6.1 Pendahuluan Tahap pertama dal ngisolasi DNA adalah memecahkan dinding se! dan sistem membran yang meliputi inti sel dan plastida. Sel mamalia dan bakteri umumnya sel dapat dipecahkan ‘dengan menggunakan ensim atau detergen. Adapun sel tumbuhan memerlukan aktivitas mekanik yaitu dengan menggerus jaringan di dalam nitrogen cair dengan menggunakan pestel dan mortar. Jaringan yang sudah halus di campur dengan detergen yang bi Jauryl sulfat) atan CTAB (Cetytrimethyl ammonium bromide) yaitu detergen yang sangat keras. Periksa kode resiko dan pengamanannya dalam katalog yang disediakan. SDS juga dapat menyebabkan kompleks dengan protein dan menyebabkan denaturasi protein, sehingga dengan mndah dapat dipre 4 inggi dan dipisahkan dari DNA. Selain detergen buffer ekstraksi juga mengandung senyawa pereduksi seperti 2-mercaptoethanol atau DTT (Dithiothreitol) dan ‘chelating agent’ seperti EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), Senyawa-senyawa ini membantu menginaktifkan aktivitas nuklease yang terdapat dalam setinp sel makhluk hidup. Nuklease dapat menyebabkan degradasi DNA. Pengaruh nuklease juga bisa diminimalisasi dengan bekerja dalam kondisi dingin. Senyawa fenolik pada tumbuhan juga seringkali membuat masalah dalam ekstraksi DNA, Karena sisa senyawa fenolik dapat mengganggu aplikasi selanjutnya. Misalnya jika DNA yang mengandung senyawa fenolik di gunakan dalam PCR seringkali tidak dapat menhasilkan amplikasi yang sempurna. Untuk menghindari senyawa fenolik biasanya dalam buffer ekstraksidigunakan PVP (polyvinylpyrrolidone). Pemurnian DNA dapat menggunakan senyawa fenoi dan kioroform (lihat daiam katatog kode resiko dan pengamanannya) untuk melakukan pemurnian dari sisa protein yang masih ada dalam ekstrak. Adapun DNA dapat dipresipitasi menggunakan etanol atau isopropanol. Setelah dipresipitasi DNA harus dibebaskan dari pelarut organik seperti etanol dan isopropanol dengan menguapkannya pada suhu ruangan, kemudian dilarutkan daiam buffer yang mengandung EDTA untuk proteksi dan buffer dengan pH relatif basa. Ingat, DNA bersifat asam sehingga akan lebih mudah larut dalam kondisi basa. Manipulasi DNA genom dalam tahap ini harus dilakukan sangat hati-hati menghindari rusaknya molekul DNA secara mekanik, beberapa aplikasi seperti untuk membuat pustaka DNA diperiukan ukuran DNA yang relatif panjang yaitu sekitar 15 pasang basa. 6.2 Bahan dan Alat 6.2.1 Bahan ® Jaringan tanaman Ethanol 75% ‘© Bufer ckstraksi: 100 mM Tris-HCI pH 8,0; 500 mM EDTA, 500 mM NaCl, i mM 2- merkaptoetanol pH 8,0. © Isopropanol © Nitrogen eair Fenol:Kloroform:isoamil alkohol (25:24:1)‘© Potassium asetat 5 M © Sodium asetat 3 M pH 5,2 = SDS 20% © Bufer Tris-EDTA (TE) : 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA ‘Tabung eppendorf vortex Freezer -20°C Mikropipet dan tips * Es © Pestel dan mortar Waterbath 69 6.3 Tata kerja 1. Gerus 0,1 g jaringan tanaman sampai menjadi serbuk halus dengan penambahan nitrogen air pada mortar dan pestel. 2, Pindahkan serbuk jaringan tanaman ke dalam tabung eppendorf dan tambahkan 0,75 ml bufer ekstraksi dan 0,1 ml SDS 20%, Setelah itu, kocok tabung menggunakan vortex dan inkubasikan tabung pada suhu 65°C selama 10 menit. Tambahkan potassium asetat sebanyak 0,3 mi ke dalam tabung, kemudian kocok kembali dengan vortex dan inkubasikan selama 10 menit 3. Sentrifuga tabung pada 14.000 rpr: selama 15 menit dan pindahkan supernatan ke tabung. baru. Tambahkan 1 ml isopropanol, kocok tabung dengan tangan dan inkubasikan pada subu -20°C selama 15 menit. Pada tahap ini DNA dapat terlihai seperti gumpaian putih bening, 4, Sentrifuga tabuag pada 20,000 rpm selama 10 menit. Buang supemnatan dan biarkanlah pelst mengering dengan cara membalikan tabung, Larutkan pelet dengan 75 il TE. Senirifuga selama 5 menit pada 14.000 g pada suhu kamar dan pindahican supernatan ie tabung baru. Tambahkan laritan fenol:kloroform:isoamil alkohol dalam volume yang sama, kocoX tabung dan sentrifuga selama 5 menit, Pindahkan fase cair bagian atas ke tabung baru 5. Tambahian 1/10 volume sodium asetat 3 M dan 50 yl ispropanol. Kecok dengan cara membolak-balikan tabung dan sentzifuga pada 14.000 rpm selama 10 menit. Cuci pelet dengan 50 4 etazol dingin 75% dan keringkan pelet. Larutkan dalam 20 al TE. Daftar Pastake