình tuyến tính xác định khối lượng
của phân tử Oxytocin-PEG là 6,1 kDa.
 38

- Gộp các phân đoạn rửa giải từ 8 đến 15 ml đo quang xác định lượng và tỷ lệ Oxytocin-
PEG trong mẫu dung dịch thu được sau sắc ký lọc gel. Xác định hiệu quả hình thành Oxytocin-
PEG trong mẫu dung dịch thu được.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới tỷ lệ Oxytocin-PEG hình
thành trong các phân đoạn sau lọc gel
Thông số M2 M1 M0 M3 M4

-20% -10% +10% +20%

Số thí nghiệm (n) 3 3 3 3 3

Lươ ̣ng Oxytocin mg 8,1 mg cho các mẫu

Lượng mPEG aldehyd (mg) 32.4 36.45 40,5 44.55 48.6

Thể tić h rửa giải Ve (ml) 12

Khố i lươ ̣ng phân tử (kDa) 6,1

Lươ ̣ng Oxytocin-PEG (mg) 27,97 ± 27,86 ± 27,7 ± 33,69 ± 34,88 ±

2,92 1,22 4,25 2,54 6,83

Hiê ̣u suất thu hồi (%) 69,08 ± 62,55 ± 56,99 ± 63,99 ± 61,51 ±
7,19 2,75 8,74 4,84 12,04

P 0.053 0,48 0,14 0,54

* Nhận xét:
- Các mẫu phản ứng đều cho hợp chất liên hợp có thể tích rửa giải Ve là 12 ml trong quy
trình sắc ký lọc gel. Như vậy khối lượng phân tử của Oxytocin-PEG là khoảng 6,1 kDa.
- Do p > 0.05 ở tất cả các mẫu so với mẫu M0 do đó sự khác biệt không có ý nghĩa thống
kê. Như vậy, các mẫu từ M1 đến M4 với M0 cho thấy tất cả các mẫu từ M1 đến M4 không có sự
thay đổi về lượng và tỷ lệ tạo thành của hợp chất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau lọc gel so
với tỷ lệ ban đầu ở mẫu M0.
- Điều này cho thấy lượng hợp chất liên hợp trong mẫu dung dịch thu được sau sắc ký lọc
gel là như nhau khi thay đổi lượng mPEG aldehyd trong khoảng 20%.
 39

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1.Về điều kiện của phản ứng Pegyl hóa Oxytocin

Trong những nghiên cứu đã công bố, các polyethylene glycol được lựa chọn cho phản ứng
Pegyl hóa protein thường sử dụng là PEG-bis succinimidyl succinat, mPEG-succinimidyl
propionat, PEG-aldehyd, PEG-imidazol carbonat, PEG-succinimidyl carbonat,...Chúng là những
dẫn chất PEG chỉ hoạt hóa một đầu; đầu còn lại trơ, không hoạt động do bị gắn với alkyl tạo
thành nhóm alcoxy (hay gặp nhất là methoxy). Khi tham gia phản ứng tạo thành hợp chất liên
hợp chúng thể hiện những ưu nhược điểm khác nhau. Trong đó, Methoxy polyethylene glycol
aldehyd được đánh giá là chất có khả năng phản ứng dễ dàng, và chọn lọc vào các nhóm amin
trong phân tử protein [41], [90].

Về điều kiện pH phù hợp cho phản ứng thường là 4,5 và 7,5. Đây là điều kiện thích hợp
cho phản ứng giữa nhóm amin (-NH2) và các nhóm phản ứng như aldehyd (-CHO), cacboxyl (-
COOH), … Cũng như là điều kiện tốt cho khả năng xúc tác của NaCNBH3 [41], [84].

Tỷ lệ chất xúc tác khử hóa NaCNBH3 được thêm vào phản ứng thường gấp từ vài lần đến
vài chục lần các nguyên liệu liên hợp [84].

Chúng tôi đã thực hiện phản ứng liên hợp với nguyên liệu là dẫn chất Methoxyl polyethyle
glycol propion aldehyd để Pegyl hóa Oxytocin. Phản ứng liên hợp được thực hiện ở hai điều kiện
pH là 4,5 và 7,5. Lựa chọn tỷ lệ của hai nguyên liệu ban đầu tham gia phản ứng là 1:1, xúc tác
của phản ứng NaCNBH3 gấp 4 lần các chất tham gia phản ứng về số mol chất. Phản ứng được
thực hiên ở điều kiện nhiệt độ thấp (40C), trong thời gian 24 giờ .

Đánh giá kết quả liên hợp của phản ứng bằng phương pháp điện di. Cả hai mẫu điện di
của phản ứng ở pH 4,5 và 7,5 đều cho thấy sự suất hiện của một chất mới. Chất này có bản chất
là protein khi bắt màu thuốc nhuộm Comassie blue và có khối lượng phân tử lớn hơn Oxytocin
ban đầu. Điều này chứng minh được phân tử mPEG propion aldehyd đã gắn kết được với
Oxytocin. Sơ bộ xác định được khối lượng hợp chất liên hợp tạo thành khoảng 6 kDa.

4.2. Xác định khối lượng của các protein sau phản ứng liên hợp

Phương pháp sắc ký lọc gel thường được dùng để tinh chế các phân tử ở trong mẫu nhỏ
và xác định trọng lượng phân tử của các protein [88], [89]. Nguyên lý của sắc ký lọc gel là là
phân tách các chất theo khối lượng phân tử của chúng. Chất có khối lượng phân tử lớn sẽ chuyển
 40

qua cột với tốc độ nhanh hơn [88]. Do đó phân tử Oxytocin-PEG nếu được hình thành sẽ được
rửa giải trước phân tử Oxytocin tự nhiên. Nếu trong hỗn hợp sản phẩm có oxytocin-PEG thì sẽ
có ít nhất 1 pick sắc ký nằm trước vị trí của pick oxytocin. Đồng thời, xác định được mối liên
quan tuyến tính giữa logarit khối lượng các protein (logMW) và thể tích rửa giải (Ve) của các
protein qua sắc ký lọc gel [88]. Do đó, phương pháp này được áp dụng để xác định khối lượng
phân tử của protein trong mẫu phản ứng liên hợp.

Tiến hành sắc ký lọc gel lần lượt các protein là Chymotrypcin, Casein, Insulin và
Oxytocin đã xây dựng được phương trình tuyến tính giữa logMW và thể tích rửa giải Ve của các
protein trong phương pháp này là y = -0,131x + 2,36. Trong đó y là logMW và x là thể tích rửa
giải của các protein qua sắc ký lọc gel. Phương trình tuyến tính này có hệ số tương quan là R là -
0,997.

Các phản ứng liên hợp thực hiện ở pH 4,5 và 7,5 được lấy mẫu tiến hành lọc gel. Kết quả
thu được cho thấy, hỗn hợp sản phẩm ở cả 2 mẫu đều có 2 pick: pick thứ nhất (ở phân đoạn 8 –
15 ml, đỉnh: 12 ml) nằm ngay trước pick của oxytocin tự nhiên (ở phân đoạn 15 – 22 ml, đỉnh:
18 ml). Đó phải là pick của 1 chất có khối lượng phân tử lớn hơn insulin và hấp thụ UV ở bước
sóng 280 nm. Xét thành phần các chất phản ứng trong hỗn hợp ban đầu, nhận thấy chất có các
đặc tính đó chỉ có thể là oxytocin đã được tăng khối lượng phân tử bằng cách gắn thêm phân tử
khác. Chúng tôi cho rằng đó là oxytocin-PEG.

Xác định được thể tích rửa giải Ve2 của Oxytocin là 18 ml tính theo phương trình tuyến
tính khối lượng là 1009 Da. Thể tích rửa giải của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG là Ve1 = 12
ml có khối lượng là 6,1 kDa. Hợp chất của phản ứng liên hợp là một phân tử mPEG aldehyd đã
gắn kết với một phân tử Oxytocin. Kết quả này phù hợp với kết quả trong mẫu điện di protein
sau phản ứng liên hợp.

4.3. Về đánh giá lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel

- Ảnh hưởng của pH phản ứng liên hợp.

Mẫu phản ứng ở pH 4,5 và 7,5 được xác định có sự hình thành của hợp chất liên hợp Hợp
chất này có chứa trong các phân đoạn rửa giải từ 9 ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel. Gộp phân
đoạn rửa giải này để tiến hành đo quang ở bước sóng 280nm.
 41

Lượng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG xác định có trong dung dịch sau sắc ký lọc gel ở
mẫu phản ứng pH 4,5 là 37,58% ± 8,91%, so với mẫu phản ứng ở pH 7,5 là 56,99% ± 8,74% (p
< 0,05). Do đó, lượng hợp chất được liên hợp ở pH 7,5 sau lọc gel lớn hơn so với mẫu phản ứng
pH 4,5. Chúng tôi lựa chọn mẫu phản ứng pH 7,5 để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên
liệu tham gia vào phản ứng.

- Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tham gia vào phản ứng liên hợp.

Thay đổi lượng mPEG aldehyd tham gia vào phản ứng liên hợp với Oxytocin trong
khoảng thêm hoặc bớt 20%, 10% so với lượng ban đầu. Kết quả cho thấy thể tích rửa giải Ve của
Oxytocin-PEG đều là 12 ml và khối lượng phân tử oxytocin-PEG đều khoảng 6 kD. Lượng hợp
chất này có chứa trong các phân đoạn rửa giải từ 9 ml đến 14 ml sau sắc ký lọc gel.

Với p > 0,05 khi so sánh các mẫu M1 đến M4 với M0 cho thấy lượng hợp chất có trong
mẫu dung dịch sau lọc gel là không thay đổi so với tỷ lệ phản ứng ban đầu. Như vậy lượng hợp
chất liên hợp trong mẫu dung dịch thu được sau sắc ký lọc gel là như nhau khi thay đổi lượng
mPEG aldehyd trong khoảng 20%.
 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Đã thực hiện gắn kết được phân tử Methoxy polyethylenglycol propion aldehyd vào
phân tử Oxytocin.
2. Xác định được hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG có khối lượng phân tử là 6 kDa,
chứng minh trong phân tử hợp chất này đã có một phân tử mPEG aldehyd gắn với một phân tử
Oxytocin.
3.Đã tinh chế được Oxytocin-PEG bằng sắc ký lọc gel. Và xác định điều kiện phản ứng
phù hợp trong nghiên cứu được xác định ở pH 7,5 với tỷ lệ 40,5 mg mPEG aldehyd và 8,1 mg
Oxytocin. Trong điều kiện này, tỷ lệ lượng hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG trong dung dịch sau
sắc ký lọc gel là 56,99 ± 8,74%.
4. Khi thay đổi lượng mPEG aldehyd nguyên liệu tham gia phản ứng trong khoảng ±20%
thì tất cả các mẫu phản ứng đều cho thấy có sự hiện của một chất mới là Oxytocin-PEG có khối
lượng phân tử khoảng 6 kD. Nhưng tỷ lệ Oxytocin-PEG hình thành sau sắc ký lọc gel ở các mẫu
không thay đổi so với mẫu ban đầu.
 43

KIẾN NGHỊ

- Cải tiến phương pháp và nguyên liệu để tổng hợp được protein-PEG đạt hiệu quả cao
hơn. Xây dựng các tiêu chuẩn đánh giá khác nhằm xác định thêm các đặc điểm và độ tinh khiết
của của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG.

- Phát triển áp dụng trong quy mô sản xuất lớn tạo hợp chất liên hợp oxytocin pegyl hóa
và tạo các chế phẩm thuốc chứa Oxytocin-PEG sử dụng qua đường tiêu hóa và ổn định trong bảo
quản.
 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO.