Đặc điểm sinh học của lactobacillus và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để nâng cao hoạt

tính kháng
khuẩn của L.sakei
A. Đặc điểm sinh học của lactobacillus
a. Nguồn phân lập L.sakei
- Các sản phẩm lên men acid lactic: kim chi (Assessment of Characteristics and Functional Properties of
Lactobacillus Species Isolated from Kimchi for Dairy Use Seung-Chun Baick1 and Cheol-Hyun Kim) –
là nguồn nguyên liệu tốt cung cấp các vi khuẩn sinh acid lactic, ngoài ra còn chứa hơn 200 loài vi khuẩn
khác nhau.
- Phương pháp:
 Dịch triết kim chi được lấy từ các vùng khác nhau ở Hàn Quốc. Sau đó mỗi mẫu được trộn với
PBS với tỷ lệ 1:1 và làm đồng nhất.
 1 ml dịch trên hòa tan với dd muối 0,85% sau đó lấy 100µl dịch vừa hòa tan phân tán đều vào
môi trường MRS agar
 Đĩa thạch được ủ ở 37oC trong 48 giờ.
b. Tác dụng sinh hóa của L.sakei

- Đối với các vi khuẩn sinh acid lactic nói chung, có tác dụng cân bằng hệ vi khuẩn trong đường ruột, điều
hòa hệ miễn dịch, sinh ra các hoạt chất sinh học, ngăn chặn các yếu tố gây bệnh, làm giảm nguy cơ bị
nhiễm khuẩn đường ruột, bệnh tim, béo phì và ung thư ((Lee et al., 2011; Li et al., 2012; Vinderola and
Reinheimer,2003). Nhưng trong đó, Lactobacillus spp có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe (Lee et al.,
2011; Zhang et al., 2011)
- Việc lựa chọn các vi khuẩn phải thỏa mãn một số yếu tố nhất định tùy theo chủng vi khuẩn. Đối với
Lactobacillus spp, cần phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
 Khả năng kháng acid
 Khả năng xâm nhập vào các tế bào biểu mô của người
 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa
 Khả năng tạo ra các hoạt chất kháng khuẩn
 Có đặc tính sinh trưởng tốt
 Tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người
- Khả năng kháng acid: L.sakei có khả năng tồn tại tốt trong dạ dày, đường ruột và chiếm phần lớn trong
hệ vi sinh vật đường ruột
Phương pháp:
- Đặc tính beta-galactosidase
- Đặc tính thủy phân protein
- Tính sơ nước trên bề mặt
- Đặc tính kháng khuẩn và chống oxi hóa: Bacillus cereus KCTC 3624, Stapylococcus aureus
KCTC 3881, Enterococcus faecalis KCTC 2011, and
Escherichia coli KCTC 1682 dùng để kiểm tra khả năng kháng khuẩn
- Hoạt động làm sạch DPPH
- solation and identification of a novel bacterium, Lactobacillus sakei
subsp. dgh strain 5, and optimization of growth condition for highest
antagonistic activity. Nghiên cứu đã chỉ ra một số đặc tính của L.sakei DGH5 được phân lập từ thịt bò
sống:
+) Chủng này là vi khuẩn hình que, có vòng vô khuẩn màu vàng, là vi khuẩn gram dương
+) Sinh trưởng trong môi trường có nhiệt độ 10, 15, 450C và tồn tại được ở 600C trong vòng 35 phút
+) Vẫn phát triển được khi ỏ trong môi trường có NaCl 7%
 +) Có hoạt tính catalase và tạo ra được D/L-lactate.

c. Đặc điểm nuôi cấy – Môi trường

- Môi trường MRS agar
B. Tối ưu hóa môi trường để phá triển hoạt tính kháng khuẩn
- Lactobacillus sakei có khả năng kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, điển hình là Listeria
monocytogenes . Để tối ưu hóa khả năng sản xuất bacteriocin, phải tối ưu hóa môi trường nuôi cấy MRS
cũng như khảo sát nhiệt độ và pH khi ủ môi trường.
+) Một số nghiên cứu cho thấy, chủng L.sakei 2a có thể tạo ra các hợp chất kháng khuẩn khác nhau:
sakacin P, a histone-like DNA-binding protein HV produced by L. sake subsp. sakei 23 (Carvalho et al.,
2010)
+) Các yếu tố môi trường: pH, nhiệt độ, các thành phần trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến
lượng bacteriocin. (Abo-Amer et al., 2011).
+) Một số thành phần như: carbohydrate, muối, các chất hoạt động bề mặt, các chất chống oxi hóa khi
them vào môi trường MRS có thể ảnh hưởng, cản trở đến quá trình tạo thành bacteriocin.
 Các yếu tố trên cần được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình sinh bacteriocin: một trong các phương
pháp là sử dụng response surface methodology (RSM)
- Các chất them vào MRS: tween 80, tween 20, Natri citrate, KCl, cysteine.Các chất thêm vào được lựa
chọn dựa trên một số nghiên cứu trước đã cho thấy các chất trên có ảnh hưởng đến sự tạo thành
bacteriocin (Vázquez et al., 2004; Todorov, 2008; Castro et al., 2011)
+) Các thành phần trên được them vào môi trường MRS và được tiệt khuẩn (121 0C trong 15 phút) trừ
cysteine. Riêng Cystein được lọc tiệt khuẩn qua màng lọc 0,22µm.
- Khảo sát pH để tối ưu hóa việc sản xuất bacteriocin:
+) Đánh giá ảnh hưởng của pH trong môi trường MRS: 4.5; 5.0; 5.5; 6.0 được điểu chỉnh bằng dung
dịch HCl 1N đã được tiệt khuẩn.
+) Tất cả các mẫu trên được ủ qua đêm ở 250C trong 18h với L.sakei 2a ( 1% v/v).
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Ủ môi trường MRS đã cấy L.sakei 2a ở 25, 30, 37, 40 oC trong 18h.
Sau khi ủ, pH của môi trường được điều chỉnh đến 6.5 bằng dung dịch NaOH 10N và được đun nóng
đến 800C trong 30 phút. Sau đó ly tâm 10 000 vòng trong 15 phút ở 4 oC để thu lấy sinh khối rồi đánh giá
hoạt tính kháng khuẩn.
- Tối ưu các chất thêm vào môi trường MRS dựa vào phương pháp RSM ( phương pháp đánh giá đáp ứng
bề mặt)
+) 4 yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến hoạt tính sinh bateriocin của vi khuẩn là: glucose, tween 20,
tween 80, nhiệt độ và pH. Kết quả như sau:

Table 1:

Morphological Biochemical Carbohydrate

Reaction Reaction Reaction
test test fermentation
 Thủy phân
Hình thái Que + D-mannose +
arginine
Gram + D/L-lactate + Mannitol -
Sinh trưởng ở 4oC - Tạo Acetoin + Tinh bột -
Sinh trưởng ở 10, Các amin sinh
+ - Glycogen -
15, 45 oC học
Sinh trưởng ở Hoạt tính
- + Melibiose +
pH=3.5 catalase
Sinh trưởng ở Sự hình thành
+ + Inulin -
Nacl 0.7% H2S
Sinh trưởng ở
- D/L-Fuccose -
NaCl 10%
Tồn tại ở 60oC/35
+ Sucrose +
phút

- solation and identification of a novel bacterium, Lactobacillus sakei

subsp. dgh strain 5, and optimization of growth condition for highest
antagonistic activity. Nghiên cứu này cũng chỉ ra các yếu tố để tối ưu hóa hoạt tính đối kháng của
L.sakei subsp. dgh strain 5
+) Các yếu tố được khảo sát là: nhiệt độ , pH, NaCl, polygalcturonic acid,
các nguyên tố vi lượng, nitrate di ammonium, disodium hydrogen phosphate, peptone and yeast extract.
+) Thứ tự về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố như sau
peptone > temperature > Na2HPO4 > trace element > NaCl > polygalacturonic acid > yeast extract > pH
> NH4NO3
+) Theo đó, nhiệt độ, pepton và Na2HPO4 có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính đối kháng của L.sakei.
+) Hoạt tính đối kháng được thể hiện mạnh nhất khi môi trường nuôi cấy có pepton 0,5%, Na 2HPO4
0,5% và 0,1% các nguyên tố vi lượng và có pH = 8 được ủ trong 450C.

C. Cơ chế kháng khuẩn và đặc điểm của bacteriocin

- Tạo ra các chất hữu cơ là sản phẩm chuyển hóa có tính chất kháng khuẩn: acid béo, acid hữu cơ,
hydrogen peroxide và dicetyl (Dunne et al., 2001).
+) Phần lớn có tác dụng trên vi khuẩn gram dương như B. cereus ở nhiều mức độ nhưng lại không có tác
dụng trên E.coli.
+) Một nghiên cứu mới đây cho thấy, Lactobacillus spp ức chế một số vi khuẩn gram âm gây bệnh
(Nikolova et al., 2009).
- Một số đặc điểm của bacteriocin
+) Antibacterial peptides ( AMP’s) được tạo ra từ vi khuẩn, nấm, côn trùng..và có cấu trúc amphipathic
chứa từ 12-120 phân tử amino acid. AMP’s có tác dụng ức chế trực tiếp sự các vi khuẩn , virus phát triển
cũng như các tế bào cung thư.
+) Bacteriocin là 1 phân nhóm của AMP’s và được mã hóa bởi DNA ribosom hoặc plasmid mang hoạt
tính kháng khuẩn. (Villarreal et al., 2008; Carvalho et al., 2010)
+) Bacteriocin có khả năng kháng khuẩn ngay ở nồng độ thấp cỡ pico hoặc nano.
+) Về cơ chế: bacteriocin có khả năng xuyên qua màng tế bào vi khuẩn, phá hủy màng tế bào vi khuẩn
 các ion, ATP và các thành phần cần thiết cho các chức năng chuyên biệt và chuyển hóa tế bào bị thoát
ra ngoài màng.
+) Bacteriocin được chia thành 4 nhóm dựa trên cấu trúc phân tử, trọng lượng phân tử và độ nhạy với
enzyme
Table 1. Classification and general characteristics of bacteriocins

Bactriocin Bacteriocin Molecular Characteristics of Bacteriocin

classes subclasses mass class/subclass

Class I A <5 kDa lantibiotics nisin [16,43]

B marsacydin alametycin
[16,42]
Class II IIa <10 kDa pediocin-like bacteriocins sakacin A, sakacin P [30]
IIb two-peptide bacteriocins lactacin F [30]
IIc sec-dependent bactriocins carno-bacteriocin A [30]
Class III >30 kDa heat-labile protein lactococcin B [31]
bacteriocins
Class IV large protein mixture of protein(s), lipid(s) leucocin S, mesenterocin 52
and carbohydrate(s) in [31]
bacteriocin molecule

Table. 2. Examples of bacteriocins from individual classes produced by LAB, place of LAB strains isolation and the extent of
antimicrobial activity

Produce Strain Source Bacterioci Class of Action of bacteriocin

bacteriocin
r n

E. faecium H41B cheese enterocin A II antagonistic activity against

enterocin P Listeria
spp. [35]

L. gasseri LA 39 faeces of gassericin A IV antagonistic activity against

newborn L. monocytogenes, S. ureus, B.
cereus
[21]

L. acidophilus M 46 faeces of acidocin B IV antagonistic activity against

newborn L. monocytogenes, C. sporogenes,
L. fermentum and Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus [25]
 L. plantarum C 11 fermented plantaricin II b antagonistic activity against
cucumbe JK (PlnJ, indicator strains of L. plantarum
r PlnK) 965, L. sake NCDO 2714, L.
plantaricin viridescens NCDO 1655, L.
EF (PlnE, plantarum UI50 [2]
PlnF)
plantaricin pheromon synthesis induction of Pln J, PlnK,
A e PlnE, PlnF; antibacterial activity
(PlnA) [23]; cytotoxic activity against
cancer cells [45]

L. sakei DSMZ pork, vacuum- sakacin A II a anti- Listeria activity;

6333 packaged antagonistic activity against L.
sake, L. curvatus,
C. piscicola, E. faecalis, L.
monocytogenes
[20,29]

L. lactis ATCC meat nisin I (typ A) a broad anti-microbial

11454 spectrum; is used as food
preservative [42]

Bodaszewska-Lubas M. et al. – Antibacterial Activity of Selected Standard Strains