Cong Nghe Enzyme Nguyen Duc Luong PDF

NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Chủ Biên )
CAO CƯỜNG - NGUYỄN ÁNH TUYẾT - LÊ THỊ THỦY TIÊN - TẠ THU HANG
HUỲNH NGỌC OANH - NGUYEN THỦY HƯƠNG - PHAN THỊ HUYÊN
A _
C Ô N G N G H Ệ i :\ 7 Y M
í* * " *** m m9
20000034(4
s NHÀ XUẢT BÀN

OẠI HỌC QUỐC GIA TP. Hồ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ồ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
N guyễn Đức Lượng (Chủ biên) - Cao Cường

N guyễn Á nh T u y ết - Lê Thị T hủy T iê n - H u ỳ n h Ngọc O anh
N g u y ễn T húy H ương - P h a n T hị H u y ền - T ạ T hu H ằ n g
CÔNG NGHỆ ENZYM
■5 ^
NHÀ XUẤT BẲN ĐẠI HỌC QUỐC GIA

TP HỒ CHÍ MINH - 2004
MỤC LỤC
LỜỈ NÓI ĐẦU 5
Chương 1 NHỮNG HlỂư BIẾT c ơ BẢN VỀ ENZYM

1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzym 7
1.2 Khái niệm về enzym 8
1.3 Cơ chế tác dụng của enzym 32

1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại enzym 52
ị
1.5 Phương pháp tách và làm sạch enzym trong nghiên cứu
1.6 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzym 59
Chương 2 NHỮNG PHƯƠNG PHÁP VÀ KỶ THUẬT c ơ BẢN
TRONG CỒNG NGHỆ ENZYM
2.1 Nguyên liệu sản xuất một số enzym quan trọng 62
2.2 Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong công nghệ enzym 73
Chương 3 ENZYM c ố ĐỊNH (ENZYM KHÔNG HÒA TAN)
3.1 Chuyển hóa sinh học 97
3.2 Đặc điểm của enzym không hòa tan 100
3.3 Phương pháp tạo enzym không hòa tan 102
3.4 ứ ng dụng của enzym không hòa tan 134
Chương 4 THƯ NHẬN ENZYM TỪ NGUỒN THựC VẬT
4.1 Thu nhận enzym amylase 146
4.2 Thu nhận enzym bromelin từ thực vật (E.c.3.4.4.24) 167
4.3 Thu nhận enzym papain (E.c.3.4.4.10) 185
4.4 Thu nhận enzym flcin (E.c.3.4.22.3) 216
Chương 5 THU NHẬN ENZYM TỪ NGƯON ĐỘNG VẬT
5.1 Đặc điểm nguồn enzym động vật 231
5.2 Một sô" tính chất của enzym từ nguồn động vât 240
Chương 6 THU NHẬN ENZYM TỪ VI SINH VẬT
6.1 Nguyên lý tổng hợp enzym ở v sv 288
6.2 Vi sinh vật trong công nghiệp enzym 295
6.3 Một số kỹ thuật chung trong nuôi cấyvsv... 296
6.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ v s v 308
Chương 7 ỨNG DỤNG ENZYM
7.1 Úng dụng enzym trong công nghiệp thực phẩm 398
7.2 ứ ng dụng enzym trong phân tích và trong y học 482
7.3 Úng dụng enzym trong kỹ thuật di truyền 499
7.4 Một số ứng dụng khác của enzym 511
Chương 8 THỊ TRƯỜNG ENZYM VÀ CÔNG NGHỆ ENZYM
TRONG TƯƠNG LAI
8.1 Thị trường enzym 521
8.2 Công nghệ enzym trong tương lai 526
TÀI LIỆU THAM KHẢO 533
LỜI NÓI ĐẦU
Enzym là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình
sinh trưởtig, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng uaì trò rất quan
trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật
phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi tìiẨỜng.
Nghiên cứu, sản xiiất enzym và ứng dụng enzym được phát
triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sần xuất enzym
đã đem lại nhừng lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước. Việt Nam là một
trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzym. Tuy
nhicn, nền công nghiệp enzym cửa ta chưa thực sự phát triển.
Cuốn sách CÔNG NGHỆ ENZYM được biên soạn trên cơ sở
những kiến thức và công nghệ sản xuất, ứng dụng enzym của nhiều
nước trên thế giới, nhằm cung cấp cho sinh viên ngành Công nghệ
thực phẩm, Công nghệ sinh học và những cán bộ khoa học có liên
quan những hiểu biết mới nhất về những vấn đề trên.
Cuốn sách CÔNG NGHỆ ENZYM gồm tám chương do PGS.TS
Nguyễn Đức Liỉợng chủ biên và các cán bợ giảng dạy Bộ môn Công
nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khocBLr Đại học Quốc gia TP Hồ
Chí Minh biên soạn.
Chươìig i, 2, 7, 8: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Chitơng 3: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng, Cử nhân Cao Cường
Chương 4: T h .s Lẽ Thị Thtiy Tiên? KS Tạ Thu Hằng, PGS.TS
Nguyễn Đức Lượng
Chương 5: T h .s Huỳnh Ngọc Oanh, PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Chỉtơììg 6: Th.s Nguyễn Ánh Tuyết, Th.s Phan Thị Huyền ỉ
Th.s Nguyền Thúy Hi&mg, PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Trong quá trình biên soạn, chúng tôi rất cố gắng trong việc
trình bày nhừng kiến thức, kỳ thuật mới và có hệ thống. Tuy nhiên,
lẩn đầu xuất bản chắc không thể không có sai sót. Chúng tôi rất
mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng để nhừng lần tái bản
sách hoàn chỉnh hơn.
Mọi ỷ kiến xin gửi vê: Bộ môn Công nghệ sình học, Trường
Đại học Bách khoa - Đại học Quốc gia TP HCM, 268 Lý Thường Kiệt,
Q I O, TP HCM.
Điện thoại: 8 639 341; 0913 742 766.
Chủ biên
PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Chương 1
NHỮNG HIỂU BIẾT c ơ BẢN VỀ ENZYM
1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN cứu VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ ENZYM
Bảng 1.1 Những cột mốc thời gian quan trọng trong nghiên cứu
và phát triển môn emym học
stt Năm Nộf dung nghién cứu, phát triển
1 1833 Pay en và Persoz tách được diatase từ malt

2 1874 Hansen là người đẩu tiên tách được renet từ bao tử cừu
3 1876 Kiihne là người đấu tièn dề nghị gọi chát xúc tác sinh học ià enzyme
Hai anh em Buchner chứng mỉnh dịch chiết tử nấm men có thể
4 1897
chuyển hóa dường glucose thành cồn và CO2
5 Đầu năm 1900 Rohm sử dụng enzym protease trong công nghệ thuộc da
6 1913 Rohm là người đầu tiên sử dụng enzym trong chất tẩy rửa
7 Thể chiến lần thử nhất Weitzman sản xuất aceton ở Anh
Boidỉn và Effront nghiên cứu a.amylase của B.Subtilis và ứng
8 1917
dụng trong ngành dệt
9 1920- 1928 WilUSIitter tinh sạch được enzym
Samner kết tinh được urease
10 1926
Northrop kết tỉnh dược protease
11 1928 Fleming phát hiện ra penicilline
Bắt đẩu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp, sử
12 Thế chiến lần thử hai dụng amyloglucosidase đường hóa tinh bột. Sử dụng
penicỉllineacylase trong sản xuất penicillins
Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sàn xuất amino
13 1969 acid. Sừ dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch
đường gỉảu fructose
Boyer et al. đưa ra kỹ thuật dỉ truyển. Kỹ thuật này có tốc động
14 1972
tích cực cho công nghệ enzym
15 1973 Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào
Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein
16 1984 Nito xác lập quả trình cơ bản tạo acry-lamide và một loạt các
quá trình sản xuất cỏ sự tham gia của enzym
Đã phát hiện ra hàng trăm loại enzym khác nhau, đã đưa vào
sàn xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzym trong sàn
17 Từ năm 1984 đến nay xuất và đởi sống. Kỹ thuật enzym cố định, tế bào cô' định đã
đưa công nghệ enzym dạt được nhiều kết quà cao.
a Chương ỉ
Enzym học là mồn học nghiên cứu về vật chất phân tử có hoạt
tính sinh học. Môn học này phát triển rất mạnh nhờ nhữtig thành tựu
của môn hóa sinh học, vi sinh vật Học, di truyền học và cả những tiến
bộ của ngành hóa hoc và vật ỉý học. Những cột mốc quan trọng trong
nghiên cứu và phát triển môn enzym học được liệt kê trong bảng 1 . 1 .
1.2 KHÁI NIỆM vé ENZYM

1.2.1 S ỉn h v ậ t n h ư m ộ t b ệ th ố n g m ờ tạ o th à n h enzym
Sinh vật được phân ra hai nhóm dựa theo cấu tạo cơ thề của chúng:
- Sinh vật đa bào
- Sinh vật đơn bào.
Mặc dù chúng có sự khác biệt rấ t lớn về cấu tạo cơ thể và những
đặc điểm sinh lý khác nhung chúng đều giống nhau về trao đổi chất
với môi trường bên ngoài và một số đặc điểm về biến dị, di truyền.
Sinh vật được xem như là một hệ thông mở có liên quan chặt
chẽ đến quá trình trao đổi chất của cơ thể ồ trong tế bào, và giữa tế
bào với môi trường bên ngỡài. Quá trình trao đổi chất bên trong tế
bào và giữa tế bào với môi trường bên ngoài, là biểu hiện sinh động
nhất của sự sông. Sự khác nhau giữa tế bào sống và vật chất không
phải sự sống chính là khả năng trao đổi chất này. Khi cơ thể không
còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Do đó, mối quan hệ
giữa cơ thể với bên ngoàỉ là mối quan hệ hữu cơ.
Quá trình trao đổi chất bao gồm quá trình dị hóa và quá trình
đồng hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân giải vật chất để cung
cấp cho tế bào năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào, quá trình này
có thể xảy ra trong tế bào hoặc ở ngoài tế bào.
Quá trình dị hóa xảy ra trong tế bào, là quá trình cung cấp năng
lượng, vật chất, cho quá trình tổng hợp vật chất để tạo ra sinh khối
nhằm làm đổi mới vật chất tế bào.
Quá trình dị hóa ngoài tế bào, phần lớn chỉ nhằm đáp ứng nhu
cầu về vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp các chất trong tế bào. Năng
lượng tạo ra từ quá trình dị hóa ngoài tế bào thường được giải phóng
ở dạng nhiệt năng.
N hững h iể u b iế t cơ b ả n về enzym 9
Quá trình tổng hợp vật chất cho tế bào ch! xảy ra trong tế bào.
Quá trình này thường phải thu nhận năng ỉượng từ các phản ứng do
quá trình dị hóa. Như vậy, quá trình trao dổi chất được xem như hệ
thấng mở của sinh vật đối với môi trường xung quanh.
Dị hóa
ngoài tế bảo
Vật chát dỊ hóa

ra khỏi tế bào
Vật chất có Vật chất tổng hợp

kích thước nhò ra khỏi tế bào
Sinh khối
Môi trường Sản phẩm bậc 2
(sản phẩm bậc 1)
Hình 1.1 Hệ thống mở cảa tế bào sinh vật
Như vậy, trong quá trình trao đổi chất của tế bào có những điểm
cần luu ý.
Quá trình trao đổi chất tạo ra hai dạng sản phẩm:
- Sản phẩm bậc một
- Sản phẩm bậc hai.
Sản phẩm bậc một, là các sản phẩm được tạo ra cầ trong quá
trình phân giải và cả trong quá trình tổng hợp. Các sản phẩm này sẽ
được tham gia trực tiếp tạo nên vật chất tế bào và tham gia vào các
quá trình tế bào.
Sản phẩm bậc hai, là các sản phẩm cũng được tạo ra từ quá
trình tổng hợp và quá trình phân giải của tế bào. Trong quá trình
tổng hợp, một số vật chất được tạo ra không tham gia vào quá trình
trao đổi chất tiếp theo, mà sẽ được thoát ra khỏi tế bào. Hiện tượng
này được coi như quá trình sinh tổng hợp thừa. Hiện tượng sinh tổng
hợp thừa có liên quan chặt chẽ đến hệ di truyền có trong tế bào. Do
đố, việc điều chỉnh hệ di truyền, nhiều khỉ ta điều chỉnh hệ gen sẽ thu
đựợc lượng lớn các sản phắm sinh tổng hợp thừa. Một số vật chất
được tạo ra do quá trình phân giải sẽ không tham gia vào quá trình
10 Chương 1
trao đổi chất mà nằm ở ngoài tế bào (quá trình dị hóa ngoài tế bào).
Một sô" vật chất khác thoát ra khỏi tế bào vào môi trường (quá trình
dị hóa trong tế bào).
Quá trình trao đổi chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài
tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục của vật chất trong thiên nhiên.
Quá trình chuyển hóa theo con đường sinh vật đóng vai trò râ't quan
trọng trong rấ t nhiều chu trình chuyển hóa các chất có trong thiên
nhiên. Các phản ứng sinh học xảy ra thường xuyên không chỉ ở trong
tế bào sinh vật mà cả ở ngoài môi trường, bao quanh tế bào đó. Các
phản ứng sinh học này, được xúc tác bởi một loại protein đặc biệt
được gọi là enzym. Các enzym tham gia các phản ứng ngoài tế bào
được gọi là enzym ngoại bào. Các enzym thực hiện trong tế bào gọi là
enzym nội bào. Cả enzym nội bào và enzym ngoại bào đều được tổng
hợp trong tế bào.
1 .2.2 B ản c h â t sin h học enzym
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về enzym, và đã đi đến

thống nhất: enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và
tham gia vào các phản ứng sinh học.
Như vậy, bản châ't sinh học của enzym là sản phẩm của các
quá trìn h sinh học, và thực hiện các phần ứng sinh hóa trong và
ngoài tế bào sinh vật. Các loại enzym đều có những đặc tính sinh
học chung như sau:
a- Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật. Quá trình tổng hợp
enzym là một quá trình hết sức phức tạp và được điều khiển, kiểm
soát rấ t chặt chẽ. Quá trình tổng hợp enzym trong tế bào sinh vật sẽ
được trình bày kỹ ở phần sau.
b- Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi
enzym được tách khỏi tể bào sống.
C' Enzyfn tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa. Vì
trong quá trình sấng của tế bào, enzym được tổng hợp và hoạt động
trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của cơ thể. Nhiệt độ
của cơ thể và của tế bào sinh vật thường là nhiệt độ thấp. Phần lớn
nhiệt độ cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30-40°C.
d- Enzym có thể tham g ià xúc tác các phản ứng trong và ngoài
cơ thể từ gmi đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng
lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình chuyến hóa này
được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi
một loại enzym. Các enzym này lần ỉượt thay nhau xúc tác đế các
phản ứng lần lượt xảy ra, đề cuối cùng tạo thành C02, H20 , một số
chảt khác và giải phóng năng lượng. Cũng có thề chuỗi phản ứng sẽ
tạo thành những chu kỳ chuyến hóa khép kín. Trong chuỗi chuyên
hóa hở hay chuỗi chuyến hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước
sẽ ỉà cơ chất cho phản úng sau.
c- Enzym có thể được thực hiện một phản ứng. Các phản ứng
này thường xảy ra ớ ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống
nghiệm). Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzym đơn (một
phán ứng) mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng.
f- Phản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng licợng rất
ỈL Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bỏi các chất xúc
tác hóa học đòi hỏi nâng lượng rất lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của
enzym, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng
ỉượng ôn hòa.
g- Eiizym chiu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứtig.
Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzym. Mỗi một enzym quyết định
một phản ứng sinh hóa. Các nhà khoa học đưa ra cơ chế này như sau:
Một gen » một cnzym ----- ► một phản ứng
Như vậy, gen sẽ quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa
học của enzym. Cơ chế này có một ý nghĩa rấ t lớn trong việc điều
khiển tổng hợp enzym trong tế bào sinh vật. Phần này chúng tôi sè
trình bày kỹ trong những phần sau.
1.2.3 Bản chất hóa học enzym
Nếu tách enzym ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành
phần hóa học của chúng, ta sẽ thấy chúng thuộc hai nhóm.
1- Nhóm enzym đơn cấu tử
Thuộc nhóm này bao gồm những enzym chỉ được cấu tạo một
thành phần hóa học duy nhất là protein. Những enzym được tạo
thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzym đơn cấu tử.
12 Chương 1
2- Nhỏm enzỵm đa cấu tử

Thuộc nhóm uày bao gồm những enzym có hai thành phần:
- Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzym
- Phần thử hai là thành phần không phải protein. Phần này
thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình
xúc tác.
Ở những enzym đa cấu tử, phần apoenzym đóng vai trò xúc tác
tohimg nếu thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu cơ đặc hiệu) thì
enzym không thể hoạt động được. Chính vi thế, chất hữu cơ đặc hiệu
này còn được gọi là châ't cộng tác (cofactor). Các chất hữu cơ đặc hiệu
này có thể gắn rấ t chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất lỏng lẻo
với phần protein. Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành
thấm tích qua màng. Ở đây xảy ra hai hiện tượng:
- Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt vào protein bằng liên kết
đồng hóa trị được gọi là nhóm phụ {prosthetic).
- Những chat hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ
dàng tách chúng khỏi protein được gọi là coenzym.
Tuy nhiên sự phân biệt này chỉ mang tính chất tương đối. Ngoài
ra các nhà khoa học cũng cho thấy, trong thành phần của enzym có sự
hiện diện một số kim loại. Các kim loại này thường là một trong
những thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu. Ví dụ, trong hệ enzym
cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân
porphyrin. Các kim loại có trong thành phần của enzym thường rấ t dề
tách ra khỏi enzym. Trong trường hợp enzym m ất kim loại, chúng sẽ
m ất hoạt tính. Khi ta đưa các kim loại tương ứng vào các enzym, hoạt
tính enzym lại được khôi phục. Tính chất này mang tính chất thuận
nghịch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzym vẫn chưa thực
sự làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cũng cho rằng, có thế
kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa
apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển
điện tử, như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase.
N hững h iể u b iế t cơ b ản về enzym 13
B ảng số 1,2 Một số enzym C.Ó chửa kim loại
stt Enzym Kim loại
1 Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe)

2 Polyphenoloxydase Đổng (Cu)
3 Carbonic anhydrase Kèm (Zn)
4 Peptidase Manganese (Mn), sắt (Fe),

magnesium (Mg)
5 Phosphatase Magnesium (Mg)
6 Arginase Manganese (Mn)
1.2.4 C ấu tr ú c enzym
7- Trung tám hoạt động
Enzym là loại protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống như cấu
trúc bình thường của một protein, enzym còn có cấu trúc rất đặc biệt,
liên quan đến hoạt động của enzym. Không phải toàn bộ các phần của
enzym tham gia vào hoạt động xúc tác, mà ọhỉ có những bộ phận rất
đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein enzym mới tham
gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm
hoạt động của enzym.
Trung tâm hoạt động của enzym bao gồm:
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp
với cơ chất.
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc
trực tiếp với cơ chất nhưtig có chức năng trực tiếp trong quá trình
xúc tác.
Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc
không gian thích hợp với khả năng xúc tác. Nếu bị tác động bởi các
điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ các chất, bộ khung này
sẽ biến đổi cấu trúc không gian. Từ đó làm thay đối sâu sắc hoạt tính
enzym. Phần của phân tử enzym không có liên quan đến hoạt tính
enzym, nếu bị tác động, bị m ất đi hoặc bị biến đổi sẽ hoàn toàn
không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym.
14 C hương 1
Trưng tâm hoạt động của enzym thường chứa các amino acid có
nhóm hóa học hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine,
cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan. Các
nhóm hóa học này hoạt động có khả năng gắn với cơ chất để tạo
thành phức chất enzym - cơ chất. Những nhóm hóa học hoạt động
mạnh bao gồm:
- Nhóm -8-NH2 của lysine
- Nhóm -SH của cysteine
- Nhóm Ỵ-carboxyl của glutamic acid.
Các gốc amino acid tạo ra trung tâm hoạt động của enzym
thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc
cấp một). Trong thực tế, chuỗi polypeptide của enzym tồn tại d trạng
thái không gian (cấu trúc cấp ba và cấp bốn), nên các amino arid này
thường tồn tại gần nhau theo cấu trúc không gian. Do cấu trúc không
gian như vậy, trung tâm hoạt động được tạo thành.
Trong trung tâm hoạt động của enzym người ta còn thấy có ion
kim loại. Các ion kim loại có m ặt trong trung tâm hoạt động của
enzym có vai trò xúc tác rất lớn.
Ngoài các gổc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học còn
cho thấy các nhóm chức của coenzym cũng được coi như một thành
phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzym.
Môi một enzym thường có một trung tâm hoạt động. Tuy nhiên,
cũng có những enzym có hai trung tâm hoạt động (alcohol hydro-
genase cửa gan), thậm chí có enzỷm có tới bốn trúng tâm hoạt động
(alcohol dehydrogenase của nấm men).
Cấu trúc không gian của enzym đã tạo ra trung tâm hoạt động
của enzym, tham gia vào quá trình xúc tác bao gồm các amÌTin ad d
tham gia xúc tác, các ion kim loại và nhóm chức của coenzym. Tuy
nhiên, còn một vấn đề khác là các trung tâm hoạt động của enzym sè
hoạt động như th ế nào?
Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động có liên quan đến cơ
chât. Các nhà khoa học khi nghiên cứu vấn đề này đã ra ba quan
điểm quan trọng:
N hữ ng h iể u b iế t cơ b ản về enzym 15
a- Chỉ những cơ chất có cấu trúc phăn tử thích hợp với trung
tâm hoạt động của enzym mới có thế kết hợp với trung tâm hoạt động
của enzym để tạo thành phức hợp enzym-cơ chất. Phản ứng xúc tác
chỉ xảy ra khi cơ chất đã gắn vào được trung tâm hoạt động của
enzym. Theo quan điềm này, cơ chất có cấu trúc phân tử trùng với
trung tâm hoạt động là hiện tượng kết hợp rất chặt chẽ và mang tính
đặc hiệu cao. Chính vì thế, mỗi loại enzym chỉ có thể tham gia xúc tác
phản ứng cho một loại cơ chất nhất định.
fr' Các loại enzym thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu
trúc không gian nhất định. Các trung tâm hoạt động này thường được
hình thành sẵn ở các enzym. Chính những trung tâm hoạt động của
enzym quyết định cho phép những cơ chất cấu trúc tương ứng với
trung tâm hoạt động mới được kết hợp vào. Quan điểm này do Fisher
đề xướng. Thuyết của Fisher tuy đã giải thích được các hiện tượng gắn
kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym, nhưng nhiều kết
quả thực nghiệm, thuyết này chưa giải thích được trọn vện.
c- Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland dược
nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn. Theo thuyết này, các nhóm chức
năng của trung tâm hoạt động của enzym tự do chưa có thể tham gia
xúc tác ngay. Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu
trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym. Chính tác động
cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức
của trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp,
chính xác để gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá
trình xúc tác.
Như vậy, Kosland cho rằng trung tâm hoạt động của enzym chỉ
dược tạo th àn h khi có sự tác động cảm ứng của cơ chất. Chính cơ
chế mềm dẻo này của trung tâm hoạt động đã giải thích dược sự
cạnh tranh giữa cơ chất và các chất không phải cơ chất nhưng lại có
cấu trúc không gian giông cơ chất. Khi đó, các chất giông cơ chất
chiếm chỗ trong trung tâm hoạt động của enzym và phản ứng cơ
chất không xảy ra.
16 Chưctog 1
Trung tâm hoạt động
Cơ chất
[S] [ESI
t
Hình 1,2 Mô hình của Fisher giải thích cơ chế tác động của enzym với cơ chất
Cơ chất
[S] ỈES]
Hình 1,3 Mô hình cửa Kosỉand giải thích tính chất mềm dẻo
cửa ernym khi kết hợp với cơ chất
Chát giống
cơ chất
Hình 1A Mô hình cửa Kosỉand giải thích sự kết hợp giữa enzym
và chất giống cơ chất
2- Cấu trúc đa nguyên

Có nhiều enzym có cấu trúc bậc bốn do nhiều đơn vị enzym
tạo th àn h , mỗi đơn vị nhỏ này là một polypeptide. Các đơn vị nhỏ
này có th ể giông nhau và cũng cổ thể khác nhau. Enzym câ\i trúc
đa nguyên được gọi là enzym multime, các đan vị nhỏ cấu thàn h
multime gọi là protome. Các multime có th ể từ 2-4 protome, cũng
có th ể có tới 12 protome.
Các multime chỉ có khả năng xúc tác khi các protome tạo ra
chúng tồn tại nguyên vẹn. Nếu các protome bị phân ly, tách rời khỏi
multime, hoạt tính xúc tác của multime sẽ giảm hoặc bị m ất tác dụng.
3- Cấu trúc dị lập thể
Một sô" enzym không chỉ có trung tâm hoạt động mà còn có
trung tâm điều khiển hoạt động của trung tâm hoạt động. Các enzym
này được gọi là enzym dị lập thể. Trung tâm điều khiển hoạt tính xúc
tác của trung tâm hoạt động gọi là trung tâm điều khiển hay trung
tâm dị lập thể.
Hai loại trung tâm này có cấu trúc hoàn toàn khác nhau, nhưng
lại hỗ trợ lẫn nhau trong việc điều hòa các phản ứng xúc tác.
Các enzym đi lập thể thường có cấu trúc bậc bốn do nhiều đơn vị
nhỏ tạo nên. Chúng liên kết với nhâu không phải bằng liên kết đồng
hóa trị, chính vì thế chúng có thể tách ra và nhập lại. Tính thuận
nghịch này tạo cho enzym dị lập thể dễ uốn và có khả năng tồn tại ở
nhiều trạng tháỉ không gian khác nhau.
4- Phức hợp multienzym
Trong cơ thể sinh vật còn tồn tại một phức hợp đa enzym được
gọi chung tên là multienzym. Phức hợp này bao gồm nhiều enzym cấu
thành, có liên quan với nhau trong cơ chế chuyển hóa của một quá
trình nhất định. Các phức hợp enzym này thường tham gia các quá
trình chuyển hóa trong cơ thể như:
• Quá trình khử carboxyl oxy hóa của pyruvic acid dể tạo thành
acetyl coenzym A.
• Quá trình tổng hợp acid béo ngoài ti thể ở các loài nâ'm men,
động vật có vú, các loài chim.
• Quá trình các peptide có hoạt tính kháng sinh như gramicidin
và tirocidin.
• Quá trình tổng hợp tryptophan và rấ t nhiều quá trình khác.
Phức hợp enzym tham gia quá trình khử carboxyl oxy hóa của
pyruvic acid gồm ba loại enzym:
- Pyruvate dehydrogenase -------------
- Transacetylase
- Dihydrolipoate dehydrogenase.
18 Chương 1
Phức hợp enzym này có trọng lượng phân tử là 4.000.000 và có

cấu trúc rấ t phức tạp. Chính vì sự phức tạp như thế, các nhà khoa học
đưa ra giả thuyết, các sản phẩm của quá trình chuyển hóa do phức
hợp enzym này thường không tách khỏi ngay phức hợp enzym mà
thường gắn với chúng.
Phức hợp enzym trong chu trình phức hợp chất béo ngoài ti thể
bao gồm sáu phân tử enzym: ACP-acyỉtransferase; acetoacyl-ACP
synthase; ACP-mononyl transferase; acetoacyl-ACP reductase; enoyl-
ACP hydratase; enoyl-ACP reductase.
Ngoài sáu enzym trên, trong phức hợp này người ta còn tìm
thấy một loại protein không có khả năng xúc tác sinh học.
Phức hợp multienzym trong quá trình tổng hợp tryptophan bao
gồm hai enzym có hoạt tính xúc tác riêng, tham gia các phản ứng
khác nhau. Trong phức hợp này, phản ứng toàn phần được thực hiện
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối. Indol là sản phẩm trung gian
được tạo thành, được chuyển trực tiếp từ protein này sang protein
khác của phức hợp enzym và không được giải phóng vào môi trường
phản ứng. Indol khi đó được giữ lại trên phức hợp enzym, nhờ đó mà
tốc độ phản ứng được tảng lên rấ t nhiều.
1.2.5 C ác tiề n c h ấ t c ủ a enzym
Ở rấ t nhiều sinh vật, enzym được tổng hợp nên thường có khả
năng tham gia các phản ứng xúc tác ngay. Tụy nhiên cũng có nhiều
sinh vật, nhất là động vật có vú, một số enzym khi tổng hợp ra không
có khả năng xúc tác ngay mà phải trải qua một giai đoạn biến đổi
nhất định mới có khả năng xúc tác.
Những enzym được tổng hợp mà chưa có khả nÃTìg tham gia xúc tác
ngay được gọi là tiền enzym (proenzym, zymogen). Những proenzym phải
được biến đổi mới có khả năng xúc tác. Quá trình biến đổi này bao gồm:
- Thủy phân liên kết peptide
N hững h iể u b iế t cơ b ản vể enzym 19
- Loại bỏ một vài đoạn peptide có tác dụng kìm hãm hoặc che
lấp trung tâm hoạt động của enzym. Sau khi bị biến đổi, trọng lượng
phân tử enzym thường nhỏ hơn trọng lượng phân tử tiền của enzym.
Quá trình biến đổi này là quá trình hoạt hóa enzym. Khi đó,
trung tâm hoạt động của enzym sẽ không bị che lấp và sẵn sàng tham
gia quá trình xúc tác.
Cơ chế tạo ra tiền enzym ở động vật có vú được xem như cơ chế
tự bảo vệ của cơ thể. Các tiền enzym này dược tạo thành ở các tuyến
sinh học của cơ thể nhưng lại hoạt động ở đường tiến hóa. Nếu các
tuyến sinh học tạo ra enzym thủy phân ngay mà không qua giai đoạn
tiền enzym, các enzym này sẽ phá hủy cấu tạ« các tuyến, và như vậy
hệ thống các tuyến sẽ bị tổn thương, quá trình tĩỊu hóa sẽ không được
thực hiện.
2- Pepsinogen và quá trình hoạt hóa chúng tạo rfếj>epsin
Pepsinogen là tiền chất của pepsin. Chúng có phân tử lượng vào

khoảng 42.000. Pepsin là enzym protease, là sản phẩm chuyển hóa từ
pepsinogen, chúng có phân tử lượng vào khoảng 35.000. So với
pepsinogen, pepsin có tính acid cao hơn. Quá trình hoạt hóa
pepsinogen được thực hiện trên cơ sở loại bỏ một phần năm phân tử
pepsinogen. Cơ chế của quá trình hoạt hóa pepsinogen đã được nghiên
cứu từ khá lâu. Có hai cách hoạt hóa pepsinogen: acid hóa pepsinogen
hoặc cho thêm pepsin có sẵn vào môi trường chứa pepsinogen.
Quá trình xảy ra khi pH = 2. Cơ chế hoạt hóa pepsinogen khi có
m ặt của pepsin như sau:
Pepsin
Pepsinogen Phức hợp pepsin - chất ức chế - 5 peptide
* Khi pH<5,4
Phức hợp pepsin - chất ức cflế pepsin-chất ức chế
Khi pH>5,4
Pepsin
Chất ức chế 4 peptide
20 Chương 1
Chất ức chế là một pepsin có trọng lượng phân tử khoảng 3240,

bao gồm 29 amino acid. Trong đó có một gốc arginine, một gốc
tyrosine, bốn gôc lysine, bốn gốc aspartic acid và hai gốc glutamic
acid. Cùng với sự tạo thành chất ức chế, quá trình hoạt hóa trên còn
tạo ra năm peptide nhọ khác. Các peptide này là các peptide trung
tính, trung bình có khoảng 10 amino acid. Trọng lượng phân tử của
toàn bộ năm peptide ngắn này vào khoảng 4.000.
Cùng với sự thủy phân chất ức chế, toàn bộ quá trình hoạt hóa
sẽ làm đứt chín liên kết peptide. Toàn bộ quá trình hoạt hóa được
trình bày theo hình 1.5.
Pepsinogen (trọng luợng nhân tử 42000)
r~ ~ — 7 " , '~ ~ ~
+Leu - He ........ Leu - Glu ........lie - Gly - Asp - Asp - His - Glu ......... Val - Leu - Aia -
1
5 peptide
"2 l '
C hất kỉm hãm
XPepsin
(trọng lượng phân (trọng lượng phân (trọng lượng phân
tủ 4000) tử 3200) tử 35000)
H ìn h 1.5 Quá trình hoạt hóa pepsinogen thành pepsin
2-Trypsỉnogen và quá trình hoạt hóa chúng tạo thành trypsin

Trypsinogen là tiền chất của trypsin. Chúng được tạo ra trong
tuyến dịch và khi đến hệ tuần hoàn sẽ được hoạt hóa đế tạo ra
trypsin. Trypsinogen được hoạt hóa bởi:
- Trypsin (trường hợp này giống như trường hợp của pepsin). Quá
trình hoạt hóa này cũng được gọi là quá trình tự hoạt hóa hay trình tự
xúc tác.
- Enteropeptidase
- Kinase
- Một số enzym từ dịch ruột.
Trong quá trình tự xúc tác, có thể xảy ra hai phản ứng có khả
năng cạnh tranh nhau.
Phản ứng tạo ra trypsin:
Trypsin
Trypsinogen ----- — ► Trypsin + hexapeptide
(hoặc Kinase)
Phản ứng tạo ra protein không hoạt động:
Trypsin
Trypsinogen Protein không có hoạt tính enzym
Trong quá trình hoạt hóa, liên kết peptide giữa lys và isoleucine
bị bẻ gãy, từ đó sẽ tạo ra trypsin và peptide ngắn. Toàn bộ quá trình
hoạt hóa này được trình bày ở hình 1 .6 .
T rypsinogen
+ V a ỉ - A s p - A s p - A s p - A s p - L y s - I l e - V a l - G ly
u
Peptide T rypsin
Hình 1.6 Quá trình hoạt hóa trypsinogen thành trypsin
3- Chymotrypsinogen và quá trinh hoạt hóa chúng tạo thành

chimotrypsin
Trong dịch tụy của bò tồn tại hai loại chymotrypsinogen:
- Chymotrypsinogen A; chymotrypsinogen B.
Chymotrypsinogen A là một chuỗi polypeptide đơn, chúng bao
gồm 249 amino acid. Quá trình hoạt hóa chymotrypsinogen không
phải là quá trình tự hoạt hổa. Từ chymotrypsinogen A, sau khi được
hoạt hóa sẽ tạo ra a,p,ô và n chymotrypsin. Trong khi dó,
chymotrypsinogen B t sau khi hoạt hóa thành chymotrypsin B. Các
dạng chymotrypsin đều đã được kết tinh. Cơ chế hoạt hóa
chymotrypsinogen theo trình tự sau:
Đầu tiên, một chuỗi đdn của chymotrypsinogen được bẻ gãy, tạo
thành ba chuỗi mở của a-chymotrypsin. Các chuỗi này dược kết hợp
với nhau bằng các cầu nối disulíủr. Người ta dễ dàng tách các cầu nối
này bằng acid performic. Ba chuỗi này được ký hiệu A,B,C. Chuỗi A có
13 amino acid; chuỗi c có 180 amino acid.
Trong quá trình hoạt hóa nhiều bộ phận khác nhau của chuỗi
polypeptide đã được xếp gần nhau, tạo ra trung tâm hoạt động của
enzym.
Toàn bộ quá trình hoạt hóa được trình bày ở hình 1.7.
22 Chương 1
1 T 1
Tyr (S S )4 lie
-1 h -------T r
Thr 0 A rg
1
ASn s Ser
1 1 1
L . ASn Cys — —-
1 I
COOH NH?
Chym otrypsinogen
1 —V 1 1 11 1
T yrC O O H (S S )4 tie TyrCO O H (S S )4 UeNH2
h - T r 1 1
A rg Thr A rgC O O H
1 1 1
Thr — A Sn + < <
Ser ASn Ser
A la NH„ 1 Ch !**■ Ch
ì1 1 1
1 1'» A S n Cys Leu A ta C y s ------ — Leu
1 í ASn
COOH n h 4
1
COOH
N eochym otrypsinogen 71 - C hym otrypsin + Ser - Arg
Tr + ch
\ ^ s ì\ -chym otrypsin + Ser - Arg
Ch
I- I I
TyrC O O H (S S )4 lleN H ,
I
A. s LeuCO O H
A la N H X j
’ ASn Cys 1 1 11
I I
COOH nh4 Ch: chym otrypsin, Tr: Trypsin
a - chym otrypsin
H ình 1.7 Cơ chế ỉioợt hóa chỵmoirypsiIìogvìì thành a-chyniotrypsin
Ngoài các tiền chất cuaenzym như đà trình bày trên còn có một
loạt các tiền chát khác như prorennin, procarboxypeptidease, đều có
khắ năng tự hoạt hóa đê tạo thành enzym.
Các proenzym hay-zymogen thường là những protease. Các tiền

chất này thường được tổng hợp ở tụy tạng, bao tử. Mỗi một proenzym
thường có một enzym hoạt hóa riêng. Các proenzym và các enzym
hoạt hóa dược trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3 Proemym và các emym hoạt hóa tương ứng
Stt Proenzim Enzym Enzym hoạt hóa
1 Pepsinogen Pepsin Pepsin

2 Chymotrypsinogen Chymotrypsin Trypsin, chymotfypsin
3 Trypsinogen Trypsin Trypsin, enteropeptidease
4 p rocarboxypeptidease Carboxypeptidease Trypsin
5 Proelastase Elastase T rypsin
í
I
Theo bảng trên, trypsin đóng vai trò rất quan trọng. Enzym này
đóng vai ‘trò quan trọng trong hoạt hóa các proenzym ở tụy tạng.
Ngoài ra, trypsin còn tham gia hoạt hóa enzym lipase như
prophospholipase. Quá trình hoạt hóa này ở tá tràng.
Các quá trình hoạt hóa proenzym tuy "có những đặc điểm riêng,
nhưng giữa chúng cũng có những đặc điểm^chung. Các đặc điểm chung
này như sau:
- Enzym tham gia quá trình hoạt hóa các proenzym không cắt
toàn bộ proenzym mà chỉ cắt giới hạn các liên kết peptide ở gần đầu
N của phân tử proenzym. Khi tiến hành cắt như vậy, các enzym này
loại phần peptide kìm hám để phần enzym sẽ tham gia được vào các
phản ứng xúc tác.
- Khi proenzym bị cắt sè làm thay đổi cấu hình không gian của phân
tử theo chiều hướng có lợi cho enzym tham gia các quá trình xúc tác.
- Điều kiện hoạt hóa proenzym như nồng độ proenzym, bản chất
và nồng độ của enzym xúc tác, nhiệt độ, pH có ảnh hường rấ t quyết
đinh đến hiêu suất hoat hỏa các proenzym.
>
1.2.6 Vaỉ trò các nhóm chức năng tro n g phân tử enzym
Phần trước đã trình bày, enzym có bản chất hóa học là protein.
Các protein này được cấu tạo bởi hàng ngàn gốc amino acid. Các
amino acid liên kết với nhau bằng các liên kết peptide qua các nhóm
a-carboxyl và a-amine.
24 Chương ỉ
Các amino acid có trong phân tử enzym đều tạo thành mạch
nhấnh (trừ glycinộ. Các mạch nhánh thường ở trạng thái tự do và có
thế tham gia vào những phản ứng hóa học nhất định. Các amino acid
nằm trong trung tâm hoạt động tạo ra những nhóm chức năng. Có
nhóm tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác, có nhóm chỉ tham gia
trong vai trò kết hợp xúc tác và định hướng quá trình xúc tác đó. Tuy
nhiên khó có sự phân rõ ranh giới giữa chức năng xúc tác trực tiếp và
hỗ trợ xúc tác của những nhóm chức trong câu trúc enzym,
Các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzym thường rất
nhạy cảm với các tác động của các yếu tố vật lý và hóa học. Dưới tác
động của các yếu tô này, cấu trúc bậc ba hoặc cấu trúc bậc bốn của
enzym sẽ bị thay đổi, làm sai lệch cấu trúc không gian của trung tâm
hoạt động. Các nhóm chức có thể gần nhau hơn hoặc xa nhau hơn. Tất
cả những hiện tượng này thường làm giảm hoạt tính xúc tác của trung
tâm hoạt động. Các nhóm chức năng có trong trung tâm hoạt động
của enzym bao gồm:
- Các nhóm carboxyl của aspartic acid và glutamic acid
- Nhóm a-amine của lysine
- Nhóm guaridin của arginine
- Nhóm indoi của tryptophan
- Nhóm imidazol của histidine
- Nhóm hydroxyl của serỉne và threonine
- Nhóm phenol của tyrosine
- Nhóm sulfuhydryl của cysteine
- Nhóm thioester của methionine
- Vòng thơm của phenylalanine.
Cơ chế chức nảng của các nhóm tham gia xúc tác có theo một
trong những kiểu tương tác như sau:
. Nhờ khả năng cho và nhận proton, chứng có thể hoạt động
như chất xúc tác acid hoặc xúc tác theo nghĩa rộng.
• Chúng có thể liên kết bằng liên kết đồng hóa trị với cơ chất
tạo thành phức hợp enzym cơ chất có hoạt tính cao để thực hiện cơ
chế xúc tác đồng hóa trị.
. Cơ chế xúc tác của trung tâm hoạt động được sự hỗ trợ của một
số kim koại. Các ion kim loại thường mang diện tích dương, có thế
đóng vai trò chất hút điện tử rất mạnh.
ỉ- Nhóm imidazol của histidine
Nhân imidazol có hai nguyên tử nitrogen. Nhân imidazol được
biêu diễn dưới dạng dị vòng với hai liên kết đôi. Trong đó, những cặp
điện tử tham gia vào sự tạo thành liên kết dôi (những điện tử n) trơ
thanh những điện tử chung và được phân bố giữa các nguyên tử.
Nhân imidazoi là một hệ thống vòng liên hợp, vì thế đám mây
điện tử Pi trong dó chuyển chỗ và những tính chất của các nguyên tử
nitrogen có thế thay đổi trong một giới hạn nhất dịnh thành những
tính chất ngược lại, do đó gây ra sự dịch chuyển proton.
c = CH HC = CH HC = CH
1 Ị. ^ I i ____I i
HN N + R ---- HN N "S ----- HN N
HC = CH HC = CH
I I ____^ H + I I
«• N N -------- N NR
/ \\ / \ ^ /
H CH R CH
H ình 1.8 Cơ chế hoạt dỘỊìỊí của imidazol
Theo sơ đồ này, sự kết hợp của nhóm mang điện tích đương R+
vào nguyên tử N3 làm cho điện tích được phân bố lại. Từ đó, dẫn đến
tích điện dương ơ nguyên tử N, và tách proton ra khỏi nguyên tử đó.
Các liên kết N - acyl - imidazol rất dễ bị ion hydroxyl và nhừng
tác nhân khác tác động. Khả năng biến đổi hỗ biến (tautomc) nội
phản tử và tính không bền vững của imidazol tạố ra khả năng xúc tác
cho imidazol. Từ đó chúng có thể hoạt động như một chất nhận trung
gian của các gốc acid. Imidazol tự do và imidazol nằm trong trung tâm
hoạt động của enzym, khi tác động với chất dẫn xuất acyl tương đối
bền vững. Có thể chúng đóng vai trò của chất vận chuyển trung gian
các gốc acid (acyl, phosphoryl) sang cho nước hoặc chuyến sang các
nhóm ái nhân của các chất nhận khác.
26 Chương 1
Ta có thể phát hiện vai trò của nhóm này đối với enzym qua trị
số của hằng-số ion hóa (Ka) của nó hoặc logarite âm của đại lượng này
(pKa). Tri sô" pKa của imidazol trong các enzym nằm trong khoảng 6-7,6.
Trị số pKa của các nhóm ion hóa trong các phân tử protein
thường có khoảng giá trị lớn, chúng có thế bị thay đổi do ảnh hưởng
của các nhóm hóa học kê bên.
Các nhà khoa học cũng cho thấy rằng, chức năng xúc tác của
nhóm imidazol không chỉ giới hạn vào chức năng của một chất
nhận nhóm acid và chất xúc tác acid-base. Ngoài khả năng kết hợp
những nhóm mang điện tích dương, nguyên tử N3 của imidazol có
khuynh hướng tạo thành những liên kết hydrogen và những phức
chất với kim loại.
Histidine rất dễ dàng tác dụng qua lại với glucid. Những phức
chất của histidine với hexose, pentose thường rất bền vững. Sự kết
hợp được thực hiện qua liên kết hydrogen giữa nguyên tử nitrogen của
imidazol và nhóm hydroxyl của OSe > N ... H-OR.
2 - N hóm hydroxyl củ a serin
Trong các loại enzym ester.ase, proteinase, phosphoglucomutase
có gốc serine trong trung tâm hoạt động và đóng vai trò rất quan
trọng trong quá trình xúc tác.
Khi cho các chat phosphor hừu cơ như diisopropylfluoro-
phosphate hay tetratyl pyrophosphate sẽ làm ức chế hoạt động của
enzym acetyl cholines ter- ase và nhiều hydrolase khác. Khi đó gốc
phosphate của các ức chế này sẽ kết hợp với nhóm hydroxyl của
serine hoạt động của cholinester_ase, chymotrypsin và một sô enzym
khác cùng loại sẽ tạo nên những chất O-phosphoryl bền vững. Thường
các liên kết này chỉ bị phân giải trong những điều kiện nhất định bởi
những dẫn xuất của hydroxylamine.
Sau khi liên kết với các chất ức chế bị phân giải, hoạt tính của
enzym sẽ được phục hồi. Từ đó các nhà khoa học kết luận rằng, chính
nhóm serine của ester~ase và proteinase đã thực hiện chức năng của
chất nhận trung gian đối với nhóm acyl trong các phản ứng thủy phân.
Nhóm OH của serine tự do, giống như nhóm alcohol bậc hai khác
rất trơ về m ặt hóa học. Tuy nhiên khi có sự phân cực thì khả năng
phản ứng của chúng tăng lên râ't nhiều.
Trong phân tử serine, người ta không^hấy có những liên kết
đôi. Như vậy, sự tăng hoạt tính của nhóm OH của serine trong trung
tâm hoạt động của enzym nguyên thủy là do ảnh hưởng của những
nhóm chức năng khác gần kề với nhóm này và cùng với nhóm này
tham gia vào tương tác tĩnh điện. Nhóm OH cùa serine bên ngoài hay
bên trong trung tâm hoạt động của enzym m ất hoạt tính khi các chất
ức chế tác động rấ t trơ về mặt hóa học.
Các nhà khoa học cũng cho thấy rằng, một số enzym thủy phân
như esterrase và peptidease có chứa nhóm hoạt động là serine. Cơ chế
hoạt động của những enzym này đựa trên đặc điểm của nhóm (-CH20)
của serine. Khi nhóm hoạt động này phản ứng ester hóa với
phosphate của DFP thì chất này khóa nhóm (-CH2O) lại. Chính vì thế
enzym m ất hoạt tính.
Ở những enzym như chymotrypsin, trypsin, ngoài nhóm serine
hoạt động còn cổ histidine cũng tham gia xúc tác gắn cơ chất vào phức
hệ enzym cơ chất.
3- Nhóm e-amine của lysine
Phân tử lysine trong th àn h phần enzym thường có nhóm E-
amỉne tự do. Nhổm E-amine trong lysine khác nhóm a-am ine của
các amino acid thông thường. Nhóm a-amine của amino acid nằm
gần nhóm OH, do đó nó được trung hòa với mức độ n h ấ t định và
được bảo vệ khỏi những tác động hóa học. Trong khi đó nhóm £-
amine lại năm xa nhóm OH, nếu nhóm này giông nhóm ạmine của
các amine bậc nhất.
Sự khác biệt trên được thể hiện rõ khi lysine phản ứng với
benzaldehyde ở dung địch nước trong môi trường kiềm. Trong trường
hợp đó, nhóm e-amine của lysine chỉ phản ứng với benzaldehyde.
28 Chương 1
c 6h 5- c o + H2 N -C H 2(CH2)3-CHCOO
h 3n +
c 6h 5- c = n - c h 2~ (CH2)3 —CHOO- + h 9o
I \
H h3n
Các nhóm E-amine phản ứng với nhóm aldehyde dễ dàng hơn
nhóm a-am ine N-tận cùng. Liên k ết —HC — N— được tạo th àn h do
tác dụng của lysine với những hợp chất carbonyl thường không
bền, dễ bị phân hủy ỗ các giá trị pH acid và kiềm. Do đó sẽ tạo ra
những ỉiên k ết tương tự imin của semimercaptaỉ. Liên kết này bị
khử bởi hydrogen với sự có m ặt của chất xúc tác hoặc bdi những
chất khử khác.
Như thế, nhóm aỉdỉmin giếng nhóm carbonyl về một số tính
chất. Tính chất này có ý nghĩa rấ t lớn trong phản ứng enzym.
HC = N - R
Thay thế H2N - R'
2H
HC = o + HaO - —HC = N' H2C - NH
Thỏy phân Khử
XH
X H
\ I
- HC - N-
Nhóm e-amine trong lysine thưdng tự do, không tham gia vào
sự tạo th à n h các liên k ế t peptide bình thường. Hàm lượng của
lysine và arginine trong phân tử protein quyết định số điện tích
dương của protein.
Một giả thuyết khác cho rằng, nhóm E-amine của lysine tác
dụng qua l ạ i với các nhóm anion không trơ của cơ chất mà cả của
coenzym. Nhóm e-amine của ỉysine hoàn toàn có th ể có khả năng
tạo nên những liên kết ion với nhóm phosphate của coenzym flavin
và các coenzym nucleotide khác. Vì thế, có th ể có sự cố’ định vị trí
của những coenzym trên toàn bộ những phần tiếp xúc tương ứng
trê n bề m ặt của apoenzym.
4- Nhóm carboxyl
Carboxyl tự do là nhóm chức có nhiều trong phân tử protein
(thường có nhiều trong glutamic acid, aspartic acid và ià nhóm tận
cùng của chuỗi peptide). Các nhóm carboxyl tham gia việc bảo vệ
và duy trì cấu hình nguyên thủy của enzym, tác dụng tương hỗ ion
với các nhóm base, hình thành những liên kết hydro, iiên kết acid
và liên kết ester.
Những nhóm carboxyl ở dạng ion hóa hoặc ở dạng không ion
hóa ở trung tâm hoạt động của enzym có thể thực hiện cơ chế xúc tác
acid-base hoặc gây ra tác dụng cảm ứng đối với tính phân cực của
những liên kết ỏ cạnh chúng và của những nhóm phức hợp enzym-cơ
chất hoặc bằng cách tạo ra sự di chuyển điện tử thông qua sự tạo
thành liên kết hydrogen.
Trong trường hợp hàm lượng NaCI cao, sẽ xảy ra hỉện tượng các
nhóm carboxyl bị khóa lại không thể hoạt động được. Do đó hiệu quả
phản ứng sẽ giảm.
Ngoài tác dụng xúc tác, nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động của enzym có tác dụng rấ t mạnh dến cấu trúc không gian của
enzym. Các nhóm này tạo nên những liên kết ion, liên kêt ester, iiên
kết amide và liên kết hydrogen.
5- Nhóm sulfuhydryl
Nhóm sulíuhydryl trong phân tử enzym đóng vai trò rấ t quan
trọng trong các phản ứng enzym. Chúng tham gia vào nhiều bỉến dổi
hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoiyl hóa, oxy hóa, alkyl hóa,
tạo thành mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những
phức hợp chuyển điện tích.
Or S ự ion hóa các thiol: Nhóm -SH thường tham gia trong rất
nhiều phản ứng dưới dạng anion. Để đánh giá khả năng phản ứng cda
nhóm -SH trong enzym cần phải biết được giá trị pH cần th iết cho sự
ion hóa này. Người ta nghiên cứu phán tử cysteine và những phân tử
của hợp chất thỉoỉ cổ trọng laợng phân tử thấp để xác định mức độ
ion hóa của nhóm -SH. Theo đó, sự phân ly proton (H*) của nhóm -SH
và -NH3 của cysteine xảy ra như sau:
30 Chươkig 1
co cr
II
coo- h - c - ch 2- S” co cr
T
H —c —CHZ—SH h - ò - c h 2-s ~
I cocr
+ nh3 nh2
b- Sự tạo thành liên kết hydrogen: Khả năng ,tham gia phản ứng
của nhóm -SH chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi sự tạo thành liên kết
hydrogen. Tác động này có thể xảy ra những phương cách sau:
- Nếu ion mercaptide tham gia vào việc tạo thành liên kết
hydrogen thì sự hút proton những nhóm -NH, -NH2 hoặc -COOH sẽ
làm giảm nồng độ điện tử của nguyên tử lưu huỳnh. Do đó, khả năng
phản ứng sẽ bị giảm.
- Trong môi trường pH sinh lý, phần lớn các nhóm -SH ở trạng
thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydrogen là do sự tham
gia proton của chính nhóm -SH. Chính nhóm proton của -SH sẽ làm
tăng m ật độ điện tích chung quanh nguyên tử lưu huỳnh. Khi lưu
huỳnh đóng vai trò chất nhận proton của liên kết hydrogen thì khả
năng phản ứng sẽ giảm. Ngược lại, khi nhóm -SH là chất proton thì
khả năng phản ứng của lưu huỳnh sẽ tăng lên.
c- Acyl hóa các thm l. Ta có thể thực hiện acyl hóa các thiol bằng
các loại thuốc thử như acetyl clorur, anhydrite acetic. Phản ứng của
quá trình acyl hóa thiol như:
RSH + (CH3C 0)20 -------- ► R - s - C - CH3 + CHgCOOH

o
Nhóm thiol dễ dàng tác dụng với nhổm carbonyl của các
aldehyde và một sô" cetonic. Khi xảy ra phản ứng ngưng tụ thuận
nghịch của các thỉol với các aldehyde mercaptal hoặc nửa mercaptal.
OH
RSH + o = c ' R -S-c£
Các chất này tác động với phân tử thiol thứ hai và tạo ra
mercaptal toàn phần (hoặc với mercaptol). Các chất 1,2 dithiol tác
d ư n g với aldehyde theo phương trình sau:
R CH2- S v , R
CHj I ■ + h2o
ị —SH + o -c ho —CH2—c h —s / \h
h o - c h - c h 2- sh H
Các nhóm -SH dễ dàng tác động với nhóm carbonyl. Chính vì
thế nếu nhóm -SH nằm trong trung tâm hoạt động của enzym, nó sẽ
đóng vai trò quan trọng trong xúc tác sinh học.
d- A lk y l hóa nhóm -SH

Các thiol có khả nảng kết hợp với những liên kết đôi của
acrylonitrite acrolein và những hợp chất khác có liên kết đôi phân
cực. Phản ứng này xảy ra mạnh ỏ môi trường kiềm.
RS" + H + CH2 R — s - CH;
II I
CH ch2
I
CN CN
Ngoài ra, khi cho nhóm -SH tác dụng với N-ethylimid sẽ xảy ra
phản ứng:
/C .
RS" + H + HC \ R S -C \
II N - C2H5 I N - C2H5
H,Ò
/
II
o
Như vậy, các quá trình trên dẫn tới sự alkyl hóa những nhóm -SH
e- Tác d ụ n g của thiol với những k im loại
Khi xem xét đến phản ứng của nhóm thiol với kim loại, các nhà
khoa học thấy các mercaptide phân ly yếu được hình thành.
R —SH + Me R - s - Me + H
Nhóm - SH dễ dàng tác động với các cation hóa trị I như thủy
ngân, bạc, đồng, vàng; các cation hóa tri II như thủy ngân, chì, đồng,
cadimium, kẽm; hóa trị III như arsenic, antimon.
Các chất 1,2 dithiol có khả năng tương tác mạnh với những kim
loại có hóa trị II như Hg2+, Cd2+,... và những kim loại có hóa trị III như
asennic, antimon. Sần phẩm của phản ứng là những chất có mạch vòng:
32 Chi/dlag 1
CH2 - SH
Ĩ p. CH2 - S
C H - S H * A S j" -------. c „ _ s )«-!>• * H.O
" R
f- Oxy hỏa nhóm —SH
Các nhóm - SH thường bị oxy hóa dưới tác dụng của iodoferi
cyanur, o-iodobenzoate, H20 2 và những chất oxy hóa khác theo
phương trình:
Chất oxy hóa
2RSH «■: ± ± RS - SR + 2H+ + 2E
Đây là phản ứng dùng để định lượng nhóm - SH trong protein.
Disulfur là chất oxy hóa đặc hiệu với thiol. Phản ứng này xảy ra qua
hai giai đoạn:
R S - S R + RS'«■■■ " " ĩ RS —SR’ + RS"
RS —SR’ + R’S"— t R*S— SR' + RS"
Trong phân tử enzym tồn tại ba nhóm -SH:

1- Nhóm - SH dễ phản ứng
2- Nhóm - SH phản ứng yếu
3- Nhóm - SH bị che lấp.
Nhóm ( 1 ) bị oxy hóa bỏi fericyanur, porphyridine, iodo
actanmỉde. Nhóm này phản ứng với nỉtropsurusiate.
Nhóm (2) không tham gia phản ứng VỚỊ nitropsurusỉate và chỉ
tác dụng với những chât óxy hóa mạnh như iodin, o-iodobenzoate,
'y
paraclomercuribenzoate.
Nhóm (3) chỉ tìm thấy sau khi phân tử protein đã biến tính.
Hoạt tính ẹnzym bị ức chế khi nhóm -SH thuộc nhóm (1) bị phân hủy.
1.3 C ơ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYM
1.3.1 Ý nghĩa quá trìn h xúc tác tro n g tế bào sinh v ậ t
Mọi sinh vật đều được cấu tạo từ tế bào. Các tế bào luôn luôn
tiến hành quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài bằng
những phản ứng sinh hóa. Các phản ứng xảy ra luôn luôn được xúc tác
N hững h iể u b ỉế t cơ b ả n về enzym 33
bởi các enzym của tế bào. Như vậy, enzym đóng vai trò rất quan trọng
trong sinh lý của tế bào. Tác động của enzym vào các phản ứng sinh
hóa mang hai ý nghĩa đối với tế bào.
i ' Làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng
Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được
thực hiện trong nhiệt độ ôn hòa, trùng hợp với nhiệt độ của cơ thể.
Các phản ứng enzym thường không đòi hỏi nhiệt độ cao, do đó nó
đảm bảo cho mọi hoạt động sinh lý bình thường của tế bào. Trong khi
đó, nãng lượng chỉ phí cho những phản ứng hóa học thường rấ t cao.
Đặc điểm làm giảm năng lượng hoạt hóa các phản ứng enzym có ý
nghĩa rấ t lớn trong sinh lý của sinh vật. Đặc điểm này gắn liền với
quá trình tiến hóa của sinh vật, nếu nhiệt độ cơ thể tăng sẽ làm rối
loạn toàn bộ quá trình sinh lý của tế bào. Khi đó cơ thể sẽ chuyển từ
trạng thái sinh lý bình thường sang trạng thái bệnh lý. Cơ thể ở
trạng thái bệnh lý là kết quả của sự rối loạn các phản ứng enzym.
Chính vì thế, việc duy trì trạng thái sinh lý bình thường của tế bào
hay của ca thể đồng nghĩa với việc duy trì hoạt động hài hòa của các
phản ứng enzym.
2- Enzym tham gia vào các phản ứng sinh hóa thưởng làm tăng
tốc độ phản ứng
Tốc độ phản ứng tăng sẽ làm tăng mức dộ chuyển hóa cơ chất.
Như vậy quá trình trao đổi chất của tế bào sẽ tăng. Kết quả là tế bào
sẽ tăng nhanh về số lượng và khối lượng. Như vậy, enzym không chỉ
đóng vai trò duy trì trạng thái sinh lý của tế bào mà còn đóng vai trò
quan trọng trong sự phát triển và sinh sản của tế bào, duy trì sự
chuyển hóa vật chất trong cáí* ^hu trình chuyển hóa trong thiên
nhiên. Nhờ có hoạt động của enzym mà khối lượng cơ chất được
chuyển hóa trong một đơn vị thời gian trong tế bào lớn gấp hàng
trăm đến hàng ngàn lần khối lượng tế bào.
34 Chương 1
1.3.2 Cơ c h ế tá c d ụ n g c ủ a en^ym
Bản chất của các phản ứng enzym là khi có sự tham gia xúc tác
của các enzym, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi
tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những
sản phẩm của phản ứng.,kDưới tác dụng của enzym cơ chất có thể có
những thay dổi không ch! về cấu trúc hóa học, mà còn thay đổi tính
chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzym xảy ra qua ba giai đoạn:
Giai đoạn-thứ nhất: Enzym sẽ kết hợp với cơ chất bằng những
liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzym-cơ chất. Phức hệ này
thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzym-cơ chất thường
xảy ra râ t nhanh và đòi hỏi một ít năng ỉượng.
Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzym sẽ bị thay đổi
cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết
quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
Giai đoạn thứ ba: Đây ỉà giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá
trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzym.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được trình bày như sau:
.í
E + s ĩ ĩ ES ----------► E + p
ở đây: E - enzym (enzyme); s - cơ chất (substrate); p - sản phẩm (products)

1- Năng lượng trong xúc tác
Enzym tham gia hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể
sống. Nhờ hoạt động xúc tác của enzym, các tế bào có thể chuyển hóa
ỉượng cơ chất rấ t lớn. Vấn đề đặt ra là enzym sử dụng nguồn năng
lượng nào và sử dụng nâng lượng bằng cách nào để tiến hành các quá
trình xúc tác mà khả năng xúc tác lại lớn như vậy?
Các nhà khoa học đưa ra hai cách sử dọng năng lượng liên kết
để tiến hành quá trình xúc tác:
Thứ nhất: Enzym sử dụng năng ỉượng liên kết để làm giảm nâng
lượng hoạt hóa. Năng lượng này được giải phóng trong quá trình hình
thành liên kết yếu trong tương tác qua iạỉ giữa enzym và cơ chất.
Thứ hai: Enzym sử dụng nàng lượng liên kết tạo phản ứng xúc
tác đặc hiệu thông qua một sồ" cơ chế sau:
- Giảm entropy: Enzym và cơ chất luôn ở trạng thái chuyến
động trong dung dịch lỏng. Nếu không có năng lượng liên kết, enzym
sẽ rất khó định hướng tác động lên cơ chất, giữ cơ chất và định hướng
phản ứng.
- Làm m ất vỏ nước bao quanh: Nhờ tương tác yếu giữa enzym và
cơ chất có khả năng làm giảm toàn bộ liên kết hydrogen tồn tại giữa
cơ chất và nước bao quanh.
- Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ỏ trạng thái
chuyển tiếp được sử dụng làm căng hoặc uốn khúc cơ chất, tạo điềi/.
kiện cho enzym xúc tác phản ứng dễ dàng. J
- Năng lượng liên kết tạo ra cấu hình không gian của enzym sao
cho phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất. Đây là giả thuyết do
Kosland đưa ra, chúng tôi đã trình bày trong phần trước.
2- Sự tạo thành phức hợp emym-cơ chất
Brown và Henri là những nhà khoa học đầu tiên đưa ra thuyết
“phức hợp trung gian”. Sau đó, Michaelis và Menten phát triển thêm.
Theo thuyết này, enzym sẽ kết hợp với cơ chất, tạo ra một phức
hợp không gian giữa enzym và cơ chất. Do tác dựng của enzym, cơ chất
bị biến đổi manh và cuối cùng tạo ra sản phẩm. Sự tạo thành phức hợp
enzym-cơ chất thường xảy ra rất nhanh và về bản chất thì phức hợp
này hoàn toàn không bền vững. Các tính chất này của phức hợp enzym
và cơ chất phụ thuộc rất nhiều ỏ bản chất hóa học của chất.
Để tạo thành phức hợp enzym-cơ chất có đến năm loại liên kết
thaiTì gia. Các liên kết này có đặc tính riêng và năng lượng liên kết
khác nhau. Các liên kết này bao gồm: liên kết phối trí, liên kết
hydrogen, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Van der Waals và liên kết
do chuyển dịch điện tích.
Enzym là những phần tử protein có phân tử lượng lớn. Trên bề
m ặt của phân tử enzym tán tại rấ t nhiều nhóm hóa học đặc hiệu. Các
nhóm chức này đổng vai trò quan trọng trong định hướng và giúp cơ
chất enzym tiếp cận với nhau. Khi enzym và cơ chất tương tác với
36 Chương 1
nhau thường tạo ra liên kết yếu, tạo ra năng ỉượng kết hợp (binding
energy). Năng lượng được tạo ra ở từng liên kết yếu này thường nhỏ,
nhưng có nhiều nãng lượng liên kết nên tổng năng lượng trong phản
ứng enzym là rấ t lớn.
Enzym sè sử dụng nguồn năng lượng này để làm giảm năng
lượng trong phản ứng enzym. Năng lượng giảm trong phản ứng enzym
được chuyển qua hệ thống các chất tham gia phản ứng. Lượng năng
lượng giảm trong quá trình hoạt hóa phải bằng lượng năng lượng các
chất tham gia phản ứng nhận được. Sự biến đểi năng lượng này được
trình bày theo hình 1.9.
TS.
TSu - năng lượng hoạt hóa
khổng có chất xúc tác
T S Ci,T s C2,T S C3 - năng
lượng hoạt hóa khi có enzym

xúc tác
AG„ - mức độ năng lượng hoạt
hỏa khổng cổ chát xúc tác
AGc - mức năng IƯỢng hoạt hóa
khi cổ chát xúc tác
E -enzym; s - cơ chát
p - sản phẩm
H ìn h 1.9 Sự chuyền hồa năng ỉượng trong phản ứng enzym
Theo ý kiến của các nhà khoa học, đầu tiên cơ chất phải được
hoạt hóa để chuyển sang trạng thái chuyển tiếp tạm thời để tương tác
với cơ chất tạo nên phức hợp enzym-cơ chất (ES). Sau đó phức hợp
này lại được hoạt hóa để được chuyển thành trạng thái chuyển tiếp
tạm thời, để chuyển sang phức hợp EP (p là sản phẩm). Sau đó phức
hợp EP lại chuyển sang trạng thái tạm thời khác để tạo thành p và
giải phóng E tự do. Năng lượng của sản phẩm sẽ thấp hơn mức năng
lượng của cơ chất ban đầu. Toàn bộ quá trình phản ứng enzym từ sự
diễn giải trên được trình bày chính thức như sau:
E +s ES EP E +p
Các nhà khoa học cho thấy rằng, trong tế bào sinh vật, muốn
tăng tốc đô phản ứng bậc một lên 10 lần cần phải có năng lượng tự do
vào khoảng 5,7Kcal/mol. Trong khi đó, năng lượng tự do được giải
phóng do sự hình thành một phản ứng tương tác yếu thường vào
khoảng 4-30Kcal/mol. Tổng năng lượng có thể dùng được do nhừng
phản ứng tương tác yếu tạo ra có thể làm giảm năng lượng hoạt hóa
vào khoảng 60-80Kcal/mol. Chính vì thế, khả năng làm tăng tốc độ
phản ứng rấ t lớn.
Năng lượng cần thiết để làm giảm năng lượng hoạt hóa trong quá
trình xúc tác, đồng thời cũng tạo ra tính đặc hiệu cho phân tử enzym.
Tính đặc hiệu của enzym là khả năng nhận biết, chọn lọc cơ
chất dể tiến hành các phản ‘ững riêng theo bản chất từng loại enzym.
3- Quá trình xúc tác của enzym
Phần trình bày trên cho thấy quá trình tạo thành phức hợp ES.
Phần còn lại cần phải được làm sáng tỏ là sự diễn biến tiếp theo của '
phức hợp ES trong phản ứng xúc tác của enrym.
Các nhà khoa học cho biết, khi tạp thành phức hợp ES, các
nhóm chức trong phức hợp ES sẽ hoạt dộng theo một số cơ chế. Trong
đó, cơ chế xúc tác acid-base và cơ chế xúc tác hóa trị phổ biến hơn cả.
Nếu như trong quá trình tạo phức, dựa trên năng lượng liên kết yếu
thì trong quá trình xúc tác ở đây, ngoài việc sử dụng năng lượng liên
kết yếu, cơ chế này còn có mặt liên kết hóa trị với cơ chất và có sự
chuyển nhóm chức năng qua lại giữa enzym và cơ chất.
a- Cơ chế xúc tác acid * base
Trong các phản ứng sinh hóa thường tạo thành những sản phẩm
trung gian. Các sản phẩm trung gian này thường mang điện tích
không bền, dễ dàng bị phân giải và chuyển về trạng thái ban đầu.
Khi được xúc tác, nhờ sư trao đổi proton với sự tham gia của H \
H30 + và OH trong môi trường nước, chúng lại tồn tại ở trạng thái ổn
định. Trường hợp này được gọi là xúc tác acid-base riêng. Còn xúc tác
acid-base chung thường xảy ra trong môi trường ngoài thành phần
nước còn có các chất khác cho và nhận proton. Các chất cho và nhận
này thường là những amino acid có trong trung tâm hoạt động của
enzym như Glu, Asp, Lys, Arg, Cys, His và Tyr.
38 Chưotag 1
Cơ chế xúc tác acid-base được trình bày như hình 1 . 10 .
R 1 r 3^
I
H - C - OH 0=0 C hấ t p hả n ứng
I
R2 N-H
1
R, R3 Nếu không có chất xúc tác,
H—C -O -Ò -O ' chất trung gian sẽphãn rã
I ngay về iại chất phản ứng
N -H
+OH” B+
+H2OH h HA+
R FT R1 R4
I I I I
H - C —O - C - O ' H-C-O-Ò-O'
R2 H - N +— H H - N +- H
I I
h 9o
R R
1 ^ i \ N/ Sản phẩm
H“ C - O “ C = o
I
í
H ìn h 1.10 Cơ chế xúc tác acid-base
Khi proton vận chuyển tới H20 hoặc từ nó xảy ra nhanh hơn sự
phân rã chất trung gian, sự có m ặt của chất cho và nhận proton khác
sẽ không làm gia tăng tốc độ phản ứng.
Khi proton vận chuyển tới H20 hoặc từ nó xảy ra chậm hơn sự
phân rã chất trung gian thì chỉ một phần chất trung gian được ổn
định và sự có m ặt của chất cho và nhận protein khác sẽ làm gia tăng
tốc độ phản ứng.
6- Cơ chê xức tác thông qua liên kết hóa trị tạm thời
Liên kết hóa trị chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn, khi có sự
kết hợp giữa chất và enzym. Ví dụ, trong trường hợp enzym tham gia
phản ứng chứa nhóm ưa nhân thì phản ứng sẽ xảy ra như sau:
A -B + X -------* A -X + B A+ X+ B
Sự tạo thành liên kết hóa trị tạm thời giữa enzym và cơ chất sẽ
hoạt hóa phản ứng rất mạnh. Trong enzym, nhiều gốc amino acid và
cofactor đóng vai trò như nhóm ưa nhân. Trong phản ứng trên, X là
nhóm ưa nhân (nucleo-philic XX
Những enzym hoạt động qua hợp chất trung gian enzym-cơ chất
đồng hóa trị được phân loại dựa theo gôc amino acid của enzym trực
tiếp với cơ chất, điều đó được tóm tắ t trong bảng 1.4.
Bảng 1.4 Cơ chế tác động của gốc amino acid trong các loại enzym
s tt GỐC amlno acld Loại enzym Cơ chế xúc tác
1 Serine Acetyl cholinesteuase Hydroxyl trong serine tạo liên kết ester với
chymotrypsin, trypsin, nhóm acyl để tạo thành phức hợp acyl-
phospho-glucomutase enzym (trong chymotrypsin) hoặc với
phosphoric aciđ để tạo thành phospho
enzym {phospho-glucomutase)
2 Cysteine Phospho glyceraldehyde Liên kết đổng hớa trị được tạo thành
dehydrogenase, papain thỉoester giữa nhóm acyl của cơ chất và
coA-acetyitransferase nhóm sulfu-hydryi của gốc cysteine
3 Histidine Các enzym vận chuyển

nhỏm phosphate như Nhóm amicLazol của histidine phosphoryl
gluco-6 phosphatase hóa
succinyl-coA-synthetase
4 Lysine Fructore diphosphate Hợp chất trung gian là một base schiff được
aldolase, transaldolase, tạo thành giữa nhóm e-NH2 cùa gốc lysine
D-amino-acid oxydase và nhóm carboxyl của cơ chất
Tuy có sự khác biệt vê cấu trúc, tính chất hóa lý, nhưng các yếu
tố trong bảng trình bày trên đều giống nhau là chúng đều có khả
nâng làm hoạt hóa cơ chất, thúc đẩy cho quá trình xúc tác mạnh lên
rất nhiều. Vì th ế chỉ cần năng lượng nhỏ, khả năng xúc tác và tốc độ
phản ứng sẽ tăng hơn rấ t nhiều so với trường hợp không có xúc tác.
40 Chương 1
Ở đây cũng cần hiểu rõ một điểm rấ t quan trọng là cơ chế hoạt
động của enzym không phải ch! do một yếu tố hay một nhóm hoạt
động đơn lẻ mà là tác động tổng 4iợp của nhiều yếu tố, nhiều nhóm
hoạt động của enzym tạo nên.
c> Cơ chế xúc tác thông qua ion kim loại
Trong rấ t nhiều enzym, ion kim loại có tác dụng định hướng cơ
chất vào trung tâm hoạt động. Ngoài ra, kim loại còn có tác dụng
làm Ổn định trạng thái chuyển tiếp, tham gia vào các phản ứng oxy
hóa khử.
4- Động học phản ứng enzym
Phần trên chúng tôi đã trình bày cơ chế xúc tác của enzym
trong phản ứng enzym. Trong phần này chúng tôi trình bày những
biến đổi hoạt tính xúc tác dưới tác dộng của các yếu tố môi trường.
a- Phương trình động học Michaelis-Menten
Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom Michaelis và Maud
Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác
bởi enzym và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản
ứng với nồng độ cơ chất và enzym. Theo mô hình này, enzym và cơ
chất sè kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzym-cơ chất (ES). Phức
hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và
giải phóng enzym (E). Enzym được giải phóng lại thực hiện những
phản ứng mới.
Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mô hình chuyểnhóa trong
phản ứng enzym với một cơ chất duy nhất như sau:
Kt K3
E+S ^ = 5 - ES E+P
K2 K4 d - 1*
trong đó: K1( K2, K3, K4 - là những hằng số vận tốc của các phản ứng
tương ứng; K4 - là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ p và E nhỏ
nhâ't. Ngoài ra, từ mô hình trên, phản ứng chuyển hóa từ ES -> p +
E là phản ứng quan trọng nhất, quyết định toàn bộ quá trình chuyển
hóa s —» p.
Vận tốc của phản ứng ES -> p + E tỷ lệ với nồng độ ES. Khi
nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng cao.
V = K2[ES] (1.2)
N hữ ng h iể u b iế t cơ b ả n về enzym 41
Giả sử nồng độ enzym ban đầu được ký hiệu là [EJ; nồng độ phức
enzym-cơ chất là [ES]; nồng độ enzym tự do khi phản ứng đạt được
điểm cân bằng là [E]. Ta sẽ có:
[E] = [E0] - [ESI (1.3)
Nếu ta giả sử nồng độ cơ chất ban đầu (cũng là nồng độ cơ chất
ở trạng thái cân bằng của phản ứng) thì sẽ thấy rằng nồng độ cơ chất
thường lớn gấp nhiều lần so với enzym.
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc
độ phản úng enzym sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Ta
có thể tính được vận tếc phản ứng trong trường hợp như sau:
Vận tốc phản ứng thuận: V, = K, [ESflS] (1.4)
Vận tốc phản ứng nghịch: v 2 = K2 [ES][S] (1.5)
Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm: v 3 = K3 [ES][S]
Trong giai đoạn cân bằng, sự phân ly ES sẽ cân bằng với sự tạo
ra ES. Khi đó vận tốc phản ứng sẽ là:
v 1= v 2+ v3 (1.6)
Thay các giá trị V vào ta sẽ có:
K , UE0] - [E S ])[S ] = (K 2 + K 3)[E S ] ( 1. 7 )
Từ đó ta có:
[ES] = ---- Í1Ẽ2ÌÍẼ1— . (1.8)
1 J K^S] + [l<2 + K3]
Nếu chia hai vế cho K1# thay K2 + K3 bằng hằng số Michaelis-

Menten, Kmta sẽ có:
[ES] = j y g L (1.9)
1 J Km+ [S]
Thay [ES] vào phưong trình v0 = K3[ES] ta sẽ có:
v KigoỊỊg] (110)
° Km+ [S1
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tấ t x ả nồng độ enzym đều
tham ,gia phản ứng dể tạo ra phức hợp enzym-cơ chất, ta có:
[ES] = [Eo] (111)
Theo lý thuyết, phản ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại
Vm„ = K3 [E0] (1.12)
42 Chương X
Từ đó, ta có thể thiết lập được cân bằng:

V — Vmaxi
mQV[S]
(1-13)
° ~ Km +[SI
Phương trình (1.13) được coi là phương trình Michaelis-Menten,
Phương trình này phản ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban
đầu của phản ứng v0, tốc độ tối đa VmaK, nồng độ cơ chất ban đầu [S]
và hằng số Km. Theo phương trình này thì Vo = VmaK/2, ta có:
V,max max
(1.14)
Chia hai vê cho vma* ta sẽ có: -T = [S] . Từ dó ta có:

2 Km + [S]
Km+ [s] = 2[S] và Km= [S] khi Vo = Vmax/2

Từ phương trình trên ta xây dựng được đồ thị phản ánh ảnh
hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu của phản ứng.
H ìn h 1.11 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất H ìn h 1.12 Đồ thị biểu diễn

đối với tốc độ xúc tác ban đầu Vo phương trình Lineweaver-Burk
Người ta dễ dàng xác định dược Kmvà v maxbằng cách nghịch đảo
cả hai vế của phương trình Michaelis-Menten
_ ! _ Km + [Sj
V,0 (1.15)
’ max
Năm 1934 Line weaver và Burk đưa ra phương trình từ phương

trìn h trên:
1 K,„
X - i + 1 (1.16)
v0 Vmax [S] Vmax
Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng: y = ax + b

Nếu vẽ đồ thị (H.1 .12 ), đường thẳng sẽ cắt trục tung ở l/v max và
cắt trục hoành ở -1/Kmvà độ nghiêng bằng
N hững h ỉể u b iế t cơ b ả n về enzym 43
Từ phương trình trên, ta dễ dàng xác định được vị trí vmax, Km

trong thí nghiệm xác định tốc độ V0 của phản ứng enzym với nồng độ
cơ chất ban đầu khác nhau. Sau này, các nhà khoa học cho thấy
phương trình Michaelis-Menten không chỉ đúng với phản ứng enzym
với một cơ chất duy nhất mà còn đúng với phản ứng nhiều giai đoạn
sau khi tạo phức ES.
Trong trường hợp enzym xúc tác phản ứng với một cơ chất thì
Vmax tương ứng với K3[ES] hay K3[E0]. Do đó K3 là hằng số' giới hạn tốc
độ phản ứng.
Đối với những phản ứng phức tạp như phản ứng có nhiều cơ
chất, ta có mô hình sau:
Ki K3 Ks
E+S 5 = = t ES 5 = = £ EP - — » E + P (1.17)
K2 k4
Khi đó vmax sẽ không tương ứng với K3[E0] mà lại tương ứng với
K5[E0]. Trong phản ứng nhiều bậc, phần lớn ở dạng EP và khi đó,
người ta dùng ký hiệu Kca, là hằng sò' giới hạn.
Như vậy, từ phương trình:
Ki K3
E+S . ==t ES « == - t E+ P
K2 K4
yà K, K3 Ks
E+s « ==£ ES 7===z EP — E+ p
K2 K4
tương ứng sẽ là K3 và Ks.
Trong phân tích hoạt tính enzym nhiều khi người ta sử dụng
khái niệm số* vòng quay (iturnover number) để biểu thị hoạt tính
enzym. Giá trị này được ký hiệu là Kcat/giây, nó phản ánh số phân tử
cơ chất biến đổi thành sản phắm trong một đơn vị thời gian bởi một
phân tử enzym khi cơ chất bão hòa.
Đốivới những enzym dị lập thể (alosteric) thấy sự phụ thuộc
vận tốc phản ứng với cơ chất không có dạng hyperbol như đã trình
bày ở phần trên mà có hình chữ (S) - dạng singnoid như hình 1.13.
44 Oniotaff 1
Hình 1.13 Ảnh hưởng của nồng độ aspartate đến vận tốc
phản ứng cửa emym aspartate carbamyỉ transpherase
Trong trường hợp này, cơ chất đầu tiên kết hợp với một trung
tâm enzym làm tâng nhanh việc kết hợp với phân tử cơ chất tiếp theo
vào trung tâm hoạt động của enzym. Hình 1.13 cho thấy chỉ cần một
nồng độ cơ chất tăng lên rấ t nhỏ cũng có thể làm tăng vận tốc xúc tác
hơn so với những enzym tuân theo phương trình Michaelis-Menten.
b- Ả nh hưởng cửa nhiệt độ đến phản ứng enzym
N hiệt độ có ảnh hưởng rấ t lớn đến phản ứng enzym. Tốc độ
phản ứng enzym không phải ỉúc nào cõng tỷ lệ thuận với nhiệt độ
phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ táng đến một giới hạn nhiệt độ nhất
định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm và dẫn
đến mức triệ t tiêu.
H ình 1.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổc độ phản ứng
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Qio dể biểu thị ảnh hưdng

của nhiệt độ đên tấc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ
phản ứng enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần ỉớn
enzym hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 * 50°c. N hiệt độ tối ưu
của những enzym khác nhau hoàn toàn khác nhau. Một số enzym
khác có n h iệt độ phản ứng tối ưu ở 60°c, một sấ khác lại có nhiệt độ
tối ưu ở 70°c, thậm chí có một số enzym của vi khuẩn Bacillus
subtiỉis lại hoạt động mạnh ở 90°c.
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzym
sẽ bị giảm. Khi đó enzym không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0°c enzym bị hạn chế hoạt động rấ t mạnh,
nhitag khỉ đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzym sẽ t&ng dần đều
đến mức tối ưu.
N hiệt độ tối ưu của một enzym phụ thuộc rấ t nhiều vào sự có
m ặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ.
Khi nhỉệt độ cao thường gây cho enzym m ất hoạt tính. Phản
ứng vô hoạt của enzym dưới tác dung của nhiệt thường biểu diễn thứ
bậc một.
trong đó: K - hằng số vận tốc phản ứng

E - nồng độ enzym hoạt động ở thời gian t
Eo - nồng độ ban đầu của enzym hoạt động.
Người ta thường sử dụng yếu tế nhiệt độ để điều khiển hoạt động
của enzym và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm,
c- Ả nh hưởng cửa pH đến phản ứng em ym
pH môi trường thường
TỐC độ phản
ảnh hưởng đến mức độ ion hóa ứngenzym
cơ chất, enzym và đặc biệt ảnh

hưởng đến độ bền của enzym.
Chính vì th ế pH có ảnh hưởng
rấ t m ạnh đến phản ứng của
enzym. Anh hưởng đó được _
Hình 1.15 Anh hưởng của pH đến
trình bày trong hình 1.15. tóV, độ phàn ứ ĩĩem ym
46 C hương 1
Nhiều enzym hoạt dộng rấ t mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên,

cũng có nhiều enzym hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt
động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Ví dụ, một số protease hoạt
động ở pH kiềm (protease kiềm), một sô' protease hoạt động ở pH acid
(protease acid) và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính
(protease trung tính).
Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản
ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn
giống vi sinh vật ....
d- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzym thường là các chất có
m ặt trong các phản ứng enzym, làm giảm hoạt tính enzym nhưng lại
không bị enzym làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và
tính chất vật lý của chúng.
Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzym bao gồm các
ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm
hãm có ý nghĩa rấ t lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế
bào sinh vật.
Cơ chế kim hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch
hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận
nghịch, phản ứng giữa enzym và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt
được trạng thái cân bằng.
Kỉ
trong đó: E - enzym; I - chất kìm hẳm (inhibitor)
Ki i k2- hằng số vận tốc của phản ứng thuận nghịch.
Trong trường hợp phản ứng xảy ra không thuận nghịch, hằng
số K2 sẽ rấ t nhỏ và không dáng kể. Ở đây, các chất kìm hãm kết
hợp với enzym bằng liên kết đồng hóa trị. Ngoàỉ ra, các chất kìm
hãm k ết hợp với enzym còn theo một cơ chế khác mà hiện nay các
nhà khoa học vẫn chưa giải thích trọn vẹn. Theo đó, các chất kìm
hãm gắn rấ t chặt vào enzym, tạo thành phức hợp EL Phức hợp này
bị phân rã rấ t chậm.
N hững h iể u b ỉế t cơ b ả n về enzym 47
Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm,
người ta chia ra những chất làm hãm như sau.
Chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là
những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng
thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết
hợp với trung tâm hoạt động của enzym. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí
của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Nếu chất kim hãm đã chiếm
được vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không
còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của
chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số* lượng các enzym
kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzym sẽ giảm.
Chất cạnh tranh
© ©
H ìn h 1.16 Mô hình các chất kìm hãm cạnh tranh với cơ chất
Vì cổ cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh
và cơ chất đều có xu hướng chiếm vị trí troỊỊg trung tâm hoạt động.
Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào hai yếu tố.
- Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất cạnh tranh.
- Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với enzym.
Phản ứng trong trường hợp có chất cạnh tranh của phản ứng
enzym sẽ như sau:
K,
E+s ES E + p
Ki
E + I ES
trong đó Kị và Ka là hằng số kìm hãm. Hằng sế này càng lớn ái lực giữa E
và I càng thấp, hằng số này càng nhỏ, ái lực giữa E và I càng cao.
48 Chương 1
Tổng hợp các quá trình trên ta có:

[E0] = [EI + [ES] + [EI] = [ES] + (1 + ^ K = ESx(1
+ 5 g x ji-) rro ..,, +. iK-n
| +. ^[I] + D
[S]
Như vậy: = Ị P I ------!------------— ; V| =
max lôJ 1+ X (1 + 4 ) [S] + Km(1 + ^[I])
rsi
[S] ' kKị/
hoặc Kffl X(1 + J-) XJ_ + 1

M Vmax Ki [S] Vmax
Như vậy ta thấy khi có sự cạnh tranh, hằng số Michaelis-
Manten Kmsẽ tăng lên, do đó làm giảm ái lực của enzym và cơ chất.
Chất kìm hãm cạnh tranh
H ìn h 1.17 Sự phụ thuộc l / v vào 1/[SJ khi có (*-*-*-) và không có
Từ phương trình: Vj ------- vmax_[Sl

[ S Ị + K m(1 + fil)
Ki
ta thấy khi [S] > [I] thì — X ÍI 0

[S] Kị
Điều đó cho thấy nếu nồng độ cơ chất đủ lớn sẽ loại trừ được
hiện tượng cạnh tranh.
Chất kìm hãm không cạnh tranh: Nếu như trong cơ chế kìm
hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của
enzym thì trong cơ chế kim hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm
không chiếm trung tâm hoạt động của enzym mà là ỏ một vị trí ngoài
trung tâm hoạt động của enzym. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm
hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym theo chiều
hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế, các chất kìm hãm làm
giảm hoạt động của enzym.
Khi kết hợp với chất kìm hăm, enzym vẫn có khả năng kết hợp
với cơ chất. Khi đổ sẽ tạo thành phức hợp EIS. Quá trình này có thể
biểu diễn như sau:
E + s ES E + P
E + I EI
EI + s EIS
ES + I E IS
Từ những phương trình trên ta có thể viết:

ỀUẼỈ [S] = [ E S ] ^ ; ỊỄ1ỊỊ] Ki -* [EI] = [E ll = [ E S ] £ n L * n
[ES] m [EI] l»J »\j
m
Cũng có thể biểu diễn theo những phương trình:
[E0] = [E] + [ES] + [El] + [EIS] = [ E S ] ^ + 1 + ^ X BỊ + 1 j
- p s k i . | ị >(i *ỊỊỊ>
V. ỈESỊ 1
Vmax [Eol 1+ ("1 + —)
[sr Kj'
hay 3 -ơ + ễK )
K*ax <1 + ầK, ầ[S] - V,—
^ Vm max
Chất kìm hãm

khổng cạnh tranh
Hình 1.18 Cơ chế chất kìm hãm không cạnh tranh

50 Chương 1
Khi chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzym vận tốc
cực đại của phản ứng enzym sẽ bị giảm (1 + —) lần. Quá trình này
’ Kị
không làm thay đổi áỉ ỉực giữa enzym và cơ chất, mặc dù vận tốc
phản ứng giảm tương úng.
C hất kìm hăm không cạnh tranh gây ra mức độ kìm hãm,
như&g mức độ kìm hãm này không phụ thuộc vào tương quan nồng độ
cơ chất và chất tóm hãm. Cơ chất cho dù có lượng lớn bao nhiêu cũng
không loại trừ được tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm.
Trong thực tế, chất kìm hâm chỉ kết hợp với phức hợp ES mà
không k ết hợp với E tự do. Trong trường hợp này cả V và Km đều bị
giảm (1 + —) lần. Các chất kìm hãm có thể là những chất sau:
K|
Kim hãm bởi sản phẩm của phản ứng: Các sản phẩm của phản
ứng có th ể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu
như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzym
để tạo thành sản phẩm Pi và p2 thì enzym cổ ái lực với cả pu p2 và cả
chất A và chất B. Khi đổ, sản phẩm Pi và p2 được xem như chất kim
hãm của enzym.
Kìm hãm do thừa cơ chất. Trong phản ứng enzym thông thường
tuân theo:
E + S ^ = tr ES ------► E + P
Khi ES đuợc tạo thành rấ t có thể có một cơ chất gắn với ES, làm
chúng không thể chuyển hóa tiếp tục được, khi đó sẽ tuân theo:
ES + S T t i t . ESS
từ đó th iế t iập được:
H H - K .- E .p s i5 * ; ẼẼỈÍẼỊ = Kị -> [ESS] = [ES]ỈS

[ES] m [S] [ESS] 1 1 J 1 JK|
[EJ = [E] + [ES] + [ESS] = ES(1 + ^ + ífỉ)

ISJ
Vj = — ^max ; hay: - = —3—(1 + + Í§J)

* V, v max' [S ]' Kj
[S] Ki
Những1h iể u b iê t cơ b ản về enzym Ỡ1
cận xiên của nó có hệ số góc là Km/Vmax sẽ cắt trục tung ở điểm -1/Km
của nó có độ nghiêng 1/VmaxKj sẽ cắt trục hoành ở điểm -Kị. Trong cả

hai trường hợp ta thấy Vị qua một cực đại khi [S] = X Kj.
e- Ảnh hưởng của chất hoạt hồ€u Các chất có tác dụng làm tăng
hoạt tính enzym gọi là các chất hoạt hổa enzym. Các chất hoạt hóa
enzym có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là những
anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn
Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các chất hoạt hóa
chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ
này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzym.
Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ
chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một sô"
liên kết trong phân tử tiền enzym hoặc các chất có tác dụng phục hồi
các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym.
5- Tính chất đặc hiệu của enzym
Tính chất đặc hiệu là biểu ÍMện khả năng xúc tác của enzym đối
với cơ chất n hất định. Enzym có tính chất đặc hiệu rấ t cao. Tính chất
đặc hiệu của enzym cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa enzym với các
chất xúc tác khác.
52 Chương 1
Mỗi một loại enzym chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa
một hay nhiều chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định.
Tính chất đặc hiệu của enzym biểu hiện ở một số kiểu dặc hiệu sau:
ơ- Đặc hiệu kiểu phản ứng. Tính chất đặc hiệu kiểu này biểu
hiện ở chỗ, mỗi enzyn* chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng
chuyển hóa n hất định trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa
khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân.
b- Đặc hiệu cơ chất. Khỉ tham gia vào các phản ứng, các loại cơ
chất phải được'"gắn vào trung tâm hoạt động của cơ chất. Tuy nhiên,
không phải cơ chất nào cũng có khả năng tiếp cận và gắn được vào
trung tâm hoạt động của enzym. Người ta phân tích đặc hiệu cơ chất
theo mức độ sau:
Đặc hiệu tuyệt đối: Là khả năng xúc tác của enzym đối với một
cơ chất nhất định. Ngoài cơ chất này ra, enzym này không có khả
năng xúc tác đối với một cơ chất nào khác nữa.
Đặc hiệu tương đối: Là khả nâng xúc tác của enzym tác dụng
lên một kiểu liên kết hóa học nhất định.
Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): Là khả năng xúc tác của
enzym đến một trong hai dạng đồrig phân quang học của cơ chất.
Năm 1941, Berman và Fructon cho rằng, trong cơ chế đặc hiệu
quang học, cơ chất phải kết hợp với enzym ở ít nhất ba điểm. Enzym
thể hiện lên môt dạng đồng phân quang học cis hoặc trans.
1.4 DANH PHÁP QUỐC TẾ VÀ PHÂN LOẠI ENZYM
Khi số lượng enzym mới được phát hiện còn ít, người ta thường
gọi enzym theo ý thích của từng người tìm ra nổ. Dần dần, theo thời
gian, số lượng enzym tìm ra ngày một nhi^ều và những enzym tìm ra
ấy có những tính chất gần giống nhau hoặc giống nhau, người ta mới
phân loại chúng thành từng nhóm và đưa ra ạhững quy ước quốc tế về
tên gọi enzym để khi nghiên cứu và ứng dụng chúng, ai cũng cổ thể
hiểu đươc enzym đó thuộc nhóm nào và bản chất của chứng ra sao.
Theo quỵ ước quốc tế, tên gọi của enzym thường được gọi theo cơ
chất đặc hiệu của chúng cùng với tện kiểu phản ứng mà chúng tham
gia. Theo đó, tên một enzym thường có hai phần.
Phần đầu là tên cơ chất. Trong trường hợp phản ứng đó là phản
ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách
nhau hai chấm.
Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng.
Ví dụ, enzym urease có tên gọi hệ thông là carbamite-
amideohydrolase. Các enzym thường ở cuối tên có đuôi “...ase”. ở một
sô' sách viết theo ngôn ngữ Slaver thì có đuôi M ...aza”. Hiện nay ngườỉ
ta dừng đuôi “...ase” nhiều hơn đuôi “aza”.
Tuy nhiên, có nhiều loại enzym vi thói quen nên vẫn dược gọi
theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại. Ví dụ như trypsỉn,
chimotrypsin, pepsin....
Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân
loại enzym ra làm 6 lớp và được đánh sô" thứ tự từ 1 đến 6 . Các sô' thứ
tự này là cố định cho mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia ra làm nhiều tổ, mỗi tổ
lại chia ra làm nhiều nhóm. Chính vì thế, theo hệ thống phân loại,
mỗi enzym thường có bôn sô: số thứ nhất chỉ lớp; số thứ hai chi tổ; sô
thứ ba chỉ nhóm; sô' thứ tư chỉ enzym.
2- O xydoreductase
Đây là enzym xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Các enzym này
là những enzym phức tạp. Chúng bao gồm hai thành phần. Phần
coenzym của chúng là NAD+, NADP+, FMN, FAD, heme...Lớp enzym này
được hóa thành những nhóm sau:
Or Dehydrogenase,. Nhóm này tham gia vào các phản ứng tách H
trực tiếp từ cơ chất và chuyển chúng đến NAD+, NADP+, FMN, FAD.
Các dehydrogenase xúc tác cho giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp,
vận chuyển đồng thời cả proton và electron. Ngoài ra, chúng còn tham
gia xúc tác cho chiều ngược lại, chuyển H từ [NADH+H*] hoặc
[NADPH+H+], FMNH2, FAD-H2 đốn cơ chất và khử cơ chất. Đây là
những phản ứng đổng vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp.
6- Oxydase. Đây là enzym xúc tác cho quá trình chuyển
electron đến oxy. Chúng hoạt hóa oxy, làm cho chúng cổ khả năng kết
hợp với proton có trong môi trường. Lớp enzym này tác dụng trực tiếp
với oxy.
c- Oxygenase. Đây là enzym xúc tác cho phản ứng kết hợp trực
tiếp oxy vào phân tử của hợp chất hữu cơ cổ vòng thơm.
54 Chương 1
Nhóm này có hai loại, oxygenase và hydroxylase, oxygenase xúc

tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy. Hydroxylase xúc tác
cho phản ứng kết hợp một nửa phận tử oxy (thường ở dạng OH) vào
hợp chất hữu cơ.
d‘ Peroxydase. Đây là enzym có coenzym là heme, xúc tác cho
phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ khi có H20 2.
2- T ra n sp h era se
Transpherase cũng thuộc lớp enzym phức tạp, Coenzym của
transpherase có bản chất hóa học rấ t khác nhau tùy theo vào bản
chất của nhóm dược chuyển vị. Lớp transpherase bao gồm những
enzym tiêu biểu sau:
a- Acyỉtranspherase. Enzym này tham gia chuyển hóa nhóm acyl
thông qua coenzym A, tạo thành phức CoAS-acyl. Khi đó, nhóm
carboxyl của acid kết hợp với nhóm -SH của coenzym A tạo thành liên
kết thioester giàu năng lượng. Các enzym này có vai trò quan trọng
trong chuyển hóa lipid và phân giải glucose.
6- Glucosyltranspherase. Enzym này tham gia xúc tác cho phản
ứng vận chuyển đường hexose, pentose từ chất cho đến chất nhận
khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác
hoặc của gốc phosphate, nguyên tử nitrogen của nhân vòng.
Ngoài ra, enzym này cũng tham gia xúc tác cho quá trình tạo
cấu trúc phân nhánh trong phân tử glycogen, amylopectin.
c- Amểnotranspherase. Enzym này xúc tác cho phản ứng chuyển
vị nhóm amine, các phản ứng chuyển thuận nghịch nhóm amine của
amino acid đến a-cetoacid. Đây là enzym phức tạp, trong đó coenzym
là picidocal phosphate.
d - Phosphotranspherase. Enzym này tham gia xúc tác chuyển

gốc phosphoryl. Trong phản ứng này thường có sự tham gia của ATP
với ý nghĩa như một cha't cho. Gốc phosphate được chuyển từ ATP
(hoặc có th ể là NTP), đến nhóm hydroxyl của alcohol hay saccharide.
3- H ydrolase
Hydrolase tham gia xúc tác cho các quá t rình thủy phân. Chính vì
thế, nước là thành phần không thể thiếu được của những phản ứng do
enzym này tham gia. Có rất nhiều enzym thuôc ỉớp enzym này như:
Or Peptide hydrolase. Enzym này tham gia xúc tác phản ứng
thủy phân peptide, tạo thành những phân tử thấp và các amino acid.
Các enzym peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở
giữa chuỗi peptide gọi là endopeptide hydrolase hay proteinase. Đại
diện cho endopeptide hydrolase là pepsin, trypsin, chymotrypsin. Các
enzym peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở đầu chuỗi
peptide gọi là exoLpeptide hydrolase hay peptỉdease. _
Năm 1960, Hartley chia proteinase ra làm bốn nhóm:
Proteinase-serine. Trong enzym này, gốc serine đóng vai trò xúc
tác d trung tâm hoạt động. Nhóm này bao gồm trypsin, chymotiypsin,
eỉastase, các proteinase làm đông máu, ácrosin.
Proteinase-thioL Trong trung tâm hoạ^ dộng có nhóm -SH trực
tiếp tham gia phản ứng, bao gồm papain, bromeiin, ficin.
Proteinase-kim loạL Trong trung tâm hơạt động, kim loại đóng
vai trò quan trọng trong xúc tác.
Protein-acid (aspartic proteinase). Trong trung tâm hoạt động có
nhóm Ỵ-carboxyl.
b- Lipase. Enzym này tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng
thủy phân treacylglycerol (dầu thực vật và mỡ động vật) tạo thành
acid béo tự do và glycerol. Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần
lượt từng liên kết chứ không phải cắt đứt cả ba liên k ết ester cùng
một lúc.
4- L ia se
a- Pyruvate decarboxylase. Enzym này tham gia xúc tác cho
phản ứng loại C02 ra khỏi phân tử pyruvic acid, tạo thành aldehyde
tương ứng là acetaldehyde. Đây là phản ứng quan trọng trong lên men
rượu. Enzym này là enzym đa cấu tử, coenzym của chúng là thiamipiro
phosphate.
56 Chương 1
b- Fumarfite hydrolase. Enzym này là xúc tác cho phản ứng tách
thuặĩi nghịch phân tử nước khỏi malic acid tạo thành fumaric acid
(acid có một nối đôi).
5- Isom erase
Enzym này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp
giữa galactose và glucose. NAD+ trong enzym này tham gia trực tiếp
trong phản ứng.
6- L igase
Enzym này tham gia xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic
acid, tạo thành oxaloacetic acid. Chúng cần acetyl-coA và Mg.2+ cho
phản ứng xúc tác. Biotin là chất mang C02 đã hoạt hốa và chuyển đến
pyruvic acid.
1.5 PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYM TRONG

NGHIÊN CỨU
Enzym là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn
chúng tồn tại trong tế bào. Các enzym này thường không có khả năng
di ditfjSiqua màng sinh học. Do đó việc tách chúng ra khỏi tế bào là
điều rấ t khó khăn.
Để thu nhận enzym nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng
nhiều phương pháp. Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử
dụng đề phá vỡ tế bào như:
Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như
bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa....
Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm.
Phương pháp hóa học như dùng các loại dung môi, butylic,
aceton^ glycerol, ethylacetate.
Có ba khó khăn trong khi tách enzym khỏi tế bào cân phải hết
sức lưu ý.
- Enzym có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các
thành phần khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này
là điều rấ t khó.
- Enzym là chất hữu cơ không bền, chúng rấ t dễ bị biến tính khi
bị tác động của các yếu tố bên ngoài.
N hững h iể u b ỉế t cơ bản về enzym 57
- Enzym là protein. Protein enzym luôn luôn di cùng những loại

protein không phải enzym nhưng lại có tính chất lý hóa rấ t giống
protein enzym. Do đó, việc tách protein-enzym ra khỏi các loại protein
không phải lúc nào củng đạt được kết quả tốt và không phải không
gặp những khó khăn nhất định.
Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch
đệm, dung dịch muôi trung tính để tách enzym ra khỏi sinh khôi đã
xử lý theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được, người ta gọi
là chế phẩm enzym thô. Sở dĩ gọi là chế phẩm enzym thô vì trong chế
phẩm này, ngoài enzym ra còn có nước, protein không phải enzym các
thành phần của tế bào.
Như vậy, việc làm sạch enzym chính là việc loại protein không
phải là enzym (đôi khi loại bỏ cả các protein-enzym không mong
muốn), nước, các thành phần khác của tế bào khỏi enzym. Công việc
này hoàn toàn không dễ dàng. Do dó, việc làm sạch enzym đòi hỏi
người làm nghiên cứu về enzym, ngoài sự hiểu biết về enzym ra còn
phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để trán h gây
mất tính hoạt động của enzym.
Để loại bỏ những thành phần không phải là enzym ta đang cần,
người ta thực hiện những phương pháp sau.
2- P hương p h á p gây biến tín h chọn lọc
Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm
biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích
hợp với enzym chịu acid và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung
dịch enzym lên 50-70°C và pH < 5. Ở diều kiện này những enzym
không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó,
bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành
phần không phải là enzym mà ta mong muốn.
2- Phương p h á p k ế t tủ a p h ă n đoạn
Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzym ở nồng độ
muối khác nhau, người ta thường sử dụng (NH4)2S0 4 để kết tủa phân
đoạn enzym. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzym. Ngoài muối (NH4)2S0 4 ra,
người ta còn sử dụng một số đung môi hữu eơ để kết tủa enzym.
58 Chươkig 1
Phương pháp kết tủa thường làm enzym biến tính rất nhanh. Vì thế
trước khi tiếtt hành kết tủa, người ta phải tiến hành làm lạnh các
"chất kết tủa và cả đung dịch enzym.
3- P hư ơng p h á p h ấ p th ụ chọn lọc
Người ta có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzym,
hoặc cho dung dịch enzym chảy qua một cột, trong cột có chứa chất
hấp thụ. Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi là hydrocyapatite. Người
ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzym
ìioặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzym, người ta
thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0°c. Sau khi hấp thụ,
người ta lại tiến hành chiết enzym (quá trình phản hấp thụ) bằng các
dưng môi thích hợp.
4- Phưctng p h á p sắc ký
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong
nước và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký
trao đổi ion để làm sạch enzym. Người ta thường sử dụng các tác
nhân trao đổi ion sau:
- Nhựa trao đổi ion
- Dẫn suất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose,
diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-
cellulose.
Người ta thường sử dụng DEAE-cellulose hơn cả. Ưu điểm của
DEAE-cellulose là ngoài tạp chất protein, các loại nucleic acid đều được
loại khỏi enzym.
- Sephađex là dẫn xuất của polysaccharide dextran. Trong chất
này, các phân tử của chúng thường liên kết với nhau bởi các liên kết
ngang nhờ tác dụng của epiclohydrin, tạo thành “sàng phân tử”. Số
lượng liên kết ngang càng nhiều, kích thước sàng phân tử càng nhỏ.
Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch
tán vào bên trong các hạt sephadex đã được ngâm trong dung dịch
đệm. Các phân tử có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các
h ạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Phương pháp này được ứng dụng
rộng rãi trong kỹ thuật enzym.
Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả
trong việc làm sạch enzym. Do đó, việc làm sạch enzym chỉ thật sự có
hiệu quả khi tạ biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau,
tạo ra hệ thống phương pháp nối tiếp nhau một eách hài hòa nhất.
1.6 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG x ú c TÁC CỦA ENZYM
Người ta xác định khả năng xúc tác của enzym thông qua việc
xác định hoạt độ hoạt động của enzym. Người ta cũng không thể định
lượng enzym trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ
hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau
một thời gian phản ứng.
1-Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzym
Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dạng một trong ba nhóm
phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzym.
- Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được
tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzym đã xác định
trước. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là
tương đối chính xác.
- Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một
lượng biến đổi nhất định của ỉượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương
ứng với một lượng enzym nhất định.
- Tiến hành chọn nồng độ enzym cần thiết để trong một thời gian
nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ta có thể tóm tắ t các nhóm phương pháp trên trong bảng 1.5.
Bảng 80 1.5 Nội dung của các nhổm phương pháp
xác định khả năng xúc tác của enzym
Nhỏm pp Các thông số cố đinh Các thống số thay đổi
1 - Thời gian Biến đổi của cơ chất và

- Nổng độ enzym của sản phẩm
2 - Lượng cơ chất mất đi (hay lượng sản phẩm Thời gian

tạo thành)
- Nổng độ enzym
3 - Thời gian, lượng cơ chất mất di hay lượng sản Nổng độ enzym
phẩm tạo thành
60 Chương 1
2- Đơn vị hoạt độ
Khả năng xúc tác của enzym được xác định thông qua hoạt độ
hoạt động của enzym. Hoạt độ hoạt động của enzym được xác định
thông qua dơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua
những đơn vị sau.
Or Đơn vị hoỌrt độ quốc tế (UI). Đơn vị hoạt độ quốc tê là ỉượng
enzym có khả nang xúc tác ỉàm chuyển hóa được 1 ịì/nol cơ chất sau
m ột phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 UI = lụm ol cơ chất (Ĩ0'6moỉ)/phút
6- K atai (Ktứ). Đơn vị Kat là lượng enzym có khả năng xúc tác làm
chuyển hóa được một mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat - 1 mol cơ chất Ịgiãy
1UI = — 10~^ Kat = 16,67 nKat (rumoKaial)
c- H oạt độ riêng. Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym ỉà sấ

đem vị W1 (hoặc một đơn vị Kataỉ) ứng với một militre dung dịch (nếu
là dung dịch) hoặc một miỉigram protein (nếu là bột khô) cửa chế
phẩm enzym. Khi biết được khối lượng phân tử của enzym ta hoàn
toàn có th ể tín h được hoạt độ riêng của phân tử.
đ- H oạt độ riêng của phán tử, Hoạt độ riêng của phân tử enzym
là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzym trong
một đơn vị thời gian. Việc xác định hoạt độ của enzym thường được
các nhà khoa học đưa ra những phương pháp rấ t cụ thể cho từng ỉoại
enzym, ứng với từng loại cơ chất. Những phương pháp này, chúng tôi
đã viết kỹ trong sách “Thí nghiệm công nghệ sinh học - Tập 2”, xuất
bản năm 2003. Tuy nhiên, khi tiến hành hoạt độ của enzym cần lưu ý
những điểm cơ bản sau:
- Khi tiến hành xác định hoạt độ cửa enzym cần phải cho lượng
cơ chất trong m ột giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hòa enzym.
Lượng cơ chất cho vào không được quá nhiều. Nếu lượng cơ chất nhiều
sẽ gây ức chế hoạt động của enzym.
- Đối với những enzym dễ m ất hoạt tính cần phải có chất hoạt
hóa hoặc làm bền enzym, thỉ cần phải cho những chất này trước khỉ
cho cơ chất vào để thực hiện phản ứng.
N hững h ỉể u b iế t cơ b ả n về enzyxn 61
- Khi xác định hoạt độ enzym cần lưu ý phải thực hiện trong điều
kiện pH cố định và thích hợp với hoạt động tối lAi của enzym nghiên
cứù. pH thường thay đổi tùy thuộc vào cơ chất và dung dịch đệm.
- Khi xác định hoạt độ enzym cần lưu ý đến nhiệt độ. Các nhà
khoa học cho rằng không nên xác định hoạt độ enzym ở nhiệt độ tối
ưu của enzym mà ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu đó một ít để
tránh khả năng ỉàm biến tính enzym khi có sự bỉến động về nhiệt độ.
- Thời gian xác định hoạt độ enzym chỉ nên kéo dài khoảng 5-10
phút, không nên kéo dài quá, dễ gây giảm hoạt độ của enzym. Tuy
nhiên, cũng có những trường hợp kéo dài đến 24 giờ đối với những
enzym có khả năng hoạt động yếu. Trong trường bợp phái kéo dài thời
gian, cần thiết phải cho chất ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt vsv.
Ngoài ra, hiện nay trên thế giới có rấ t nhiều cách biểu thị đơn
vị hoạt độ của enzym. Những đơn vị đó như sau:
MWU (đơn vị Wohlgemuth cãi tiến). Đơn vị MWU là đạn vị biểu
thị một lượng enzym cần thỉết chuyển hóa một mg tinh bột hòa tan
đến dextrin trong 30 phút ồ điều kiện thí nghiệm.
SKB (đơn vị hoạt động enzym này do Sandstedt, Kneen, Blish
đưa ra). Đơn vi SKĐ là đơn vị hoạt độ enzym đuợc đo bằng lượng
enzym cần thiết để dextrin hổa một gam p-dextĩin giới hạn đến kích
thước xác định sau một giờ ỏ điều kiện thí nghiệm.
GAU (đơn vị đo hoạt độ của gỉucoamylase). Đơn vị GAU ỉà số
lượng enzym cẩn thiết đưa vào phản ứng để giải phóng một gram
đường glucose sau một giờ trong điều kiện thí nghiệm.
NU (đơn vị Nothrop). Đơn vị NU là số lượng enzym cần th iết đưa
vào phản ứng, giải phóng ra 67,08mg nitrogen phi protein trong đỉều
kiện thí nghiệm.
HU (đơn vị dextrinogen). Đơn vị HU là số lượng enzym cần thiết
sử dụng để chuyển hóa một pound tinh bột đến dextrose trong 72-96
giờ ở pH:4 và 60°c.
AU (đơn vị Auson). Bơn vị Auson được điCa ra để đo hoạt tĩnh
enzym sử đụng trong chất tẩy rửa. Mỗi một gam chứa 25-30 đơn vị
Auson của enzym suỉtilin tinh thể. Đơn vị được biểu diển ịìig (đo tà n g
hemoglobin ).
Chương 2
NHỮNG PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT c ơ BÀN

TRONG CÔNG NGHỆ ENZYM
2.1 NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT MỘT s ố ENZYM QUAN TRỌNG
Enzym ỉà protein được sinh vẠt tổng hợp trong mỗi tế bào và là
chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi
sinh vật đều được coi như nguyên liệu để sản xuất enzym. Tuy nhiên,
không phải tấ t cả mọi sinh vật đều có những enzym giông nhau và
các loại enzym hoạt động với tốc độ chuyển hóa vật chất hoàn toàn
không giống nhau.
Cố những sinh vật tổng hợp ra một loại enzym rấ t mạnh, sinh
vật khác có khả năng tổng hợp enzym đó rấ t yếu nhưng lại có khả
năng tổng hợp loại en^ym khác rấ t mạnh. Ngay trong một cơ thể đa
bào, có cơ quan tổng hợp ra enzym này, cơ quan khác lại tổng hợp ra
enzym khác. Do đó việc xác định l«ại loài sinh vật và cơ quan tổng
hợp ra một loại enzym mà ta đang cản cho những mục đích ứng dụng
cụ thể là điều rế t cần thiết.
Bản chết của enzym là protein có hoạt tính xúc tác sinh học và
được sinh vật tổng hợp. Như bảng 2.1 đã trình bày, động vật, thực vật *
và vi sinh vật (VSV) là những giới sinh vật đều có khả năng tổng hợp
enzym và đều là nguồn cung cấp enzym. Tuy nhiên, giữa chúng có
những khác biệt rấ t lớn.
N hững phương p h áp và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzym 63
Bảng 2.1 Một số nguồn enzym và enzym quan trọng

Mã số Nội bào, Mức độ ứng dụng trong
stt Enzym Nguổn enzym
enzym ngoại bào sản xuất cổng nghiệp
Nguồn dộng vật
1 Catalase 1.11.1.6 Gan động vật Nội bào - Thực phẩm
2 Chymotrypsin 3.4.21.1 Tụy tạng Ngoại bào - Thuộc da
3 Lipase 3.1.1.3 Tụy tạng Ngoại bào - Thực phẩm
4 Rennet 3.4.23.4 Da múi khế dộng vật Ngoại bào + Phomai
5 T rypsin 3.4.21.4 Tụy tạng Ngoại bào - Thuộc da
Nguổn thực vật
6 Actỉnidin 3.4.22.14 Trái kiwi Ngoại bào - Thực phẩm
7 a-amylase 3.2.1.1 Malt Ngoại bào +++ Bia
õ p-amylase 3.2.1.2 Malt Ngoại bào +++ Bia
9 Bromelin 3.4.22.4 Dịch dứa Ngoại bào - Bia
10 p-glucanase 3.2.1.6 Malt Ngoại bào ++ Bia
11 Ficin 3.4.22.3 Mủ sung Ngoại bào - Thực phẩm
12 Lipoxygenase 1.13.11.12 Đậu nành Nội bào - Thực phẩm
13 Papain 3.4.22.2 Mủ du đủ Ngoại bào ++ Thịt
Nguổn vi khuẩn
14 a-amylase 3.2.11 Bacillus sp Ngoại bào +++ Tinh bột
15 p-amylase 3.2.1.2 Bacillus sp Ngoại bào + Tinh bột
16 Asparaginase 3.5.1.1 Ẽ.coìi Nội bảo - Sức khỏe
17 Glucose somerase 5.3.1.1 Bacillus sp Nội bàó ++ Siro fructose
18 Penicillin
amidase 3.5.1.11 Bacillus sp Nội bào - Dược
19 Protease 3.4.21.14 Bacillus sp Ngoại bào +++ Chất tẩy rửa
20 Pollulanase 3.2.1.41 Klebsiella Ngoại bào - Tinh bột
Nguổn nấm sợỉ
21 a-amylase 3.2.1.1 Aspergillus sp. Ngoại bào ++ Bảnh kẹo
22 Aminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus sp. Nội bào - Dược
23 Glucoamylase 3.2.1.3 Aspergillus sp. Ngoại bào +++ Tinh bột
24 Catalase 1.11.1.6 Aspergillus sp. Nội bào - Thực phẩm
25 Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma sp. Ngoại bào - Xử lý chất thải
26 Dextranase 3.2.1.11 Penicilìum sp. Ngoại bào - Thực phẩm
27 Glucose oxidase 3.2.3.4 Aspergillus sp. Nội bào - Thực phẩm
28 Lactase 3.2.1.23 Aspergillus sp. Ngoại bào - Sữa
29 Lipase 3.1.1.3 Rhizopus $p. Ngoại bào ++ Thực phẩm
30 Rennin 3.4.23.6 Muco miehei Ngoại bào ++ Phomaí
31 Pectinase 3.2.1.15 Aspergillus sp Ngoại bào + Đổ uống
32 Protease 3.4.23.6 Aspergillus sp. Ngoại bào - Bánh kẹo
33 Raffinase 3.2.1.22 M ortierella Nội bào - Thực phẩm
Nguồn nấmmen
34 Invertase 3.2.1.26 Saccharomyces sp. Nội và ngoại bào - Bánh kẹo
35 Lactase 3.2.1.23 Khuyveromyces sp. Nộỉ và ngoại bào - Sữa
36 Lipase 3.1.1.3 Candida sp. Ngoại bào - Thực phẩm
37 Rafinase 3.2.1.22 Saccharomyces sp. Nội bào - Thực phẩm
í Ghi chú: + + + s ả n lư ợ ng > 100 tấ n /n ă m ; + + s ả n lư ợ n g > 10 tấ n / n ă m

+ s ả n lư ợng > 1 tấ n /n ă m ; - s ả n lư ợng < 1 tấ n /n ă m .
64 Chường 2
2,1.1 N g u ồ n enzym đ ộ n g v ậ t
Ở động vật, không phải tấ t cả những mô bào đều có khả năng
tạo ra những loại enzym mà ta mong muốn. Tất nhiên tế bào nào
cũng đều phải tổng hợp ra enzym cho mình, thực hiện các phản ứng
sinh hóa của từng mô bào, từng tế bào.
Động v ậ t là cơ th ể đa bào, đã được phân hóa thàn h các cơ
quan. Việc nghiên cứu chức năng của từng cơ quan đã được làm
sáng tỏ, tuy nhiên những chuyển hóa sinh học xảy ra trong những
cơ quan chức năng đó vẫn còn rấ t nhiều vấn đề cần được nghiên
cứu sâu hơn để hiểu rõ hơn. Ở dây, chúng ta chỉ quan tâm đến
những cơ quan của động vật có khả năng sinh tổng hợp lượng
enzym lớn và ta có thể khai thác, ứng dụng chúng trong các quá
trìn h sản xuất công nghiệp. Cho đến nay người ta mới khai thác
enzym từ các tuyến dịch, hoặc những cơ quan trực tiếp, hoặc gián
tiếp vào quá trìn h tiêu hốa của động vật. Enzym được khai thác từ
động v ậ t chủ yếu thuộc nhóm protease. Ưu điểm của protease từ
nguồn động v ật là có hoạt tính khá cao và ổn íiịnh. Nhưng enzym
được khai thác từ nguồn động vật cố những khố khăn rấ t lớn, cho
đến nay vẫn chưa có biện pháp khắc phục.
• Mặc dù enzym protease từ nguồn động vật được loài người khai
thác và ứng dụng hàng ngàn năm nay để sản xuất các sản phẩm từ
sữa, nhưn&hỉện nay lượng enzym thu nhận từ động vật được thay thế
dần bằng enzym v sv . Thu nhận enzym từ nguồn động vật thường rất
khó và hiệu quả kỉnh tế ktiông cao. Mục tiêu của ngành chăn nuôi là
thu nhận sinh khối (thịt, xương, da, lông, sữa..), việc thu nhân enzym
chỉ là phụ, không thể cổ trường hợp chăn nuôi chi để thu nhận
enzym. Enzym được thu nhện trong trưởng hợp này được coi như một
sản phẩm đi kèm những sản phẩm sinh khối. Enzym chỉ chiếm một
khối lượng rấ t nhỏ trong sản phẩm của ngành chăn nuôi.
• Mặc dù ngành chăn nuôi đã có những thành công rấ t ỉớn trong
việc tập trung hóa nghề chăn nuôi, cơ giới hóa, tự động hóa một phần
nhưng nhìn chung toàn bộ quy trình chăn nuôi vẫn không thể trồ
th àn h một ngành công nghiệp được kiểm soát chặt chẽ. Yếũ tố rủi ro
về bệnh tật, về nguồn thực phẩm vẫn là mối quan tâm rấ t lớn của các
N hững phư ơng p h áp và kỹ th u ậ t cơ b ả n tro n g công nghệ enzym 65
nhà khoa học và người sản xuất. Hiện nay, chăn nuôi vẫn còn bị động
trước các yếu tố thiên nhiên và bệnh tật, thu nhận enzym từ động vật
với nhiều rủi ro như vậy chắc sẽ không ổn định.
• Cho đến nay chưa có một nghiên cứu tạo giông động vật nào
nhắm vào mục tiêu tạo enzym protease mạnh, dùng trong công nghiệp
thực phẩm. Các nghiên cứu tạo giống động vật bằng phương pháp lai,
phương pháp biến đổi di truyền cổ điển, hay phương pháp tái tổ hợp
gen hiện đại đều chí nhắm vào những mục tiêu ngoài enzym. Có thể
người ta không quan tâm đặc biệt đến enzym từ nguồn động vật, việc
thu nhận enzym từ nguồn động vật đượọ coi như một phần đương
nhiên trong thu nhận sinh khấi từ chăn nuôi.
2.1.2 N guồn th ự c v ậ t
Từ ỉâu loài người đã biết sử dụng một số bộ phận của thực vật
để tiến tiến hành sản xuất một sế sản phẩm thực phẩm, hoặc ứng
dụng trong một sấ lĩnh vực khác. Những bộ phận hay loài thực vật
sau đây được sử dụng để thu nhận enzym phổ biến nhất.
1- Thu nhận enzym amylase từ thốc đại mạch nay mầm (malt)
Thóc đại mạch nảy mầm được gọi là malt. Malt được sử dụng rất
nhiều trong sản xuất bia và được coi như nguyên liệu chính trong sản
xuất bia. Trước đây, người ta còn sử dụng malt như nguồn enzym duy
nhất để đường hóa tinh bột trong công nghệ sản xuất cồn từ nguồn
nguyên liệu chứa tinh bột, sau này người ta thay chúng bằng nguồn
enzym từ v sv . Hiện nay malt được coi như là nguyên liệu chứa enzym
amylase lớn nhất, và enzym amylase từ nguyên liệu này cũng được coi
như loại enzym được thu nhận, ứng dụng nhiều nhất trong tấ t cả loại
enzym hiện có.
2- Thu nhận enzym papain từ quả đu đủ '
Đu đủ là một loài thực vật phát triển rất nhiều ở vùng nhiệt
đới. Quả đu đủ được sử dụng như một loại thực phẩm, mủ đu đủ chứa
nhiều papain. Papain được xem như loại enzym protease. Nhiều nơi
trên thế giới trồng đu đủ để thu nhận papain là chủ yếu. Hiện nay
papain được sử dụng làm mềm thịt, sử dụng nhiều trong y học và cả
ngành thuộc da và ngành dệt.
66 Chương 2
3- Thu nhận bromelin từ cây dứa

Cây dứa cũng là loài thực vật phát triển nhiều ở các nước nhiệt
đơi. Người ta trồng dứa chủ yếu để lấy quả dùng như một loại thực
phẩm cao cấp. Trong rất nhiều bộ phận của cây dứa có chứa bromelin.
Cromelin là một loại enzym protease thực vật, có nhiều ở vỏ quả, đặc
bi?t chúng có nhiều ở chồi dứa. Đây là những phần không sử dụng
được với mục đích làm thực phẩm. Do đó, việc khai thác bromelin từ
các bộ phận này của dứa vừa có ý nghĩa làm sạch môi trường vừa có ý
nghĩa sản xuất enzym bromelin. Bromelin được ứng dụng nhiều trong
việc làm mềm thịt, trong sản xuất thuốc tiêu hóa và các ngành công
nghiệp khác.
4- Thu nhận ficin từ quả sung
Ngoài các loài thực vật kể trên, các nhà khoa học còn phát hiện
ra íìcin có trong quả sung. Hoạt tính xúc tác của loại protease cũng rất
cao. Một vài nơi trên trên thế giới có khai thác enzyxn flcin từ loại
quả này.
Toàn bộ tính chất hóa học, khả năng xúc tác, kỹ thuật khai thác
và kỹ thuật ứng dụng các loại enzym từ thực vật chúng tôi sẽ trình
bày kỹ trong những chương sau. Ýuy nhiên, chúng ta cùng phải nhận
biết rằng các loài thực vật tuy có khả năng sinh tổng hợp các loại
enzym có hoạt tính cao, nhitag quá trình nuôi trồng chúng lại rất khó
khản do bị lệ thuộc nhiều vào điều kiện tự nhiên và thời gian để thu
hoạch dài.
2.1.3 N g u ổ n vỉ sin h v ậ t
Khoa học nghiên cứu về v sv chậm hơn khoa học nghiên cứu về
động vật và thực vật. Mãi thế kỷ 18 người ta mới biết về sự tồn tại
của v s v trong thế giới sinh vật, tuy nhiên việc ứng dụng các công
nghệ có hoạt động của v sv thì có từ rất tâu đời. Dựa trên nền tảng đó
nên v s v ứng dụng đã phát triển rất nhanh, đặc biệt là trong th ế kỷ
20- Trong đó công nghệ enzym từ v sv đặc biệt phát triển rấ t mạnh ở
th ế kỷ 20 đầu th ế kỷ 21. Nguồn enzym này dần dản thay thế enzym
từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vsv và
về kỹ thuật sản xuất.
N hững phư ơng p h áp và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzym 67
Trong ba nguồn enzym được trình bày ở phần trên, nguồn

enzym từ v sv được quan tâm và sản xuất nhiều nhất không chỉ ơ
khối lượng mà ỏ cả số lượng các loại enzym.
Nguồn enzym từ v sv cõng là nguồn enzym duy nhâ't được đưa
vào sản xuất theo quy mô công nghiệp. Khác với thực vật và động vật,
v sv được cấu tạo từ một tế bào, chính vì cơ thể chl dược câu tạo từ
một tế bào nên v sv có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật.
Trong cuốn sách này sẽ trình bày kỹ phương pháp thu nhận enzym từ
v sv . Những ưu điểm cơ bản của v sv dùng dể sản xuất enzym dược
tóm tắ t như sau:
- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chặ*t
lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
Trong khỉ đó, động vật và thực vật không thể thực hiện được khối
lượng chuyển hóa lớn như vậy, khả năng chuyển hóa khối lượng cơ
chất lớn hơn hàng ngàn lần khối lượng tế bào của v sv đòi hỏi một
lượng enzyrn tương ứng. Do đó, v sv phải tổng hợp một ỉượng enzym
rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn, điều này cũng đồng nghĩa
với khả nãng tổng hợp enzym của v sv hơn hẳn khả năng tổng hợp
enzym ở động vật và ở thực vật.
- Hoạt tính enzym của vsv cao hơn hoạt tính enzym được tổng
hợp từ động vật và từ thực vật.
- Tốc độ sinh sản của v sv rất cao, trong một thời gian ngắn ta
có thể thu được lượng sinh khối v sv rất lớn. Đặc điểm này giúp ta
trong một thời gian ngắn ta thu được một lượng enzym nhiều hoặc
lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
* Đặc điểm quan trọng nhất ồ v sv là chúng là những cơ thể rất
nhỏ bé, ta có thể đưa chúng vào những thiết bị lên men. Các thiết bị
lên men được đặt trong phòng hoặc nhà sản xuất mà ta có thể kiểm
soát được nhiệt dộ, độ ẩm, mức độ tiệt trùng hay vệ sinh nhà xưởng.
Mặt khác, ở trong các thiết bị lên men, ta hoàn toàn điều khiển YB
kiểm soát được các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ chất khô, nồng
cơ chất, các chất gây độc hại, ánh sáng hoặc lưu ỉượng không khí cần
68 Chương 2
thiết. Hay nói cách khác, các điều kiện cần thiết của một quá trình
sản xuất công nghiệp ta hoàn toàn có thể thiết lập theo ý muốn và
kiểm soát chúng một cách chặt chẽ, kể cả khả năng cơ giới hóa và tự
động hóa ỏ mức độ cao. Do đó, từ đặc điểm rấ t quan trọng này, ta có
thể sản xuất enzym từ v sv từ hình thức thủ công, sang hình thức
công nghiệp hiện đại, với sản phẩm được sản xuất hàng loạt và có
kiếm soát.
- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzym từ v sv là những nguyên
liệu rẻ tiền và dễ kiếm, v sv không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố
dinh dưỡng của môi trường, nhất là những v sv tổng hợp enzym.
Nhiều khi những nguyên liệu dùng để sản xuất enzym chỉ là phế liệu
của một ngành sảri xuất nào đó. Điều này không chỉ có ý nghĩa về
m ặt kinh tế (nguyên liệu rẻ tiền), mà còn có ý nghĩa rấ t lớn về m ặt
môi trường sống. Chính vì thế enzym được sản xuất từ v s v thường rẻ
tiền hơn enzym từ các nguồn khác.
- Điểm cuối cùng cũng rất quan trọng là ta hoàn toàn có thể
điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzym trong khi sản xuất. Các enzym
tham gia thủy phân được v sv tổng hợp là những enzym cảm ứng,
hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzym được Monod-Jacob tìm ra
vào năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rấ t rõ ở v sv . Tác động
của các yếu tô' bên ngoài đến v sv là tác động trực tiếp, tế bào v sv
chịu tác động này thường rấ t mạnh và chúng phản ứng lại với tác
động đó cũng rấ t nhanh. Chính vì th ế ta có thể sử dụng pH, nhiệt độ
và đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển quá
trình tổng hợp enzym.
Những enzym tham gia vào phân giải một chất nào đó, và khi
có m ặt của chất đó trong môi trường nuôi cấy thì lượng enzym này
được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với mức độ bình thường khi không
có cơ chât, được gọi là enzym cảm ứng. Các enzym cảm ứng sẽ dược
tạo ra trong tế bào, chúng hoạt động cả trong và ngoài tế bào chúng
thuộc nhóm enzym thủy phân và thuộc loại enzym dị hóa.
N hững phư ơng p h áp và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzyra 69
Những chất được đưa

vào môi" trường, kích thích
và thúc đẩy nhanh quá trình
tổng hợp ra enzym cảm ứng
phân hủy chính, chất này
được gọi ỉà cơ chất cảm ứng.
Cơ chất cảm ứng thường
được coi như yếu tế rất quan Hình 2,1 Điều khiển quá trình sinh
trọng dùng để đỉều khiển tổng hợp enzym bởi cơ chất cảm ứng
quá trình sinh tổng hợp
enzym. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tâng dần* thì khả năng tổng
hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng liềulượng cơ
chất thì sẽ đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chựng lại và
thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất
gây nên.
Như vậy, muôn điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzym bằng
cơ chất cảm ứng phải chú ý hai điểm:
Thứ nhất: Muốn thu nhận enzym cảm ứng nào thì phải cho cơ
chất cảm ứng của enzym đó vào môi trường. Ví dụ:
- Muốn thu nhận amylase thì phải cho tinh bột
- Muốn thu nhận protease thì phải cho protein
- Muốn thu nhận pectinase thì phải cho pectin
- Muốn thu nhận cellulase thì phải cho cellulose.
Tương tự như vậy ta tiến hành thu nhận các enzym cảm ứng
khác cùng theo nguyên tắc trên.
Thứ hai: Tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều
lượng nhất định nào đó* Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng
hợp sẽ giảm. Do đổ không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh
tổng hợp càng cao.
Monod và Jacob đưa ra thuyết điều khiển sinh tổng hợp enzym
cảm ứng dựa trên nguyên tắc trên.
70 Chương 2
Gen diều khiển Gen tổng hợp 1. 2. 3. 4.
ị Enzym E2
I
Cơ chất
(S)
Hình 2.2 Sơ đồ quá trình điều khiển sinh tổng hợp enzym cảm ứng
Bình thường khi không cổ cơ chất, chất kìm hãm có trong tế bào
sê tương tác với gen điều khiển, toàn bộ quá trình tổng hợp enzym sẽ
bị phong tỏa và không hoạt động.
Khi ta cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác
với chất kìm hãm, gen điều khiển thoát khỏi sự phong tỏa của chất
kìm hãm và các gen tương ứng. Enzym được tổng hợp ra sẽ phân hủy
cơ chất. Khi đó chất kìm hãm sẽ không bị phong tỏa và sẽ tương tác
với gen điều khiển, toàn bộ hệ thống bị đóng lại, quá trình tổng hợp
bị ngưng trệ. Như vậy muốn enzym được tổng hợp, ta phải luôn cho vào
môi trường ỉên men cơ chất cảm ứng. Cách điều khiển này rất có ý
nghĩa trong sản xuất các loại enzym cảm ứng. Thắng lợi hay thất bại
trong sản xuất enzym cảm ứng phụ thuộc rất nhiều ở việc xác đinh cơ
chất cảm ứng, về liều lượng cần thiết của chất cảm ứng đưa vào môi
trường. Sau đó, người ta điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzym
trong sản xuất bằng pH, nhiệt độ, hoạt tính của nước cũng như bằng
nhu cầu oxygen.
Sản xuất enzym từ động vật và thực vật không thể áp dụng
phương pháp điều khiển trên.
Ở thực vật, giai đoạn đầu của quá trình sản xuất enzym là giai
đoạn trồng cây, giếng như các kỷ thuật nông nghiệp thường được thực
hiện hàng ngàn năm nay. Từ những thành phần của cây có chứa
enzym, người ta thu nhận chúng và áp dụng những kỹ thuật cụ thể
cho từng loại enzym để thu nhận các loại chê phẩm enzym khác nhau.
Tương tự như vậy ỏ động vật, người ta nuôi động vật và chỉ thu
nhận enzym ở những bộ phận tạo ra enzym chứ không phải tấ t cả
toàn bộ các bộ phận khác của động vật.
N hững phư ơng p h áp và kỹ th u ậ t cơ b ản tron g công nghệ enzym 71
Riêng ở v s v lại hoàn toàn khác, người ta có thể thu nhận chế
phẩm enzym thô dạng lỏng (từ quá trình nuôi cấy chìm). Ở đây, dịch
nuôi cấy chủ yếu chứa enzym ngoại bào và có thể thu nhận chế phẩm
enzym thô dạng rắn (từ nuôi cấy bề m ặt trên môi trường bán rắn).
Chế phẩm này chứa không chỉ enzym ngoại bào mà còn chứa cả
enzym nội bào. Sau khi thu nhận dược chế phẩm enzym thô (dạng
lỏng hay dạng bán rắn), người ta tiến hành tinh chế chúng và thu
được enzym ở dạng tinh khiết hơn. Tùy theo mục đích sử dụng mà
người ta sử dụng enzym ở dạng thô hoặc ở dạng tinh khiết.
----- - vsv giống
1
Nhân giống
I Sản xuất ứng dụng

Sản xuất chế phẩm enzym —
vsv CỐ định lên men
X
►(0
« ' cấy bể
Nuôỉ / mặt S Nuôi cấy
’ chìm
.
*0 ).
-C Nguồn enzym
Ui
c từ thực vậỉ
g>
C \ /
‘9
o Thu nhận Nguổn enzym
tử động vật
chế phẩm
ứng dụng „L.

ứng dụng
Hình 2.3 Công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzym
72 C hương 2
Trong sản xuất các chế phẩm enzym, người ta chia ra ỉàm hai
giai đoạn riêng biệt.
Giai đoạn 1, giai đoạn sản xuất hay công nghệ sản xuất enzym
từ nguồn vsv, động vật, thực vật. Tùy theo nguồn gốc enzym mà
người ta áp dụng những kỹ thuật rấ t khác nhau. Ví dụ, cũng từ nguồn
thực vật, kỹ thuật thu nhận papain khác rấ t xa so với kỹ thuật thu
nhận amyỉase từ malt (những kỹ thuật chi tiết chúng tôi sẽ trình bày
trong những chương sau của cuốn sách này). Kết thúc giai đoạn 1 ta
thu được chế phẩm enzym thô. Enzym thô là hỗn hợp bao gồm protein
enzym, nước, protein không phải là enzym, thành phần môi trường
chưa đồng hóa hết, sản phẩm của quá trình đồng hóa của tế bào, và
cả sinh khối tế bào. Như vậy, trong chế phẩm enzym thô chứa rất
nhiều vật chất không phải enzym.
Chế phẩm enzym thô từ nguồn gốc v s v được phân ra hai loại.
Loại chế phẩm enzym có chứa v s v sống hoặc bào tử của chúng. Loài
này vừa được coi như chế phẩm enzym thô vừa được coi như giống v s v
có khả năng sinh tổng hợp enzym. Loai thứ hai là chế phẩm enzym
thô không chứa v s v sống và bào tử v sv mà có thể chứa v s v đâ chết.
Lớại này chỉ được coi như chế phẩm enzym thô mà không được coi
như giống vsv.
Sau khi đã có chế phẩm enzym thô, người ta sử dụng phương
pháp hóa lý để loại dần các thành phần, không phải enzym ra khỏi
thành phần enzym. Sản phẩm cuối cùng của các kỹ thuật này là chế
phẩm enzym tinh khiết.
Toàn bộ công nghệ sản xuất chế phẩm enzym được tóm tá t
trong hình 2.4*
N hữ ng phư ơ ng p h á p và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công ng h ệ enzym 73
Cơ quan, tế bào động vật Cơ quan, tế bào thực vật Vỉ sinh vặt
Nghiển ■* Nuổỉ cấy (lôn men)
1
Tricf, ly
P
Enzym nội bào
n
Enzym ngoại bảo
1
Phá vd tố b à o
Lọc hoặc ly tâm
Cô đặc
!
Tình chế
!
Sấy
I
Sản phẩm cuối
Hình 2.4
22. PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT cơ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYM
Trong phần này, chúng tôi không trình bày sâu về cách thu
nhận mủ đu đủ, dịch chiết bromelin, các chế phẩm protease thô từ
nguồn động vật, thực vật, cũng như công nghệ lên men chìm, lên men
bề m ặt dể thu nhận chế phẩm thô từ v s v . Những vấn đề này, chúng
tôi sẽ đề cập tro n g những chương sau. Ở dây, chúng tôi chỉ trình bày
những kỹ thuật cơ bản làm sao thu nhận được chế phẩm có hoạt tính
cao nhất và các kỹ thuật tỉnh sạch chúng để thu được những chế
phẩm enzym tinh khiết.
74 Chương 2
2.2.1 Ý n g h ĩa c ủ a kỹ th u ậ t tỉn h sạ c h tro n g công n g h ệ enzym

Công nghệ enzym được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm
thô và kết thúc ở giai đoạn tạo thành chế phẩm tinh khiết.
Bắt đầu từ chế phẩm enzym thô, người ta tiến hành tinh sạch
enzym bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Các kỹ thuật này, chúng tôi sẽ
lần lượt trình bày trong phần kế tiếp. Các kỹ thuật tinh sạch enzym
thường đưa đến những kết quả quan trọng như sau:
• Khối lượng chế phẩm enzym sẽ được giảm dần qua từng bước
tin h sạch. Chế phẩm enzym thô thường chứa những thành phần cơ
bản sau:
- Nước chiếm khối lượng lớn nhất
- Protein không có hoạt tính sinh học
- Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động vật và thực vật), từ
môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn từ VSV)
- Enzym (hay protein có hoạt tính sinh học).
Như vậy quá trình tinh sạch là quá trình loại bỏ ba phần đầu,
chỉ nhận sản phẩm cuối là protein có hoạt tính sinh học. Việc loại ba
thành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai đoạn mà
phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ
loại bỏ được một phần không phải là enzym ra khỏihỗn hợp. Khi các
thành phần không phải là enzym được loại dần ra, khối lượng chế
phẩm sẽ giảm theo.
Bảng 2.2 Giá trị enzym qua từng bước kỹ thuật
BƯỚC Trọng Hiệu suất Hoạt tính Gỉá theo Giá theo đơn v|
Giá chung
kỹ thuật lượng (%) rtòng khối lượng hoạt tính
0 1,000 100 1 1,00 1 1,00
1 0,250 75 3 1 10 4 1 47
2 0,063 56 0 1,20 19 2.13
3 0,016 42 27 1.30 83 3.08
4 0,004 32 81 1,40 358 4,92
5 0,001 24 243 1,50 1536 6,32
Nguồn: Martin Chaplin và Chrỉstophen Bucke, (1990).
Như vậy, nếu enzym được tinh sạch theo những bước kỹ thuật
khác nhau sẽ thu nhận những giá trị quan trọng sau:
- Giảm được khối lượng. Trị số này có nghĩa cho việc đóng bao
bì, vận chuyển, sử dụng và bảo quản.
N hững phư ơng p h á p và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công n ghệ enzym 75
- Tãng dược hoạt tính enzym có ý nghĩa rất lớn trong quá trình
sử dụng sau này.
- Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm
Để giải quyết được những mục tiêu trên, ta thực hiện những kỹ
thuật cơ bản sau.
2.2.2 Kỹ th u ậ t cơ b ả n
1- Các phương pháp cơ học tách enzym
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều dể tách enzym
khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp:
- Phương pháp ly tâm (centrifugation)
- Phương pháp lọc (filtration).
Or Phương pháp ly tâm
Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong
công nghệ enzym, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá
rộng rãi để thu nhận dung dịch enzym, dung dịch này chứa các enzym
ngoại bào. Enzym nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muấn thu nhận
enzym nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.
Hình 2*5 Enzym nội bào và ngoại bào

Phần lớn các enzym ngoại bào (exoenzym) là những enzym hòa
tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các
thành phần rắn là dung dịch enzym thô. Dung dịch enzym thô này
còn chứa thành phần sau:
- Protein cổ hoạt tính sinh học (enzym)
- Các chết hòa tan khác
- Nước.
Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng
lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzym tinh
khiết mà là chế phẩm enzym thô, vì còn chứa protein không hoạt
động, nước và các chất hòa tan khác.
76 Chương 2
Dung dịch rửa

Lọc Khí
Hoàn lưu (NH2)2S 0 4 Siêu lọc
Lên men Lọc

Cô đặc Chất thải Đóng gói
a- thùng chứa; b- máy lọc; c- hệ thống thiết bị lắng
d ' máy ly tâm; e- thiết bị giữ chất lơ lửng; f* sấy
Hình 2.6 Công nghệ tách emym ngoại bào
Giổng vi sinh vật
Dung dịch đệm
Dung dịch enzym thỏ

Thẩm tích
Siêu lọc Sắc ký Phân đoạn s á y đo lạnh

a- thiết bị lên men; b- trao đổi nhiệt; c- thiết bị (y tâm;
d- thỉết bị phá vỡ tế bào; e- thiết bị lọc
Hình 2.7 Công nghệ tách enzym nội bào
Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu
được hỗn hợp nhiều thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được
dung dịch enzym thô tương tự như ở vsv.
N hững phư ơng p h á p và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzym 77
Để trán h hiện tượng biến tính của enzym, trong nhừng mẫu
'nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản
xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều
kiện nhiệt độ thấp.
Các chất rắn lắng trong quá trình ly tâm được tách khỏi dung
dịch. Tốc độ lắng của vật chất rắn được mô tả trong phương trình sau:
( 2 . 1)
trong đó: V - tốc độ lắng; d - đường kính vật lắng;

p s - tỷ trọng vật lắng; Pị - tỷ trọng của dung dịch
Co - gia tốc góc radian; ĩ) - độ nhớt động học
r - hệ số đề kháng của môi trường lọc
Fs - yếu tố đúng đối vật lắng trong quá trình tương tác
0 - yếu tố hình khối ( 0 =1 khi vật lắng có hình cầu).
Thời gian ly tâm cần thiết phụ thuộc vào thể tích (V) và tốc độ lắng.
Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm

thu nhận dung dịch enzym bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly
tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm
nhanh, lièn tục và không gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzym.
Hiện nay, trong công nghệ enzym, người ta đang sử dụng rộng rãi ba
kiểu ly tâm như hình 2.8, 2.9, 2.10.
Chất Chất
ỉhải th ải
Hình 2J8 Ly tâm Hình 2.9 Ly tâm Hình 2.10 Ly tăm

hình trụ thẳng đứng liên tục nằm ngang liên tục nhiều đĩa
78 Chựdng 2
Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trình bày trên, ở một số nhà
máy sản xuất enzym có sử dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn
kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất
quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.
Bảng 2,3 Lựa chọn kiểu ly tâm
s tt Kiểu ly tâm Nổng độ chất rắn (%) Kích thước hạt (lim)
1 Ly tâm nhiểu đìa (muitichamber) 0 - 0,5 0,5 - 500

2 Ly tâm tách kết tủa (desludging) 3 -1 0 0,5 - 500
3 Ly tâm iắng (decanter) 5 -4 0 5 - 50.000
4 Ly tâm đẩy (pusher) 20*75 100 - 50.000
5 Ly tâm sàng (sieve) 5 -6 0 5 -1 0 .0 0 0
6 Ly tâm phun (nozzle) 5 -2 5 0 ,5 -5 0 0
b- Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzym, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật
hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu
nhận dung dịch enzym nội bào, enzym ngoại bào hòa tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung
dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thi*ờng gặp nhiều khó
khăn như kích thước vật chết dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt
của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trỏ quá
trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề m ặt vật liệu
lọc; áp suất khi lọc; độ nhớt dịch lọc; sức đề kháng.
Theo lý thuyết, quá trình lọc dung dịch enzym trong công nghệ
enzym tuập theo phương trình sau:
1 dV .
— — -JL -
Ap
__________ _z_______ (O 3 )
A dt H r[a(w/A) + r]
trong đó: A - diện tích bề m ặt vật*liệu lọc; v s - thể tích chất lọc
t - thời gian lọc; Ạp - áp suất qua màng lọc; ịir - độ nhớt chất lọc
a - sức đề kháng riêng trung bình của khối lọc
w - khối luợng chất rắn = - - P™ - V ; p - là tỷ trong chất loc
(1 - mw) . o r
r - hệ số đề kháng của môi trường lọc.
Áp suất qua màng lọc thường ổn định đối với máy lọc thùng
quay và được sử dụng rộng rãi trong công nghệ lên men. Nếu như ta
cho rằng khối lọc không có khả năng nén, khi đó a là một hằng số,
và phương trìn h trên sẽ có dạng:
ụra,p.w 5 , Vrr (2.4)

Vs/A 2Ạp(l - mw) A Ap
Trong công nghỉệp sản xuất enzym, người ta thường sử dụng các
kiểu sau:
Lọc ép (pressure filter): Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được
sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ.
Phương pháp này sử dụng để lọc enzym rất có hiệu quả.
Lọc chân không (vacuum filter): Là phương pháp được ứtig dụng
nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có
hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay (;rotary vacuum filter) được sử
dụng nhiều hơn cả. Máy lọc chân không quay được mô tả như hình 2.11.
Hình 2.11 Mẩy ỉọc chân không quay
Lọc theo dòng chảy cắt ngang (cross-flow filtration). Trong

những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzym sử dụng phương
pháp lọc theo dòng chảy cắt
oooooooooo
ngang. Theo đổ, dòng dung dịch o o o o o o o o o o—Chất rân
o ------------- - o
lọc sẽ chảy song song bề mặt O Ỡ O O O O O O O O
nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ oooooooooo
được thoát qua vật liệu lọc và đi Vật liệu học
xuống phía dưới. Phương pháp học
này có UU điểm là làm giảm sức ty 'ộ ' ' ữ ' Dỉch
đề kháng quá trình lọc của vật Hình 2.12 Lọc cross-flow
liêu chất rắn.
80 Chương 2
Lọc thòng thường (conventional

Chất rắn
filter). Phương pháp lọc thông
thường đã có từ rấ t lâu, hiện nay
ở một số nhà máy vẫn còn sử
dụng. Phương pháp lọc này đang
được thay th ế dần bằng những Hình 2.13 Phương pháp
phương pháp khác nhanh hơn, có lọc thông thường
hiệu quả hơn.

2- Các phương pháp phả vờ tể bào %
Mục đích của việc phá vỡ tế bào (tế bào động vật, thực vật và
VSV) là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào. Cùng với các chất
có trong tế bào được giải phóng ra ngoài ỉà enzym nội bào.
Đối với tế bào động vật và tế bào thực vật ta phải tiến hành
nghiền n á t trước khi thực hiện các quá trình trích ly, lọc, cô dặc, làm
sạch và sấy.
Đối với tế bào v s v phải tiến hành tách bằng phương pháp ly tâm
hoặc bằng phương pháp lọc. Phần dịch thu được của một trong hai
phương pháp này là dịch chế enzym ngoại bào. Phần sinh khối v sv sau
ly tâm hoặc lọc chứa enzym nội bào, muốn thu nhận được enzym nội bào
của v sv phải tiến hành phá vỡ tế bào. Việc phá vỡ tế bào động vật và
thực vật không mấy khó khán, nhiừig phá vỡ tế bào v sv rất phức tạp vì
tế bào v s v vừa có kích thước rất nhỏ và vừa có thành tế bào có cấu trúc
khá đặc trưng. Do đó, phá vd tế bào v s v đòi hỏi phải cố những phương
pháp rất đặc biệt.
Các phương pháp phá vỡ tế bào vsv được tóm tắt trong hình 2.14.
N hững phư ơng p h áp và kỹ th u ậ t cơ bản tro n g công nghệ enzym 81
Hình 2.14 Các phương pháp phá vờ tế bào sinh vật
Or Phá vờ tế bào bằng phương pháp cơ học

Mục đích của phá vỡ tế bào ỉà giải phóng các chất có trong tế
bào và đảm bảo được hoạt tính enzym nội bào. Việc phá vỡ tế bào
sinh vật bao gồm cả phá vờ tế bào động vật, thực vật và vsv.
Đôi với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ
quan (hay mô bào) của động vật có chứa enzym và cần phải được trừ
d nhiệt độ thấp để tránh m ất hoạt tính enzym. Trước khi trữ lạnh
cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác bám theo mô bào đó,
các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzym trong
thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mổ.
Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải được làm sạch và
được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzym ngay.
Tế bào động vật và tế bào thực vật thường rấ t dễ phá vỡ bằng
các phương pháp cơ học. Riêng tế bào vsv, việc phá vỡ tê bào có
những khó lchÃn nhất định-
- Tế bào v s v có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng
phương pháp nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có
quả.
82 Chương 2
- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường,
đặc biệt là môi trường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo
ra nhiều enzym ngoại bào tương ứng. Các enzym ngoại bào này được
hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch
nuôi cấy, do đó trong công nghiệp ít khi người ta tiến hành nghiền tế
bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzym nội bào). Tuy nhiên, trong
thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzym nội bào ở v sv ngày càng
nhiều, do đó phương pháp cơ học được ứng dụng để phá vỡ tế bào v s v
ngày càng nhiều.
Phương pháp đồng hóa áp lực cao (high-pressure homogenization):
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế
bào quy mô công nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ
được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rấ t m ạnh vào vành ống
(máy đồng hóa manton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt (shearing-
gaulin) và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50-5000
lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của
tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví dụ, đối với tế bào vi
khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar.
Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường được áp dụng cho việc
phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào thực yật ít khi
phải dùng phương pháp này.
Phương pháp nghiền ẩm (wet grinding): Phương pháp nghiền ẩm
cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất
enzym. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi
thủy tinh có kích thước 0,2 - Imm để tăng quá trình phá vỡ tế bào.
Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh (glass
balls) mà người ta dùng hạt thủy tinh (glass beads), vì hạt thủy t inh có
độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.
b- Phá vờ tế bào không phải bằng p p cơ học (nonmechanical method)
Ngoài hai phương pháp 'Cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào
bằng phương phảp không phải là phương pháp cơ học. Các phương
pháp đó bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp nhiệt và
phương pháp enzym (ở một số tài liệu, người ta còn gọi là phương
pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).
Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo
ra áp suât thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các
chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi
áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên, vì trong quá
trình thực hiện, người ta sử dụng hóa chất nên các hóa chất này
thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp.
Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone.
Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương
pháp này thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy
sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một phương pháp vật lý khác cũng
được áp dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở dạng thử
nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu (osmotic shock).
Nguyên tắc của phương pháp này là, khi đưa nhiệt độ của huyền phù
tế bào xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 40°c
(thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và
người ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ
thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzym nhưng hiệu suất phá vỡ
tế bào không cao.
Phương pháp sinh học (phương pháp enzym). Có hai phương
pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và
phương pháp thủy phân bằng enzym đưa từ bên ngoài vào.
Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho
một số enzym có khả năng phân giải một số thành phần của thành tế
bào, các enzym này phải là những enzym cố trong tế bào và là của tế
bào đó. Bình thường các enzym này không hoạt động mạnh, nhưng nếu
điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt
động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân
thành tế bào, làm chết tế bào. Tự phân (autolis) là quá trình được áp
dụng nhiều trong phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta
thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt
độ 48-52°C, trong khoảng thời gian 6-24 giờ. Phương pháp này có nhiều
nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzym có trong tế bào
không chỉ thủy phân các chất ỏ thành tế bào mà cả những chất có
trong tế bào, thậm chí các enzym cũng bị phá hủy. Phương pháp này
hiện nay không dược sử dụng nhiều trong công nghiệp.
84 Chương 2
Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương
pháp sử dụng enzym từ ngoài tế bào. Các enzym này được đưa vào
huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình thủy phân có định hướng
các chất n hất định trong thành tế bào. Người ta thường sử dụng hệ
enzym cellulose dể phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào
thực vật. Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế
bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản
xuất thể nghiệm và sản xuất công nghiệp). Ngoài ra, người ta còn sử
dụng lysozym trong các loại tế bào khác.
3- Phương pháp cô đặc
Dung dịch enzym thô thường chứa lượng enzym không nhiều. Để
xử lý một khối lớn dung dịch enzym phải tốn rấ t nhiều công sức và
chi phí cho xử lý này rấ t cao. Mặt khác lượng enzym có trong dịch
enzym thô quá ít, hoạt tính enzym không cao. Chính vì thế, người ta
phải cô đặc dung dịch enzym nhằm một số mục đích sau:
- Làm tăng hoạt tính của enzym trong một khối lượng dung
dịch enzym
- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này
- Tăng khả năng bảo quản enzym
- Giảm chi phí vận chuyển, bảc quản
- Tăng hiệu suất tác động của enzym đối với cơ chất.
Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzym bằng
một trong những phương pháp sau:
a- Phương pháp nhiệt: Chúng ta có th ể tiến hành cồ đặc enzym
bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enaym
thường gặp rấ t nhiều khó khăn vì enzym là protein rấ t nhạy cảm
với n h iệt độ, nguyên nhân là do hầu hết enzym đều được tổng hợp
trong tế bào (trừ enzym nhân tạo). Trong cơ thể, enzym thường hoạt
động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào sống. Trường hợp
nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ
chết. Enzym m ất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế
bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ
không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ, tế
bào không th ể tồn tại.
N hững phư ơng p h á p và kỹ th u ậ t cơ bản tro n g cổng nghệ enzym 85
Khi enzym được tách ra khỏi tế bào thưởng hoạt động tối ưu ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở
hầu h ết ở các loại enzyur. Tại sao lại có hiện tượng này thì nhiều
nhà khoa học giải thích theo nhiều cách khác nhau. Tuy có nhiều
khác biệt trong việc giải thích hiện tượng trên, nhưng các nhà khoa
học đều đi đến thống nhất là những sinh vật cổ nhiệt độ sinh lý cao,
hay khả năng chịu được nhiệt độ cao đều có enzym hoạt động mạnh
ở nhiệt độ cao. Do đó, tùy theo nguồn thu nhận enzym và tính chất
của từng loại enzym mà quyết định chế đạ gia nhiệt trong quá trình
cô đặc.
Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng
nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng enzym trong dung dịch sẽ
tăng lên, hoạt tính enzym cũng tăng cao. Tuy nhiên, nếu không chú ý
đến điều kiện nhiệt độ để không chế nó trong một khoảng cho phép
thi hoạt tính enzym có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến
triệt tiêu hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian
cần thiết trong quá trình cồ đặc là điều rất cân thiết.
Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương
pháp sau:
- Bốc hơi lớp mỏng (thin-layer evaporator)
- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng (centrifugal thin-layer evaporator)
- Bốc hơi Ông dài (ỉong-tube evaporator).
b- Phương pháp kết tủa
Kết tủa là phương pháp dược sử dụng rất rộng rãi trong các
nghiên cứu enzym trong phồng thí nghiệm và sản xuất enzym trong
quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên
tắc, enzym là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một
số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật
ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương.
Kết tủa ẩm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết
nằm trong dung địch chứ không nằm trong phần tủa.
Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại
nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.
86 Chưctag 2
Chính sự phức tạp này, phương pháp kết tủa khó thu nhận được
protein hoàn toàn tinh khiết. Muốn thu được protein tinh khiết hcm,
người ta phải sử dụng những phương pháp đặc biệt khác.
Ở phân tử enzym, các gốc ưa
nước và kỵ nước thường nằm trên
bề mặt. Chúng quyết định mức độ
hòa tan của enzym ở những loại
dung môi khác nhau. Trong đó, các
nhóm kỵ nước có xu hướng nằm
trong lòng phân tử protein, một
phần không nhỏ nhóm này nằm
Hình 2*15 Sự phân bố điện tích
trên bề m ặt protein và có khả nãng và các phần kỵ nước trên bề mặt
tiếp xúc với dung môi, các nhổm này protein, enzym
sẽ cùng với các nhóm tích điện và
các nhóm lưỡng cực khác cổ vai trò quyết định đến tính chất enzym.
Độ hòa tan của enzym được coi là kết quả của tương tác lưững
cực của chất hòa tan với nước, và tương tác ion của chúng với muôi có
trong dung dịch. Nếu bề m ặt của enzym có tính kỵ nước cao, có nghĩa
là chỉ một phần nhỏ của nó tương tác được với dung môi, còn một số ít
hơn nừa các nhóm tích điện thì tương tác với muối. Nếu điện tích
giảm tới 0, sự đẩy tích điện sẽ giảm theo mức độ tiến gần đến điểm
đẳng diện và các phân tử sẽ hút lẫn nhau mạnh hơn, dẫn đến sự tạo
tủa. Hiện tượng này gọi là kết tủa ở điểm đẳng điện.
Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác đụng
với phân tử nước bao quanh protein enzym và làm chuyển hóa điện
tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzym.
Trong công nghiệp enzym, nguời ta thường sử dụng muối
ammonium sulfate. Các th iết bi dùng trong quá trình kết tủa bằng
muôi ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép không ri.
Tuy nhiên, thép không rỉ (stainless Steel) có nhiều loại, do đổ nhiều
trường hợp th iê t bị được chê tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn
bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay ammonium sulfate
N hững phương p h ẩ p và kỳ th u ậ t cơ b ản tro n g công n ghệ enzym 87
bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song
chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có
thể ở 35 - 40°c, nhưng để tránh khả năng làm m ất hoạt tính enzym,
người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzym
trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau.
Nồng độ tói ưu của muối đùng trong kết tủa enzym sè được xác
định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối
dùng trong kết tủa enzym rất rộng, khoảng 20 - 80%.
Phương pháp kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ: Dung môi
hữu cơ có ảnh hưỏng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzym, ảnh
hưỏng soỉvat hóa của phâa tử nước xung quanh phân tử enzym bị thay
đổi, tương tác giữa các phân tử enzym sê tăng lên.
Trong công nghiệp sản xuất enzym, người ta thường sử dụng
ethanol và acetone để kết tủa enzym. Khi tiến hành kết tủa enzym
bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do
enzym rấ t nhạy cảm với nhiệt độ khi có m ặt của các chất như ethanol
hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzym phải làm
lạnh cả dung môi hừu cơ và dung dịch enzym. Mức độ nhạy cảm nhiệt
độ của enzym khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức
độ nhạy cảm của enzym với nhiệt độ khi có m ặt của muối vô cơ. Người
ta thường tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ
từ 3-10°C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa
enzym được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzym và từng
nồng độ enzym có trong dung dịch enzym.
Khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzym sẽ làm giảm khả
năng tan của nước bao quanh enzym. Hiện tượng này xảy ra là do sự
giảm hằng sô' điện ly của dung, môi, đẩy một lượng lớn nước. Các phân
tử nước sắp xếp rất trậ t tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt
enzym có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ. Từ đó
làm gia tăng độ hòa tan của chúng. Các enzym có tính kỵ nước mạnh
sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ.
88 C hương 2
: Phẩn tử kỵ nước
: Dung môi hữu cơ
H ìn h 2,16 Các phân tủ em ym trong dung môi hữu cơ
Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzym có thể do

các lực tĩnh điện, lực Van der Waals (giống như ỏ muối); Tương tác kỵ
nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện
thì sự kết tủa diễn ra tố t nhất, khi dó lượng dung môi hữu cơ sử dụng
cho quá trình tủa là ít nhất.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết
tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân ỉà do, khi hằng số điện môi
giảm phân tử protein cổ thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt
động, trong khi đổ các gốc kỵ nước lại tiếp xức với dung môi. Hiện
tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng, nếu thực hiện ở
nhiệt độ 4-10°C không thấy xuất hiện kết tinh enzym.
Kết tủa em ym bằng polymer. Polyethylene glycoỉ ỉà một
polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong k ết tủa protein,
enzym. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế ỉắng của chúng gản giống dung
môi hừu cơ. Phương pháp này có ưu điếm ỉà ta có th ể thực hiện quá
trình kết tủa enzym ỏ nhiệt độ.bình thường (nhiệt độ phòng thí
nghiệm) và lượng polyethylene glycoỉ cần sử dụng để k ết tủa không
nhiều (khoảng 5-15%). Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của
dung dịch r ấ t cao và như th ế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho kỹ thuật
làm sạch sau này. Polymer được sử" dụng rấ t rộng rãi dể kết tủa
enzym cả trong nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công
nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều ỉà polyethyleranine và
polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau.
N hững phương' p h á p và kỳ th u ậ t cơ b ản tro n g C ô n g ’ nghệ enzym 89
Cơ chê tạo kết tủa của các polymer với enzym giống như cơ chê tạo
kết tủa của các dung môi hữu cơ với enzym. Trong công nghiệp, người ta
thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15-20% dể kết tủa enzym.
Kết tủa ernym ờ điểm đẳng điện của protein-enzym
Protein là chất lưỡng cực (ampholyte), chúng có cả nhóm acid
và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzym phụ thuộc vào pH, mức độ
này là tối thiểu khi chúng ỏ điểm đẳng điện, phần lớn protein có
điểm đẳng điện ỏ khoảng acid, vì thế quá trình này được gọi là kết
tủa acid (acid precipitation). Kết tủa enzym ồ điểm đẳng điện thường
được thực hiện d quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công
nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng diện và thời gian lưu để tạo kết tủa
bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzym. Như vậy, thiết bị
phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzym càng
lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo
dài, enzym càng đễ bị biến tính.
c* Phương pháp siêu lọc (ultrafiltration)
Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc
có lỗ lọc siêu nhỏ. Phương pháp này dược ứng dụng rất nhiều trong
nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu
lọc hiện nay có ba loại được trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4 Quá trinh tách bằng màng lọc
s tt Quá trinh lọc Ưnh vực ứng dụng Khoảng tách, (nr)
Lọc dỏng chảy cắt ngang Thu nhận tế bào vi khuẩn > 1.000.000 {hay
1
(cross-flow micmtìttration) những hạỉ nhỏ)
Siêu lọc (uttratìttration) Cô đặc enzym, phân ly và > 10.000 (đại phân tử)
2
phân đoạn
Thẩm thấu ngược (reverse Cô đặc chất có phân tử lượng > 200
3
osmosis) nhỏ. loại muối
Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt
ngang để thu nhân sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch
90 C hương 2
enzym. Phương pháp thầm thấu ngược dùng để thu nhận khối lượng
các chất có .thối 'lượng phân tử thâp và có khả năng hòa tan. Trong
khi đó, siêu lọc lại được sử dụng rấ t rộng rãi để thu nhận enzym, siêu
lọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong
khoảng 1000-300.000 dalton. Người ta thường sử dụng cellulose
acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinyli dene và
polypropylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các
ỉoại nguyên liệu màng ỉọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid
hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta còn tách muối trong dung dịch
enzym bằng lọc thẩm tích.
4- Phương pháp tinh sạch enzym
Trong y học và trong phân tích, người ta rấ t cần đến enzym có
độ tỉnh sạch cao. Có ba phương pháp tinh sạch enzym đang được ứng
dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất:
- Phương pháp kết tinh (icrystallization)
- Phương pháp điện di (electrophoresis)
- Phương pháp sắc ký (íchromatography).
a- Phương pháp kết tỉnh
Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung địch
ammonium sulfate để kết tinh enzym, dung dịch ammonium sulfate để
kết tinh enzym đòi hỏi độ tinh sạch phải rấ t cao là rấ t khó, vì vậy
phương pháp này ít được phổ biến.
b- Phương pháp điện di
Phương pháp điện di chỉ được ứng dung nhiều trong phòng thí
nghiệm. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo
quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa đuỡe phát triển rộng rãi.
c- Phương pháp sắc kỷ
Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trong nhất để
làm sạch enzym. Các phương pháp sắc ký được tóm tắ t trong bảng 2.5.
N hững p hư ơng p h á p và kỹ th u ậ t cơ bản tro n g công n ghệ enzym 91
Bảng 2,5 Những phương pháp sắc ký
stt Những phương pháp Nguyén tắc Mục đích tách
1 Sắc kỷ hấp thụ (adsorption) Lỉôn kết bổ mặt ÁI lực bổ mặt (surface a ffinity)
2 Sắc kỷ phân bố Phân bố cân bằng Phân cực
(distribution) (distribution equilibrium )
3 Sắc kỷ trao đổỉ ỉon Liên kết ion vạ t mang
4 Sắc kỷ lọc gel Khuếch tán qua tồ lọc Kfch thước phân tử
5 Sắc kỷ ky nước Háp thụ đặc hiệu Cáu trúc phân tử
6 sẳc kỷ đổng hóa trị Liên kết đổng hóa trị Phân cực
7 Sắc ký tạo vòng kỉm loại Tạo phửc Cấu tạo phân tử
(m etal chelate)
8 sẳc kỷ ái lực (affinity) Hấp thụ đặc hiộu Cáu trúc phân tử
Một số dạng th iế t bị trao đổi ion được mô tả trong những

hình 2.17 và hình 2.18.
1- đáy
2' bộ phân phối dịch lòng phía dưới
3- mặt bít phía dưới, \6\ vào và ra của dịch lỏng
4- tẩm lót thoát nước
5- vò ngoài
6- nhựa trao đổi fon
7- bộ phàn phòỉ trầm lắng
8‘ ống trào
9* túi hỉnh nhán
10- Ống thoát nước
11” nắp
12- đẩu vào dịch lỏng
13* bộ phân phối dịch ỉông phía trên
Hình 2.17 Bộ lọc ionit loại hở

92 Chương 2
1- dầu vào và ra của chất lổng phía dưới

2- đáy
3- đĩa của bộ phân phối phía dưới
4- lớp nhựa trao đổi ỉon
5- vỏ ngoài
6- vấu tai tựa
7- lớp nhựa cao su
8 ' bộ phân phổi phía trên
9- nắp đậy
10- nắp nạp nguyên liệu
11- lồ nạp khí
12* đẩu vào và ra của chất lỏng phía trên
13- cửa quan sát
14- nắp chuông có khe
Hình 2.18 Bộ lọc ionit loại kín

Phương pháp sắc ký lọc gel (gel filtratwn). Theo phương pháp
này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzym. Các loại
geì được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột được mô tả
trong bảng 2.6. Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích
thuớc và bình dáng của chúng.
Bảng 2.6 Các loại gel dùng trong lọc geỉ
s tt Hãng vả lèn thưutog myi Loẹl gel Khoảng phán đoẹnt (M/)
1 Bioget (Bio-Rad) Potycrylamỉde (P-type) 100-400.000
Agarose (A-type) 1000- 150 X 106
2 Uetrogete (IBF. Serva) Agarose/potycrylamide 60.000- 1,3 X 10®
Agarose 25.000 - 20 X 10®
3 F radogel (Merk) Vinyl polymer (nhiổu loại khác nhau) 100 - 5 X 10®
4 S ephadex (Pharmacia) Dextran 50 - 600.000
5 Sephacryt (Pharmacia) Sephacryi/bisacrylamide 5000 - 1 X 10«
6 Sepharo&e (Pharmacia) Agarose 10.000 X 4 0 x 10*
Agarose liên kổt chéo 10.000 X 1 X 10*
7 Gtycophase (Pierce) 1.2 dihyđroxypropyl-substituted 1000 * 350.000
Sổc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự
tích điện cỏa phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng
rộng rãi trong sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp. Tính chất
tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH. Từ đó,
N hữ ng phư ơng p h á p và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzyra 93
người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation. Các nhóm trao đổi
cation và anion được mô tả trong bảng 2.7.
Bảng 2.7 Các loại nhựa trao đổi ion
Nhóm trao dối
stt Hãng và tên thương mọi Loại chất
Anion Cation
1 Cellex (Bio-Rad) Cellulose DEAE; ECTEOLA; CM phosphoryi
QAE; TEAE; OEAE
2 Bio-Gel (Bio-Rad) Agarose DEAE CM

3 Trisacryl (IBE-Serva) Polymer tổng hợp DEAE CM
4 Fractogel (Merk) Polymer vinyl DEAE CM; SP
5 Sephadex (Pharmacia) Dextran QAE CM
6 Sepharose (Pharmacia) Agarose DEAE SP
7 Sephacel (Pharmacia) Cellulose OEAE CM
Ghi chú: CM: carboxymethyl - o - CH2 - c o - Na+

DEAE - diethylaminoethyl - o - CH2 - CH2 - N+(C2H5)2HOH'
ECTEOLA: hỗn hợp amine
QAE: 2 hydroxypropyiamine - o - CH2 - CH2 - N+(C2H5)2 - CH(OH) - CH3 - 8r
SP: sultopropyl - o - CH2 - CH2 - SQa'Na*
TEAE: trỉethylaminoethyl - o - CH2 * CH2 - N+(C2H5)3 Br\
Sắc ký kỵ nước (hydrophobic chromatography). Phương pháp này

dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm
kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ
xảy ra ở nồng độ muối cao và quá
« 0 + HS -Ị £nzym|
trình phân đoạn với muối. Phương
pháp này đặc biệt thích hợp đối với
những enzym đã được làm cô đặc
trước đó bằng phương pháp kết tủa ^ —s —s —ị Enzym ị +
với muối ammonium sulfate. 3 *
Sắc ký đồng hóa trị {covalent fi-S H
chromatography). Liên kết đồng

hóa tĩị được tạo thành giữa các
h
S-SR + HS - ị Enzyn I
protein ở trạng thái tình. Toàn bộ
quá trình làm việc của sắc ký đồng Hình 2.19 Sắc ký đồng hóa trị
hóa trị được biểu diễn ở hình 2.19.
94 C hương 2
__ 1
Sẩc ký ái lực (affinity chromatography). Phương pháp này dựa

trên khả năng giữ enzym bằng những chất nền không hòa tan, được
nhồi vào trong các cột sắc ký được trình bày trong hình 2.20.
1. Hấp thụ
2. Rửa
H ìn h 2.20 Sắc ký ái lực
Phương pháp sắc ký được ứng dụng theo quy mô công nghiệp,
được bắt đầu ứng dụng vào năm 1960. Thời gian đầu người ta thường sử
dụng gel sephadex-G25 và phương pháp tách bằng trao đổi ion với
DEAE-sephadex A.50. Trong những năm gần đây, nhờ tiến bộ của việc
chế tạo máy móc và thiết bị, nhiều công ty đã áp dụng nhiều phương
pháp khác nhau trong quá trình sản xuất với quy mô công nghiệp. Các
cột sắc ký có thể được chế tạo bằng thủy tinh, bằng plastic hoặc bằng
thép không ri. Trong thời gian gần đây, người ta thường chế tạo các cột
sắc ký bằng thép không rỉ vì có thể sử dụng đuợc lâu, không bị vỡ như
bằng thủy tinh và không bị lão hóa nhự plastic.
Hình 2.21 cho thấy một số cột sắc ký tiêu biểu được sử dụng
nhiều trong sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp.
N hững phương p h á p và kỹ th u ậ t cơ b ản tro n g công nghệ enzym 95
Hình 2.21 Sắc ký cột của hãng Pharmacia
H ình 2.23 Thiết bị trao dổi ion trong tinh sadi enzym theo quy mô công nghiệp
_ ,» •
96 C hương 2
5' Tạo sản phẩm enzym

Sau khi được làm sạch, người ta tiến hành thực hiện giai đoạn
cuối cùng là tạo sản phẩm, đóng bao. Chế phẩm enzym có thể được
tạo thành các loại sản phẩm sau: enzym dạng dung dịch; enzym dạng
huyền phù; enzym dạng bột khô; enzym dạng viên nhỏ.
Enzym ở dạng dung dich hay ở dạng huyền phù, có nhược điểm ià
rất khó bảo quản. Do đó, người ta thường phải đưa chúng vào dung dịch
các chất bảo quản. Mặt khác, khi sử dụng người ta cũng phải giữ nó ở
điều kiện nhiệt độ nhất định, không được bảo quản ở nhiệt độ cao.
Enzym ở dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ, thường dễ bảo
quản và khả năng bảo quản rất lâu. Ngoài ra, các chế phẩm enzym
này thường dễ vận chuyển.
Tóm lại, toàn bộ quá trình chiết xuất và tinh sạch enzym được
trình bày tóm tắ t trong bảng 2.8.
B ả n g 2.8 Các phương pháp cơ bản chiết xuất và tinh sạch enzym
s tt Các giai đoạn Phường pháp sử dung
1 Phá vỡ tế bào Cơ học, vật lý. hóa học, sinh học

2 Chiết tách enzym H20, acid, kiểm loảng, dung dịch đệm, dung
môi hữu cơ
3 Tách các phẩn tử không hòa tan Ly tâm, lọc
4 Loại các thành phẩn không phảỉ protein:
- Chất cỏ phân tử lượng thấp
Thầm tích, lọc gel, siêu lọc
- Nucleic acid
Sử dụng nuclease, protease
- Lipid Dung môi hữu cơ
5 Tách phân đoạn protein và enzym:
- Kết tủa Muối dung môi hữu cơ, các hợp chát sinh học
đặc hiệu
- Phân tích trong hệ dung địch hai pha Sử dụng các dung dịch polymer tan trong nưóc
- Gây biến tính hỗn hợp protein Sử dụng acid, kiém, nhiệt độ
- Sắc ký Hấp thụ, traô đổi ion, ái lực, lọc gel
- Ly tâm Trong gradient nổng độ gel polyacrylamide
- Điện di
- Kết tủa bằng đỉện Trén cột hoặc gel bản mòng
- Kết tinh Bằng muối hoặc b&ng dung mổi hữu cơ
6 Cò đặc Siéu lọc, đông khô, cô chân khổng
Chương 3
ENZYM CỐ ĐỊNH
(ENZYM KHÔNG HÒA TAN)
3.1 CHUYỂN HÓA SINH HỌC

Quá trình chuyển hóa sinh học là quá trình vật chất trong tự
nhiên được sinh vật chuyển từ dạng này sang dạng khác thông qua
hoạt động sống của tế bào. Hoạt động sông của tế bào là quá trình
trao đổi chất giữa bên ngoài và bên trong tế bào thông qua hoạt động
của enzym và của tế bào.
Nhờ hoạt động xúc tác của enzym tạo cho tế bào sinh vật và cơ
thể sinh vật như một hệ thống mở. Ở đó năng lượng chứa trong vật
chất luôn luôn được biến đổi, luôn luôn dược trao đổi giữa bên trong
và bên ngoài cơ thể.
Toàn bộ chuyển hóa sinh học được thực hiện bởi bốn quá trình sau:
- Quá trình hoạt động của enzym ngoại bào (enzym tự do)
- Quá trình hoạt động của các vi sinh vật (VSV) trong quá trình lên men
- Quá trình hoạt động của tế bào cố định
- Quá trình hoạt động của enzym cô" định.
2- C huyển h ó a v ậ t c h ấ t do enzym tự do hay enzym hòa tan
(soluble enzyme, free enzyme)
Enzym tự do hay enzym được tách khỏi tế bào, chúng có khả
năng hòa tan trong môi trường nước và thực hiện các phản ứng ngoài
tế bào sinh vật. Những enzym này còn được gọi là enzym ngoại bào.
Các enzym này đóng vai trò rấ t quari trọng trong sự chuyển hóa vật
chất ngoài thiên nhiên và cả trong sản xuất và đời sống. Tuy nhiên
khi sử dụng các enzym này, các nhà khoa học cũng cho thấy chúng có
những nhược điểm sau:
98 Chương 3
• Trong quá trình tham gia phản ứng, các loại enzym này thường
lẫn vào sản phẩm. Việc tách sản phẩm cuối ra khỏi enzym hòa tan là
một công việc rấ t khó khăn và đòi hỏi chi phí không nhỏ. Nhiều sản
phẩm của quá trình thủy phân đòi hỏi không được chứa tạp chất và
các thành phần khác như enzym. Ví dụ như trong*sản xuất glucose sử
dụng trong y học phải tuyệt đối sạch cả về phương diện hóa học và cả
về sinh học.
• Sau phản ứng, nếu tách được enzym ra khỏi phản ứng để thực
hiện các phản ứng tiếp theo, enzym sẽ không giữ được hoạt tính như
hoạt tính ban đầu, như vậy việc tái sử dụng enzym sẽ không có hiệu
quả, trong nhiều trường hợp enzym này không sử dụng được nữa.
Các enzym hòa tan thường kém bền nhiệt, acid, kiềm, dung môi
hữu cơ hay một số ion kim loại nặng. Do đó, việc sử dụng các biện
pháp bảo vệ chúng trong phản ứng là điều rấ t cần thiết.
2- C huyển h ó a v ậ t c h ấ t bằng enzym k h ô n g h ò a ta n
Enzym không hòa tan (insoluble enzyme) hay enzym cố định
(immobilized enzyme) được hiểu theo cả nghĩa hẹp và nghĩa rộng.
Theo nghĩa hẹp: Enzym không hòa tan là những enzym được đưa
.ỉ
vào những pha riêng rẽ, pha
này được tách riêng với pha
dung dịch tự do. Pha enzym
không hòa tan trong nựớc và
• Phaenzym; /ỳ 'P h a dung dịch tự do
được gắn với những polimer ưa
nước có trọng lượng phân tử Hình 3.1 Hệ thống hai pha của enzym
lớn (Michael Trevan).
Theo nghĩa rộng: Các chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào,
cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại (Klaus Mosbach). Như
vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym đã
được cố định vào một chất mang, bao gồm cả enzym có trong tế bào
sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào
một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
Enzym cố định 99
Enzym không hòa tan hay còn được gọi là enzym cố định
(immobilized enzyme) thường là những enzym hòa tan được gắn vào
một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gán
này mà enzym từ trạng thái hòa tan (soluble) chuyển sang không hòa
tan (insoluble). Khi chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái
không hòa tan, enzym không hòa tan có những ưu điểm như sau:
♦ Enzym không hòa tan có thế được sử dụng nhiều lần, hoạt tính
của enzym không hòa tan ít thay đối trong những lần tái sử dụng. Đặc
điểm này của enzym không hòa tan có ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật,
nhờ đó ta có thể tái sử dụng nhiều lần và sẽ làm giảm chi phí cho
việc sản xuất enzym. Đây là Ưu điếm lớn nhất của việc thu nhận và
ứng dụng enzym không hòa tan.
• Enzym không hòa tan không lẫn vào sản phẩm cuối của phản
ứng enzym, do đó chúng ta không phải chi phí cho việc tách enzym ra
khỏi sản phẩm. Sản phẩm cuối thu được sẽ được coi như là sản phẩm
đã tương đối sạch.
Từ hai đặc điểm trên cho thấy, sử dụng enzym không hòa tan có
ý nghĩa kinh tế hữn sử dụng enzym hòa tan nhiều lần.
3-Chuyển hóa vậ t c h ấ t do các quá trìn h lên men
Quá trình lên mén là quá trình chuyển hóa sinh học được thực
hiện bởi các tế bào vi sinh vật sống tự do. Lên men (fermentation) là
quá trình chuyển hóa vật chất đặc trưng cho riêng vi sinh vật. Các
quá trình lên men là tập hợp rất nhiều các quá trình enzym. Ớ đó,
toàn bộ các phản ứng xảy ra trong tế bào theo một trật tự được quyết
định bởi hệ thông gen có trong nucleic acid.
Khác với quá trình enzym
ngoài tế bào, quá trình lên men Chat J L «'1
\ , *-— Cơ chat
thường xảy ra phức tạp hơn, các chuyến hóa
cơ chất ở ngoài tế bào phải

thẩm thấu được vào trong tế Sản phẩm sản phẩm
chuyển hóa bậc 2
hào. Tại đây sẽ tạo ra các sản
phẩm bậc một (sinh khối), sản Tế bào
phẩm bậc hai (sản phẩm trao Hình 3.2 Quá trình lên men
đổi chất)* Quá trình tạo ra các
100 Chương 3
sản phẩm trẽn chỉ được thực hiện trong tế bào sống. Nếu tế bào chết
thì các quá trình chuyển hóa lại mang lại ý nghĩa khác. Đó là quá trình
thủy phân bởi enzym ngoại bào.
Quá trìn h chuyển hóa sinh học này xảy ra thường xuyên, liên
tục trong thiên nhiên và đã được loài người ứng dụng vào sản xuất
hàng ngàn năm nay như sản xuất rượu, bia, nước giải khát, phomai,
tương, chao, nước mắm và phát triển mạnh các công nghệ lên men
hiện đại như amino acid, kháng sinh, các chất kích thích tăng
trưởng....
4- C huyển h ỏ a v ậ t c h ấ t do t ế bào c ố đ ịn h
Tế bào cố định là tế bào vi sinh vật được gắn vào một chất
mang. Các chất mang và vi sinh vật gắn vào đó được đưa vào bình
phản ứng sinh học (bioreactor). Cơ chất được đưa vào từ đỉnh của bình
phản ứng sinh học và sản phẩm được lấy ra ở đáy bình phản ứng sinh
học. Quá trình này được thực hiện liên tục.
Tế bào cố định (immobilized cells) được ứng dụng rộng rãi và
đem lại hiệu quả kinh tế rất rõ rệt.
Toàn bộ các quá trình chuyển hóa sinh học được tóm tắt như sau:
Hình 3.3 Các quá trình chuyển hóa sinh học

Ở đây chúng tôi chỉ trình bày các quá trình rfhu nhặn và ứng
dụng enzym không hòa tan, còn các quá trình khạc sẽ được trình bày
ở các cuốn sách khác.
3.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZYM KHÔNG HÒA TAN
Khi gắn enzym hòa tan vào một sỏ chât mang, enzym này có
những đặc điểm khác hẳn enzym hòa tan.
Enzym cố đ ịn h 101
1- Hoạt tính của enzym không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt
tính riêng của enzym hòa tan cùng loại, sỏ dĩ có sự thay đổi về hoạt
tính riêng của enzym không hòa tan là do nhừng nguyên nhân sau:
Do ảnh hưởng điện tích của chất mang, Khi gắn enzym vào chất
mang có điện tích khác với điện tích của enzym, câu trúc không gian
của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Vì sự thay đổi cấu trúc
không gian của enzym nên sự tương tác của enzym và cơ châ't chậm
lại, phản ứng xảy ra sẽ yếu hơn. Mức độ giảm hoạt tính của enzym
phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc không gian của enzym khi ta
gắn chúng vào chất mang.
Do enzym bị nhốt vào một geỉ. Khi ta nhốt một enzym vào một
gel nào đó, gel sẽ bao lấy phân tử enzym tạo thành một vật cản đối
với cơ chất của enzym. Do đó, sự tiếp xúc giữa trung tâm hoạt động
của enzym với cơ chất gặp khó khăn hơn so với sự tiếp xúc giữa cơ
chất với enzym tự do.
2- Enzym không hòa tan hoàn toàn tuân theo định luật
Michaelis-Menten. Tuy nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzym
không hòa tan có những sai khác nhất định:
- Có thể sẽ xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzym và
chất mang.
- Hiện tượng cản trỏ sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của
phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng.
3- Enzym không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzym hòa tan
cùng loại vi chúng được bảo vệ bởi chất mang.
4- Enzym không hòa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu
sang kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzym hòa tan chứ không
trùng với pH tối ưu của enzyn\Jiòa tan cùng loại.
5- Enzym không hòa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzym
hòa tan cùng loại.
6- Ta có thể tái sử dụng enzym không hòa tan nhiều lần. Trong
khi đó enzym hòa tan chỉ cỏ thể sử dụng một lần. Đặc điểm này rất
có ý nghĩa về kinh tế khi ta tiến hành các phản ứng theo qui mô
công nghiệp.
102 Chương 3
3.3 PHƯƠNG PHÁP TẠO ENZYM KHÔNG HÒA TAN
3.3.1 L ịch sử n g h iê n cứ u và p h á t triể n

• Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym
invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả
năng thủy phân đường saccharose. Sau dó trên thế giới xuất hiện
nhiều báo cáo về khả năng cố định các enzym bằng liên kết đồng hóa
trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cứu nào về
enzym không hòa tan đuợc ứng dụng vào thực tế.
• Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số
enzym như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên
polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cứu trên
mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot.
• Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầubán thấm có
gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể.
• Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc
nhốt các enzym như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel
polyacrylamide.
• Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên
kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong
năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt
enzym carbonic anhydrase.
• Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm
để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định.
• Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe
Seiyaku - Nhật đã là những ngứời đầu tiên thực hiện thành công việc
áp dụng enzym không hòa tan vào sản xuất công nghiệp. Theo phương
pháp cố định enzym của những tác giả người Nhật, enzym
aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua
liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân.
• Năm 1970, Mosbach đã tiên hành cô định ba loại enzym: p-
galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa
trị với các hạt sephadex.
• Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome chứa
amyloglucosidase.
Enzym cô" đ ịn h 103
• Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người
đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất
L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamide. Tế bào E.
coli chứa trong gel có hoạt tính aspartase rất cao.
• Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase
cố định, đã tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo quy mô công
nghiệp. Cho đến nay có khoảng 4,5 triệu tấn siro fructose được sản xuất
theo phương pháp enzym cố định.
Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men, chông ô nhiễm môi trường và cả trong y học.
3.3.2 Các y ế u tố ả n h hưởng đ ế n enzym khô n g h ò a ta n

1- Động học của entym không hòa tan
Động học của một enzym không hòa tan có những khác biệt
đáng kể so với động học của chính enzym dó trong dung dịch tự do.
Các tính chất của một enzym có thể được biến đổi bằng cách chọn lựa
quy trình cố định thích hợp, nhưng ngược lại cùng một phương pháp
cố định có thể có những ảnh hưởng khác nhau trên nhiều loại enzym
khác nhau. Những thay đổi này có thể do sự thay đổi hình thể enzym
trong quá trình cô định, hay là do sự hiện diện và bản chất của giá
thể cố định.
(a)- hoạt tính của chymotrypsin tự do; (b)- hoạt tỉnh của dẫn xuất chymotrypsin với acryloyl
chloride; (c)- hoạt tính của acryloyl chymotrypsin được co-polymer hóa với polymethacrvldte gel. Có
đến 12 nhóm được gắn cộng hỏa trị với mỗi phàn tử enzym. Dần xuất thẩp hơn sẽ am cho độ ổn
định thấp hơn; (d)- hoạt tính cùa chymotrypsin cố định bằng phương pháp nhốt (khòng cộng hóa trị)
vớỉ giá thể là polymethacrylate gel.
Hình BA Minh họa cách sử dụng tương tác nhiều điểm

để ổn định hoạt tính enzym (Martinek et al, Ĩ977ỳ.
104 Chương 3
Quá trìn h cố định có thể gây ảnh hưởng lớn đến tính ổn định
của enzym. Nếu quá trình cố định đưa ra bất kỳ một yếu tô' nào làm
biến dạng đối với enzym vào, điều này có nghĩa là nó sẽ thúc đẩy sự
bất hoạt enzym dưới các điều kiện gây biến tính (ví dụ: nhiệt độ cao
hay pH quá khắc nghiệt). Sự kết hợp giữa enzym và giá thể càng tự
nhiên thì độ ổn định của enzym đó càng lớn (H.3.4), càng bảo vệ
được cấu trúc vật lý protein trước những tác nhân gây thay đổi cấu
hình thì enzym càng ít bị biến tính bấy nhiêu. Có nhiều quy trình cố
định enzym bằng liên kết cộng hóa tri sử dụng rấ t thành công có
liên quan đến giai đoạn thuận nghịch tự do ựreeỉy-reversibỉe stage),
ở giai đoạn này những liên kết cộng hóa trị được phép hình thành,
bẻ gãy và tái tạo cho đến khi một câu trúc được liên kết bằng nối
cộng hóa trị tự nhiên nhâ't hình thành, diều này ổn định enzym
được cố định. Sự ổn định được củng cố thêm nhờ việc ngăn chặn
những phân tử enzym tương tác lẫn nhau, ngăn chặn sự tấn công
của vi sinh vật và các phản ứng thủy giải protein trong quá trình cố
định. Để đạt được độ ổn định cực đại về hoạt tính enzym, thì bề mặt
của enzym và giá thể phải bổ trợ cho nhau cùng với sự hình thành
nhiều tương tác cộng hóa trị cũng như không cộng hóa trị. Thông
thường các yếu tố này phải được cân bằng lẫn nhau như, giá trị của
quy trình, nhu cầu về loại giá thể đặc biệt nào đổ, và phải đảm bảo
răng cơ chất không bị gây cản trở về m ặt không gian để có thể
khuêch tán đến vị trí hoạt động của enzym cố định, nhờ đó mới có
thế phản ứng với một vận tốc phù hợp.
Mức độ ổn định được xác định bởi nồng độ của gel và sô ỉượng của
các tương tác không cộng hóa trị. Tất cả các phản ứng được thực hiện ở
60°c sử dụng cơ chẩt nhân tạo có trọng lương phân tử thấp. Sự điều chế
enzym chymotrypsin cố định cho thấy độ ổn định cao gấp 100.000 lần,
hầu hết là nhờ bản chất đa điểm của enzym cho dù sự ngăn cản mất hoạt
tính enzym do tự phân là một nhân tố đóng góp quan trọng.
Các hằng số động học (ví dụ: Km, v ma*) của enzym có thể bị biến
đổi bởi quá trình cố định là do những thay đổi về cấu trúc bên trong
và giới hạn lối vào vị trí hoạt động của enzym. Vì thế, sự đặc trưng
nội tại (k/Km) của những enzym này có thể bị thay đổi tương đối so
với enzym hòa tan. Ví dụ về vấn đề có liên quan đến trypsin như: ở
trạng thái dung dịch tự do enzym này thủy giải 15 liên kết peptide
Enzym cố địn h 105
của protein pepsinogen, nhtftig đối với trypsin cố định thì con số này
chỉ là 10. Giá trị biểu kiến của những thông số động học này khi được*
xác định qua thực nghiệm, có thể khác với các giá trị nội tại. Điều
này có thể là do những thay đổi trong tính chất của dung dịch ở vùng
lân cận trực tiếp với enzym cố định, hay là do những ảnh hưởng của
phân tử khuếch tán trong môi trường địa phương (H.3.f>). Mối liên hệ
giữa những thông số này được minh họa như sau:
Môi trường vi mô Mỏi trường vĩ mô ÍS1 IS J
Hình 3.5 Sơ đồ mặt cắt ngang của một hạt enzym không hòa tan
(a) Điểu thị mổỉ trường vi mô và môí trường vĩ mổ, các chấm hlnh tam giác thể hiện các
phân ỉử enzym. Môi trưởng vi mổ bao gổm dung dịch bên trong cộng với phẩn bao quanh dung
dịch mà chịu ảnh hưởng bởi các dặc tính bổ mặt của enzym cố định. Sự phân cắt cơ chất sỗ xảy
ra giữa hai môi trưởng này. Các phân tử Cờ chất (S) phải khuếch tán qua lớp màng bao quanh
(vận chuyển ngoại vỉ) để đến được bể mặt xúc tác và được chuyển thành sản phẩm (p). Để cho
ỉất cả enzym dược sử dụng, cơ chất phải khuếch tán vào trong các tỗ trẻn bể mặt của các hạỉ
enzym cố định (vận chuyển nộỉ vi). Tính chất xổp (e) là tỳ lệ giữa thể tích của dung dịch dược
chửa trong các hạt với tổng thể tích của hạt. Trạng thái uốn khúc (tortuosity: t) là tỷ lệ trung bình
của độ dài đường đi qua các lỗ, giữa bất kỳ điểm nào trong hạỉ với khoảng cách chính xác phẩn
còn lại của nỏ. Trạng thái uốn khúc phụ thuộc vào trạng thái hinh học của lỗ. Biểu đổ này được
phóng dại vé kích thước nhằm mục đích làm rỏ ràng hơn. Điển hình, đường kính của phân tử
enzym (2-1 Onm) nhỏ hơn 10-20 lần so với đường kính lỗ. đường kính lồ nhò hơn 20 đến 40 lần so
với dường kính hạt (10'2000mm); môi trưởng vi mô bao gổm iớp khuếch tán (dày gần 10mm) và
lớp ngăn cách mỏng hơn (dày gần 20nm).
(b) Nóng độ của cơ chẩt ở bé mặt hạt (bán kính R) là [Sr] trong khi nổng độ nội tại
ở bất kỳ phạm vi nhỏ hơn nào (r) là một giá trị thấp hơn dược biểu diền bằng ỊS,].
106 C hương 3
2- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym không hòa tan
Khi gắn lên chất mang, enzym bị giới hạn trong một phạm vi
mồi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay
đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzym ban đầu (enzym
hòa tan). Enzym có thể thay đổi về pH, nhiệt độ hoạt động, cũng như
các giá trị của hằng số Michaelis và tính chất đặc hiệu, tuy nhiên
những thay đổi này còn phụ thuộc nhiều vào bản chất hóa học của
chất mang. Nói chung, enzym cố định thường bền với các tác nhân
biến tính hơn, nhưng hoạt độ riêng thường thấp hơn enzym hòa tan.
Đối với các enzym tác dụng được trên nhiều cơ chất dặc biệt là các
proteinase và nuclease thì sự giảm hoạt độ xảy ra mạnh mẽ hơn ở
những cơ chất có phân tử lượng cao. Việc không với tới trung tâm
hoạt động của enzym đối với các cơ chất có kích thước nhất định có
thể được giải thích như là một sự ức chế không hoàn toàn hoạt độ của
enzym liên kết bởi các chất kìm hãm.
Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ
của enzym cố định là tương tác protein-protein giữa các phân tử
enzym đã được liên kết. Trong mọi trường hợp đều thấy hoạt độ riêng
của chế phẩm bị gỉảm đi cùng với sự tăng lượng enzym được kết hợp
vào trên một đơn vị trọng lượng của chất mang.
Nhìn chung, các enzym cố định vẫn giữ được tính đặc hiệu của
mình. Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có độ bền
vững lớn đôi với các tác động khác nhau. Như vậy, đứng trên quan
điểm thực tế, sự giảm hoạt dộ hoàn toàn có thể bù lại dược bằng tính
chất này.
Or Hoạt tính eảữ enzym không hòa tan phụ thuộc vào bản chất
và tính chất hóa học của chất mang
Các tíiĩh chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền
cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kỵ nước,... đều cổ ảnh
hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, tính bền, và hoạt
tính sinh học của các dẫn xuất enzym cố định. Bản chất hóa học của
chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn
xuất enzym, và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các
chất từ môi trường phản ứng.
Dần xuất enzym không tan thường có tính bền nhiệt cao so với
enzym tan do kết quả của sự định vị enzym tạo nên. Chất mang cũng
có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi có
khả năng làm đứt nối liên kết hydrogen và liên kết kỵ nước.
Khi enzym được giới hạn trong phạm vi môi trường xác định,
sẽ xảy ra nhiều kiểu tương tác khác nhau của chết mang polymer lên
môi trường vi mô bao xung quanh phân tử enzym cố định. Kiểu thứ
nhất, có thể coi như là “hiệu ứng phân phối*, trong đó polymer nhờ
vào những tính chất lý hóa học đặc trưng sẽ kéo tới bề m ặt của
enzym (hoặc đẩy khỏi enzym) cơ chất, sản phẩm của phản ứng và
các phân tử khác, điều này làm tăng (hay giảm) nồng dộ của những
chất này trong môi trường vi mô ở sát enzym. Kiểu thứ hai, là bản
thân chất mang polymer ngăn cản sự khuếch tán tự do của các phân
tử theo hướng tới enzym cũng như đi khỏi enzym, từ đó ảnh hưởng
đến hiệu quả xúc tác của enzym. Ví dụ, trong trường hợp enzym được
cố định bằng chất mang polianion (polymer tích điện âm), khi đó
chất mang sẽ tác động mạnh với cơ châ't cation, cơ chất tích điện
dương sẽ tập trung quanh polymer chất mang tích điện âm, lúc dó
m ật độ cơ chất ở khoảng không gian ở gần enzym cao, mặc dầu nồng
dộ trung bình của nó trong cả hệ thấp. Đồng thời polymer cũng sẽ
lồi kéo bất kỳ cation khác, chẳng hạn như các proton, từ đó dẫn đến
gia tăng nồng độ H+ xung quanh enzym, làm cho pH thấp hơn so với
độ pH trung tính trong toàn hệ. Trong trường hợp polymer và cơ
chất tích điện giống nhau thì các quá trình ngược lại. Như vậy dễ
dàng nhận thấy, khi sử dụng polymer và polyanion làm chất mang
sẽ không có ion nào nằm trong dung dịch được phân bố đều trong hệ
mà nồng độ các ion trong môi trường vi mô xung quanh enzym sẽ
khác với nồng độ của chúng ở trong pha dung dịch tự do. Điều đó
làm cho quá trình động học enzym trd nên rấ t phức tạp. Hoạt động
của enzym hòa tan trong phương trình động học được xác định trên
cơ sd nồng độ cơ chất, proton, sản phẩm phản ứng,... được đo đạc
trong pha dung dịch tự do, vì vậy chúng có thể trùng lặp hay không
trùng lặp với những giá trị tương ứng à môi trường vi mô xung
quanh enzym, từ đó ảnh hưởng đến hoạt động của enzym.
108 Chương 3
Người ta thầy, khi papain được cố định trên màng cellulose

nitrate tác động thủy phân gelatin, thì papain này mặc dù có hoạt
tính thấp hơn so với papain trong dung dịch pha loáng, nhitog thực tế
nó lại thủy giải cơ chất tốt hơn. Điều này xảy ra là do cellulose nitrate
nằm trong màng đá hấp thụ gelatin làm biến tính, nó tạo điều kiện
thuận lợi cho việc thủy giải gelatin.
Tính chất chung của các chất mang polyanion là khả năng gây
Va sự phân bố lại proton giữa pha dung dịch tự do và môi trường vi mô
xung quanh enzym. Polianion có xu hướng tập trung proton xung
quanh nó và do vậy làm giảm pH xung quanh enzym cố định, ngược
lại polycation lại đẩy proton ra và làm tăng pH, điều đó có thể ảnh
hưởng đến hoạt độ của enzym.
Trường hợp enzym được
cố định trên chất mang
polyanion, độ pH ở gần enzym
sẽ thấp hơn ở trong dung dịch
tự do. Giả sử pH tối ưu của
enzym tự do trong dung dịch
được pha loãng là 8,0 và
đường cong phụ thuộc hoạt
tính của enzym vào pH có pHe
dạng hình chuông (H.3.6). Hình 3,6 Sơ đồ giới thiệu sự phân bố

Nếu như pH có bên ngoài ion H* do chất mang polymer gây ra
đổi với enzym không hòa tan (2)
(pHe) là pH của dung dịch tự
do bằng 8,0, thì pH bên trong (pHi) ở môi trường xung quanh enzym
do có hiệu ứng phân phối lại proton sê nhỏ hơn 8 (ví dụ bằng 7). Như
vậy mặc dù độ pH đo được trong hệ thống bằng 8, enzym thực tế sẽ
hoạt động ở pH bằng 7, mà ở đó hoạt tính của nó chỉ bằng 50% giá trị
tối đa (điểm A). Do vậy phải tăng giá trị pHe tới 9 để tạo điều kiện
cho enzym hoạt động ở giá trị pHi 8 và khi đó nó sẽ thể hiện hoạt
tính tốì đa của mình (điểm B).
Đường cong 1 tương ứng với enzym trong dung dịch được đưa ra
để so sánh. Polyanion được sử dụng làm chất mang.
Enzym cô' địn h 109
Trong các hệ enzym cố định, sự xê dịch giá trị pH tối ưu thường

xảy ra. Để khắc phục, người ta thường bổ sung vào trong hệ phản ứng
dung dịch có lực ion cao để ngăn cản ảnh hưởng của các nhóm ion có
mặt trên chất mang polymer và làm chuyển dịch pH. Ngoài ra, bằng
cách sử dụng dung dịch đệm có nồng độ cao cũng khắc phục được. Như
vậy, sự thay đổi pH tối ưu của enzym cố định chỉ xảy ra trong dung
dịch đệm có lực ion thấp.
Nhiều tài liệu cho thấy hoạt tính của enzym cô" định trên các
chất mang có phân tử lượng cao giảm đáng kể so với hoạt tính của
chúng trên bề m ặt các chất có phân tử lượng thấp. Điều này được giải
thích là do sự cản trở không gian tạo bởi các chất mang có phân tử
lượng cao dối với sự tiếp cận của các đại phân tử cơ chất với các tâm
hoạt động của phân tử enzym. Ví dụ, trypsin gắn vào polymer bằng
liên kết cộng hóa trị chỉ có thể thủy giải 10 liên kết peptide của cơ
chất của nó trong khi trypsin tự do thủy giải 15 liên kết như vậy.
b- H oạt tín h của enzym không hòa tan p h ụ thuộc vào 8ự khuếch
tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác
Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ
thuộc vào các yếu tcT:
- Kích thước lỗ gel của chất mang polymer
- Trọng lượng phân tử của cơ chất
- Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh
enzym và dung dịch tự do.
Những hạn chế về mặt khuếch tán cũng có ý nghĩa đáng kể
trong quá trình sử dụng hệ thống enzym cố định. Trong vấn đề này,
đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ
chất đóng vai trò hàng đầu. Song những hạn chế khuếch tán không
chỉ đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng
môi trường vi mô xung quanh enzym và dung dịch tự do. Hoạt tính
xúc tác của enzym dẫn tới sự thay đổi nồng độ của cơ chất và sản
phẩm phản ứng ở vùng môi trường vi mô xung quanh enzym. Điều này
làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung
địch và chất mang chứa enzym cô" định. Sự xuâ't hiện của gradient
nồng độ nói trên được giải thích bởi tốc dộ khuếch tán thấp của các
phân tử trong gel và hoạt tính xúc tác cao của enzym.
110 Chương 3
Những giới hạn khuếch tán có thể được thể hiện ở hai dạng'hàng
rào khuếch tán bên ngoài và bên trong. Rào khuếch tán bên ngoài xuất
hiện là do có sự tồn tại của lớp mỏng dung môi không pha trộn bao xung
quanh hạt polymer đó là lớp nemst. Các chất khuếch tán vào lớp này
nhờ có sự kết hợp của khuếch tán phân tử thụ động và sự đối lưu. Độ dày
của lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn của dung môi xung quanh các
hạt chứa enzym cố định. Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào
khuếch tán bên ngoài, vì vậy trong bất kỳ quy trình công nghệ nào, tốc
độ khuấy đảo đóng vai trò hết sức quan trọng.
Rào khuếch tán bên trong là sự giới hạn khuếch tán tự do ở bên
trong chất mang polymer do chính chất mang gây ra. Trong giới hạn
của hạt polymer chỉ có sự khuếch tán phân tử thụ động không bị ảnh
hưởng bởi tốc độ pha trộn. Rào khuếch tán bên trong sẽ biểu lộ rõ ràng
hơn nếu như enzym được cố định bằng cách đưa nó vào trong chất
mang polymer chứ không phải là gắn nó vào bề mặt của chất mang.
Những giới hạn khuếch tán cùng hiệu ứng phân phối có ảnh
hưởng đến những đặc tính động học của quá trình khuếch tán nếu so
sánh chúng với những số liệu nhận được đối với enzym tự do. Điều
này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần phải để ý
tới khi thiết lập quy mô của quá trình.
c- Ảnh hưởng của pH lên enzym không hòa tan
Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối uu
của enzym cô" định. pH tôi ưu của enzym cố định có thể bị chuyển dịch
về phía kiềm hay phía acid so với pH tối ưu của enzym hòa tan.
Chẳng hạn như chymotrypsin khi gắn với chất mang là co-polymer
của maleic acid-ethylene thì pH tối ưu bị chuyển dịch về phía kiềm
gần hai đơn vị pH.
Trái lại, khi chymotrypsin kết hợp với chất mang đa cation thì
pH tối ưu chuyển dịch về phía acid. Như vậy, sự chuyển dịch pH tối líli
ỉà do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên. Sự có
m ặt của trường tĩnh điện mạnh dẫn tới nồng dộ H+ gần chất mang và
trong dung dịch khác nhau. Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất
mang điện tích âm cao hơn, còn gần chất mang điện tích dương thấp
hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối uu của enzym liên kết đồng
hóa trị với chất mang có diện tích âm sẽ chuyển «địch sang phía pH
kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị
với chất mang mang điện tích dương thì pH tối uu sẽ chuyển dịch
sang phía pH acid. Còn khi lực ion lớn điện tích của chất mang được
làm trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzym cô' định
gần giống như của enzym hòa tan.
3.3.3 Các p hư ơ ng p h á p cố đ ịnh enzym
Mục đích cuối cùng của việc cố định enzym là gắn được enzym
vào một chất mang nào đó để ta có thể thực hiện phản ứng enzym
nhiều lần. Công việc này cần thực hiện các bước sau:
- Chọn chất mang phù hợp với enzym cần gắn vào nó
- Hoạt hóa chất mang cho khả nảng gắn enzym tốt hơn
- Tiến hành các kỹ thuật phù hợp để gắn enzym vào chất mang.
1- Chất mang dùng để cố định enzym
a- Những yêu cầu của một chốt mang lý tưởng
Một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây:
• Một chết mang lý tưởng sử dụng trong cô" định enzym điều
trước hết là cần phải rẻ. Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế
của quy trình công nghệ, đặc biệt có ý nghĩa khi quy trình đó ứng
dụng ở quy mô công nghiệp.
• Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định. Nhờ đó
mà chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy
trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất.
• Về m ặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi
trường phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzym.
Chất mang không gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu.
• Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn
công của vi sinh vật.
• Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề m ặt tiếp xúc
lớn. Tính chất này của chất mang vừa táng khả năng cố định enzym,
vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzym, nhờ đó làm tăng
hoạt tính của enzym cô" định và số lần tái sử dụng.
• Chất mang cổ thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt,
dạng màng, dạng phim mỏng....
ò- Phăn loại chất mang
Tất cả các chất mang dùng trong cố định enzym được chia làm
hai nhóm: chất mang polymer hữu cơ; chất mang vô cơ.
112 Chương 3
C hất m a n g là p olym er h ữ u cơ, gồm hai nhóm: polymer tổng hợp

và polymer tự nhiên.
Chất mang ỉà các polymer tự nhiên (natural polymer)
• Chất mang polysaccharide: Là nhóm chất mang đang thịn
hành và được sử dụng thương mại rộng rãi nhất hiện nay, đó là
cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng.
Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất và dễ dàng tạo hạt. Tuy
nhiên do vấn dề giá cả (agarose của hãng Sigma có giá thành khoảng
800-2000ƯSD/kg) nên agarose chỉ thường được sử dụng trong nghiên cứu
và vì mục đích y học. Vì vậy không thể sử dụng ở quy mô công nghiệp.
Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM-cellulose, DEAE-
cellulose có tín h chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất
và ổn định nên chỉ sử dụng ở dạng sợi và dạng vi h ạt (microsphere),
Anginate, carrageenan là hai vật liệu khá mới mẻ. Cả hai vật
liệu này tạo gel trong dung dịch CaCI2 dùng để nhốt tế bào, ervzym.
Tuy nhiên hai loại vật liệu này có một nhược điểm căn bản là gel
không ổn định trong môi trường có phosphate.
Tinh bột là vật liệu rất phong phú và rẻ tiền. Từ lâu, tinh bột
dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất
mang cố định enzym như là lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase.
Tuy nhiên, có nhược điểm là độ trương còn hạn chế và thiếu các nhóm
chức năng, vì vậy khả năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Để
khắc phục nhược điểm này, tinh bột thường được ghép copolymer với
các vinyl monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid vừa cải thiện
tính chất cơ lý, dộ trương, vừa tạo các nhóm chức năng trên bề mặt
như —NH2, —COOH, làm tăng diện tích tiếp xúc và khả năng cô định
enzym. Vật liệu tinh bột ghép copolymer này cố dinh tốt urease,
trypsin và có khả năng hấp phụ kim loại nặng.
Chitin và chitosan là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng
trong cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer rấ t phổ biến
trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai sau cellulose. Chitin có cấu tạo tương
tự cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-(3-D-glucose. Chitin
tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm, cua, côn trùng, thành
tế bào v s v . Chitosan là dẫn suất của chitin khi xử lý bằng k iề m đặc.
Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng
hấp phụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố
Enzym cố địn h
định enzym qua cầu nôì glutaldehýde. Chitosan dùng để nhôt

enzym, tê bào trong khuôn gel khi xử lý với glutaraldehyde và
sodiumtripolyphosphate, ferrocianur potassium.... Cả chi tin và chitosan
đều có một nhược điểm là tính chât kỵ nước, đô trương kém, diện
tích bề m ặt tiếp xúc nhỏ. Đế khắc phục nhược đièm này, hiện nay đang
có xu hơớng ghép copolymer với các monomer với các monomer ưa nước
như aciylamide, acrylic acid, hydroxyethylmethacrylate, methylmethacrylate.
Nhờ đó mà chitin, chitosan cải thiện được các tính chất như độ trương,
diện tích tiếp xúc bề mặt, tính chất cơ lý, đảm bảo các yêu cầu của một vật
liệu cố định erizym, tế bào lý tưởng.
Hiện nay cũng có xu hướng chung là các vật liệu polymer tư
nhiên được ghép copolymer với các polymer tổng hợp đế cải thiện tính
chât cơ lý. Nhiều vật liệu copolymer này đã được thương mại hóa như:
ultrogel (copolymer của agarose với polyacrylamide), cellulose được
ghép với acrylamide.
• Chất mang là protein: Các chất mang là protein thường dùng
là gelatin, keratin, albumin. Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo
màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm -NH2, vì vậy thường được
sử dụng nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là
glutaraldehyde. Nhóm chất mang là protein có nhược điểm là thường
kém bền, dễ nhiễm khuẩn, hay gây ra các phản ứng miễn dịch với cơ
thể khi sử dụng trên người và độn£ vật.
Chất mang là các polymer tổng hợp (synthetic polymer):
Hiện nay có rất nhiều polymer tồng hợp được sử dụng làm chất
mang cố định enzym như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol,
polyvinylacetate, poly acrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,
polyethylene ghép với vinyl monomer,... ưu điểm chung của các
polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn
công của vi khuẩn, độ trương tốt, một sô* polymer có thể diều chính
được kích thước siêu lỗ.... Tuy nhiên các polymer tổng hợp cũng bộc lộ
những nhược điểm nhất định như một sô" có giá thành cao như
poly acrylic, polyacrylamide, polyhydroxyethylmethacrylate có khả
năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là
do quá bền vững, không thể phân hủy trong tự nhiên vì vậy gây ô
nhiễm môi trường. Công nghệ sản xuất các polymer này cũng gây ô
114 Chương 3
nhiễm môi trường nghiêm trọng. Đây là một vấn đề quan trọng đặt ra
đòi hỏi con người cần quan tâm và giải quyết.
Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt,
kích thước của lỗ gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề m ặt tiếp
xúc lớn. Polyacrylamide và polyacrylate thường được nạp vào cột, và
có rấ t nhiều dạng khác nhau như polymer có nhóm thiol, amine, hoặc
aldehyde. Phương pháp cố định chủ yếu bằng cách nhốt enzym, tế bào
trong khuôn gel khi được polymer hóa bằng hóa chất như
ammoniumpersulfate, bằng bức xạ gamma, Roentgen. Thường thì để
tăng khả năng đóng mạch của gel polyacrylamide, cần phải bổ sung
thêm N, N-methyllenbisacrylamide làm chất đóng mạch (crosslinking
agent). Ngoài ra còn có thể cố định enzym trên các vật liệu này bằng
phương pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị và microcapsule.
Các chất mang vô cơ: Ngoài các polymer được sử dụng làm chất
mang còn có một số chất mang vô cơ đã dược sử dụng thương mại như
sợi bông thủy tinh, silicum oxide, alỉuminium oxide, mangesỉum oxide.
Đây là những dạng oxide có cấu trúc lỗ và có khả năng hấp phụ tốt.
Một số vấn đề cần chú ý khi sử dụng các vật liệu có nguồn gốc là silic
là khá đắt tiền, cho nên chỉ sử dụng vệt liệu này trong sắc ký lọc gel
và cô" định những enzym đặc biệt. Nhược điểm của các vật liệu này là
tan trong dung dịch kiềm có pH >7,5. Để hạn chế điều này người ta
phủ lên sợi bông thủy tinh hay siỉỉcum oxide một lớp ziconia, tạo ra
một lớp ổn định với kiềm. Ngoài ra còn có thể sử dụng ceramic xốp để
cô" định enzym.
Gần đây trên thị trường có một loại vật liệu vô cơ có tên là
celite hay diatomic, đây là một loại vật liệu không đồng nhất, chứa
nhiều ion kim loại, là một loại vật liệu rẻ tiền nhưng lại có rấ t nhiều
ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong cố định enzym. Ngoài
ra còn có rấ t nhiều dạng vật liệu từ tính (magnetic materials) đã được
sử dụng để cố định enzym, những ứng dụng của vật liệu từ tính vô
cùng phong phú. Người ta có thể gắn kháng thể và thuốc để tiêu diệt
khối u ung thư.
Các loại vật liệu dã được thương mại hóa sử dụng làm chất
mang cô" định enzym được thống kê ở bảng 3.1.
Bảng 3,1 Một số nguồn nguyên liệu thương mại hóo

sử dụng trong cố định emym và tế bào
Nhỏm chức
Chất mang Tẽn thương mại Dân xuất
năng hoạt hóa
BioGel A-150m; A-50m; Là dẫn xuất với tỷ lệ agarose khác -OH
A-15m; A-1,5m; A-0.5m nhau
Affi-Gel 101 Aminoalkyl -n h 2
Affi-Gel 102
Affi-Gel 201 Aminoalkyl carboxylic aciđ -COOH
Agarose Affi-Gel 202
Affi-Gel 401 Thio alkyl -SH
Affi-Gel 501 Thủy ngản hữu cơ Hg+
Affi-Gel 10 Carboxylic acid N-hydroxysuccinimỉde -COOH
Uitroget A Kích cỡ lồ khác nhau -OH
Ultrogel AcA Polyacrylamide -OH
Avicel Không thay thế -OH
Cellex Không thay thế -COOH
CMR cellulose Carboxymethyl -COOH
Cellulose Cellex-PAB Không thay thế -OH
Nitrocellulose Nitrate
CM-celtulose hydrazide Hydrazide -CO-NH 2
CM-ceilulose Carboxymethyl -COOH
Collagen Không thay thế 'OH, -NH2
Sephadex -OH
DEAE-sephadex Diethylaminoethyt
Dextran
CM-sephadex Carboxymethyl -COOH
SP-sephadex Sulfopropyl -SO3H
Diatom ite Celite -Si-OH
CPG Không có dẫn xuất -Si-OH
CPG-Dextran Aminopropyl CPG -CH-OH
Thủy tinh
Carboxy-CPG Carboxylate - -COOH
GPG-thiol Aminopropylcysteine -SH
Kim loại từ tính Ferrofluid
Nylon Nylon tube Không có dẫn xuất -CO-NH
BiogelP hydrazide Hydrazide -c o - n h - n h 2
AE-Biogel p Aminoethyl -n h 2
Biogel CM* Carboxymethyl- -COOH
Enzacryl-AA Arylamin
Polyacrylamide Enzacryl-AH Alkylhydrazide -CO-NH-NH2
Enzacryl-PT Cysteinyl -SH
EnzafixP-HZ Alkylhydrazide
Sepheron Hydroxymethyl -OH
Trysacryl Trishydroxymethyl -CH2OH
Polyester insolmer Crosslinker
Polystyrene Polysep p
Polyvinylaicohol PVA -OH
Silica Unisil Không có dẫn xuất SiOH
116 Chương 3
2- Phương pháp hoạt hóa chất mang

a- Hoạt hóa chất mang bằng cyanogen halogenur
Các chất mang có bản chất polysaccharide (-OH) thường được
hoạt hóa sơ bộ bằng cýanogenhalogenur. Phản ứng hoạt hóa xảy ra
trong môi trường kiềm. Chất mang hoạt hóa có khả năng liên kết
cộng hóa trị với -NH2 của protein enzym.
Porath và Bar-Eli lần đầu tiên đã hoạt hóa cellulose, agarose và
dextran bằng phương pháp này. Quá trình hoạt hóa diễn ra như sau:
Cyanogen bromide sản phẩm trung gian
Khi xử lý polysaccharide bằng BrCN sẽ tạo ra imidocarbonate và

carbamate. Carbamate bền vững, còn imidocarbonate tương tác với -
NH2 bậc n hất của enzym trong điều kiện môi trường kiềm vừa phải.
Chất hoạt hóa BrCN và Gác sản phẩm trung gian tạo thành rất
độc, do đó cần có các thiết bị bảo vệ trong khi tiến hành nghiên cứu,
sản xuất. Để trán h tình trạng ô nhiễm này, Kohn và Wilchek đã cải
tiến th àn h phương pháp “cyano-transfer”, phương pháp này đơn giản
và hiệu quả hơn. Mặc dù vẫn sử dụng BrCN nhưng được hòa tan trong
dung môi acetonitrile hoặc aceton và thêm vào triethilamin. Dạng
triethylammonium nitrile có khả năng hoạt hóa tốt các polysaccharide
ở môi trường pH trung tính. Tuy nhiên nếu nhóm hoạt hóa quá nhiều
sẽ là nguyên nhân làm giảm hoạt tính enzym cố định.
b’ Hoạt hóa bằng ethyl chloroformate

Khi sử dụng phương pháp hoạt hóa bằng cyanogen bromide,
cyanogen bromide và các sản phẩm trung gian tạo thành rấ t độc.
Chloroformate có thê được sử dụng để tạo ra các sản phẩm trung
gian tương tự nhưng không có độc tính. Phương pháp này được thực
hiện như sau:
Ethyl chloroformate
c l c o 2c 2h 5 H2N — enzym p
+ n
----- OH o — C — enzym
— ° \
c = 0 ----- »
----- OH — 0/ OH
Cellulose Chất trung gian carbamate vòng
c- Hoạt hóa bằng phương pháp azide

Hiện nay phương pháp này vẫn được xem là phương pháp hàng
đầu. Các chất mang chứa nhóm chức -COOH của CM-cellulose
polyacrylamide và nylon có thể hoạt hóa bằng phương pháp này.
Trước hết là ester hóa CM-cellulose. Sau đó chuyển ester thành
hydrazide, rồi azide. Azide trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với -
NH2 của enzym. Phản ứng sẽ diễn ra theo sơ đồ sau:
t
o o
ỹ OCH2—C —NH—NH2
o c h 2c o o h CH3OH Ị- o c h 2- c —0CH3 NHjNHj
(hidrazide)
OH Ester-hỏa I- OH {hidrazin) t OH
HNOo
Carboxymethyl - cellulose
o
y
OCH2—c —NH — enzym H2N -(e n z y m ) + r OCH2- C “ N
[ OH
{hidrazide)
hno2
t OH
Azide liên kết với enz)rm ở điều kiện nhiệt độ từ 0-5°C, pH=8,7.
d- Hoạt hòa bằng glutaraỉdehyde
Các chất mang chứa nhóm -NH2 như polyacrylamide, chitin,
chitosan, cellulose, tinh bột ghép acrylamide đều có thể sử dụng
phương pháp này. Giutaraldehyde là một chất có chứa hai nhóm
aldehyde hoạt hóa. Một nhóm sẽ gắn với -NH2 của chất mang, nhóm
còn lại sẽ gắn vào -NH2 của enzym.
118 Chương 3
G lutaraldehyde Oligoglutaraldehyde
HC=0 HC=0 HC=0 HC = 0

ĩ _ H I H, H, H I H, H2 H I Hj, H,
CHZ —C = Ò —c - C — C = C — C —C — c = C —C —C •
CH'2
I H2N — e n z y m e .
-/H2
CH enzym
I /
HC = 0 HC = 0 HC = NH HC = 0
H I H2 H2 H I H2 H2 H I H2 H2
~c = c ~ c - c -C = c - c —c —c = c —c —c —
I
NH — enzym
e- Hoạt hóa bằng phản ứng diazo

Những chất mang cố nhốm amine có thể sử dụng phương pháp
này. Muối diazo của chất mang hoạt hóa có thể phản ứng không chỉ
với nhóm amine, mà cả với nhóm phenol, imidazol của protein của các
enzym. Phản ứng cộng hóa trị với enzym xảy ra nhanh chóng ở nhiệt
độ thường và môi trường nước trung tính. Quá trình hoạt hóa và gắn
enzym diễn ra như sau:
hno2
HO
N2- + E -------- --
\
Also —NH 2'
hisỉidime imidazole
f- Hoạt hóa bằng carbodiimide
Các chất mang chứa nhóm carboxyl, có thể được hoạt hóa bằng
các dẫn suất của carbodiimide, trong đó tốt hơn cả là của N,N-
diciclohexilcarbodiimide. Khi có mặt chất này enzym dễ dàng liên kết
cộng hóa trị với chất mang và N,N-diciclohexilcarbodiimide sẽ chuyển
thành diciclohexilure không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ
nên dễ dàng tách bỏ.
Phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH=5), nên phương
pháp hoạt hóa này phù hợp với các enzym như amylase, pepsin,
:ellulase....
Carbodỉimide
R1- N = C = N - R 2
+
I 0 enzym
OH
h °-
IN I '
Chất mang O-acyỉ isourea 1 Lc_J|_c-N -R

R2 \
g- Hoạt hỏa bằng S-aminopropyltriethoxysilane

Hoạt hóa bằng trialkoxysilane cho phép hoạt hóa những loại vật
liệu trơ như thủy tinh có thể gắn với enzym. Thực hiện qua các phản
ứng sau:
Cyanogen bromide Sản phẩm trung gian
CNBr cyante ester
+
1
III
----- OH ----- 0 —
0
I
----- OH ---- OH — Ợh
Sepharose Carbamate trơ
limiđo - carbamate
H2N — Enzyme "n hoạt động H2N — enzym
c =NH
NH o
II H II H
o — c — N— enzym - o — c — N— enzym
OH - OH
Dần xuất isourea N-substituted carbamate
3- Các phương pháp cố định enzym

Trong tế bào sinh vật tồn tại sẵn cả enzym ở dạng hòa tan và cả
enzym không hòa tan. Muốn thực hiện được các phương pháp tạo enzym
không hòa tan ta phải tách và thu nhận được enzym từ tế bào vsv.
120 Chương 3
Tách và tinh sạch enzym từ tế bào sinh vật đã được trình bày ỏ
chượng I. Đối với enzym không hòa tan có sẵn trong tế bào, sau khi
thu nhận, ta gắn chúng vào chất mang, làm táng khả năng xúc tác
của chúng. Đốì với các enzym hòa tan khi gắn vào chất mang sẽ thu
được enzym không hòa tan có đầy dủ các tính chât mà ta đã trình bày
ở phần trên.
Toàn bộ phương pháp cố định enzym được tóm tắ t d hình 3.7.
Hình 3.7 Các phương pháp cổ định emym
a- Phương pháp nhốt enzynu Có hai phương pháp nhốt enzym:

- Nhốt enzym trong gel
- Nhốt enzym trong hệ sợi.
Phương pháp nhốt enzym trong gel: Phương pháp nhốt enzym
trong gel là phương pháp dựa trên oơ sd tạo ra một màng bọc hay một
polymer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của phản ứng cổ
thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngoài thông qua màng bọc này và
enzym sẽ được giữ nguyên trong khuôn gel đó.
Phương pháp này được thực hiện như sau: Enzym được trộn vào
trong một polymer. Sau đó tiến hành các quá trình trùng hợp với sự có
mặt của một hay nhiều tác nhân khâu
mạch, tạo ra phức chelate. Khi đó, enzym
sẽ được bao bọc trong khoảng không của
gel mới tạo thành.
Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzym
đã được nghiên cứu kỹ và đã được áp dụng
rất thành công ở nhiều nước. Những loại
Enzym được nhốt
nguyên liệu dó được trình bày trong bảng
trong gel không hòa tan
dưới đây.
c h 2= c h CH2=C H
I
CONH2 0=0
E I
Acrylamide NH
enzym
monomer I
CH2
NH
I
K2S2O0 c=o
Polymer hóa
chất khởi động I
C H=CH2
DMAPN
chất gia tốc
I
NH
CO CONHí
I
-C H 2-C H -C H 2- CH- ‘CH2- C H - C H 2- C H - C H 2-
I I
co CO
I ĩ
NH NH
I I
ch2 Enzym -CH2
NH NH
I
CO CO
I I
—CH2—CH—CH2—'CH —CH2—CH —CH2—CH •—CH2—
I
conh2 CO
Hình 3,8 Tóm tắt một quy trình cố định enzym bằng phương pháp nhốt
122 Chương 3
Giá thể polymer sử dụng ở đây là các đơn phân acrylamide được
polymer hóa.
%,
Bừng 3.2 Phương pháp nhốt enzym trong khuôn geỉ
s tt Nguyên liệu Enzym Tài liệu tham khảo
(1 ) (2 ) (3) (4)
Acetyl choline steaterfe
Ngo and Laidíer, 1978
(EC.3.1.1.7)
Alcohol dehydrogenase
Lomiere et al, 1991
(EC.1.1.1.1)
* Chymotrypsỉn Martinek et al 1977,
(EC.3.4.21.1) 1980. Kuan 1980
Asparaginase
Mon et ai, 1Ỡ76
{EC.3.5 1.1)
D-gluco dehydrogenase
Chen et ai, 1979
(EC. 1.1.1.47)
Alcohol dehydrogenase
Chen et al, 1979
(EC.1.1.1.1)
p-D-galactosidase
Danielson et al, 1979
1 Poly acrylamide (EC.3.2.1.23)
Phenol Kjellen and Neufahi,
2 -monoxygenase) 1979-1980
(EC.1.14.13.7)
Sada eỉ al, 1980
Urease (EC.3.5.1.5)
p-D- fructofuranosidase
Adachi et ai, 1980
(EC.3.2.1.26)
Penicillin amidase
Szewczuk, 1979
(EC.3.5.1.11)
Catalase (EC. 1.11.1.6 ) Đuchhol et al, 1978
D-glucose oxydase
Buchhol eỉ al, 1981
(EC.1 .1.3.4)
Glucoamylase
Monyamaetal, 1980
(EC.3.2.1.3)
D-gluco oxydase
Harula et al, 1987
Iso-propyl acryiamide (EC.3.2.1.3)
2
N-N-methylene bis acrylamide Penicillin G-acylase
Prabhune et al, 1991
(EC.3.5.1.11)
AMP-diaminase
3 Acrylamỉde/glycidylmethaorylate Karube et al. 1977
(EC.3.5.4.6 )
(1 ) (2 ) (3) (4)
p-D- fructofuranosidase
Fukur et al, 1978
Ethyleneglycol/2 hydroxy ethylmetha (EC.3.2.1.26)
4
cry late D-glucose isomerase
Fukur, 1978
(EC.5.3.1.5)
a-amylase Kumacura et ai 1977,
(EC.3.2.1.1) 1979
Glucoamylase
Kaetsu et al. 1979
(EC.3.2.1.3)
Ceilulase
Kaetsu et al, 1979
(EC.3.2.1.4)
5 Hydroxyethylmeth acrylate
a-D-glucosedase
Kaetsu et al, 1979
(EC.3.2.1.20)
D-glucose oxidase
Kaetsu et al, 1 Ỡ7Ỡ
(EC.1.1.3.4)
Penicillin acylase
Boccu et ai, 1987
(EC.3.5.1.11)
N’Vi nil pyrolidome/2 hydroxyethyl D-glucose oxidase

6 Qursel hasuci, 1992
methacrylate (EC.1.1.3.4)
Poly (sodium 2 -acrylamide
Cafarase
7 2 -methyer propanesul phonate/poly) Kohjiva et al, 1991
(EC.1.11.1.6)
(2 'tomethylamenior hylmethacrylate)
Lipase Koshiro and Ozaki,
8 Urethane prepolyme
(EC.3.1.1.3) 1987
Lipase
9 Photocrosslinkable prepolyme Konigi etal, 1987
(EC.3.1.1.3)
Lipase
10 Sorbitol E090/Epichtorohydrin Marcinowski, 1987
(EC.3.1.1,3)
11 Polyaziridines Miscellaneous Wood et al, 1990

Urease Gobinathan and Balan,
(EC.3.5.1.5) 1989
12 Polyvinyl alcohol
Invertase
Suehiro, 1989
(EC.3.2.1.26)
1,3 phenylenediamine/ D-glucose oxidase Almeida and Wingard,

13
electropolymeization (EC.1.1.3.4) 1991
D-glucose oxidase
14 Phenol electropolymeization Bartlett et al, 1992
(EC.1.1.3.4)
124 Chường 3
(1 ) (2 ) (3) (4)
Phosphatase acid
Braun et al. 1991
(EC.1.1.3.4)
ị
Ị
I Alkalins photphatase
15 Tetramethosy-silate ! Braun et al. 1991
(EC.3.1.1.3)
j
Trypsin I
Braun et al, 1991 i
(EC.3.4.21.4)
C-S lyase Thomas and Parkir,
(EC.4.4.1.4) 1991
I Invertase t '
I Umeyama et ai 13C7
vLC.3.2.1.26)
16 Alginate
II Linasp
Ii I1 Konishi et al, 1989 ;
I (EC.3 1.1.3) I
i
Jl-D-galactosidase
Isushima. 1991
I (EC.3.2.1.29)
1
1
! Phosphatase acid
Koenig and Ugi, 1991
(EC.3.1.3.2) I
17 Algtnic acid/Ugi reaction
Lactatedehydrogenase I i
Koenig and Ugi. 1991 I
(EC.1.1.1.27)
j
Amynoacylase
Tosa et al. 1979 I
(EC-3.5.1.14)
Aspartate
amynonialyase Tosa et al. 1979 I
i
18 K. Carrageeman (EC.4.3.1.1 ) I
I
II Fumarate hydratase
Tosa et ai, 1979 Ị
(EC.4 2.1.2)
Ỉ
Lipase
Konishi et al. 1988
(EC.4.2.1.2)
íL 19
.
Fibroin Lipase (EC.4.2.1.2) Nakayama et at, 1986
Invertase
I 20 Gelatin Sugisawa et al, 1987
{EC.3.2.1.26)
Glucose oxidase
21 Hardened^jelatin Elcin and Ako, 1992 j
ỉ __ (EC.1.1.3.4)
---- --------------------
i
! I |i‘D-galactosidase Schacht and Nobel.
ị 22 Ị Gelatin/oxidized polysaccharide
(EC 3 2.1.23) 1989
I
Lipase
23 í Mircoemulsion organogel I Jenta et al, 1991
(EC.3 1.1.3)
Phương pháp nhốt enzym trong hệ sựt

Năm 1972, Dinelli đã tiên hành một thí nghiệm khá độc đáo là
nhốt enzym trong hệ sợi và những nghiên cứu này được kết thúc vào
năm 1978. Theo kêt quả nghiên cứu của Dinelli, enzym khi được nhốt
vào hệ sợi phát huy khả năng xúc tác rất tốt.
Phương pháp nhốt enzym trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản
ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzym trong gel. Các sợi sử dụng để
nhốt enzym thường là những sợi nhân tạo. Các loại sợi này có độ bền
với acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan. Tính chất
trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các polymer tạo ra
loại sợi này. Toàn bộ các loại sợi được sử dụng để nhốt enzym được
trình bày trong bảng 3.3, trong đó cellulose acetate là được sử dụng
nhiều hơn cả.
V///S/7'S777\ KWAV — .............. .. 1,1.............
GE cDE GE
y /f//s /7 T A Y 7S7SJ/7T A K ? _
Enzym duợc nhốt trong sợi ống có tỗ Enzym duợc nhốt trong những sợi bông
Hình 3.9
Bảng 3,3 Phương pháp nhốt enzym trong các sợi nhân tạo
stt Loại sợi Enzym cố djnh Tài liệu tham khào
Amyloglucosidase (EC.3.2.1.3) D.Angiuro et al, 1991
Ị Cellulose
Acetyl choiinesterase (EC.3.1.1.7) Tusarova et al, 1991
Amino acylase (EC.3.5.1.14) Bartoli etal 1978
Fumarate hydratase (EC.4.2.1.2) Marconi, 1975
Glucoamylase (EC.3.2.1.3) Corno et al, 1972
D-gluco isomerase (EC.5.3.1.5) Giovenco et al, 1973
2 Cellulose acetate Dihydropyrimidinase (EC.3.5.2.2) Snamprogetti, 1976
p-D-fructo furanosidase (EC.3.2.1.26) Marconi et al, 1974
Penicillin amidase (EC.3.5.1.11) Marconi et al, 1973
Tryptophan synthetase (EC.4.2.1.20) Marconỉ et al, 1974
Dipeptidyl peptidase (EC.3.4.14.1/2) Pardin et al, 1977
Polyvinyl alcohol Urate oxidase (EC.1.7.3.3) Kitano et al, 1980
3
and cellulose Urease (EC.3.5.1.5) Kitano et al, 1980
Polyvinyl alcohol Invertase (EC.3.2.1.26) Tsutsumi et al, 1990
4
fibers Amynoacylase (EC.3.5.1.14) Tsutsumi eỉ al, 1990
Polysulphone/
5 Glucoamyiase (EC.3.2.1.3) Ishizuki et al, 1991
polyethyleneimine
6 PVC Lipase (EC.3.1.1.3) Rucka and Turkiewier, 1990
7 Polypropilene fibers Lipase (EC.3.1.1.3) Kimura and Takahashi, 1991
126 Chương 3
Phương pháp tạo vi nang nhốt enzym

Các vi nang được tạo ra để nhốt enzym thường có kích thước
1-100Jim. Các vi nang có tính châ't là cho các cơ chất và sản phẩm
phản ứng qua lại tự do.
Năm 1964, Chang là người đầu tiên tạo ra vi nang để nhốt
enzym. Phương pháp này có ưu điểm là enzym được nhốt trong đó khá
bền với mọi tác động bên ngoài và sử dụng được nhiều lần. Nguyên
liệu tạo vi nang được liệt kê trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Tạo vi nang để nhốt enzym
stt Nguyên liệu tạo vi nang Enzym Tài liệu tham khào
p-D-galactosidase (EC.3.2.1.23) Wadiak and Carboneli, 1975

1 Nitro cellulose
Asparaginase (EC.3.5.1.1) Chang, 1973
Alcohol dehydrogenase (EC. 1.1.9.1) Campbell and Chang, 1976
Malate dehydrogenase (EC.1.1.1.37) Campbell and Chang, 1976
Catalase (EC.1.11.1.6) Mogensen and Vieth, 1973

o
<c Collodion
Piruvate Kinase (EC.2.7.1.40) Campbell and Chang, 1975
Hexokinase (EC.2.7.1.1) Campbell and Chang, 1976
Urease (EC.3.5.1.5) Mogensen and Vleth, 1973
3 Nylon p-D-galactosidase (EC.3.2.1.23) Ostergaard and Martiny, 1973
Asparaginase {EC.3.5.1.1) Morietal, 1973

A■ Polyurea
D-glucose oxidase (EC.1.1.3.4) Komoeietal, 1987
5 Polyeỉectrolyte complex Lactate dehydrogenase (EC. 1.1.1.27) Stefucaetal, 1991
Poly (2-hydroxyethyl)
6 Urokinase (EC.3.4.21.31) Liuetal, 1991
methacrylate
7 K-Carrageeman p-D-galactosidase (EC.3.2.1.23) Inushima, 1991

8 Coated liposomes D-glucose oxidase (EC. 1.1.3.4) Qzden and Hasirci, 1990
9 Polyethylene lycol Alkaline protease (EC.3.4.21.14) Koishi and Seklguchgi, 1980.
styrenebutadiene
10 Lipase (EC.3.1.1.3) Omi and iso 1989
ruber/polyvinyl alcohol
11 Ethyl cellulose Triacylglycerol lipase (EC.3. 1 . 1 .3) Kitaịemaetal, 1969

Catalase (EC. 1.1 1 .1 .6 ) Kitaịemaetal, 1969
12 1p uiyo
fi l\z*5tvrp
Ijr letnp
Urease (EC.3.5.1.5) Kltaịemaetaỉ, 1969
H ình 3.10 Enzym được nhốt trong các vỉ tiểu cầu

b' Phương pháp tạo liên kết enzym với chất mang
Đây là những phương pháp không phải nhốt enzym vào một
chất mang mà gắn enzym vào chất mang. Như vậy, không phải tất cả
các vật liệu đều có thể sử dụng làm chất mang được mà chúng phải có
tính chất đặc biệt mới gắn enzym được vào chất mang. Tính chất đặc
biệt của những chất mang này như sau:
- Chất mang phải bền với acid hoặc kiềm
- Chất mang phải gắn được với enzym theo những cơ chế nhất định
- Chất mang không được tham gia phản ứng với cơ chất.
Tùy theo tính chất của các chất mang, người ta thực hiện gắn
enzym vào chất mang theo những cơ chế sau:
Phương pháp hấp phụ
Phương pháp tạo liên kết ion
Phương pháp liên kết với kim loại
Phương pháp tạo liên kết đổng hóa trị.
Các chất mang sử dụng để gắn enzym được phân thành ba nhóm sau:
B ảng 3.5 Những chất mang được sử dụng trong cố định enzym
stt Phân loại Chất mang
Các chất mang hữu cơ Than hoạt tính, agar, agarose, albumin, cellulose, chitin,
1
nguồn gốc tự nhiên chítosan, collagen, dextran, gelatin, glucomannan, sợi, tinh bột
2 Các chất hữu cơ tổng hợp Acrylamkte, acrylic, maleic anhydride, nyion, polystyrene
Nhôm, bentonite, calcium phosphate, titanium phosphate,
3 Các chất vô cơ
ceramic, magnesium, cát tatinic
Phương pháp hấp phụ: Nhờ khả năng hấp phụ của các nguyên
liệu làm chất mang, enzym sẽ được gắn vào bề m ặt của chất mang.
Khả nầng hấp phụ của chất mang càng cao, enzym càng được gắn
nhiều vào chất mang. Do đó, khả năng tái sử dụng enzym cố định
càng cao. Một số chất mang sử dụng trong phương pháp hấp phụ được
trình bày trong bảng 3.6.
128 Chương 3
Bảng 3,6 Phương pháp hấp phụ trong cố định enzym

s tt Chất mang Enzym Tài liệu tham kHào
Chất mang hữu cơ

1 Cellulose hạt Lipase (EC.3.1.1.3) Kery et aỉ, 1990
2 Phospholipid Lipase (EC.3.1.1.3) Akitavà Umezawa, 1991
3 Phenoxyacetyl cellulose Alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1) Dixon et al, 1979
Glyceraldehyde-3 phosphate Dixon et al, 1979
dehydiogeivase (EC.1.2.1.12)
B-D-xylosidase (EC.3.2.1.27) Ogumtimein and Reilly, 1980
4 Palmitovl-cellulose Triacylglycerol lipase (EC.3.1.1.3) Horiuti and Imamura, 1978
5 Aminocacylase {EC.3.5.1.14) Watanabe et al, 1979
I annici arninonexye cellulose
naringinase Ono et ai, 1978
6 T annia-TE AE-cellulose Pullulanase (EC.3.2.1.14) Ohba and Ueda, 1980
7 Concanava A-agarose Phosphor diestease (EC.3.1.4.1) Schỉgeret alt 1980
8 D-glucose oxidase (EC. 1.1.3.4) Mattiason. 1978
Lecithin-agarose Peroxidase (EC. 1.11.1.7) Mattiason, 1978
Catalase (EC. 1.11.1.6) Mattiason. 1978
9 Heptyl-agarose Chlorophylase (EC.3.1.1.14) Sudina, 1979
10 Hexyl-agarose Guanylate cyclase (EC.4.6.1.2) Garbers, 1978
11 Octyl-agarose Guanylate cyclate (EC.4.6.1.2) Garbers, 1978
12 Decyl-agarose Guanylate cyclase (EC.4.6.1.2) Garbers, 1979
13 Than hoạt tính Glucoamyiase (EC.3.2.1.3) Cho and Bailey, 1979
14 Chitin hay chitosan Trypsin (EC.3.4.21.4) Goodman, 1982
15 Tannin-(£itosan Chitinase (EC.3.2.1.14) Sakai, 1991
16 Xương Invertase (EC.3.4.21.4) Safanik, 1987
17 Hạt ca1, Các chất mang
Trypsin (EC.3.4.21.4) Safanik, 1987
nguồn vô cơ
18 Zeolite D-glucose oxidase (EC. 1.1.3.4) Pifferi, 1980
19 Zeolite/AI20 3 Invertase (EC.3.2.1.26) Straus, 1990
20 TripVin (EC.3.4.21.4) Buchholz, 1990
Silicagel Alcohol dehydrogenase Mickel, 1979
(EC.1.1 . 1 . 1 )
21 Bentonite Miscelaneous Kawa, 198Ỡ
Trong thực tế, người ta thường sử dụng các chất có khả năng
hấp phụ cao như cellulose, agarose, chitin, polyacrylamide, nylon,
nhựa trao đổi ion, silicagel, thủy tinh. Khi tiến hành hấp phụ có thể
xảy ra các trường hợp sau:
- Nếu chất mang có nhiều lỗ xốp, enzym sẽ bám vào toàn bộ bề
m ặt phía trong và phía ngoài lỗ xốp.
- Nêu chất mang không có lỗ xôp, enzym sẽ chi bám trên bề mặt
chất mang.
- Nếu chất mang có điện tích, chúng sê tạo thành liên kết ion.
Phương pháp liên kết ion: Dựa trên khả năng tạo liên kết ion
giữa chất mang và enzym, người ta gắn enzym vào chât mang. Liên kết
ion thường không bền bằng sự hấp phụ của enzym đôi với chất mang.
Năm 1956, Mitz là người đầu tiên thực hiện phương pháp liên
kết ion đế gắn enzym vào chất mang. Ông đã sử dụng DEAE đề gắn
enzym vào.
Năm 1966, Tosa lại sử dụng DEAE-sephadex như một chất mang
để gắn aminoacrylase trong quy trình công nghiệp sản xuât amino
acid, sau đó là hàng loạt những nghiên cứu theo phương pháp này và
đã áp dụng khá thành công theo quy mô công nghiệp. Toàn bộ các
nguyên liệu sử dụng như chất mang đề thực hiện phương pháp lièn
kết ion được liệt kê theo bảng 3.7.
Bảng 3,7 Phương pháp tạo liên kết ỉon
s tt Chất mang Enzym Tàí liệu tham khảo
Các chất trao dổi anion

Glucoamylase (EC.3.2.1.3) Maeda, 1979
Phosphodiestease (EC.3.1.4.1) Aukati, 1978
D-glucose isomerase (EC.5.3.1.18) Huitron, 1978
1 DE AE -cellulose Insulinase (EC.3.2.1.7) Guinaud. 1981
Methanol oxidase (EC. 1. 1.3.13) Baratti, 1978
Dextrausucrase (EC.2.4.1.5) Kaboli, 1980
Aminoacylase (EC.3.5.1.14) Szwajcer, 1981
2 TE A E-cellulose D-glucose isomerase (EC.5.3.1.18) Huiton, Limorì 1978
D-glucose isomerase (EC.5,3.1.18) Huiton, Límorì 1978
Phenol 2 monooxygenase (EC.2.4.1.5) Kaboli, 1980
3 DEAE-sephadex
Dextrausucrase (EC.2.4.1.5) Kaboli, 1980
NAD. (P) H.oxíđase Hacozaki, 1990
Yokomichi, 1989
4 DEAE-sephađex-ASO Lipase (EC.3.1.1.3)
Yang, 1991
5 DEAE-Bio-gelA Phenol 2 monooxygenase (EO. 1.14.13.7) Kjellen, 1979. 1980
6 Amberlite IRA D-glucose oxydase (EC. 1.1.3.4) Klei, 1978
Amberíyst A21 Loose, 1990
7 Lipase (EC.3.1.1.3)
Các chất trao dổi cation
Penicilin amidase (EC.3.5.1.11) Carley smith, 1980
8 CMC
Acid phosphotase (EC.3.1.3.2) Vaidya, 1978
9 Cellulose phosphate Amyno acyl-t-RNA-synthetase Yamada, 1978
10 CM-sephadex P-D-fructofuranosidase (EC.3.2.1.26) Woodward, 1978
1 1 SP-sephadex Dexỉrausucrase (EC.2.4.1.5) Kaboli, 1980
1 2 Amberlite iRA 93 D-glucose oxydase (EC. 1.1.3.4) Annesini, 1990
13 Nylon/polyethyleneimine Aminocylase (EC.3.5.1.14) Obon, 1990
130 Chương 3
Phương pháp liên kết kim loại: Người ta làm tăng hoạt tính bề
m ặt của chất mang bằng những hợp chất kim loại. Từ đó, các enzym
sẽ gắn chặt hơn vào các chất mang. Những chất mang được hoạt hóa
bề m ặt bằng kim loại được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Phương pháp tạo ỉỉên kết kim loại
s tt Chất mang Enzym Tài liệu tham khảo
1 Cellulose Nuclease p. (EC.3.1.23.30) Rocugawa, 1979
2 DEAE-cellulose Pectinlyase (EC.4.2.2.10) Hanish, 1978
3 Gelatin Glucoamylase (EC.3.2.1.3) Kennedy, 1984
4 Bông thủy tinh Papain (EC.3.4.22.2) Kennedy, 1980
5 Nylon D-glucose-dehydrogenase (EC. 1.1.1.47) Bisse, 1978
6 Nhôm Glucoamylase (EC.3.2.1.3) Allon, 1979
7 Silicagel Trypsin (EC.3.4.21.4) Volkowa, 1979
Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị

Dựa trên nguyên tắc của sự tương tác đồng hóa trị giữa phân tử
enzym và chất mang. Các chất mang này phải là những chất không
được tan trong nước. Phương pháp này được ứng dụng rất rộng rãi
trong quy mô công nghiệp.
Bảng 3.11 Phương pháp cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị
Nhóm hoạt hóa Nhóm hoạt hóa Phản ứng,
s tt
của chất mang của enzym liẽn kết
(1 ) (2 ) (3) (4)
z
1
- < ^ - n ; ci
w
1
1 Liên kết diazo
0
muối diazoni
1
-C C K
2 - C O '' - nh2 Tạo amide
anhydrid acỉd
-n h 2
- ch?con3 - SH ì
3 Tạo amide*
Acyl azide J
- CO> = N H
4 -C O ' -N H 2 Tạo amide
imidocarbonate
- R - NCS
5 -n h 2 Tạo amide
Isothio cyanate
6 - ^ 3 “ NCS -n h 2 Tạo amide

iso cyanate
- CH2COCI
Acyl chloride
- co- c = o
8 - co^ -n h 2 Tạo amide
cyclic carbonate
R
1
NH
1
9 c - c o 2- -n h 2 Tạo amide
II
NH
1
R 0 - acylisourea
5
C 02—C —CH —CO —NH —C2 H5
so*
Chương 3
(1 ) (2 ) (3) (4)
11 C 5 “ n° 2 - nh2 Arylate hóa

NO,
5' fluoro-2,4 dimtroanilide
12 -n h 2 Arylate hóa
NO?
ỉ —o —CH -C H -n h 2
13 - OH Aikyl hóa
X => NH > 0 > s
oxirane - s
- NH?
- o - CH? - CH? - so? - CH = CH,
14 - SH Aikyl hóa
Vínylsuiphonyl
- OH
° = Q = °
-n h 2
15 - SH Arylaỉ hóa
o
- OH
-C H O
16 - nh2 Tạo shift base
Aldehyde
-n h 2
17 -N H = C C p í Phản ứng ugi
- C0 2 H
I NH
II Phản ứng
18 - C “ OC?Hs -N H 2
amỉdỉn
ester imido
- CN Phàn ứng
19
z
í
CM
Cyanide amidin
~ s - s - 0 Tạo thio
20 N - SH
disulfide
Cẩu disulfide
Phàn ủng
21 - SH
enzym-mercury
-n h 2 -n h 2
22 Tạo amid
Amine - c o 2h
- CONHNH? -n h 2
23 Tạo amid
Acyl hydrazo - c o 2h
I
4r Mô hình thiết bị sử dụng trong phản ứng emym không hòa tan
Phản ứng enzym không hòa tan là những phản ứng liên tục. Do đó,
ta có thể thọn một trong những mô hình phản ứng trong những hình sau:
o o
Thiết bị phản ửng enzym

hòa tan có cánh khuấy
Thiếỉ bị phản ứng Thiết bị phản ứng tuán Thiết bị phản ứng tuán
enzym khống hòa tan ^ ... hoàn có ỉấm ngăn hoàn không có tấm ngân
Hình 3.12 Một số kiểu thiết bị phản ứng
Thiết bị phản ứng liên Thiết bị phản ứng tuẩn hoàn hai ngăn
tục cỏ màng ngăn
i= -rT T —
=1 ^ a i
Thiết bị phản ứng cố Thiết bị phản ứng liôn tgc có màng ngân
định enzym liên tục
Hình 3.13 Thiết bị phản ứng ỉiên tục
A A
V V
Hình 3.14 Thiết bị dòng chảy liên tục có màng ngân
V
134 Chương 3
f,
A
T
H ìn h 3,15 Thiết bị dòng chảy H ình 3.16 Thiết bị dòng chảy
liên tục có sợi ngăn cản liên tục có tấm ngăn
3.4 ỨNG DỤNG CỦA ENZYM KHÔNG HÒA TAN
3.4.1 ứ n g dụng tro n g m ột s ố quy trìn h công nghiệp

Ngày nay, có một vài quy trình công nghiệp ở quy mồ lớn dang
hoạt động mà có sử dụng enzym cố định. Hai ví dụ điển hình là quá
trình sản xuất fructose siro từ tinh bột bắp và quá trình sản xuất
L-amino acid từ hỗn hợp L và D-amino acid. Enzym cô" định penicillin
acylase cũng đã được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất
penicillin bán tổng hợp.
2- S ả n x u ấ t fructose nhờ enzym glucose isomerase
D-glucose không thể được thay thế trực tiếp từ đường sucrose bởi
vì glucose ít ngọt hơn. Hơn nừa, tinh thề glucose trong dung dịch đậm
đặc có thế làm cho quá trình khó thực hiện hơn. Đế loại bỏ những trở
ngại này, người ta chuyển đổi từ dạng đồng phân glucose sang
fructose, sử dụng enzym glucose isọmerase.
H- c * ° ch 2oh
1 1
H -C -O H
o
-o
II
-------1---------
O H -C -H glucose isomerase O H -C -H
I I
H -C -O H H -C -O H
I I
H -C -O H H -C -O H
I I
CH2OH CH2OH
D- glucose D- fructose
Hệ số cân bằng của phản ứng này ở 50°c gần bằng 1, giá trị này
không thay đôi lớn theo nhiệt độ bởi vì ước lượng nhiệt của phản ứng
này là Ikcal/mol. Kết quả là sản phẩm có chứa glucose và fructose
theo tỷ lệ 1:1. Hỗn hợp này ngọt hơn so với glucose đơn lẻ và rất phù
hợp để thay thế đường trong nhiều ứng dụng như sản xuất nước giải
khát, thực phẩm và làm bánh kẹo. Sở dĩ sản phẩm cuối ngọt hơn là
do có chứa nhiều fructose.
Enzym ngoại bào glucose isomerase được tạo ra bởi nhiều vi sinh
vật, cự thể là Arthobacter và Streptomyces sp. Nhu cầu phá vỡ tế bào
mà không phá hủy enzym làm cho glucose isomerase có giá thành cao
hơn so với các enzym thủy giải ngoại bào khác. Hơn nữa, glucose
isomerase rất nhạy cảm với một số tác nhân kìm hãm. Cả hai yếu tố
này cho thấy duy trì enzym ở dạng cô" định dưới những điều kiện phản
ứng được kiểm soát tốt là một biện pháp cần được thực hiện. Người ta
đã cồ' định glucose isomerase dưới dạng kết hợp với collagen, bông hay
một vài loại tác nhân gắn kết khác. Sơ đồ điển hình sản xuất fructose
siro từ tinh bột bắp sử dụng enzym glucose isomerase cố định được
trình bày trong hình 3.17.
Làm khô bằng
ánh sáng
Hình 3.17 Sơ đồ tóm tắt quá trình sản xuất fructose siro
từ tinh bột bắp nhờ glucose isotnerase
Có nhiều công đoạn tách lọc và xử lý giữa quá trình đường hóa
và đáng phân hóa phải thỏa mãn các điều kiện cơ bản của enzym học:
để tối ưu hóa độ Ổn định nhiệt của a-amylase được sử dụng trong giai
đoạn hóa lỏng (nhiệt dộ của giai đoạn này vào khoảng 105°C) thì cần
136 Chưctag 3
sử dụng ion canxi. Mặt khác, những ion này ức chế glucose isomerase,
và chúng được loại bỏ nhờ quá trình trao đổi ion trước khi dung dịch
đường dextrose được cho vào thiết bị thực hiện phản ứng isomer hóa.
2- ứng đụng của enzym raffinase cố định
Sự phát triển của enzym raffinase (a-D-galactosidase) phù hợp
với các ứng dụng thương mại là một thành công trong lĩnh vực công
nghệ enzym. Một cách hiển nhiên, thật khó có thể chấp nhận cách
điều chế enzym có chứa invertase để loại bỏ nguyên liệu trong suốt
quá trình sản xuất sucrose. Việc tìm ra một chủng sinh vật cổ khả
năng sản xuất a-galactosidase không phải là invertase là rấ t cần
thiết. Chủng nấm mốc Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer có thể
đáp ứng đủ được các yêu cầu này. Chủng nấm mốc này được nuôi cấy
trong những dạng hạt, thu nhận những dạng hạt này, sây khô và sử
dụng trực tiếp như một loại enzym cố định. Chế phẩm này được khuấy
trộn với nước chiết củ cải đường trong một reactor có cánh khuấy theo
từng mẻ. Khi quá trình loại bỏ raffinose hoàn tất, ngừng khuấy và
bơm nước chiết củ cải đường ra khỏi các hạt enzym lắng ở đáy. Enzym
bị m ất đi sẽ được bù thêm vào để tiếp tục tiến hành phản ứng với mẻ
nước củ cải đường mới. Đường galactose phóng thích ra sẽ bị phân hủy
ở điều kiện base trong giai đoạn đầu của quá trình tinh sạch nước củ
cải đường và không gây ra bất kỳ trở ngại nào trong suốt quá trình
sucrose được tái tạo. Quá trình này làm tăng thêm 3% hiệu suất và
làm giảm đáng kể việc gây ô nhiễm do thải bỏ rác rĩ đường.
Raíĩinase cố định có thể cũng được sử dụng để loại bỏ raffmose
và stachyose từ sữa đậu nành. Những loại đường này gây ra chứng
đầy hơi khi chúng ta dùng sữa đậu nành như là một loại sữa thay thế
trong một chế độ ăn kiêng đặc biệt.
3- ứng dụng của enzym invertase cố định
Invertase là loại enzym đầu tiên được sử dụng trong quy mô lớn
dưới dạng enzym cố định. Trong thời kỳ 1941-1946, người ta thay acid
thường được sử dụng trước đây trong quy trình sỗn xuất siro vàng
(golden syrup) bằng enzym invertase của nấm men. Các tế bào nấm
men sẽ tự hủy và sản phảm của sự tự hủy này sẽ được làm sạch bằng
cách điều chỉnh pH về 4,7, sau đó lọc qua lớp calcium sulphate và hấp
phụ trong than xương. Một lởp than xương có chứa invertase được
thêm vào trong than xương đang được sử dụng để khử màu của siro.
Quy mô sản xuất khá lớn, lớp invertase-than sâu khoảng 60cm nằm
trong một lớp than sâu 619cm. Chế phẩm này rấ t ổn định, các yếu tố
giới hạn thưởng là sự ngoại nhiễm vi sinh vật hoặc khử màu không
tốt, ít khi là m ất hoạt tính enzym. Quy trình này rấ t có hiệu quả kinh
tê nhưng sản phẩm không có mùỉ vị tỉnh tế như quá trình sử dụng
nguyên liệu được thủy giải bằng acid, do đó quy trình sử dụng enzym
cố định lại không được quan tâm khỉ người ta thấy được giá trị của
việc dùng acid một lần nữa. Tuy nhiên, gần đây enzym cố định lại
được giới thiệu sử dụng một lần nữa với thương hiệu Brimac™, sản
phẩm này là hỗn hợp invertase-than được ổn định nhờ liên kết chéo
và thời gian bán hủy là 90 ngày (sử dụng ở pH 5,5; 50°C). Nếu dùng
acid để thủy phân sẽ không thể sản xuất ra được siro nghịch đảo với
chất lượng tương đương. Khi sử dụng enzym sẽ tránh được những vấn
đề mà phương pháp dùng acid thường gặp phảỉ đó ỉà màu đậm, nồng
độ muối và tro cao, hiệu suất chuyển đổi tương đối thấp. Nếu
invertase tự do có thể được sử dụng (thời gian phản ứiig khoảng một
ngày) thì việc sử dụng enzym cố định (thời gian phản ứng khoảng lỗ
phút) làm cho quy trình sản xuất trở nên cạnh tranh hơn, có thể sản
xuất 16 tấn siro nghịch đảo bằng cách sử dụng 1 lít enzym hạt.
4- Sản xuất L-amino acỉd nhờ enzym aminoacyỉase cố định
Nhu cầu sử dụng L-amino acid trong thực phẩm và y học gia
tâng nhanh chóng. L-amino acid đã được tiến hành nghiên cứu sản
xuất từ công nghệ vi sinh vật hay bằng phương pháp tổng hợp hóa
học. Các amino acid được tổng hợp bằng phương pháp hóa học thường
gặp một số bất lợi do tạo ra cả dạng đồng phân D-amino acid, dạng
đồng phân này không có giá trị dinh đuỡng. Do đó, trong quá trình
sản xuất người ta mong muốn chỉ thu dược dạng đồng phân L trong
sản phẩm cuấỉ.
Công nghệ của công ty Tanabe Seiyaku (Osaka, N hật Bản) được
triển khai để đạt được mục tiêu này. Công nghệ này dựa trên cơ sỏ
của enzym cố định. Nguyên lý chung được thể hiện qua phản ứng dưới
đây (được xúc tác bởi enzym aminoacylase):
D L -R -C H -C O O H L - R - CH -C O O H D -R -C H -C O O H
aminoacylase
h2o + NHCOR' NH2 NHCOR'
+
DL- acylamỉno L- amino D- acylamino
acid add acid
138 Chương 3
_____________________________________________________________________________________________________ _____■______________________________________________________________________ J
Phản ứng này xảy ra trong một thiết bị dạng cột có chứa enzym
aminoaujiase cô" định (H.3.18), L-amino acid mong muốn được tách ra
khỏi dạng acyl D-amino acid dựa trên sự khác biệt về độ hòa tan. Sau
đó D-acylamino acid được racemic hóa thành dạng DL-acylamino acid
để tiếp tục quay trở lại lò phản ứng có chứa enzym aminoacylase cố
định. Quy trìn h tiến hành được trình bày trong hình 3.19.
Đảng điểu khiển

Thiết bị làm khô
' ---------- 9 " liên tục
flow Temp
rate PH
Acetyl-D-
Máy tạo
■— t--------- »— - 4 = J amino acid
Acetyl tinh thể
Tinh thể L
Máy ghi phàn amino acid
ửng tự động
H ình 3,19 Sơ đồ sản xuât L-amino acid sử dụng amino acylase

của công ty Taabe Seiyaku, Nhật Bản
Cnzym cố địn h 139
I- Chibata, T. Tosa và một số cộng sự ở công ty Tanabe Seiyaku

đã có những nỗ lực đáng kê để tìm ra công thức sử dụng enzym cố
định một cách tối ưu nhất. Bảng 3.10 nêu lên một số tóm tắt mà họ
rút ra được khi sử dụng một vài loại enzym cô' định khác nhau.
Bảng 3.10 Tính chất của một vài dạng amỉnoacylase khác nhau
(sử dụng acetyl-DL-ỉnethionin làm cơ chất)
Loại aminoacylase cố đinh

Tỉnh chất
Gắn bằng Gắn bằng liên kết
Aminoacylase Nhốt bằng
Hên kết ion cộng hóa trị
tự nhiên polyacrylamide
(DEAE-sephadex) (iodoacetylcellulose)
pH tối Ưu 7.5-8,0 7,0 7,5-8,5 7,0

Nhiệt độ tối ưu (°C) 60 72 55 65
Năng lượng hoạt
6,9 7,0 3,9 5.3
hóa (kcal/mol)
Co?* tối ưu (mM) 0,5 0,5 0,5 0,5
Km (mM) 5,7 8,7 6,7 5,0
Vmax (nmol/h) 1.52 3.33 4,65 2,33
Quá trình chuẩn bị Dễ Khó Khó
Lực nối Yếu Mạnh Mạnh
Khả năng ỉái sinh Có thể Không thể Không thể
Theo bảng trên, ngoài hoạt tính xúc tác thì còn có rấ t nhiều
yếu tố khác cần phải được cân nhắc khi chọn loại chất xúc tác để sử
dụng trên quy mô công nghiệp. Hiện nay, loại aminoacylase gắn với
DEAE-sephadex bằng liên kết ion được chọn sử dụng bởi vì nó có
hoạt tính cao, dễ dàng chuẩn bị, có khả năng tái sinh và ổn định.
Năm 1978 công ty Tanabe Seiyaku báo cáo rằng công thức này sử
dụng trên năm năm mà không có bất kỳ sự phân hủy hay giảm hoạt
tính đáng kể nào.
Năm 1983 người ta sử dụng enzym acylase được cố định trên
màng siêu lọc, enzym này có vai trò chuyển đổi N-acetyl-D,Lr
methionin thành L-methionin. Sản phẩm enzym cố định này đã được
thương mại hóa. Có rất nhiều ứng dụng khác nhau của enzym cố định
vào các quy trình hóa học đã được khám phá (bảng 3.11). Có một vài
loại enzym cố định đã được thương mại hóa, còn một số hiện đang
được nghiên cứu.
140 Chương 3
5- ứng dụng của lactase cố định

Lactase là'm ột trong những enzym được nghiên cứu ỏ dạng tự do
và cố định trên quy mô lớn. Enzym này cố rấ t nhiều ứng dụng, nhung
do giá thành khá đắt nên người ta khuyến khích sử dụng enzym này
dưới dạng cố định. Lactase cố định rất quan trọng chủ yếu trong việc
xử lý huyết thanh sữa, khi đó chất béo và protein trong nhũ tương sữa
có xu hướng bám lên bề m ặt chất xúc tác sinh học. Điều này sẽ ỉàm
giảm hoạt tính của enzym và làm tăng sự ngoại nhiễm vi sinh vật.
Lactase của nấm men đã được cố định bằng cách kết hợp với các
sợi cellulose triacetate trong suết quá trình kéo sợi ướt, quy trình này
đã dược xây dựng ở Ý. Lactase của KLuyveromyces lactis có pH hoạt
động tối ưu = 6,4-6,8; hoạt tính = 90U/g. Lactase của nấm mốc đâ được
cố định trên silica xốp sử dụng chất hoạt hóa glutaraldehỵde và
g-aminopropyltriethoxysilane (ở Asperigiỉlus niger có pH tối ưu là
3,0-3,5, hoạt tính = 500Ư/g; ở A. oryzae có pH tối ưu là 4,0-4,5; hoạt
tính = 400U/g). Do lactase của nấm mốc và nấm men có pH tối ưu
khác nhau, cho nên enzym của nấm men hoạt động tốt trong huyết
thanh sữa có pH trung tính, còn enzym của nấm mốc hoạt động tốt
hơn trong huyết thanh sữa cổ tính acid.
Lactase cô" định bị ảnh hưởng lớn bởi hai quá trình: ức chế do
sản phẩm tạo thành là galactose và sự hình thành các oligonucleotide
không mong muốn. Cả hai vấn dề này có thể được giảm thiểu bằng
cách gia táng yếu tố hữu hiệu và làm giảm mức độ thủy giải hay nồng
độ lactose ban đầu, nhưng những điều kiện này cũng làm giảm lợi
nhuận kinh tế. Việc kiểm soát tạp nhiễm vi sinh vật trong bioreactor
là một vấn đề thiết thực quan trọng nhất. Trong một vài quy mô, điều
này có thể khắc phục bằng cách thường xuyên làm vệ sinh với các
chất tẩy rửa hay dung dịch protease pha loãng.
6- Sản xuất kháng sinh
Benzylpenicillin và phenoxymethylpenicillin (penicillins G và V)
được tạo ra nhờ quá trình lên men và là những tiền chất chính của
nhiều loại kháng sinh bán tổng hợp, ví dụ như ampicillin. Liên kết
Enzym c ế địn h 141
amide có thể được thủy giải theo cách thông thường nhưng các điều
kiện dể phản ứng thủy giải xảy ra đặc hiệu rất khó đạt được. Phản
ứng thủy giải đặc hiệu này có thể thực hiện dễ dàng bằng cách sử
dụng enzym penicillin amidase (hay còn được gọi là penicillin acylase).
Người ta có thể sử dụng penicillin-V-amidase và penỉcỉỉlỉn-G-amỉdase
để tạo penicillin V và G, phản ứng thủy giải bằng pencillin-V-amidase
thường đặc hiệu hơn phản ứng dùng pencilỉin-G-amỉđase.
Penicillin amidase có thể được thu nhận từ E. coli và được cố
đỉnh trên nhiều loại giá thể khác nhau, cụ thể như sephadex G200
được hoạt hóa bởi cyanogen bromide. Đây ỉà một trong những thành
công sớm nhất về việc sử dụng enzym cấ định để sản xuất kháng
sinh, nó có thể được sử dụng trong những quy trình phản ứng theo
từng mẻ hay bán liên tục với hiệu suất cao (40.000 đơn vị/kg penicillin
G; 35°C; pH 7,8; 2 giờ), có thể sử dụng lại hơn 100 lần. Nổ cũng được
sử dụng trong PBRs (packed’bed reactor) với độ bền hơn 100 ngày, có
thể sản xuất ra 2 tấn 6-aminopenicillanic acid/lkg enzym cố định.
H sQ /CH,3
Hs ° H H ,3 ^ 3 0 HSN+- C - C H /'
H,N*. ì Ỵ-CHj
0 - C - C - N - C - C H ' Ỵ C H 3 +H íO — „_ c _ c -0 +
ỵ C — N — CH — COị o
2
Penicillin-G-amidase có thể được sử dụng dể tổng hợp kháng
sinh penicillin và cephalosporin. Ampicillin đã được sản xuất bằng
cách sử dụng penicillin-G-amidase cố định bằng cách hấp phụ với
DEAE -cellulose trong cột.
CH
H3N+-C -C H / S V -C H 3 H o H ° H H s S\ L n t
I Ị I + <p-9 - c - 0 - c H 3 _ ^ * - c - c - N - ( : - c i i/ Ỵ-C H 3 +H<>CH
C— N — ỏh-co2 J1lj+ '♦ I I Ị
NH3 3 C — N — CH — C0 2 meOianoi
6-aminopenicillanic acid D-phenylglycine methyl ester
o
v ampidlíin
142 Chương 3
--~T~--------
Bảng 3.11 Tóm tắt một vài ứng dụng của enzym cố định
trong các quy trình hóa học
Phản ứng xúc tác Enzym cố định Quy trình hỏa học
Phản ứng oxjhóa-khử L-amino acid oxidase Sản xuất D-amino acid
p-tyrosinase Sản xuất L-DOPA
Sản xuất L-tyrosine
A'-hydrogenase Sàn xuẩỉ prednisolone
Flavoprotein oxidase N-ox^ hóa các loại thuổc có chứa

nhóm amino hay hydrazine
Phản ứng chuyển nhóm Dextransucrase Sản xuất dextran
Phosphorylase Polymer hóa glucose
Polynucleotide Sản xuất polynucleotide

phosphorylase
Carbamate kinase Tổng hợp ATP
Phản ứng thủy giải Ribonuciease Tổng hợp trinucleotide
ct-amylase Sản xuất glucose
Glucoamyiase Sản xuất gh^cose
Cellulase Sản xuất glucose
Invertase Sân xuất đưỡng nghịch chuyển
Leucine amino peptidase Chuyển đổi dạng đổng phân quang

học D và L của amino acid
Carboxy peptidase Chuyển đổi dạng đổng phản quang

Papain Thủy giải casein
Penicillin amidase Sản xuất 6 -aminopenicillanic acid
Tổng hợp penicillin và cephalosporin

Aminoacylase Chuyển đổi dạng đổng phân quang
AMP deaminase Sàn xuất S^ínosinic acid

Phản ứng lyase (tổng Aspartase Sản xuất L-aspartic acid
hợp không dòỉ xửng)
Tryptophanase Sản xuất L-tryptophan
D-oxynitrilase Sản xuất D-mandelonnitrỉle
Phản ứng isomer hóa Glucose iso me rase Sản xuất fructose
3.4.2 M ột số ứ n g d ụ n g của enzym cố đ ịn h tro n g y học và tro n g

p h â n tíc h
Ngày nay, người ta đã tìm ra hơn 120 bệnh về rối loạn chuyển
hóa ở người, đa sô" các bệnh này là do thiếu một loại enzym đặc biệt
nào đó. Ví dự, bệnh phenylcetone niệu (phenylketonuria) do một
khuyết tậ t bẩm sinh về chuyển hóa protein, tạo ra quá mức amino
acid phenylamine trong máu, làm tổn hại hệ thần kinh và đưa đến
chậm phát triển trí tuệ nghiêm trọng. Những người bị mắc bệnh này
thường thiếu enzym chuyển đổi phenylalanine thành tyrosine. Để
chữa trị bệnh này người ta dùng nhiều liệu pháp, trong đó có việc
không được dùng thức ăn có chứa phenylalanine. Ngoài ra, có một
cách có thể sử dụng để chữa trị đó là thay thế enzym chuyển hóa bị
m ất đi. Tuy nhiên, một enzym có chức năng tương tự không có nguồn
gốc từ cơ thể người không thể đưa một cách trực tiếp vào cơ thể bởi vi
nó sẽ gây ra một đáp ứng miễn nhiễm có hại cho cơ thể. Để giải quyết
vấn đề này, người ta cô lập enzym trong các vi hạt, sợi hay gel. Khi
đó, enzym có thể không gây ra đáp ứng miễn nhiễm có hại nào trong
khi cơ chất của nó có kích thước nhỏ có thể đi xuyên qua gel, các lỗ
trên sợi hay màng của các vi hạt. Những enzym có lớp màng bao bọc
này không bị các kháng thể tấn công do có lớp màng không nhạy cảm
với kháng thể, khi đó protein dược tạo thành in vivo trên bề m ặt lớp
màng có vai trò làm giảm ảnh hưởng của cơ chất là phenylalanine.
Cũng theo nguyên tắc này người ta có ý tưởng làm thận nhân
tạo. Trong thiết bị nhân tạo này, urease và hạt resin hấp phụ hay
than chì được kết thành nang với nhau. Khi đó urea sẽ bị urease phân
hủy tạo thành ammonia, ammonia sẽ được hấp phụ trong các vi nang:
khuếch tán urease - + hâP ,ên resin
Urea ------ — — ► urea urease- » HCO3 + NH4 ------ I — 11--------- ►
vào vi nang hay than chỉ
Trong số các thử nghiệm lâm sàng quy mô nhỏ về enzym cố

định, người ta đã tiến hành thử nghiệm trên quá trình chuyển đổi
144 Chương 3
steroid. Cortisol là một loại thuốc hữu dụng trong điều trị bệnh viêm
khớp, cortisol có thể được sản xuất từ một loại tiền chất rất rẻ tiền là
11-deoxycortisol nhờ cột enzym cố định 11-p-hydroxylase. Cũng theo
cách này mà cortisol có thể chuyển thành một loại thuốc chừa bệnh
cao cấp hơn đó là prednisolone khi sử dụng thiết bị phản ứng có chứa
enzym A1 dehydrogenase cô định. Tuy nhiên, hầu hết các quá trình
biến đổi steroid thương mại hiện nay đều được thực hiện nhờ công
nghệ vi sinh vật.
c h 2o h
c- OH
11-b-hydroxytase A1dehydrogenase ,
cố định o cố định ®
11 - deoxycortisol cortisol Prednisolome
Các enzym cố định luôn có

những đóng góp quan trọng trong
phân tích sinh hóa. Một trong
những ví dụ điển hình là điện cực
có mang enzym cố định, điện cực
này cho phép kiểm tra liên tục
một hàm lượng nhỏ chất nào đó.
Trong điện cực urea (H.3.20),
urease cố định phân hủy urea
thành những ion mà có thể dò ra
được nhờ những kỹ thuật điện
hóa học chuẩn. Cũng sử dụng điện Hình 3.20 Điện cực urea có mang
enzym urease cố định trong lớp gel
cực có mang enzym cố định, các
gắn kèm với điện cực thủy tinh
phản ứng sinh hóa có thể được tự
động hóa như trong sơ đồ ò hình 3.21. Khi sử dụng những hệ thống
này cho phép xác định nồng độ glucose hay lactate nhờ những enzym
được cố định trên điện cực này lần lượt là glucose oxidase hay lactate
dehydrogenase.
Máy phát
xung điện
0,2mL/min
Dung dịch lọc
Giá xoay
để mầu
Xilanh 1ml
nén phức hợp
enzym gel
Cột thu
dung dịch
thửa
Máy phát
xung điện
Hình 3.21 Sơ đồ hệ thống phân tích glucose tự động (sử dụng glucose
oxidase) và lactate (sử dụng lactate dehydrogenase cố định)
Dựa trên cách thức này, các điện cực có enzym cố định đă được
chế tạo dùng để kiểm tra nhiều hợp chất quan trọng (bảng 3.12). Gần
đây, phương pháp đo huỳnh quang trên bề mặt rắn cùng đã được xây
dựng đế quan sát các phản ứng enzym trên màng. Bằng cách tiếp cận
này, việc xác định nồng độ của nhiều enzym, cơ chất và các cofactor
có thể tiến hành trực tiếp. Ngoài ra trong sắc ký ái lực, việc cố định
một loại chất nào đó mà có ái lực lớn với một loại chất khác trong
dung dịch cần tinh sạch có ứng dụng rất lớn. Điều này cho phép có
thể tách chiết, tinh sạch hay phân tích các tác nhân kìm hãm enzym,
các cofactor, các kháng nguyên, kháng thể hay các loại cơ chât khác.
Bảng 3.12 Một số chất có thể phát hiện bằng cách sử dựìig enzytn cố địnỉi
Aceỉaldehyde D-galactose Creatine Penicillin
Acetylcholine D-glucose Creatine Một vài loại thuốc
phosphokinase diệt côn trùng
D-alanine D-glutamate L-cysteine L'phenylalanine
Lralanine L-gulono-A.-lactone Dehydrogenase Phosphate
Các hợp chất béo có nitrogen Hypoxanthine Diamine Sulfate
Alkaline phosphatase D-lactose 2-deoxy-D-glucose L-tryptophan
L-arginỉne Lactate dehydrogenase Ethanol L-tyrosine
0 -aspartate L-lactose Formaldehyde Urea
Belzatdehyde NADH L-galactonolacetone Uric acid
Cholinesterase
Chương 4
THU NHẬN ENZYM TỪ NGUỒN THựC VẬT
Thực vật co nguồn enzym đã được loài người hiểu biết và ứng
dụng từ rấ t lâu. Cho đến nay, người ta đã thu nhận enzym từ thực vật
để ứng dụng vào các ngành sản xuất khác nhau chủ yếu là nhóm
amylase và protease.
4.1 THU NHẬN ENZYM AMYLASE
Amylase, một loại enzym có ý nghĩa về m ặt sinh lý, thương mại
và lịch sử còn được gọi là diastase. Enzym này có ở cả thực vật lẫn
động vật. Amylase được tinh sạch từ malt vào năm 1835 bỏi Anselme
Payen và Jean Persoz.
Amylase thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác sự phân giải các
Hên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham
gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành
glucose, maltose và dextrin hạn chế. Amylase trong nước bọt còn được
gọi là ptyalin. Trong nước bọt của người có loại enzym amylase này
nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo.
Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn
tấ t ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy mà đôi khi còn được gọi là
amylopsin. Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành
disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.
Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những
loại enzym được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và
nhiều lĩnh vực kinh tế khác, dặc biệt là trong các ngành công nghiệp
thực phẩm để làm lỏng tinh bột. Amylase được thu nhận từ hạt nảy
mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Trong đó amylase được thu nhận
từ m alt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia.
4.1.1 Đ ặc đ iểm n g u ổ n n g u y ên liệ u
Từ lâu người ta đã biết sử dụng các loại enzym từ hạt nảy mầm
để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải
khát (bia),... hoặc sản xuất các hỗn hợp bột enzym gồm amylase,
protease để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già,
nhữn g ngưưi bị suy tiê u hóa.
Thu n h ậ n enzym từ n g uồn thực v ậ t 147
Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm,
sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzym được gọi
là malt. Malt có thê được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại
mạch, lúa, ngô, dậu,... mà chủ yếu là từ đại mạch, lúa....
2- Đại mạch (Hordeum sativum)
Đại mạch có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4, 6 hàng),
trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia,
những loại còn lại được dùng làm thức ăn gia súc và các mục đích
khác. Malt đại mạch là nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia.
Khoảng 1/3 sản lượng hạt đại mạch trên toàn thế giới được sử dụng
để sản xuất malt. Hạt đại mạch hình bầu dục, được bao bọc bởi lớp vỏ
trấu, trên bụng có rãnh, trên ngọn có râu.
Bảng 4A Thành phần dinh dưỡng của đại mạch
Thành phẩn dinh dưỡng Thành phẩn % Thành phần dinh dưỡng Thành phẩn %
Protein 11,6 Cellulose 6
Tinh bột 69,4 Khoáng 2-3
Lipid (tổng số) 2 Nước 11
(Số liệu cung cấp bởi Viện Nông nghiệp thuộc Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, 2003).
Yêu c ẩ u về th à n h p h ầ n củ a đ ạ i m ạch cần th iế t cho việc *
sả n x u ấ t m alt
Nước: độ ẩm trung bình của hạt đại mạch là 10-14%. Nếu vượt
quá độ ẩm này thì sẽ khó bảo quản do dễ bị hư hỏng do nấm mốc tấn
công, còn nếu độ ẩm giảm xuống thấp hơn 10% thì hạt sẽ bị giảm khả
năng nảy mầm.
Tinh bột: trong tinh bột đại mạch có khoảng 17-24% amylose và
76-83% amylopectin. Nếu hàm lượng tinh bột trong hạt đại mạch cao
thì khi đến giai đoạn đường hóa trong quá trình sản xuất bia, lượng
đường hòa tan trong dịch đường sẽ cao, hiệu suất thu hồi bia và chất
lượng bia sẽ cao.
Tinh bột đại mạch có trọng lượng riêng: 1,63%; nhiệt độ hồ hóa:
80°C; kích thước hạt tinh bột: 2-10 hay 20-30ụ.
148 Chương 4
Protein: protein có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sản xuất
m alt và sản xuất bia. H ạt đại mạch có hàm lượng protein khoảng
10-12% (tính theo chất khô) là tốt nhất cho sản xuất bia, không nên
cao hơn 12% và cũng không nên thấp hơn 9-10%.
Các sản phẩm thủy phân, của protein rất quan trọng đối với sự
t
nảy mầm của h ạt đại mạch, sự tổng hợp các enzym trong quá trình nảy
mầm, là thành phần cần thiết cho sinh sản và phát triển của nấm men
bia, góp phần vào việc tạo màu sắc, tạo bọt và giữ bọt cho bia.
Các emym: cấc enzym có vai trò rất quan trọng, nó tham gia xúc
tác tấ t cả các phản ứng sinh hóa trong suốt quá trình sản xuất malt
và sản xuất bia. Trong hạt khô, enzym phần lớn ở dạng liên kết,
chúng chỉ được giải phóng và hoạt động khi hạt đi vào gỉaỉ đoạn nảy
mầm và các quá trình đường hóa sau đó.
Các enzym thủy phân tinh bột: chủ yếu là amỵỉase gồm có
a-amýlase và P-amylaset ngoài ra còn có maỉtase, sitase, invertase....
Các enzym thủy phân protein: protease, peptidase, amidase thủy
phân protein thành các sản phẩm trung gian như peptide,
polypeptide, pepton,... và đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid.
Ngoài ra còn các enzym khác như enzym oxy hóa khử hoạt động
trong quá trình hố hấp cửa hạt.
Ngoài ra còn có cellulose, hemicellưlose tập trung ở vỏ hạt,
pentozan, đường, đặc biệt là saccharose (chiếm khoảng 1,8% chất khô
hạt), các chết chát, chất đắng đa phần tập trung ở phần vỏ hạt, các
chất khoáng....
Quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển các enzym
từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời
còn tổng hợp nên hàng loạt các enzym mới và trong giai đoạn này cần
chú ý không làm giảm nhiều chất khô của h ạ t bằng cách đảo trộn
thường xuyên dể tạo độ thoáng khí. H ạt đại mạch trước khi ngâm
không cổ hoạt lực của enzym a-amylase. Khi h ạt trải qua 3-4 ngày
trong giai đoạn nảy mầm thi hoạt lực của enzym a-amylase tăng lên
và dạt đến mức cực đại vào ngày thứ 7, sau đố sẽ giảm xuống.
Thu n h ậ n enzym từ n g u ồ n thực v ậ t 149
Quá trình nảy mầm của hạt ỉà quá trình sinh hóa rất phức tạp.
Các enzym được tạo ra trong giai đoạn nảy mầm để thủy phân các
chất cao phân tử thành các hợp chất và các chất đơn giản hơn, đồng
thời giải phóng năng lượng cho quá trình nảy mầm. Loài người biết sử
dụng quá trình tổng hợp enzym này để sản xuất bia.
2- Lúa (Oryza sativa L.)
Lúa là một loại cây lương thực quan trọng đối với hơn 1/2 dân số
thế giới, Lúa được trồng nhiều ở Ấn Độ và vùng Đông Nam Á. Thời
gian sinh trưdng của lúa từ 75-250 ngày tùy theo chủng loại. Hiện
naỵ}Việt Nam là nước xuất khắu lúa đứng hàng thứ hai trên th ế giới.
a- Cấu tạo hạt lúa
Vỏ trấu: được cấu tạo từ các hợp chất cellulose và silic. vỏ trấu
rấ t cứng giúp bảo vệ hạt chống lại sự tấn công của côn trùng, mầm
bệnh và những điều kiện thời tiết bất lợỉ. Trên vỏ trấu có các đường
gân nổi lên rấ t rõ và màu sắc của vỏ trấu (từ vàng nhạt đến vàng
nâu) tùy thuộc vào giấng lúa. Ở đầu mảnh dưới của vỏ trấu có ba mũỉ
nhọn, mũi ở giữa nhọn và bén hơn hai mũi bên. Đầu mảnh trên có
một mũi nhọn, mũi giữa của mảnh dưới hợp với mũi của mảnh trên
tạo thành mỏ của hạt.
Màng lúa: có chiều cao bằng khoảng 1/3 vỏ hạt. Độ dài của
màng phụ thuộc vào giống lúa và điều kiện canh tác. Màng lúa có
màu nhạt và hồng hơn vỏ trấu.
Vỏ hạt: có màu trắng dục hay màu đỏ, bọc xung quanh hạt gạo
và mỏng như lụa. vỏ hạt có cấu tạo bên ngoài là lớp biểu bì, trong là
tầng trung quả và trong cùng là nội biểu bì.
Nội nhũ: là phần lớn nhất trong hạt lúa. Thành phần chủ yếu là
glucid chiếm đến 90%, còn lại là protein, vitamin....
Phôi: phôi có một tử diệp nằm ở góc hạt, ép sát vào nội nhũ.
Đây là cơ quan biến đổi các chất dự trữ trong nội nhũ thành chất dinh
dưỡng cung cấp cho sự phát triển của cây mầm.
b- Thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo thay đổi tùy theo giống,
điều kiện canh tác, điều kiện đất dai.
150 Chương 4
Bảng 4,2 Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo
Thành phẩn Hàm Thành phẩn Hàm

Đơn vị tính Đơn vị tính
dinh dưỡng IƯỢng/100g dinh dưỡng lượng/1 0 0 g
Protein g 6 Cellulose g 0.6
Tinh bột g 82 Nưởc g 10,2
Lipid (tổng số) g 0,8 Năng lượng kcal 361
(Viện Nghiên cửu Dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan, 1999)
Nước: trong hạt thóc nước ở dạng tự do lẫn dạng liên kết. Hạt
lúa càng già lượng nước trong hạt càng giảm. Lượng nước trong hạt
lúa có liên quan và ảnh hưởng đến chất lượng của lúa và gạo.
Glucid: trong tinh bột có hai thành phần chính là amylose và
amylopectin. Tỷ lệ amylose và amylopectin thay đổi tùy theo giống
lúa. Trong gạo tẻ chứa trung bình 19,5% amylose và 81,5%
amylopectin; trong nếp có chứa .0,7% amylose và 99,3% âmylopectin.
Trong vỏ trấu và vỏ hạt còn có cellulose và hemicellulose, đây là
những polysaccharide không tiêu hóa được.
Protein: trong gạo, hàm lượng protein chiếm khoảng 8-9%.
Lượng protein thoái hóa và biến tính dần trong quá trình bảo quản.
Protein khi kết hợp với nước sè trương nở thành thể keo.
Lipid: lượng lipid trong hạt lúa, gạo chiếm khoảng 2%.
Vitamin: trong hạt lúa có chứa nhiều loại vitamin như: Bl, B2,
pp, B6, H, c , E, carotenoicL
Amino acid: trong hạt lúa có nhiều amino acid tự do, đó là
những sản phẩm trung gian khi tổng hợp hoặc thủy phân protein.
Các enzym: các enzym trong hạt lúa là amylase (a-amylase và P-
amylase), protease và một số enzym oxy hóa khử khác.
Trong quá trình nảy mầm hoạt động của các enzym tăng cao
thúc đẩy cho các phản ứng sinh lý, sinh hóa xảy ra trong hạt. Trong
quá trình nảy mầm, các quá trình sinh tổng hợp các loại enzym và các
quá trình sinh hóa gần giống ở đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo
thành enzym và tốc độ phản ứng.
Thu n h ậ n enzym từ nguồn thực v ật 151
Khi h ạt chưa nảy mầm, các enzym tồn tại ở dạng liên kết. Khi
hạt nảy mầm, các enzym này chuyên sang dạng hoạt động và còn có
sự hình thành một số enzym mới ở phôi.
3- Ngô (bắp) (Zea mays)
Có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có
màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện
diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ. Ngô màu hồng
(đỏ) là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin.
a- Thành phần dinh dưỡng của hạt ngô
Bảng 4.3 Thành phần dinh dưỡng của hạt ngô
Thành phẩn dinh Thành phấn dinh
Bắp nếp Bắp ngọt ■ Bắp nếp Bắp ngọt
dưdng g/1 0 0 g dưỡng g/1 0 0 g
Protein 9,1 12,9 Cellulose 1,8 2.9
Tinh bột 72,8 69,3 Nước 11.2 9,5
Lipid (tổng sổ) 2,2 3.9 Khoáng 2,9 1,5
(Cortez và Wild-Altamirano, 1972),

b- Cấu tạo của hạt ngô
Vỏ quả (ở lớp ngoài cùng) gồm 12-14 dãy tế bào, dày 0,3|.im,
chiếm 5-7% khối lượng hạt. Thành phần của vỏ quả chủ yếu là
cellulose, pentozane.
Vỏ hạt: mỏng, chiếm 2% khối lượng hạt. Thành phần của vỏ hạt
chủ yếu cũng là cellulose, pentozane.
Lớp aỉeurone: gồm một lớp tế bào có kích thước lớn bằng hai tế
bào khác, chiếm 6-8% khối lượng hạt. Thành phần của lớp aleurone là
cellulose, protein, chất béo và ít nguyên tô tro.
Phôi: chiếm 10-11% khối lượng hạt. Thành phần của phôi gồm
có: chất béo (33-45%), protein (20%), đường và tro (7,5%), tinh bột
(59É), cellulose (4%).
Phôi nhữ: phôi nhũ chiếm 75% tổng kho'i lượng hạt. Các thành
phần trong nội nhũ bao gồm: tinh bột (77-84%), protein (7-11%), chất
béo (1%), đường (1%), tro (0,3-0,8%), cellulose (0,590.
Trong ngô vàng có chứa 9mg caroten/kg hạt ngô.
152 Chương 4
N£ô trắng dùng để thay thế malt dại mạch trong sản xuất bia
do có hàm lượng tinh bột cao và protein thấp. Protein của ngô chủ yếu
thuộc nhóm prolamin và gluten rấ t khó hòa tan, hiệu suất thủy phân
thấp và phần lớn bị thải ra ngoài. Ngô được sử dụng trong sản xuất
bia dưới dạng bột đã được nghiền nhỏ.
Tuy nhiên có khi sử dụng ngô trong sản xuất bia, ngườỉ ta gặp
một trở ngại lớn là phôi hạt quá lớn, thành phần chất béo cao, khó
lọc và làm ảnh hưỏng không tốt đến độ bền keo và khả năng tạo bọt
của bia. Vì vậy, để có thể giảm được vấn đề này cần phải tách vỏ và
phôi h ạt trước khỉ đưa vào chế biến dịch đường.
Để có thể thực hiện được công đoạn này, hạt ngô phải được
ngâm trong nước ấm 50°c cổ chứa S02 nồng độ 0,1-0,2% trong thời
gian 30-50 giờ. Sau khi ngâm, hạt mềm ra và dễ dàng tách được phôi
nguyên vẹn. S02 được sử dụng với mục đích ngăn ngừa sự phát triển
của v s v và làm cho màng protein bị phân hủy và khuếch tán vào
dung dịch. Sau khi ngâm, hạt ngô được thủy giải đến 45%, sau đó được
dưa vào thiết bị nghiền thô để tách phôi rồi đưa vào thiết bị nghiền
mịn để thu ngô ở dạng bột.
4.1.2 T ính ch ấ t của enzym amylase
Tinh bột bị thủy phân trong suốt quá trìn h nảy mầm của hạt
ngủ cô'c nhờ vào hoạt động của các loại enzym thủy phân mà
quan trọng n h ấ t là enzym amylase. Mặc dù a-am ylase đóng vai
trò chủ yếu trong sự phân cắt phân tinh bột nhttag còn cần phải
có m ột sự phôi hợp giữa a-amylase, p-amylase, một loại enzym cắt
nhánh, và a-glucosidase để thủy phân hoàn toàn tinh bột.
Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó a-amylase,
(5-amylase, Ỵ-amylase (hay glucoamylase) thủy phân các liên kết
a-l,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide dồng loại.
Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-
glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase)
thủy phân các liên kết a-l,6-glucoside. Sáu loại amylase này được xếp
thành hai nhóm: endoamylase (enzym nội bào) và exoamyỉase (enzym
ngoại bào).
Thu n h ậ n enzyra từ nguổn thực v ật 153
Endoamyỉase: gồm có a-amylase và nhóm enzym khử nhánh.

Nhóm enzym khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp
là pullulanase (hay a-dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là
transglucosylase (hay oligo-l,6-glucosidase) và amylo-l,6-glucosidase.
Các enzym này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi
polysaccharide.
Exonuclease: gồm có P-amylase và Ỵ- amylase. Đây là những
enzym thủy phân tỉnh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Amylase
Exoamylase Endoamylase
p-amylase y-amylase Enzym khử nhánh a-amylase
Khử trực tiốp Khử gián tỉếp

a-dextrin 6 -glucanohydrolase oligo-1 ,6 -glucos»dase
(pulĩulanase) (transglucosylase)
và amyto 1 ,6 -gíucosỉdase
Hình 4.1 Các loại enzym endoamylase và exoamyỉase
Trong kiểu phân cắt gián tiếp (amylo 1,6-glucosidase), trước hết cần
phải loại bỏ một oligosaccharide bởi transglucosidase, để lại một glucose
liên kết với một tetrasaccharide tạo thành liên kết 1,6-glycoside.
Các dạng amylase không chĩ khác nhau ở đặc tính mà còn khác
nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt. Tốc độ phản ứng của
amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polymer hóa của cơ chất.
Các enzym amylase từ các nguồn khác nhau sẽ cổ tính chất, cơ chế tác
dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.
Amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có thành phần, tính chất,
nhiệt độ hoạt động, pH tối Uli và các đặc điểm thủy phân khác nhau.
154 C hương 4
1- H o ạ t đ ộ n g c ủ a a m y la s e
Tinh bột (/.-amylase

Dextrin + oligosaccharide
Dextrin không nhánh

Pullulanase
Dextrin p-amyiase
/ am yiase
O H" +
Amylase phân cắt Amylase phản cắt

ư- 1 ,4-glucoside </-1 ,6 -glucoside
Iiỉn h 4.2 Iỉoạt (ỉộng phàn cắt liên kết a-1,4 và a-l,6-glycosìde của amylase
2- C ơ c h ấ t c ủ a a m y la s e
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

a- Tinh bột
Tinh bột là nhóm carbohydrate ơ thực vật có chủ yếu trong các
loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì,... trong các loại ngủ cốc,
cac loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H1206)„. Tinh bột từ mọi
nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin (Meyer,
1940). Các loại tinh bột đều có 20-30# amylose và 70-80tf
amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem như là chất dự trử
năng lượng quan trọng. Ví dụ, tinh bột có trong củ và hạt quả được
xem như là chất dự trừ năng lượng cho quá trình nảy mầm, tinh bột
cu dược xem như chất dự trừ cho cây khi gặp khó khăn và cho cá quá
trình náy mam (củ khoai tây, khoai mì, khoai lang...).
Amy lose có trọng lượng phân tứ 50.000-160.000, được cấu tạo từ
200-1.000 phân tử D-gỉucose nối với nhau bởi liên kết u-l,4-glucoside
tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh.
Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục

triệu, dược câu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose, nôi với nhau bởi
liên kết a-l,4-glucoside và a-l,6-glucoside tạo thành mạch có nhỉều
nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh
bột bị đun nóng (60-85°C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ
tinh bột. Dưới tác dụng của enzym amylase, tinh bột bị thủy phân do
các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzym
amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của
sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp
tục bị đường hóa thì sản phẩm sẽ là maltose và glucose.
Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng
quan trọng cho cơ thế con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp
tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành
disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại
thực phẩm nhưng nguồn cung câjp chủ yếu là đường và tinh bột.
6- Glycogen
Glycogen là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật được dự
trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ
từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế
bào động vật, vsv. Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với
nhau bởi liên kết a-l,4-glycosiđe. Ở các vị trí phân nhánh, glucose
nổì với nhau bằng liên kết a-l,6-glycoside. Glycogen có sô" mạch
nhánh nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu - 3
triệu. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều
carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất
béo để dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ỏr
trong gan.
3- Các loại amylase
Or a-amylase (1,4-a-gỉucan 4-gỉucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)
a-amylase Cỏ khả năng phân cắt các liên kết a-l,4-gkỉcoside
của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzym nội bào (endoenzym).
a-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có
khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn.
Ctf chế tác dụng của a-amylase
Sự thủy phân tinh bột của a-amyỉase trải qua nhiều giai đoạn
- Trước tiên enzym này phân cắt một số liên kết trong tinh bột
tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị
thủy phân tiếp tục để tạo ra maltose và glucose.
156 Chương 4 ,
- Amylose bị phân cắt thàn h các oligosaccharide hay còn gọi

là polyglucose (6-7 gôc glucose) dưới tác dụng cỏa a-amylase, sau đó
các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần
và tạo th à n h m altotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác
dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amyỉose là 13% glucose
và 87% maltose.
Tác dụng của a-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự
và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có
dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do a-amylase không thể cắt
được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của a-amylase:
Gỉcũ đoạn dextrin hóa:
a-amylase
Tinh bột ------ — ► dextrin phân tử lượng thấp
Giai đoạn đường hỏa:
a-amylase
Dextrin ----------- ► tetra- và ỉrimaltose----------- ► di- và monosaccharide
a-amylase
Amylose * oligosaccharide----- ■■■» polyglucose
ị
Maltose ----------- mattotriose +— ----- maltotetrose
Khả năng dextrin hóa của a-amylase rấ t cao do đó người ta còn

gọi a-amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
ÒOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO&
A oooỹooooõi* Sóoooõoooo b
&00ÔÕỈ booooohôooooob Ấ0000Ẳ
Aỹoổ&i òoopòtei Aoorooophitx& Sõl
ỉỉ ỉỉ ®Ỉ1 ỉ ỉ ỉi® ỉ ỉ ỉ ỉ ỉ ỉ
a) amylase b) amylopectin
Hình 4.3 Cơ chế tác động của a-amyla&e ỉên tinh bột
a) amylose; b) amylopectỉn
Thu n h ậ n enzym từ ng uổn thực v ậ t 157
Đặc tính: a-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần

amino acid khác nhau, mỗi loại a-amylase có một tổ hợp amino acid
đặc hiệu riêng, a-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan,
acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm
khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzym. a-
amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của a-amỵỉase malt là 59.000kDa (Knin,
1956; Fischer, Stein, 1960).
- Amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các amyỉase có tính acid yếu và có tính chất
cửa globuline.
- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7 (Bemfeld p, 1951).
- a-amylase là một metaloenzym. Mỗi phân tử a-amylase đều có
chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử
gam/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3
của enzym, duy trì hoạt động của enzym (Modoỉova, 1965). Do đổ, Ca
còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzym khỉ bị tác động bởi các tác
nhân gây biến tính và tác động của các enzym phân giải protein. Nếu
phân tử a-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị m ất hết
khả năng thủy phân cơ chất, a-amylase bền với nhiệt độ hơn các
amylase khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm ỉượng Ca trong
phân tử. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng
như Cu2+’ Ag+, Hg2\...
- Điều kiện hoạt động của a-amylase từ các nguồn khác nhau
thường không giông nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của
a-amylase từ malt khác với a-amylase từ vsv. pH tối thích cho hoạt
động của a-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có
thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7-5,4).
- Độ bền với acid của a-amylase malt kém hơn so với độ bền của
a-amylase nấm môc.
- Độ bền của a-amylase bị ảnh hưông bởi nhiệt độ và pH. Tuy
nhiên so với các loại amylase khác thì độ bền với nhiệt của a-amylase
cao hơn. ở 0°c và pH 3,6, a-amylase của malt hoàn toàn bị m ất hoạt
tính, a-amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ồ nhiệt độ
158 Chương 4
58-60°C. Do đó trong sản xuất rượu, người ta thường dùng malt để

đường hóa cơ chất ở nhiệt độ 60-65°C.
Bảng 4.4 Độ bền với. nhiệt độ của a-amylase từ malt
(Miller, Johnson và Palmer)
Nhiệt độ Hoạt độ cửa a-amylase Nhiệt độ Hoạỉ độ cùa a-amylase

Í°C) (%) so với ban đẩu (°C) , (%) so với ban đầu
65 100 80 25
70 100 85 1
75 58 90 0
b- p-am ylase (1,4-a-gỉucan-maỉtohydrolase) (EC 3.2,1.2)

p-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy
mầm. Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, p-amylase xúc tác sự thủy phân
các liên kết a-l,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân
cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose được tạo
thành do sự xúc tác của p-amylase có cấu hình p.
ở ngũ cốc, p-amylase tham gia vào sự phân giải tinh bột trong
quá trình nảy mầm của hạt. Ở lúa, p-amylase được tổng hợp trong hạt
suốt quá trình nảy mầm của hạt và hầu như không được tổng hợp ở
hạt khô. Ở lúa mạch, enzym có m ặt à trong hạt khô, nó được tích lũy
trong suốt quá trình phát triển của hạt và chủ yếu là liên kết với tinh
bột của hạt. Khi ỏ dạng liên kết, enzym này là một phân tử có trọng
lượng phân tử là 64kDa và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được
phóng thích dưới dạng tự do và có trọng lượng phân tử là 59kDa.
Wang và cộng sự (1996) tìm thấy ở thực vật có một hormone
gián tiếp kích thích sự biểu hiện gen của p-amylase ở lúa và ông
thấy rằng gibberellin không làm tăng sự hoạt động của enzym
p-amylase, trong khi đó abscisic acid lại cản sự hoạt động của enzym
này và sự tích lũy mRNA.
Cơ chê tác dụng của p-amylase: p-amylase là một enzym ngoại bào
(exoenzym). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các
nhánh ngoài cùng của cơ chất, p-amylase phân cắt các liên kết a-1,4
glucoside nhưng khi gặp liên kết a-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết
a-1 ,6 glucoside th ì nó sẽ ngừng tá c dụng. P h ầ n p o ly sacch arid e còn lại
Thu n h ậ n enzym từ n g uổn thực v ật 159
là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết a-1,6 glucoside và
được gọi là p-dextrin.
H ìn h 4,4 Cơ chế tác động của p-amylase ỉên tinh bột
Tác dụng của p-amylase lên tinh bột như sau:

p-amylase
Tinh bột ---------------► maltose (54-58% ) + p-dextrin (42-46% )
(glucogen)
Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả a và p-amylase thì
lượng tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95%.
Sự khác nhau giữa a và p-amylase khi xúc tác sự thủy phân tinh bột:
- P-amylase hầu như không thủy phân các hạt tinh bột nguyên
vẹn nhiừig nó phân hủy hồ tinh bột rất mạnh.
- P-amylase phân giải 100% amylose thành maltose.
- P-amylase phân giải 54-58% amylopectin thành maltose.
Đặc tính:
- p-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm -SH,
nhóm -COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là enzym
ngoại bào (exoenzym).
- p-amylase không bền khi có Ca2+, p-amylase bị kìm hãm bởi
Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodin, ozon....
- p-amylầse chịu nhiệt kém hơn a-amylase nhưng bền với acid
hơn. p-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70°c. Nhiệt độ hoạt động tối
thích của p-amylase là 55°c, pH 5,1-5,5.
160 Chương 4
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- JT“*------------------
a-amylase cùng với P-amylase có trong mầm của lúa mạch. Tuy
nhiên, trong công nghiệp người ta sản xuất kmylase từ tụy tạng động
vật hoặc từ nuôi cấy vsv.
c- ỵ-amylase (glucoamyỉase hay a-l,4-gỉucan-glucohydrolase) (E.c.3.2.1.3)
Glucoamylase cố khả nâng thủy phân liên kết a-1,4 lẫn a-1,6
glucoside. Khi thủy phân liên kết a-l,4-glucan trong chuồi polysaccharide,
Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử
của mạch để tạo ra glucose. Enzym này có nhiều tên gọi khác nhau:
a-l,4:l,6-glucan-4:6-glucohydrolase; glucoamylase; amylogỉucosỉdase; taka-
amylase B; y-amylase; maltulase,.... glucoamylase là enzym ngoại bào.
Ngoài các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucoside, glucoamylase còn có
khả năng thủy phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 glucoside.
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột,
glucogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành
glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác.
Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so
với các chất có phân tử nhỏ. Các polysaccharide có nhánh như
amylopectin, glucogen, p-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5-5,5 và
nhiệt độ 50°c. Nó bền với acid hơn a-amylase nhưng kém bền hơn
trong nibu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+.
d- Oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn
(dextrin-6-glucanhydrolase) (E.c.3.2. L 10)
Enzym này thủy phân liên kết a-l,6~gỉucoside trong isomaltose,
panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men dược.
Enzym này này có ồ v s v nhưng đồng thời cũng cổ trong hạt nảy mầm
(đại mạch, thóc nảy mầm). Ngoài oligo-l,6-glucosidase, hệ dextrinase
của h ạ t ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin -1,6-glucosidase hay R-
enzym (E.c.3.2.1.9) và dextrin- 1,6-glucosidase hay amylo -1,6-
glucosiđase hay dextrin-6-glucanhydrolase (E.c.3.2.1.33). Hai loại
Thu n h ậ n enzym từ ng u ổ n thự c v ậ t 161
enzym này đều thủy phân dextrin triệt để hơn a và p-amylase do đó

trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrìnase là 40°c và
pH tối thích là 5,1.
4.1.3 Phường pháp th u nhận amylase

1- Phương pháp thu nhận
CL- Malt đại mạch
Malt là từ chĩ trạng thái hạt đã nảy mầm. Quá trình sản xuất
malt gồm các bước sau: ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi,
tách mầm, bảo quản malt khô.
Yêu cầu về nguồn nguyên liệu
- H ạt cổ màu vàng vàng óng ánh, thơm mùi rạ tươi.
- Hạt phải thuần, tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5%. Không
có hạt bị bệnh.
- Vỏ h ạt < 7-9% trọng lượng hạt. Trọng lượng 1000 hạt khoảng
40-44g.
- Sức nảy mầm (qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm): 80-90%.
- Khả năng nảy mầm (tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy
mầm): > 95%.
- Độ ẩm hạt khoảng 15%.
- Dung trọng: 650-680g/L
- Hàm lượng protein: 9-12%.
- Hàm lượng tinh bột > 63-65%.
Sản xuất malt
Các bước trong quy trình sản xuất malt đại mạch
Đại mạch »» Làm sạch, phân loại --------► ■ Sấy bảo quàn Ngâm hạt
1
Malt khô + -------- Tách mẩm rễ --------- sấy malt ---------- Mait tươi -------- ủ mầm
Ngâm hạt: hạt đại mạch được'ngâm trong nước sạch cho đến
khi đạt đến sự cân bằng về ẩm độ. Chú ý đến sự thông khí trong
khôi h ạt bằng cách đảo trộn khối hạt thường xuyên. Mục đích của
giai đoạn này là tạo độ ẩm cho hạt trong điều kiện có đầy đủ 02 và
162 Chương 4
đẩy C02 và các sản phẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của hạt ra
khỏi khối hạt.
Khi ngâm hạt, nước sẽ thấm vào hạt làm tăng thể tích hạt. Các
enzym ở trạng thái không hoạt động chuyển sang trang thái hoạt
động và hoạt tính của enzym sẽ mạnh dần và thủy phân các chất dự
trữ có phân tử lượng cao ở trong hạt thành các chất có phân tử nhỏ
hơn như đường, amino acid. Vì vậy, cần phải luôn luôn chú ý đến sự
thông khí, độ ẩm hạt và nhiệt độ.
H ạt đại mạch khô hầu như không có hoạt lực của a-amylase.
Khi h ạ t chuẩn bị nảy mầm thì xuất hiện hoạt lực của a-amylase và
hoạt lực này tăng dần. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 của quá trình nảy
mầm (nhiệt độ 18-20°C), hoạt lực này đạt đến mức tối đa, sau đó
giảm xuống. Vào lúc hoạt lực của enzym dạt đến mức tối đa thì phải
ngừng quá trìn h nảy mầm bằng cách sấy h ạt đang nảy mầm ở nhiệt
độ thích hợp. Một số chỉ tiêu malt tươi phải đạt được:
- Mùi vị: có mùi dưa chuột
- H ạt malt mềm, bóp vụn được nhưng không được nhão, dính tay
- Chiều dài mầm bằng từ 2/3 )Cho đến bằng chiều dài hạt
Chiều dài rễ bằng từ 1/2 đến hai lần chiều dài hạt
Hoạt độ của enzym amylase: °WK - 350-450
Sấy malt: sấy malt với mục đích làm gỉảm độ ẩm malt và điều
khiển malt khô có được thành phần hóa học, màu sắc, mùi vị thích
hợp, đồng thời phải đảm bảo được hoạt tính của malt để đưa vào sản
xuất bia.
Trong quá trình sấy, ở giai đoạn đầu khi độ ẩm h ạt còn khá cao
và nhiệt độ còn thấp (37-40°C) thì các hoạt động thủy phân do enzym
vẫn còn xảy ra và đôi khi còn mạnh hơn cả trong giai đoạn hạt đang
nảy mầm vì đây là điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của
nhiều loại enzym. Khi độ ẩm hạt còn cao mà nhiệt độ sấy táng cao thì
protein enzym sẽ bị biến tính làm ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzym. Vì vậy, khi độ ẩm hạt còn cao thì cần phải sấy ở nhiệt độ
thấp. Khi độ ẩm hạt giảm xuống đến mức cho phép (mức độ an toàn
cho enzym) thì mới bắt đầu tăng nhiệt độ sấy nhưng nhiệt độ sấy
không làm xảy ra hiện tượng caramel hóa, phản ứng melanoidin....
Đặc điểm chất lượng của malt đại mạch khô sử dụng trong sản
x u ấ t bia
- Màu malt phải vàng tươi, vỏ óng ánh
- Kích thước, hình dạng tương tự như hạt đại mạch khô
- Malt có vị ngọt dịu, nhẹ
- Không lẫn tạp chất, hạt không bị vỡ
- Dung trọng: 530-560g/l
- Trọng lượng khô tuyệt đối của 1000 hạt: 28-38g
- Thành phần hóa học:
+ Độ ẩm khi vừa sấy xong < 4,5%
+ Đô ẩm tối đa cho phép trong giai đoan bảo quản: 7%
+ Thời gian thực hiện đường hóa: 10-15 phút
+ pH dịch đường: 5,5-6,5 J
+ Thành phần malt khô (% chất khô): Tinh bột: 5; pentozan
hòa tan: 1,0; hexozan và pentozan không hòa tan: 9,0; cellulose: 6,0;
saccharose: 5,0; đường khử: 4,0; protein: 10,0; protein hòa tan: 3,0;
chất béo: 2,5; tro: 2,5.
Thu nhận, xử lýf
làm sạch, phân
(K h ôn g k h í)
sấy khô Đảo quản Tách mẩm rễ
Nguyên liệu chuẩn bị nguyên liệu chế tạo malt
H ìn h 4,5 Sơ đồ dây chuyền sản xuất

malt đại mạch
b- M alt thóc
Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ồ vùng ôn đới có khí hậu lạnh. Ở
những vùng nhiệt đới người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, báp
để thay th ế một phần hay toàn bộ malt đại mạch.
Các bước trong quy trình sản xuất malt thóc:
164 Chương 4
Trong quá trình nảy mầm của hạt, các enzym như amylase,
protease... hoạt động m ạnh xúc tác cho các biến dổi sinh lý, sinh hóa
trong h ạt như thủy phân các chất cao phân tử như tinh bột, cellulose,
protein th àn h những chất đơn giản hơn. Quá trình nảy mầm xảy ra
khi h ạt có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt dộ.
Ngăm hạt: trong hạt lúa khô có sẵn một lượng nước ở dạng liên
kết. Nước từ bên ngoài khi thấm vào hạt sẽ hòa tan các chất dự trữ,
hoạt hóa các enzym xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân
tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng
trưởng của phôi để hình thành cây mầm. Phôỉ là nơi hút nước mạnh
nhất. Tốc độ hút nước rất mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch
áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào
bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rấ t mạnh,
càng về sau, sức hút nước của hạt càng giảm.
ủ hạt: việc ủ hạt trải qua ba giai đoạn
Giai đoạn 1: kéo dài ba ngày, ở ngày thứ ba h ạt bắt đầu nảy
mầm, nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh.
Khối h ạt cần được đảo 2-3 lần/ngày.
Giai đoạn 2: kéo dài ba ngày. Lúc này chồi mầm và rễ mầm
tăng trưỏng mạnh, nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt dộng
hô hấp cao. Khôi hạt cần được đảo 2-3 lần/ngày.
Giai đoạn 3: những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm
dần, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2-3 ngày/lần
Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của hạt
Khi nước từ bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử
bên trong h ạt thấm nước và trương lên, các enzym thủy phân hoạt
động phân cắt các chất này thành những chất đơn giản hơn ồ trạng
thái hòa tan. Các chất này một phần được chuyển đến để nuôi phôi,
một phần bị tiêu hao do hoạt động hô hấp và phần lớn được sử dụng
để chuyển hóa thành những hợp chất cao phân tử mới ở các mô của
cây mầm. Hoạt động hô hấp trong hạt cần dược cung cấp c>2, đồng
thời thải ra khí C02 và tỏa nhiệt làm cho nhiệt độ của khối hạt tăng
cao, do đó cần phải chú ý đảo trộn khôi hạt.
Hoạt động của enzym: trong hạt khô, enzym ở dạng liên kết và
chúng được, chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm.
Ngoài ra, còn có một số enzym được tổng hợp mới. Các enzym hoạt
động trong quá trình nảy mầm của hạt lúa:
a-amylase: enzym này hoàn toàn không hoạt động ở hạt chín.
Hoạt tính của enzym a-amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm
của hạt. Ở nhiệt độ 15-17°c, hoạt tính của a-amyỉase đạt đến cực đại
vào ngày thứ 10-12 của quá trình nảy mầm; ở nhiệt độ 28-30°C, hoạt
tính của a-amylase đạt cực đại ở ngày 5-8.
p-amylase: enzym p-amylase tồn tại ỏ dạng liên kết và một số ít
hoạt động rất yếu trong hại; chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng lên
trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian dể hoạt động của enzym này
đạt đến cực đài cũng tùy thuộc vào nhiệt độ.
Enzym oxy hỏa khử: trong quá trình nảy mầm, hoạt động của
các loại enzym này tâng ỉên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt
cũng gia tăng. Hoạt động hô hấp của hạt manh nhất vào ngày thứ 4-6
ở nhiệt độ 27-28°C và cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm hạt,
nhiệt độ và lượng 02 cung cấp.
Protease: các protein dự trữ trong hạt bị phân cắt do hoạt dộng
của các protease tạo thành sản phẩm cuối cùng là các amino acid, các
amino acid này sau đó được sử dụng để tổng hợp thành các hợp chất
mới trong tế bào của các mô cây mầm.
Trong quá trình nảy mầm của hạt, mầm phát triển chậm trong
những ngày đầu, từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 mầm phát triển mạnh,
sau đó giảm dần. Để hoạt tính của enzym đạt đến mức cao nhất mà ít
làm tiêu hao chất khô, người ta nhận thấy thời gian ủ hạt khoảng 7-8
ngày là tế t nhất.
Trong quá trình ủ hạt cần hạn chế ánh sáng để ngăn cản hoạt
động của diệp lục tố làm phát triển thân, lá (hao tốn chất khô) do đó
trong giai đoạn đầu của quá trình nảy mầm không đậy khối hạt đế
tăng cường việc cung cấp 02 cho phôi nhưng sau đó cần đậy kín để che
chông cho ánh sáng chiếu vào.
166 Chương 4
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phản tinh bột
ĩhiệt độ: Sự gia táng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định sẽ
làm cho tốc độ thủy phân tinh bột tăng lên. Khi nhiệt độ tăng lên
10°c thì tốc độ thủy phân tinh bột có thể tăng lên đến hai lần. Nhiệt
độ thích hợp cho hoạt động của các amylase là 65-70°c.
pH: pH thích hợp cho hoạt động của amylase là 5,6-5,8 đối với
a-amylase và 4,8-5 đôi với p-amylase.
Sự hồ hóa tinh bột: hồ tinh bột dề bị thủy phân hơn tinh bột
còn nguyên vẹn. Bình thường chuồi hydrate carbon của tinh bột ở
dạng xoắn do có một số liên kết tạo ra cấu trúc này. Khi bị hồ hóa,
các liên kết này bị đứt ra, chuỗi hydrate carbon được tháo xoắn duỗi
thẳng ra nên các enzym dễ tác dụng hơn.
Hoạt độ của amylase: hoạt độ của amylase càng mạnh thì quá
trình thủy phân tinh bột xảy ra càng mạnh.
ứng dụng của malt thốc
Trước đây, m alt thóc được sử dụng để làm m ạch nha và sau
này được sử dụng làm«4
nước giải k h át lên men* Việc sử dụng malt
thóc để thay th ế cho m alt đại mạch trong sản xuất bia còn đang
được nghiên cứu.
2- Phương pháp tinh sạch
ơ- Tinh sạch enzym amylase bằng phương pháp sắc kỷ
H ạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 30°c trong 8 ngày. Hạt
náy mầm được đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với
800ml dung dịch đệm TRIS/HCI 50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A).
Sản phẩm đồng hóa được ép. qua hai lớp lưới nyỉon và dịch lọc thô
được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên
được xem như dịch enzym thô. Dịch enzym thô được cho kết tủa với
(NH4)2S 04 (25-60%). Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml
dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ" 15.000 vòng trong 20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên
trong dung dịch đệm A thì sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52
(Whatman) và được cân bằng bới dung dịch đệm A; enzym được tách
rửa bằng NaCI nồng độ 0-0,5M. Dung dịch được thầm tích và được lôi
cuôn qua cột CHA (ancyclodcxtrin), cột này được đặc biệt dược sứ dụng
đô lôi cuôn amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyên
qua 12 sắc ký cột superose. Những phân đoạn này được SƯ dụng cho
các thí nghiệm tiếp theo.
b- Thu n h ậ n enzym amylase bằng phương p h á p đ iện di trên gel
polyacrylam ide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis - PAGE)
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây
mám được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tý lệ mố đệm
là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp sau khi đồng hóa đươc ly tâm với
tôc độ lO.OOOrpm trong 15 phút ơ nhiệt độ 4°c. Phần nổi ơ trên dược
chuyến sang một ống ly tâin khác và được xem là dịch enzym.
Gel được chuẩn bị sắn sàng và được đưa vao điện di với cường độ
dòng điện 70V. Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra
nhuộm với dung dịch nhuộm màu đế xác định sự hiện diện của amylase.
4.2 THU NHẬN ENZYM BROMELIN TỪTHựC VẬT (E.c.3.4.4.24)
4.2.1 Đặc đ iểm nguồn n guyên liệ u và brom elin

1- Đặc điểm nguồn th u nguyên liệu
Cây dứa iAnanas comusus/ thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromcỉiaccac có
nguồn gốc từ Nam Mỹ. Hiện nay, ờ nước ta loại dứa dược trồng nhiều nhất
là Ananas coniusa được sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp,
nguồn thu nhận enzym và ngoài ra còn được sử dụng trong một sô
lĩnh vực khác như dược, mỹ phấm.... Phần thân và lá sau khi thu
hoạch quả có thê được sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón.
Trong quả dứa chín, nước chiêm đa số, hàm lượng 80-86%, phần
còn lại là carbohydrate chiếm 10-18% (trong đó có 60-67% saccharose,
glucose và fructose chiếm 30*40%), protein 2-3%, acicl hữu cơ 0,1-1,6%
(trong đó có citric acid chiếm 87% và 13% còn lại là maleic acid), tro
0,3^, sắc tố 0,03-0,6% và các hợp chất phenolic (tạo màu), các hợp
chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A (0,3mg carotene/100g thịt
quả), BI và c (8,5mg/100g thịt quả) và enzym bromelin là một enzym
thủy phân protein. Ngoài ra ơ lá non trên ngọn thân cây dứa có có
chứa rất nhiều vitamin c.
168 Chương 4
2- Đặc điềm enzym bromelin

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm
sulíhydryl, có khả năng phân giải proteỉn được thu nhận từ họ
Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái).
Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây ỉàm thuốc.
Năm 1957, Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn
bromelỉn và người ta bắt đầu tìm cách chiết tách nó và sản xuất dưới
dạng thuốc để chữa bệnh. Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân
biệt bromelỉn thân hay bromeỉỉn quả và bromeỉin thân là nhóm
enzym có giá trị kinh tế. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa,
bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau.
Bromelin có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều.
Bromelỉn là enzym thủy phân protein, nỏ phân cắt protein trong cơ
thể sinh vật. Một trong những lợi ích của nó được chú ý đến đổ là một
chất gỉúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi trường acid trong dạ dày
và cả trong môi trường kiềm ở ruột non. Đromeỉin có thể thay thế
được cho cả những enzym tiêu hóa khác như pepsin và trypsin.
Bromelin có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh
viêm thấp khớp do đó các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelin
như chất làm giảm đau, kháng viêm và kháng sưng. Hiệu quả của
bromelin là làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gây ra đau,
viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách
ngăn cản những tiền chất gây viêm. Bromelin cổ ảnh hưỏng tích cực
trên các prostaglandin hữu dụng.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng
thủy phân khá m ạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Đromeỉỉn có hoạt
tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ
hay ílcin trong cây thuộc họ Sung. Enzym bromelin có trọng lượng
phân tử khoảng 33.000Da, lớn gấp 1,5 lần so với papain.
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzym bromelin kể từ ba tháng
trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20
ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống
nhưng không m ất hẳn.
Bromelỉn còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có
thể thu được 3,6kg bromeỉin từ 3781 nước rút ra từ thân cây dứa).
4.2.2 T ính chấ t enzym brom elin
Thành phần chủ yếu của bromelỉn cổ chứa nhóm sulíhydryl thủy
giải protein. Trong dịch chiết bromeỉin còn có chứa một ít peroxydase,
phosphatase acid và chất cản protease. Khi chiết tách và tinh sạch
phân đoạn có chứa nhóm suỉíhydryl của bromelin thì thu được một
enzym thủy phân protein hiệu quả ỉn vitro, nhưng ỉại bị bất hoạt sinh
ỉý in vitro ở một số điều kiện mà bromelỉn cổ hiệu quả. Như vậy, rõ
ràng rằng phần lớn các hoạt động sinh ỉý của bromelin không chỉ phụ
thuộc vào phân đoạn có hoạt tính thủy phân protein mà nó còn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác ở trong bromelin.
Hiện tại người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có tám
thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein. Hai thành phần
chính được gọi là F4 và F5. Phân đoạn cổ hoạt tính mạnh nhất là F9
chiếm khoảng 2% protein trên tổng số. Người ta ước tính rằng khoảng
50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có
glycosylate. pH tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4,0-4,5 và của
F9 thì gần với pH trung tính. Dịch chiết bromelin toàn phần có hoạt
động trong khoảng pH 4,5-9,8. Bromelin được chiết tách từ các phần
khác nhau trên cây dứa và bromelin từ những nguồn khác nhau sẽ có
hoạt động sinh lý khác nhau nhung hoạt tính thủy phân protein thì
giống nhau. Bromelin không ổn định với nhiệt độ do đó các hoạt động
sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện
bảo quản không thích hợp.
Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động
vật. Nồng độ cao nhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi
ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân protein của nó bi bất hoạt
nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh và yếu tố
a-2-macroglobuline của huyết thanh.
170 C hương 4
1' Cấu tạo hóa học

Bromelin th ân là một protease nhưng nó khác với các protease
thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân
tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Sợi
hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trong sợi
hydrate carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ
chế xúc tác của phân tử. Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydrate carbon
của phân tử bromelin như sau:
Hình 4,6 Cẩu trúc sợi hydrate carbon của bromelin

Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và
bromelin quả thi tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp
phân tích mâ có thành phần amino acid thay đổi khác nhau. Bromelin
có th àn h phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid
và bromelin quả là 283-161 amino acid.
Bromelin thân là một sợi polypeptide cổ amino acid ở đầu amine
là valine và ở đầu carbohydrate là glycine, còn bromelin quả có amino
aciđ ở đầu amine là aỉanine.
B ảng 4.5 Thành phần amino acỉd và những nhóm khác của bromelin
Amino acid Thân Quả xanh Quả chín
Aspartic acid 29 - 29.4 29,8 29,8
Glutamic acid 23 23,2 23,4
Glycine 24,6 - 35 32.6 32,2
Alanine 35 - 35,4 23,8 24,4
Valine 2 1 .6 - 2 2 19,8 20,1
Leucine 10 10 10
Threonine 21 - 21,2 16,4 16,2

Cysteine 28 - 28,2 32,2 32
Methionine 13,6-14 13,5 13.8
Proline 14- 14,2 11.6 12,1
Phenylalanine 8 ,8 -9 7,6 8
T yrosine 2 0 ,8 - 2 1 22,4 22,2
Tryptophan 8 - 8 .1 5,6 -
Histidine 1,9-2 1.4 1,3
Lysine 22,9 * 23 7.8 8,3

Arginine 11,5-12 8 ,6 9,1
Amid 41,6-42 43 43,4
Glucosamine 5,8 - 6 0 .2 0 ,2
Carbohydrate 1.46 3.2 3.2
2- Cẩu trúc không gian của bromelỉn

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và
nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:
Ser - Val - Lys - Asn - Gin - Asn - Pro - Cys - Gly - Ala - Cys - Tryp -
- i Gly
Bromelin là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine
và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S -S - . Phân tử
có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelin thân có chứa nhổm sulfhydryl có vai trò
chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 câu
nối disulflte. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có lẽ có vai
trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym.
172 Chương 4
3- Tính chất vật lý

*,
Các ngỉììên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được
Murachỉ và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:
Bàng 4.6 Những tính chất vật lý của bromelin thân
Hằng số sa lẳng s 2.73S
Hằng số khuếch tán D 7 ,7 7 X 1 0 ‘7 c m 2/ s
Thể tích riêng phần V 0,743ml/g
Độ nhớt bên trong II] 0,039di/g
Tỷ số m a sảt f/fo 1,26
Điểm đẳng điện pl 9,55
Sự hấp thu A1\ mở 280nm 20.1
33.200'
Trọng lượng phân tử 32.100“
35.500’"
*: tính bằng phương pháp sa lắng ■khuếch tán

**: tính từ hằng số sa lắng vá độ nhớt bên trong
***: tính bằng phương pháp Archibald.
4- Hoạt tinh của bromeỉin

a- Hoạt tính phân giải cửa bromelỉn
Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và
esterase. Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy
phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.
Khả năng phản giải các cơ chất tự nhiên của bromelin
Bảng 4.7 Hoạt tính phân giải casein của bromelin
Hoạt tính phan giàl casein (UI/mg)

Cơ chất
Bromelìn thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
Casein 7.4 4,0 3,0
Đôi với cơ chât là casein, hoạt tính phân giải của bromeỉin thân
cao hơn bromelin quả xanh và bromelin quả chín.
T hu n h ậ n enzym từ n g uồn thực v ật 173
Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelin
B ả n g 4.8 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin
Hoạt tính phân g iil (Uỉ/mg)
Cơ chất
Bromelin thân Bromelỉn quả xanh Bromelỉn quả chfn
BAA 3,7 9,1 7.2
B ảng 4,9 Hằng sổ Mỉchaelỉs với các cơ chất tổng hợp khác nhau
BAA BAEE BAEM
Bromelin thân 1,2 X 10'3 1,7 X 10' 1 3,2 X 10 2
*: ở điểu kiện nhiệt độ 5°c và pH 6,0; BAA: Benzoyl-L-Arginỉne amide

BAEE: Benzoyl-L-Arginine ethyl ester; BAEM: Benzoyl-L-Arginine methyl ester
Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin
thân và bromelin quả chín.
So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao hơn
gấp 140 lần. Sự khác biệt này có lẽ là do cơ chế xúc tác khác nhau.
b- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin
Giống như các cấu trúc xúc tác sinh họd khác, bromelin chịu ảnh
hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym,
nhiệt độ, pH, ion kim loại, một sô' nhóm chức, phương pháp ly trích,
phương pháp tinh khiết....
Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các
phản ứng xúc tác của bromelin không ổn định mà phụ thuộc lẫn
nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng
độ cơ chất, nồng độ enzym, thời gian phản ứng, sự có m ặt của các
chất hoạt hóa....
Ả nh hưởng bồi cơ chất: trên những loạỉ cơ chất khác nhau,
bromelin có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì
khả năng phân giải của bromelin mạnh hơn papain 4 lần, nếu cơ
chất là casein thì hoạt tính của bromelin tương tự như papain. Đối
với các cơ chất tểng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE
(Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy giải của
bromelin yếu hơn papain.
Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ
sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng
độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym.
174 Chương 4
Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60°c thì
bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với
nhiệt độ. Ở 5°c, pH 4-10 thì enzym giữ hoạt tính tối đa trên casein
trong vòng 24 giờ. Ở 55°c, pH 6,1 thì enzym bị m ất 50% hoạt tính
trong vòng 20 phút. Quá trình dông khô làm m ất 27% hoạt tính.
Ả n h hưởng của độ pH : pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng
đến hoạt tính xúc tác của enzym. pH tối thích của bromelin không ổn
định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng
độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất của dung dịch đệm, sự
hiện diện của chất tăng hoạt.
Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là
ammonium sulfate hoặc molypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính
cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ô pH 4,6-5,4. Bromelin thân đã được
tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0, ổn định
ở pH 3,5-5,6 với nhiệt độ 63°c. Enzym bromelin đã tinh sạch chỉ còn
lại 60-70% hoạt tính. Bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH
tối thích của enzym là 5-8 tùy thuộc vào cơ chất.
Ả nh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng
đến hoạt tính của enzym do chúng thường gắn vào các trung tâm
hoạt động của enzym. Muôi thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến
hoạt tính* của enzym bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo
nồng độ của muối.
Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do
chúng kêt hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzym.
A n h hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản
B ả n g 4.10 Ả nh hưởng của trạng thải và điều kiện bảo quản

trên hoạt tính của bromelin
Hoạt tính (Ul/mg protein)
Dịch chiết Đông khô

Nguyên liệu tươi 1.600 1.150
Bảo quản ở 4°c trong 5 ngày 830 630
Sấy khô ở 4°c 1.880 1.360
4.2.3 P hư ơ n g p h á p th u n h ậ n brom elin

1- Phương pháp thu nhận
Enzym bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả
và trong chồi quả. Việc thu nhận và tinh sạch bromeỉin có thể thực
hiện theo sơ đồ sau:
Bẽ
Quả/thân/chổi dửa — » Xay nhuyễn ------ ► Dịch lọc ------ ► Ly tâm ^
Lọc Oịch ly tâm
Kết tùa ị
Sản phẩm
Tinh sạch - sấy khô -*«------ Chế phẩm brommelin thồ
enzym tinh khiết
Hình 4,7 Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin
a- Thu dịch enzym thô
Quả dứa hoặc tlíân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu
dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc dộ 6.000 vồng/phút trong 10 phút để
loại bỏ chất xơ sẽ thu dược dịch chiết có chứa bromeiin.
Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch
enzym bromelin thì các hợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm
tăng độ nhớt của dịch chiết sẽ làm trở ngại cho quá trình iọc. Các nhà
khoa học s. Sathivel, K. Niranjan và w . Prinyawiwatkul đã tìm ra
phương pháp dồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có
thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích
các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng.
Theo như nghiên cứu này thì khi đồng hóa nguyên liệu ở
15MPa độ nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị của độ brix và
pH thay đổi không đáng kể, sản lượng và hoạt tính của enzym gia
tăng. Ở 15MPa, sản lượng enzym tăng gấp hai lần (l,27g/500ml dịch
chiết từ quả kể cả phần lõi) với hoạt tính cao n h ất là 2,06ƯI/mg so
với khi đồng hóa ỏ điều kiện bình thường và ỏ 20MPa thì sản lượng
enzym thu được từ vỏ quả là 0,9g/500ml dịch chiết. Vậy đồng hóa
mẫu dưới áp suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dịch chiết giúp
cho việc sử dụng phương pháp siêu ỉọc thuận lợi hơn, đồng thời làm
tăng sản lượng và hoạt tính của enzym bromelin từ quả dứa và các
phế phẩm của nó.
176 Chương 4
6- Các phương pháp tách bromelin

Phương pháp kết tua enzym
Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do
dó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa
và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang
điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein
liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết
hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và
cản trở sự kết tủa của chúng. Đối với enzym protein cũng như các
protein enzym khác, dể có thể kết tủa được enzym, điều cần thiết là
phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ
sung vào dung dịch protein enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa
nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi
phân tử protein dó, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là
acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở
nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzym. Ammonium sulfate là
loại muối trung tính có độ hòa tan rấ t tốt do đó ở dung dịch bão hòa
của muối này thì tấ t cả protein đều kết tủa.
Heinicker ,và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ
thân và trái. Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các
dung môi hữu cơ do đó dể sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến
hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh. Như vậy nước ép từ thân
và trái dứa phải được làm lạnh ở 0 đến 4°c và acetone tinh khiết ở
20°c. Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp
bromelin-ethanol cũng phải giữ ỗ điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi thu
được kết tủa, tủa bromelin phải được rửa bằng acetone và làm khô
th ậ t nhanh để bromelin không bị biến tính.
Renée Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão
hòa là 0,7 (70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin. Sự kết
tủa với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) là một
quá trìn h thuận nghịch, tủa dễ dàng hòa tan bằng nước và muôi có
thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích. Phương pháp
này có thể thực hiện ồ nhiệt độ thường.
Để có thể thu nhận enzym, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức
mô có chứa enzym bằng các nghiền mô để thu dịch chiết có chứa
bromelin rồi sau đó dùng các tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin.
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế
phẩm enzym đó là:
- Nồng độ của ammonium sulfate
- pH của dịch chiết
- Nhiệt độ kết tủa
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết.
Thông thường nếu sử dụng phương pháp kết tủa với ammonium
sulfate thi cứ 60kg nguyền liệu tươi sẽ thu được khoảng lkg bromelin thôf
Cách làm J
- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị 1 lít dung dịch

nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy
đều (dung dịch đạt độ bão hòa ammonium sulfate là 70%). Để yên ở
nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc dộ 6.000 vòng/phút
trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho
ethanol 96° (cũng đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1
cồn), trộn đều, để ở nhiệt dộ 0°c trong 3-4 giờ. Ly tâm hổn hợp với tốc độ
6.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20%
acetone lạnh vào một thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên
trong một giờ ở nhiệt độ 0-4°C. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6.000
vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tỏa. Thêm hai thể tích acetone lạnh
vào, để 1 giờ ở 0-4°C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.
Phương pháp hấp phụ
Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzym. Có thể
sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện
tương tự nhau.
Cấu tạo của kaolin: kaolin là một loại khoáng vật sét có khả
năng hấp phụ tốt. Kaolin có cấu tạo thành từng lớp, mỗi lớp có một
tấm tií diện SKV' và một tấm bốt diện Al(OH)6‘3, đĩnh chung của tấm
tứ diện quay về phía tấm bát diện. Ở ngay vị trí chung này thì các ion
OH‘ của tấm bát diện được thay thế bằng ion o 2' của tâm tứ diện.
178 Chương 4
o õ2
• Si*4
® OH"
© AI*3
H ìn h 4.8 Cấu tạo của kaolin
Ở vị trí của hai lớp sát cạnh nhau, các ion O2* ồ bề m ặt của lớp
này nằm gần các ion OH' ở bề mặt của ỉớp kia và do đó xuất hiện liên
kết hydrogen giữa các ion trái dấu này làm cho các lớp kaolin dính
sát lại gần nhau và khoảng cách giữa hai lớp là 7,1A°.
Kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tá n cao, do đổ
chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính. Một
tính chất quan trọng là do kaolin có độ phân tán cao nên nó có ảnh
hưởng đến hấp phụ các chất.
Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt. Kích thước h ạ t nhỏ
hơn I ịìĩĩi do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ
tăng lên rấ t nhiều. Một lý do khác dẫn đến khả nảng hấp phụ vật
chất của kaolin cao là do trên bề m ặt kaolin có rấ t nhiều ion OH’ và
0 2\ những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với các
chất bị hấp phụ.
Cách ỉàm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào
dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 2ỗmg kaolin/ml dung dịch
nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa.
Tủa được gọi là bromelin-kaolin.
Phương pháp siêu lọc
Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới
một áp suất để tách phân đoạn các thành phần trong chất lỏng đó. Sự
phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và
tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước
của lỗ trên màng (giá tri loại trừ cut-off) mà sau khi thực hiện quá
trình siêu lọc sẽ thư được nước và những chất có phân tử nhỏ còn
nhừng các phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng.
Dung dịch enzym sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có
chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sẽ
sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang
dùng phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất có trọng lượng
phân tử thấp hơn các protein enzym và đồng thời cô đặc được enzym.
Phương pháp siêu lọc được sử dụng trong ngành công nghệ thực
phẩm và các quá trình sản xuất sinh học để tách các chất dễ bị biến
tính bởi nhiệt như lọc và ổn định rượu vang, lọc nước ép trái cây, cô
đặc sữa làm phomai, làm bơ, cô đặc lòng trắng trứng, cô đặc huyết
thanh động vật, cô đặc và tinh sạch các chất pectin, gum, gelatin,... cô
đặc và tinh sạch các enzym, kháng thể, polysaccharide, polypeptide,
vaccine,... thu hồi các protein và các carbohydrate từ nước thải và các
sản phẩm phụ....
Màng siêu lọc: màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng.
Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt
với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này
được chế tạo từ các loại polimer bền như fluoro polimer (FS), cellulose
acetate (CA), polysulphone (GR).... Tùy theo mục đích cụ thể mà người
ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ, cô đặc protein: dùng màng FS,
GR;’ cô đặc enzym: dùng màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc
Trong quá trình siêu lọc cần chú ý đến các yếu tố sau:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng
sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của
protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vi các yếu tố này
có thể làm bít màng.
- Áp suất: thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng chảy
qua lm 2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho
đến khi đạt đến giá trị (tóc độ) cực đại. Nêu áp suất tăng cao hơn
nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy
nên được chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ứng với hiệu số PIi-Pt2 ở trong
khoảng 0,5-3bar. Áp suất dòng vào lớn nhất (Pli max) là 7bar (tương
đương 102Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (Pl2 min) là 0,5bar (tương
đương 7,25Psi).
180 Chương 4
Các kiểu siêu lọc: có ba kiểu hệ thống siêu lọc

- Kiểu một bước (single pass operation)
Thấm qua màn
I I (sàn phẩm)
I---------1
i Chậu I
I chứa 1 PL1 PL2
V/
I
I
L- ^ >bơm
.9X9
f " " """" ’ Modula *
van
Cô đặc
Hình 4.9 Kiểu một bước

- Kiểu lô (batch operation): chất lỏng được tuần hoàn qua màng
đến nồng độ của dịch cô đặc ồ trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
r
I
Thể tichđáu
j Chậu J
C hứa Thấm qua màn
' 1 1 - * Thể tích cuối _
PL2 (sản phẩm)
J PL1
\ X
Ọ X Ọ . Cô đặc
Ị" Mcylula — 1----------
L- ^ >bơm van
Hỉnh 4.10 Kiểu lô

- Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): dòng chấ
lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ô trong chậu chứa không thay
đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô
đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
1
I I Thể tích
Ị Chậu Ị không đổi Thấm qua màn
I chứa I (sản phẩm)
X,
\ /^ PL1 PL2
- + -bơm
of 1 Moduia
van
Hình 4.11 Kiều thể thích không đổi

Thu n h ậ n enzym từ n guồn thực v ậ t 181
Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc

- Có thể chọn lựa màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzym: enzym có thể cô dặc 25 lần mà không bị mất
hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym.
Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thi độ tinh sạch của
enzym càng cao.
- Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao cổ thể làm mất hoạt tính
của enzym, do đó nhiệt độ 10-20°c được xem là khoảng nhiệt độ thích
hợp nhất cho năng suất mà không làm m ất hoạt tính enzym. Quá
trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5°C).
Cách làm
- Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ (cut-off) 30.000, diện
tích màng 336cm2.
Dịch nước dứa sau ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này
thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cò đặc. Thu nhận
tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
PHẾ UỆU CỦA THỊT QUẢ DỬA
Xay nhuyôn óể phá vỡ tổ chức

mô ly tăm. tàm lạnh ỏ 0 - 4”C
DUNG DICH NƯỔC DỨA 1
PHƯƠNG PHÁP TỦA PHƯƠNG PHẤP HẤP THỤ PHƯƠNG PHÁPSIÊU LOC
(NH*>2s o 4
aceionlạnh I acetonlanh
(4 1) f (20% hoặc 1:1) ỷ <70% bảo hỏa)
Làm lanh Làm lanh Để hồn hợp Dịch thấm qua
hôn hợp hỗn hợp d nhiệt độ phòng Khuáy 30 phút Dịch cố đậc (làm siro, ruợu
trong 4-5 giở trong 1 giở trong 30 phút thu citric acid)
7 \
Cỗ dông
Ly t&m bồ tủa acflton lanh
I aceton lanh (2 :1)
I <2:1)
Lốm lanh trong một giở
Ly tâm Dung dịch Ly tâm mu tủa

Ly tâm thu tủa Ly tàm thu tủa Ly tâm thu tùa thu tủa nước dúa 2 rủa tủa với acetori lạnh
X
Sấy khổ
I
Sấy khổ
I
sáy khô Sáykhổ Sấy khô
I T T
I B RO E to n ] I BROA I I BRON I I BRO-K I Ị B R O S L (p )
ỉ
I BRO-SL (1) ]
Hình 4.12 Các quy trình thu nhận bromelin

182 Chương 4
- Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng carboxyl methyl

cellulose (CMC). Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu
được bromelin ở dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và
đơn giản hơn so với các phương pháp khác.
Công nghệ chế tạo CMC: CMC được chế tạo từ vải màn, bông, vải
gạc loại tốt. Cân 300g vải màn hay gạc ngâm trong 2000ml dung dịch
NaOH 45% trong 10 phút, thỉnh thoảng trộn cho đều, thêm 2000ml
dung dịch monochloacetic 15% cho vào thành 4 lần, vừa cho vừa đảo
trộn đều. Đun cách thủy hỗn hợp ở nhiệt độ 60°c trong thời gian 30
phút. Sau đó làm lạnh bằng nước đá đến khi hỗn hợp có màu vàng.
Thêm vào đó lOOml dung dịch acetic acid 10% từ từ từng ít một. Sau 2
giờ pha loãng với nước cất đến 201. Để yên, gạn bỏ rồi thêm nước như
trên đến phản ứng trung tính. Nếu còn kiềm thì ngâm tiếp với dung
dịch acetic acid, rồi rửa loại acid. Ngâm trong H2SO4 0,1N trong thời
gian 48 giờ, sau đó rửa bằng nước cất đến pH trung tính, sấy khô ở
50°c. Quá trình phản ứtig xảy ra như sau:
NaOH CICH 2 COOH

Vải màn ------- ► Alcaíicellulose ------ —------► Carboxyl methýl cellulose (CMC)
Tách chiết bromeỉin từ dịch chiết dứa bằng CMC

CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate
0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy
trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa
protein bằng đệm phosphate 0,05M, pH 6,5. Sau đó, tiến hành phản
ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm
phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCI 0,5M khuây trộn 3-4 lần. Sau hai giờ
lây ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp
tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, gộp các
dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym.
Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0,1% so với chồi dứa tươi
và có hoạt tính 24nk/mg chế phẩm enzym. So với tủa (NH4)2S 0 4 thì độ
sạch của chế phẩm enzym cao hơn gần hai lần, thời gian nhanh hơn
và tiến hành thuận lợi.
2- Phương pháp tinh sạch enzym bromelin
Enzym bromelin được tinh sạch bầng phương pháp thẩm tích,
lọc qua sephadex, phương pháp sắc ký.
T h a n h ậ n enzym từ n g uồn thự c v ậ t 183
a- Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Cân Ig enzym thô, pha trong 10ml dưng dịch đệm sodium
phosphate 0,03M có pH 7,2. Sau khi tất cả enzym đã hòa tan thì cho
hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 11 dung dịch
đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được chuẩn bị
bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương
tự như trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay
đung dịch đệm bên ngoài một lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được
khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới
hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tâng theo sự gia tăng nhiệt
độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein
enzym sẽ bị biến tỉnh do nhiệt độ cáo làm ảnh hưởng đến những mấi
tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym. Chính vì vậy, để làm
giảm sự biến tính của enzym dỡ nhiệt, người ta thường tiến hành tinh
sạch enzym ở nhiệt độ thấp.
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadèx
Tinh sạch bàng cách lọc qua sephadeXũ-50
Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 100°c trong một giờ rồi
nhồi vào cột (kích thước cột 23,5x0,9cm). Đặt một cái phễu thủy tinh
phía trên cột, cho sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục. Các hạt
sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục đến khi nhồi xong
cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và
không cổ bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một
giờ, với vận tốc khoảng lml/7 phút.
Cân lOOmg enzym thô hòa vào trong lm l dung dịch đệm sodium
phosphate 0,03M, pH 7,2. Khi enzym đã hòa tan hoàn toàn thì cho
hỗn hợp enzym từ từ vào cột. Cho duiig môi phân ly enzym qua cột và
điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút. Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi
mới bắt đầu thu dịch e n z y m Dịch enzym được thu đến khi dùng
Ba(NỌ3)2 để thử (NH4)2S04 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì
ngừng quá trình thu dịch enzym. Dịch enzym thu nhận được làm đông
khô. Quá trình lọc enzym qua sephadex G-50 nên được tiến hành
trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm
thiểu sự biến tánh của enzym. Quá trình lọc enzym qua sephadex diễn
ra trong khoảng thời gian 1 giờ.
184 Chương 4
Tinh sạch bằng cách ỉọc qua sephadex G-100

Sephadex G-100 được đun cách thủy ở 100°c trong 5 giờ, sau đó
nhồi vào cột kích thước 28xlcm. Thực hiện nhồi cột tương tự như thực
hiện với sephadex G-50. Sau khi hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dịch
đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 chảy qua cột khoảng 3-4 giờ để
cân bằng cột.
Cân lOOmg enzym thô hòa vào lml dung dịch đệm như trên rồi
cho vào cột. Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzym ià
lml/5phút. Thu từng phân đoạn enzym (mỗi phân đoạn là 3ml) và do
OD ồ bước sóng 280nm. Tính trọng lượng phân tử của bromelin theo
công thức: LgM = 5,941 - 0,847 ^
Vo
trong đó: Vo = 40%Vt (Vt: thể tích tổng cộng của cột)
Ve: thê tích dung môi phân ly enzym được tính từ lúc cho mẫu
vào đến khi thu nhận mẫu.
Tinh sạch bromeỉin bàng phương pháp sấc ký
Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH
6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác
phân giải BAEE, casein và glucagon.
Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thư được 5 phân
đoạn khác nhau về thành phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex
G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzym. Trọng
lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 đến
20.000 Dalton.
Bromelin thân và bromeliiỉ quả thô được cho chạy sắc ký gel
trên sephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi
ion trê n sulfo ethyl sephadex chỉ cho một phân đoạn protein đơn có
hoạt tín h phân giải protein. Còn nếu sắc ký hoán vị gel ở pH 7 rồi
sau đó sắc ký trên sulfo ethyl sephadex cho thấy có sự hiện diện
của hai protease riêng biệt được đật tên là bromelin II và III, hai
protease này có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên
polyacrylamide ơ pH 9,5.
Thu n h ận enzym từ nguồn thực v ật 185
Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên sephãdex G-50 và sắc
ký trao đổi ion trên DEAE-cellulose thì thấy có một thành phần chính
và 5 thành phần phụ.
Bromelin quả: khi sắc ký trên DEAE-cellulose và sulfo ethyl
sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ.
4.3 THU NHẬN ENZYM PAPAIN (E.c.3.4.4.10)
4.3.1 Đ ặc đ ỉể m c h u n g
Được tách từ nhựa trái đu dủ xanh, papain thuộc nhóm enzym
thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính
chất và cơ chế hoạt động. Papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên
được tách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith
từ nhựa khô.
Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.4.10, có hoạt tính
xúc tác tương tự như bromelin (trong dứa) và íĩcin (trong cây sung).
G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một
nguồn enzym. ông công bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calcutta
Medical Journal* Đến năm 1879, Wrutz và Bouchet là những người
đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân hủy
protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain”
tiếp tực được sử dụng dể miêu tả mủ đu đủ khô được dùng rộng rãi
trong công nghiệp và cả trong chế phẩm enzym thủy phân dạng kết
tinh từ mủ. Chế phẩm enzym thương mại là hỗn hợp gồm hai enzym
khác nhau được gọi là papain peptidase 1 và papain peptidase 2
(Jansen và Bals gọi enzym thứ hai là chymopapain).
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp
toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa
nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau:
papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid),
chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III,
proteinase IV, thiolprotease. Trong đó, papain là protease có hàm
lượng cao nhất tới 95% (tổng hàm lượng protease có trong nhựa) và là
enzym có ý nghĩa quan trọng nhất. Các tính chất vật lý của papain
gần giống với chymopapain nhưng papain có hoạt tính mạnh hơn gấp
nhiều lần chymopapain.
186 Chương 4
4.3.2 T ín h c h ấ t •
1- Tính chất vật lý
B ả n g 4.11 Tính chất vật lý của papain
Điểm đẳng điện pl = 8.75
Hằng số lắng S 20 2.42 ± 0.04
Hằng số phân tán D20( 10 7 sec.cm2) Í 0 .2 7 + 0.13

Phân từ lượng 20.700
\ Độ triển quang{a}D -66,7°
Độ xoắn 17%
Vỏng hiệu ứng coton 290nm
Thể tích riêng phần V(ml/g) 0,724
Trị số ma sát f/f 0 1.16
Bột màu vàng hay nốu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không tan trong hầu hết
các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2 O hay glycerine
Bền nhiệt
2- Tính chất hóa học

a- Cấu tạo hóa học
Papain là một endoprotease có chứa 16,19éN và 1,2%S. Papain
là một protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L.
Smith, papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng
lượng phân tử là 20.900 Dalton.
B ả n g 4.12 Thành phần amino acid của papain
Amino acid Sô' lượng Amino acid S ố lượng
Alanine 13 Lycine 9
Arginine 10 Phenylalanine 4
Aspartic acid 17 Proline 9
Half - cysteine 6 Serine 11
Glutamic acid 17 Threonine 7

Glycine 23 T ryptophan 5
Histidine 2 Tyrosine 17
tsoleucine 10 Valine 15
Leucine 10 Methionine 0
Tống cộng: 185

Thu n h ậ n enzym từ n g uồn thực v ật 187
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papaỉn được cấu tạo
bởi 212 amino acid trong đó không chứa methionine. Phân tử lượng là
23.350Da, phân tử của nó là một mạch polypeptide với đầu N là
isoleucine, đầu c là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu
disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95,' 153-200, không có chức năng sinh
học, chỉ làm tãng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm -SH
tự do ở vị trí 25.
Thành phần chính của papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein
disulfurcysteine. Khi hoạt hóa papaỉn bằng KCN sẽ giải phóng ra
nhóm thiol của enzym và p-thio cyanatalanine do sự tương tác giữa
cyanur và cysteine. Sau đó, p-thio cyanatalanine khép vòng tạo thành
a-iminotiazolidin. Khi có oxy không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều
ngược lại, tức là cysteine kết hợp với nhóm sulfurhydride của papain
hoạt hóa tạo thành sản phẩm không hoạt hóa. Quá trình hoạt hóa
papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó.
M
III
C
> h3
c h 2- c h
I Ncoo"
H\ N/ H
I
H ìn h 4.13 Cơ chế hoạt hỏa papain
bàng cyanur ? N|H
\ CH
' / \ -
ch2 coo
6- c ấ u trúc không gian

Phân tử papain cổ dạng cầu với kích thước: 36x48x36A°, mạch
chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt
động nằm tại bề m ặt của khe này, nhổm sulfhydryl hoạt động của
cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải
khe. Phần xoắn a chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.
Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần
của papaỉn. Điểm đáng lưu ý là cảc hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi
xoắn a. Ở phía trái có ba đoạn xoắn a, gồm các đoạn 24-43, 69-78, 50-58.
Vùng trung tâm (nhân kỵ nước) gồm các nhóm Val 31, Ileucin 34,
188 Chương 4
Leucine 53, Valine 75 và lie 80. Còn ở phía phải có đoạn xoắn 116-
126 và một đoạn xoắn ngắn 138-143, trung tâm kỵ nước gồm các
nhóm Leu 121, Ile 125, Val 130, Phe 141.
Ngoài ra, trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử
được tạo thành bởi các nhóm guanidine của gốc arginine và nhóm
carboxyl của Asp hoặc Glu hay nhóm amide của Asp hay Glu. Ví dụ,
liên kết hydrogen được hình thành giữa Arg 8 và Asp 6.
H ình 4.14 Cấu trúc bậc hai của papain

Thu n h ậ n enzym từ ng uồn thự c v ậ t 189
Hình 4.15 Hình thể chuỗi peptide cua papain

c- Cẩu trúc tâm hoạt động của papain
Tâm hoạt động của papain gồm có nhổm -SH của cysteine 25
và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhốm imidazole
của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.
Asp 175
\ c ^N H 2
190 Chương 4
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các
amino acid là: Lys- Asp- Glu-Gly- Ser- Cys-Gỉy- Ser- Cys
Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide vùng trung
tâm hoạt động của papain gần giông như của ficin và trypsin, mặc
dù chúng từ những nguồn gốc khác nhau.
Ficin: Arg - Gỉu - Glu - Gly - Glu - Cys - Gly - Ser - Cys
Trypsin: Lys - Asp - Ser - Cys - Glu - Gly - Gly - Asp - Ser
d ‘ Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino
acid, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide:
R R R R
I I I I
{ - NH -C H -C O -N H -C H -C O -)n ’ + (HOH)------- ► (-NH-CH-CO OH), + (H 2N -C H -C O -)k
i+ k= n
Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid:
R R R R
1 ■ ..
(NH2-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) -------►
I - í' -
(NH2-CH-COOH)n+(H2N-CH-CO -)k-
n‘ + k’ = n
So với các protease cổ nguồn gốc động vật và v s v khác,
papain có khả năng thủy phân sâu hơn, vì vậy nó đượcdừng để
thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân
bằng trypsin hay chymotrypsin.
Tính đặc hiệu cơ chất của papain rấ t rộng, papaỉn có khả
năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với
prolin&và với các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do.
Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn tùy thuộc vào
trạn g th ái của cơ chất, tức là cơ chất có bị biến tính hay không.
Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu
hơn. Giông các protease serine khác như chymotrypsin hay trypsin,
papain có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân các dẫn xuất acyl.
Phản ứng được tiến hành như sau:
(1) RCOX + pap-SH ------- ► p ạ p -S -C -R + HX
II
o
(2) p ạ p -S -C -R + H20 ------► pap-SH + R-COOH
II
o
T hu n h ậ n enzym từ n g uồn thực v ật 191
Phản ứng thủy phân này đã được chứng minh theo nhiều cách
khác nhau bởi Lowe và Williams 1965, Kirsh và Igelstrom 1966,
Brabacher và Bender 1966.
Tính ái nhân của phân tử sulfur và nhóm SH m ạnh hơn
oxygen và được tăng lên nhiều nhờ hệ thống histidine-asparagine
mặc dù ản h hưởng của nó không rộng như hệ thông histidine-
asparagine trong cơ chế enzym chymotrypsin. Nhờ đó mà nó thúc
đẩy phản ứng thủy phân xảy ra dễ dàng hơn do carbon của cơ chất
có khuynh hướng phản ứng với những nguyên tử có tính ái nhân:
Ọ f Ọ
\\ f I II I
R - C y 5+ ........ S - C -------- - R-C-S
I I +
X H X —H
Enzym có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ
chat peptide của mình. Enzym sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên
một chuỗi có phenylalanine ỗ vị trí p 2 như hình sau:
I
Hình 4A I Sự sắp xếp tương ứng của enzym

và chuỗi gồm 7 gốc amino acid cứa cơ chất
Các gốc amino acid được nhận biết nằm ở trên và dưới điểm
thủy phân được ký hiệu bằng chữ P i và P’i; còn Si và Si’... (i = 1, 2, 3, 4)
là các vùng tương ứng trên phân tử enzym, do đó các peptide kiểu như
X-Phe-Y-Z (X, Y, z là các gốc amino acid) thì sẽ được cất tại vị trí
giữa Y và z.
Các peptide có kiểu như X-Phe-Y (ví dụ: A la-A la-P h e-A la) có
phenylalanine nằm ỏ vị trí thứ hai trước đầu tận cùng thì không
được thủy phân bởi papain. Không những thế, các peptide này còn
có tác dụng như chất kìm hám cạnh tranh của papain.
Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiol esterase và
transferase.
192 Chư&hg 4
e- Hoạt hóa
Papain cần nhốm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc
tác. C hất hoạt hóa có ảnh hưởng rấ t lớn đến hoạt tính của
protease thực v ậ t nói chung hay papain nói riêng. Do trung tâm
hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25 và nitrogen bậc 3
của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa
papain là các chất có tính khử như: cysteine, glutatìon acid,
hydrocyanic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate... trong dó cysteine
là chất hay dùng nhất. Khi có m ặt các chất này thì nhóm ~SH ở
trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt
tính papain. Sự hoạt hóa càng được tăng cường khi có sự hiện diện
của các chất cổ khả năng liên kết với kim loại như EDTA.
Để thu được hoạt tính cao nhất, thích hợp n h ất là dùng hỗn
hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đống vai trò chất hoạt hóa
papain còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim
loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Cơ chế của sự hoạt hóa là:
Pa-S-S-Pa
(bất hoạt)
2+
Pa-S + "S-Pa {2 Pa-S'} Me2+
4fioạt động) 2+ (bất hoạt)
f~ B ất hoạt
Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các châ't oxy
hóa như: Oa, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, ỉodur acetamide,
thủy ngân chlobenzoate, cystine và các hoạt chất disulfur khác.
Đặc biệt papain rấ t dễ bị m ất hoạt tính khi có m ặt hydrogen
peroxide. Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng phản ứng
với nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papaỉn và do vậy mà phá
vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Papain bị bất hoạt thuận nghịch bồi không khí, cysteine ở
nồng độ thấp. Các ion kim loại nặng như Cd+, Cu2+, Zn2\ Hg2\ Pb2+,
Fe2+ và các tác nhân gây ức chế papain.
Thu n h ậ n enzym từ n g uồn thực v ật 193
Papain tác dụng với chloromethyl cetone của phenylalanine

và lysine thì m ất hoàn toàn hoạt tính. Trong trường hợp này
chúng tác dụng lên nhóm sulíhydryl của enzym thay vì lên nhóm
imidazol của histidine như trường hợp của trypsin và chymotrypsin.
Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazine, hydroxylamine,...
cũng ức chế papain. Carborxyl-L-glutamic acid ức chế không cạnh
tranh ở pH = 3,9-4,5.
Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm
th ế thứ hai kể từ đầu mạch c là chất ức chế cạnh tranh mạnh của
papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động.
Điều đáng chú ý là papain râ't bền đốì với các tác nhân biến
tính như dung môi hữu cơ hay được dùng trong hóa học protein (độ
quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay
urea 6-8M/1.
Các chế phẩm papain sau bảo quản vài tháng có độ hoạt động
chỉ vào khoảng 30%. Ngay cả khi được hoạt hóa, lượng sulfhydryl
tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/lmol papain và thường không quá 0,5
mol/mol. Nguyên nhân do nhóm sulhydryl đã bị khóa bất thuận
nghịch một phần và bản chất hóa học của hiện tượng này hiện nay
vẫn chưa được nghiên cứu hết.
g- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym
N hiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương dối cao.
ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3h ở 100°c.
Còn ở dạng dung dịch papain bị m ất hoạt tính sau 30 phút ở
82,5°c và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (>100°C) thì nó sẽ bị m ất
hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào
dung dịch. Điều này là do khi ở dạng dung dịch ta tăng lên đến
nhiệt độ >100°c thì cấu trúc tâm hoạt dộng của enzym bị phá hủy
hoàn toàn.
Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ỏ trạng thái tỉnh thể thì
papain có độ bền nhiệt độ thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bổi lẽ
trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó.
Papain trong dung dịch NaCi giữ d 4°c bền trong nhiều tháng.
Trong dung dịch dẫn xuâ't thủy ngân, papain cũng không m ất hoạt
tính trong nhiều tháng trong khi enzym m ất hoạt tính của nó mỗi
ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxy hóa.
194 Chương 4
Khi thủy phân các protein khác nhau thì tùy thuộc vào cơ
chất mà n h iệt độ phản ứng thích hợp cho papain cũng khác nhau.
Đối với cơ chất casein, t 0pt là 37°c. Papain dạng ổn định ở trạng
th ái khô có th ể chịu nhiệt độ sấy ở 115°c trong thời gian 2h mà
hoạt tín h vẫn duy trì dược 90%..
pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5-
8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH<4,5 hoặc
trong môi trường kiềm m ạnh có pH>12.
Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ
chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn papain phản ứng với
casein ở pH tối ưu là 7-7,5 với albumin ở pH tốì ưu 4,5-7,1 và với
gelatin lại có pH tối ưu 5,2-6 và 6,4. Điểm đẳng điện pl = 9.
Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzym
được Ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.
Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong
methanol 70% và cũng không thay đổi độ nhớt trong methanol
50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ
và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi câu hình
của papain. Các chất gây biến tịnh mạnh như TCA 10%, guanidine
hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang
học và hoạt tín h của papain.
4.3.3 V ài n é t về tin h h ìn h sả n x u ấ t p a p a in ở V iệt Nam và tr ê n

t h ế giới
Thị trường quô'c tế hiện nay có nhu cầu rấ t lớn về papaỉn. Để
đáp ứng đồi hỏi và để có thêm ngoại tệ, từ hai thập kỷ qua, khoa
làm vườn Trường Đại học Tamil Nadu (Ấn Độ) đã tổ chức nghiên
cứu và kết quả là đã chọn được một giông cây đu đủ mới từ giống
CP-15 có hàm lượng papain cao và đặt tên là CO-5. CO-5 là giống
đặc b iệt thích hợp để lấy papain. Trong bốn vụ mùa liên tiếp nó
cho papain đạt mức kỷ lục (mỗi quả 14-15 g papain thô). Đây thực
sự là m ột bước khai thông trong nghiên cứu cây đu đủ và là mức kỷ
lục của th ế giới về sản xuất papain.
Giá trị xuất khẩu papaỉn trên thị trường quốc tế rấ t cao, theo
giá thị trường quốc tế năm 1990-1991:
- Loại từ 0,2-0,4ƯI/mg (phương pháp Kuznit)

500mg: 159Fr = 26,5ƯSD.
- Loại từ 10-20ƯI/mg (phương pháp Kuznit)
250mg: 285Fr = 47,5ƯSD.
Nhu cầu về papain hàng năm ước tính là 600.000 tấn trong khi
thị trường chỉ đủ khả năng cung cấp 300.000 tấn. Trong nhiều năm
liền, Mỹ luôn là quốc gia thống trị thị trường tiêu thụ papain. Gần
đây thị trường chính của papain là khu vực châu Âu.
Thông thường chế phẩm papain thương mại chỉ chứa 5-8%
papain, còn lại là chymopapain và peptidase. Chế phẩm thương mại
thường là nhựa đu đủ (latex) sấy khô bằng các phương pháp khác
nhau, so với nhựa tươi và chế phẩm đông khô của Việt Nam chúng-có
hoạt tính kém hơn khoảng 3 lần (bảng 4.13), hàm lượng protein tan
cũng nhỏ hơn: 175mg/g chế phẩm thương mại so với 675mg/g chế
phẩm đông khô.
Bảng 4.13 Hoạt tính thủy giải protein của chế phẩm papain Việt Nam
Hoạt tính protease Hoạt tính amldase
Chế phẩm
(Ul/mg) (Ul/mg)
Thương mại (Merk) 19,9 1.5

Đông khô (VN) 53,5 31
Tươi (VN) 42,2 1,9
Các chế phẩm trên đều có thành phần tương tự nhau khi chạy
điện di trên gel polyacrylamide trong hệ p-alanine có pH 4.3 (H.4.18).
Chúng có năm tiểu phần trong đó một là p, ba tiểu phần là
chymopapain và một tiểu phần là peptidase A.
»[ I I I I r A - chế phẩm thương mại

1 2 3 4 5 B - chế phẩm đông khô
c - chế phẩm tươi
B _____________________ _____________ 1 * papain
1 2 3 4 5 2, 3, 4 - chymopapapain
5 - peptidase
cI I__ L L I___-
1 2 3 4 5
H ình 4.18 Điện di đồ các chế phẩm papain

196 Chương 4
Các kết quả thu được trình bày ở bảng 4.11 cho thấy các loại
enzym có hoạt tính protease chứa trong chế phẩm nhựa đu đủ đều có
trong các chế phẩm thu nhận được ở Việt Nam, trong đó papaỉn chiếm
4,7-9,6%; chymopapain chiếm 45,1-65,9%; peptidase B từ 6,9-39,7%;
peptidase A từ 5,5-9,6%.
B ả n g 4.14 Thành phần các enzym thủy giải trong chế phẩm papaỉn
Chế phẩm Thành phần protein (% ) Hoạt tính thủy giải (%)
Chế phẩm thương mọi Merk

Papain 4.7 3,7
Chymopapain 66,2 40,5
Peptidase B 15,2 32,9
Peptidase A 13,5 16,7
Chế phầm đông khổ (VN)
Papain 7,6 1,4

Chế phẩm tươi (VN)

Papain 9,6 3,7
Hiện nay, ỏ vùng Đaklak được Vương Quốc Bỉ tài trợ dự án phát
triển cây đu đủ. Dự án này nhằm tạo công ăn việc làm cho người dân
tộc. Toàn bộ số mủ papain được xuất sang Bỉ ở dạng thô khoảng
60000đ/kg. Theo sự hướng dẫn của chuyên gia Bỉ, mỗi sáng từ 5-7 giờ
người ta chích trái và thu mủ papain. Mủ này được phơi khô và xuất
thô. Chưa có một chuẩn mực về chât luợng papain thô này.
4.3.4 T h u n h ậ n enzym p a p a in
1- Thu n h ậ n nhự a đu đủ
a~ Đ iều k iệ n lấy nhự a
Cây: đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập
mạp cho nhựa nhiều.
Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng
từ 0,3-1 kg là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả già quá hoặc quả
Thu n h ậ n enzym từ nguồn thực v ậ t 197
to vừa cho nhựa ít vừa không sánh sệt, hoạt tính enzym không cao.
Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho ít nhựa. Để thu chế phẩm enzym
có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần tuổi.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai
đoạn độ ẩm không khí cao). Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa
chảy chậm và đặc, khó thu nhận.
- Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao
- Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp.
b- Tiến hành
- Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây.
- Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ
dường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu
quá 2cm, nếu khồng dịch nửớc và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa
và làm giảm chất lượng dịch nhựâ thu được).
- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng
trong 4-6 phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín, giữ trong tối.
- Bảo quản lạnh, mang về phòng thí nghiệm. Mục đích của giai
đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để
đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa.
- Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng
lẫn vào.
- Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng.
- Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4-7
ngày. Lần đầu tiên có thế chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu
nhựa sau, rạch 2-3 đường giữa những dường rạch trước đó.
- Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho
nhựa tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để
nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng,... vì
nó làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng,... phải
được làm bằng nhựa hoặc thép không ri.
- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% độ ẩm.
- Sau 2-3 tháng, quả đu đủ chín, có thể lấy ra khỏi cây. Đu đủ
chín có thể ăn được nhưng khó bán vì bề ngoài không đẹp. Tuy nhiên,
vỏ quả đu đủ chín xanh có chứa khoảng 10% pectin, do đó có thể dùng
quả đế thu nhận pectin.
198 Chương 4
2- Một sô'phương pháp thu nhận papain bán tinh khiết

Vấn đề tinh sạch papain dã được nghiên cứu rộng rãi từ trước
tới nay, chủ yếu dùng dung môi hữu cơ để tinh sạch papaỉn.
Nhựa đu đủ đủ tuổi, sau khi lấy về được chiết rửa 2-3 lần bằng cồn
90°, lọc lấy cặn và làm bay hơi cồn. Cặn được hòa tan trong nước cất, sau
đó lại dùng cồn để kết tủa lại, sấy ở nhiệt độ 37-40°C, thu papain.
Ngâm papain trong thể tích nước cất nhất định trong vài giờ
hoặc hòa tan nhựa tươi trong nước cất, có thể bổ sung một ít glycerine
cho tạo thành dịch nhũ tan đều, lọc lấy dịch qua vài lớp vải màn.
Dùng acetone lạnh với tỷ lệ 2:1 so với thể tích dịch lọc. Sau đó ly tâm
lạnh và thu lấy kết tủa. Sấy kết tủa ở nhiệt độ 45°c, có thể sấy chân
không hoặc phơi khô, sau đó nghiền thành bột.
Tinh chế papain bằng phương pháp kết tủa phân đoạn sử dụng
(NH4)2S04và NaCI.
Để nâng cao mức độ tinh sạch đối với papain, người ta đã sử
dụng phương pháp sắc ký cột với CMC.
3- Phương pháp thu nhận papain tinh khiết
Or Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzym papain,
chymopapain còn chứa một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao
su, chất béo,... và các chất tạp khác. Để có được quy trình tách và làm
sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải cố quy trình hòa tan
nhựa đu dủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn, tạp lớn.... Trộn
180g nhựa đu đủ khô với lOOg celite và 150 cát sạch, nghiền kỹ trong
cối ồ nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan
6,3g cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0,054M,
kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5,7). Khi dịch nhựa tạo
thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ồ trên. Quá trình nghiền và
trích được lặp lại với 300mỉ đung dịch cysteine. Sau đó rửa cối với
dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 11. Dịch
huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc
Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô đuợc sử dụng và
quá trình này có thể rất chậm. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng
xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch enzym
được tiến hành trong điều kiện lạnh.
b- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9

Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách
thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng llOml dung dịch NaOH
IM. Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở
2600rpm trong 1 giờ. Dịch trích phải trong do các tủa gây biến tính
protein đã được loại bỏ.
c- Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate
Cho ammonium sulfate vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, sau
1-2 giờ, ly tâm ở 2500rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ
lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung
dịch ammonium sulfate 40% độ bão hòa.
d- Quớ trình phân đoạn bằng NaCl
Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0,02M (pH 7-7,5),
tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCI rắn. Sau một giờ, ly
tâm ở 2500rpm trong một giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng.
e- Kết tình
Tủa được thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine
0,002M, pH 6,5 ở nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được
điều chỉnh lại đến 6,5 sau khi cho protein vào. Giữ ồ nhiệt độ phòng
trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đó duy trì ở 4°c qua đêm,
sau đó ly tâm lạnh ở 2500rpm trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể.
p Tái kết tình
Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dịch
có nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ
(đồng thời khuấy dều) dung dịch NaCI bão hòa (10ml/300ml đung dịch
protein). Khi 75% thể tích đung dịch NaCI đã cho vào, papain bắt đầu
kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 4°c qua đêm,
sau đó ly tâm thu tủa như ở bước 5. Hoạt độ riêng của enzym có thể
tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
g- Sấy chân không
Sấy chân không ở nhiệt độ khoảng 40°c, thu nhận papain tinh
chế. Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan
tinh thể enzym trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó
tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A°. Đem kết tinh dịch lỏng thu
được sau siêu lọc.
200 Chương 4
4’ Phương pháp tỉnh sạch enzym tinh khiết

Tinh chế enzym là một nhiệm vụ khó khăn với các nhà thực
nghiệm vì mang bản chất protein, nó tồn tại dưới những lượng nhỏ,
không bền, ở dạng keo và dưới dạng hỗn hợp phức tạp với những
protein giống nhau về m ặt hóa lý. Những phương pháp chiết xuất
protein được xác định dựa trên những nghiên cứu sơ bộ những tính
chất hóa lý của chúng. Những tính chất riêng của một số protein có
thể rất giống nhau và điều đó gây khó khãn cho việc chiết xuất một
protein riêng biệt ra khỏi hỗn hợp.
Enzym rấ t dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của
các tác nhân bên ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến
tính protein, gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành
nhanh quá trình trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, môi
trường có pH thích hợp và không có mặt các chất gây biến tính.
Để tinh chế enzym một cách hiệu quả cần kết hợp nhiều phương
pháp khác nhau.
a- Phương pháp hấp phụ có chọn lọc
Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan
trọng và thành công nhất. Để thực hiện phương pháp này người ta
cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Khi đó, tùy theo khả
nãng tương tác của chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác
nhau sẽ được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau
đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút enzym ra khỏi cột.
Phương pháp hấp phụ thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym.
Có thể thực hiện hấp phụ chọn lọc các enzym theo hai cách:
Hấp phụ âm tính: nếu enzym không được hấp phụ, phương pháp
xử lý này có thể xem như là dùng chất hấp phụ để tách những hợp
chất tạp ra khỏi dung dịch enzym.
Hấp phụ dương tính: nếu enzym được hấp phụ, nó sẽ được tách ra
khỏi những cấu tử khác trong dung dịch và sau đó được rửa giải khỏi
chất hấp phụ bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các dung dịch đệm khác
có khả năng rửa giải enzym. Sau khi ly tâm để loại các hợp chất không
tan, dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dịch đệm.
Thu n h ậ n enzym tử nguồn thực v ật 201
Chât hâp phụ phổ biến là gel calcium phosphate và gel nhôm c r
Than thường được sử dựng để hấp phụ các tạp chất, một sô' chất hâ'p
phụ khác như gel Zn(OH)2 đồi khi cũng được sử dụng. Tuy nhiên, gel
calcium phosphate được xem như là chất hấp phụ hiệu quả nhất trong
phương pháp này.
Muôn sự hấp phụ enzym tốt nhất, cần phải tuân theo những
nguyên tắc chung sau đây:
- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 19c
- Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1
- Môi trường hơi acid, pH = 5-6
- Nồng độ chấị điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại
của bất kỳ một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp
phụ. Vì thế, một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu
được kết quả mong muốn.
Đế hấp phụ âm tính, người ta dùng những trị số pH cao và nồng
độ các muối lớn. Nếu những dung dịch men sau khi phân đoạn bằng
muối vẫn còn chứa một lượng lớn muối vô cơ thì trước khi hấp phụ
chúng cần phải loại muôi bằng thẩm tích (hoặc lọc qua sephadex).
Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0°c trong
lúc trộn dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng.
Đây là một phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa chất hâp phụ
và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng
được chất hấp phụ.
Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:
- Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng thích hợp gel
- Trộn đều
- Quay lắng
- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào.
Ngược lại với những phương pháp phân đoạn, các thí nghiệm
kiểm tra hoạt tính được tiến hành với những mẫu nhỏ từ dung dịch
chính và tiến trình tách enzym luôn được theo dõi. Thường thì ỉượng
chất hấp phụ đầu tiên không hấp phụ được enzym nào trong khi
những protein khác được hấp phụ. Sau đó enzym được tách ra khỏi
dung dịch một cách khá đột ngột chỉ trên một hoặc hai phân đoạn
202 Chương 4
................................................................... .....-—----- —------------------------------------------r-
chất hấp phụ sau đó, dung dịch lúc bấy giờ chỉ còn lại phần lớn các
protein tạp. Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng
chất hấp phụ phải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên
(phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những
phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung dịch. Sự
xây dựng những phương pháp tinh chế men bằng cách hấp phụ phải
dựa trên một số lớn những thí nghiệm sơ bộ, được tiến hành trong
những điều kiện khác nhau.
Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ.
Nếu enzym không được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp
phụ vào nước và ly tâm lại. Trong sản xuất, để gel được phân tán tốt
trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với tóc độ
cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ
(pH = 7,6). Khi quá trình rửa giải gặp khó khăn, có thể lặp lại quá
trình cho đến khi không còn enzym nào được tách chiết, enzym với độ
tinh khiết mong muốn được thu nhận. Quá trình càng hiệu quả với
dung dịch ammonium sulfate 10%. Phương pháp giải hấp này đã được
sử dụng thành công với nhiều enzym khác nhau.
Thể tích dung dịch chất rửa giải không nên quá lớn và thường là
ít hơn thể tích gel ly tâm. Tốt hơn nên tiến hành rửa giải nhiều lần
với những thể tích nhỏ hơn là một lần với một lượng lớn.
Những gel alumine hydroxide và calcitriphosphate thường do
bản thân người nghiên cứu tự chuẩn bị lấy.
Chuẩn bị geỉ calcitriphosphate: 150ml dung dịch calcium chlorite
(132g CaCl2.6H20/I) dược hòa tan thành 1600ml với nước và lắc đều với
150ml dung dịch sodium phosphate (152g Na3P04.12H20/l). Chuẩn hỗn
hợp lên pH 7 bằng acetic acid. Phần kết tủa được rửa 3-4 lần và lắng
gạn với lượng nước lớn (15-201). Chết tủa cuôì cùng được rửa với nước
cất trong thiết bị ly tâm (thu được 9,lg khối lượng khô). Cho chúng
vào nước cất ở trạng thái lơ lửng, huyền phù và giữ như thế khoảng
một tháng. Sau khi loại bỏ lớp nước trong, gel được lắc đều và trọng
lượng khô trong mỗi ml được xác định, như thế gel đã sẵn sàng để
được sử dụng. Lưu ý nên giữ chúng trong tối.
Chuẩn bị geỉ alumine hydroxide: hòa tan 300g (NH4)2S 04 trong
6,51H20, đun lên 60°c và cho vào 420ml NH3 20% về khối lượng (dung
T hu n h ậ n enzym từ nguổn thực v ậ t 203
dịch phải được giữ ở môi trường kiềm sau đó). Đổ dung dịch nóng
(500g A12(S04)3.18H20 trong 11 nước) vào dung dịch điều chế ở trên và
khuấy mạnh. Tiếp tục khuấy trong 15 phút, giữ nhiệt độ không thấp
hơn 60°c. Pha thành 401, để cho kết tủa hình thành và lắng. Rửa
nhiều lần, thông qua quá trình lắng cặn, cho vào nước rửa lần 4:80ml
dung dịch NH3 20%. Sau 12-20 lần rửa, dung dịch có màu trắng sữa,
sau đó ta rửa thêm hai lần nữa, giữ như thế trong nhiều tuần.
Muốn cải thiện nhiều hơn nữa những tính hấp phụ của các gel
thì cần phải giữ chúng trong vài tháng. Khi đó, những tính chất vật
lý lại thay đổi, chủ yếu là mức độ hydrate hóa của chúng. Nếu không
tính đến “tuổi” và khả năng hấp phụ một phần nhất định cỏa gel thì
rất khó lập lại những kết qua thí nghiệm về chiết xuất enzym được
dẫn ra trong tài liệu. Do đó, những diều kiện để hấp phụ enzym mà ta
nghiên cứu cần phải được xác lập bởi chính người thí nghiệm, ngay cả
trong trường hợp chúng đã được mô tả trong những công trình khác.
Để thực hiện phương pháp này, người ta cho dịch enzym chảy từ
từ qua cột chất hấp phụ. Khi đó, tùy theo khả năng tương tác của chất
hâ'p phụ với từng loại enzym mà các enzym khác nhau sẽ được hấp
phụ trên các chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó bằng cách
dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút các enzym ra khỏi cột,
phương pháp hấp phụ được dùng để làm đặc dung dịch enzym.
6- Cột sắc kỷ
Để quá trình tinh chế enzym đạt hiệu quả cao nhất, ngoài
những phương pháp thông thường phổ biến như kết tủa enzym bằng
muối hoặc các dung dịch hữu cơ từ các dung dịch, phương pháp hấp
phụ chọn lọc trên jela vô cơ, cần tiến hành những phương pháp hiệu
quả hơn nữa để chiết xuất enzym tinh khiết khi'm à trong dung dịch
còn sót lại những protein khác tương tự về tính hòa tan và những tính
chất hoá lý khác.
Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách
enzym tinh khiết. Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao
đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử, nhưng trên thực tế, hầu như các quá
trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên. Quá trình
dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các protein tan trong nước hoặc
204 Chương 4
những dung dịch đệm loãng với những chất trao đổi ion khác nhau,
protein được hấp R;hụ bằng cách tạo các liên kết tĩnh điện giữa những
phần tĩnh diện trên bề mặt chất hấp phụ. Sự bền vững của việc hấp
phụ từng protein trên chất trao đổi ion được xác định bởi trị sô điện
tích của protein, mà trị sô" này lại phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ
muối (của dung dịch đệm). Khi thay đổi pH dung dịch hay tăng lực ion
của dung dịch đó (tăng nồng độ dung dịch đệm hoặc muối trung tính
vào, ví dụ: NaCl hay KC1), các liên kết bị đứt và protein được tách ra
khỏi chất trao đổi ion.
Thông thường, cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung
dịch đệm với cột trao đổi ion đã được cân bằng -» dung dịch đệm -> giải
hấp phụ bằng dung dịch điện giải (gradient muối) với nồng độ tăng dần
chảy qua các cột, các ion cưa dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa, các
enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó, enzym nào có ái lực với nhựa kém
nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất. Do đó, lần lượt các enzym khác
nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong
đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất.
Chia dòng chảy ra nhiều phân đoạn, sau đó tiến hành kiểm tra
độ enzym và hàm lượng protein toàn phần. Có thể nói, việc rửa giải
đã thu được nhiều thành công khi sử dụng nhiều mức độ gradient
muối khác nhau.
Các gel được sử dụng trong phương pháp hấp thu chọn lọc được
mô tả ở phần trên không thích hợp khi sử dụng trong phương pháp sắc
ký cột mà các nguyên liệu đặc biệt được khai thác riêng cho mục đích
này. Những dạng calcium phosphate nhất định được trộn với super-
cellulose hay cellulose. Calcium phosphate có thể được biến đổi thành vi
tinh thể h\ dr> xyapạtide và được dùng trong cột mà không thêm bất kỳ
vật liệu hạt nào.
Nhiều loại nhựa resin trao đổi ion, đặc biệt là amberlite IRC-50
(hoặc dạng tốt hơn của nó là XE-64) đã được sử dụng thành công với
nhiều loại enzym. Những dẫn xuât khác nhau của cellulose, đặc biệt là
diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose) và carboxymethyl-celỉulose
(CM-cellulose) được sử dụng rất nhiều. Ban đầu người ta đã thử dùng
nhựa để trao đổi ion. Tuy nhiên, dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được
hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ
và điểm đẳng điện trong vùng kiềm. Ở những điều kiện dùng để tách
enzym ra khỏi cột (pH và nồng độ các chất điện giải), enzym bị biến
tính từng phần và hoạt độ enzym giảm. Ngoài việc rửa giải các protein
enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế gần
đây chất trao đổi ion trên cơ sở cellulose đã được áp dụng rộng rãi. Khi
phân tách enzym, người ta sử dụng rộng rãi carboxymethyl cellulose và
diethylaminoethyl ester hóa những nhóm hydroxyl của cellulose, nhờ
những hợp chất có halogen thay thế (ví dụ: monochloâcetic
diethylchloethylamin acid).
Lực hấp phụ của một chất trao đổi ion được xác định bởi:
- Tính chất hóa lý của protein
- Đặc tính của những nhóm tích điện trong chất trao đổi ion
- Những điều kiện hấp phụ protein.
Do đó không thể đề ra trước những điều kiện cần thiết để tách
tốt nhất enzym đó ra khỏi những protein khác bằng chất trao đổi ion
mà phải tùy vào trường hợp, những điều kiện đó cần phải được nhà
thực nghiệm lựa chọn.
Ví dụ: Các anion dùng để phân tách các protein acid thừa nhóm
carboxyl tự do được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion
thấp (0,005-0, IM) ở pH 7,5-8,5.
Các cation dùng để hấp phụ các protein kiềm thừa nhóm amine,
tiến hành với những dung dịch loãng ở pH 4,5-6,5.
Trước khi đưa dung dịch protein vào cột, cần phải loại bỏ tới
mức có thể được những muối vô cơ ra khỏi dung dịch đó. Điều này đặc
biệt quan trọng nếu như người ta dùng phương pháp diêm tích phân
đoạn để bước đầu chiết xuất phân đoạn enzym.
Muốn loại trừ muối ra khỏi dung dịch enzym, người ta tiến hành
phép thẩm tích trong những túi hoặc ống cellophane đối với nước hoặc
đối với những dung dịch dệm loãng trong vòng 10-15h. Khi đó, hoạt
độ enzym giảm do những yếu tố phối hợp bị loại trừ khỏi enzym như:
do mất một phần protein hoạt động khi nó thấm qua cellophane hoặc
bị biến tính trong quá trình thẩm tích.
206 Chpfcfng 4
Trong thời gian gần đây, việc loại trừ khỏi dung dịch protein các hợp
chất vô cơ và các hợp chất khác có khối lượng phân tử không lớn được tiến
hành nhờ sephadex hay các hợp chất có kết hợp cả tác dụng lọc gel
(DEAE-sephadex, CM-cephadex). Sephadex, mạng lưới polysaccharide ba
chiều và những vật liệu tương tự hoạt dộng như những rây phân tử
được sử dụng để lọc protein dựa theo kích thước phân tử của chúng.
Sự phân tách hiệu quả dạt được trong vài trường hợp. Việc sử dụng
những vật liệu này dựa trên nguyên lý: những phân tử nhỏ hơn có
th ể di vào và có thể được giữ lại bởi các hạt. Sephadex thích hợp
với các protein khôi lượng phân tử đến 100.000 hay những
polyacrylamide liên kết ngang thích hợp vđi phân tử lượng đến
300.000. Khi các dung dịch protein chảy qua cột đã chứa đầy
sephađex, các phân tử lớn nhanh chóng theo cột di chuyển xuống
dưới, những phân tử này không thám nhập được vào trong các tiểu
p phân sephadex, trong khi đó những phân tử nhỏ (muối) bị giữ lại
và đi qua sephadex chậm hơn rất nhiều.
Khi phân tách, quá trình tiến hành tuần tự như sau:
- Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho
chảy một lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein.
- Protein chảy ra khỏi cột vào một thể tích dung dịch hơi lớn
hơn so với thể tích của nó lúc đưa vào cột.
- Ngoài ra, các cột chứa sephadex G-75, G-100 và G-200 cung
xảy ra sạ*phân tách từng phần các protein tùy theo khối lượng phân
tử của chúng. Do đó, ngoài việc loại trừ những chất “kết tinh” ra khỏi
dung dịch, các cột chứa sephadex từ G-75 đến G-200 có thể sử dụng để
phân tách từng phần protein dựa theo kích thước phân tử.
Ngoài sephadex, tấ t cả các cột đều cần gradient muối cho việc
rửa giải. Sự giải phóng các protein ra khỏi chất trao đổi ion xảy ra
trong điều kiện giảm ái lực của chất này với các protein bị hấp phụ.
Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết
với nhựa. Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau:
theo từng nấc hoặc từ từ (tách theo gradient)
- Tăng nồng độ các dung dịch đệm
- Tăng nồng độ dung dịch NaCI hay KCI thêm vào dung dịch
- Thay đổi pH của dung dịch tách.
T hu n h ậ n enzym từ nguồn thực v ật 207
Enzym nào có ái lực vói nhựa kém nhất thì sẽ dễ bị đẩy ra

khỏi cột nhất. Cuối cùng các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi
cột theo từng phần chiết khác nhau. Dung dịch chảy ra khỏi cột được
thu lại thành những phân đoạn riêng biệt với thể tích nhỏ (dưới
5ml), trong đó người ta xác định hàm lượng protein và hoạt độ
enzym. Sau khi tách, cột anion cellulose được phục hồi bằng cách rửa
bằng dung dịch NaOH 1%, cation cellulose được rửa bằng dung dịch
HCI 0,5M.
Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất được
tập trung lại (là phân đoạn chứa enzym cần thu), loại bỏ muôi và làm
cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở
nhiệt độ thấp.
Phương pháp sắc ký trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân
tách hỗn hợp protein và trong tách riêng những enzym và hormone
tinh khiết tới mức tối đa. Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp
chất protein nhỏ khỏi những chế phẩm enzym thuần nhất về điện ỉy.
Chuẩn bị hydroxy apatide: 21 dung dịch Na2HP04 0,5M và 21 dung
dịch CaCI2 0,5M được đổ vào bình 51 có cánh khuấy cơ học với tốc độ
15ml/phút đối với mỗi loại dung dịch. Rút lớp bề m ặt ra và tủa được
rửa bốn lần với 31 nước. Cho 100ml dung dịch NaOH 4% thể tích vào
bình chứa 31 nước có chứa tủa lơ lửng. Vừa khuấy vừa đun sôi bình
trong lh. Sau 5 phút, rút bỏ lớp trên, tủa được khuấy với 41 nước trong
5 phút, lặp lại như thế ba lần. Cho vào 41 dung dịch đệm phosphate
0,0 lm; pH 6,8; khuấy và đun sôi hỗn hợp. Sau 5 phút, rút bỏ lớp bề mặt
và quá trình xử lý được lặp lại lần nữa với dung dịch đệm phosphate
0,00 IM, mỗi lần đun sôi 15 phút. Trữ sản phẩm trong dung dịch
phosphate 0,001M, có thể giữ bền, ổn định ít nhất trong một năm.
c- Điện di: là phương pháp vật lý cố giá trị để phân tách các
hỗn hợp protein, enzym và cũng là phương pháp để xác định sự tinh
khiết của các chế phẩm protein. Gần đây, phương pháp này được áp
dụng ồ những giai đoạn tinh chế enzym cuấi cùng.
208 Chương 4
Nguyên tắc của phương pháp

Phân tử protein có điện tích tự do chứa những nhóm acid, base.
Nếu các phân tử protein không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó
tổng diện tích âm bằng tổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng
của điện trường ngoài, chúng di chuyển sang các cực. Các protein
khác nhau có trị sô" của điện tích tự do khác nhau. Vì thê, tôc độ của
chúng di chuyển trong diện trường ở những điều kiện nhất định về
pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp protein được
phân tách ra thành một sô" vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn
riêng biệt.
Có nhiều phương pháp điện di khác nhau. Trong tinh chế enzym
có hai phương pháp được áp dụng:
Phương pháp ranh giới chuyển động: được áp dụng chủ yếu để
xác định điểm đẳng điện và độ tinh khiết cùng tính thuần nhất của
chế phẩm enzym.
Phương pháp điện di khu vực trên giấy và trong khối hoặc trong
cột có chứa các chất làm đầy: được áp dụng để chiết xuất sơ bộ và
tinh khiết enzym. Các khôi và cột thường được chứa đầy bột cellulose,
tinh bột, những hạt thủy tinh hoặc nhựa hóa học (polyethylene
polymetacrylate): là những chất không tích điện và không hấp thụ
protein trên bề m ặt của chúng. Thực nghiệm cho thấy điện di trên hồ
làm jela thạch hoặc thạch thu được những kết quả tốt khi phân tách
protein. Tiến hành điện di trong những cột thẳng đứng cũng có những
ưu th ế khi thu nhận các phân đoạn protein và enzym, và cột có thể
được sử dụng nhiều lần sau khi đã rửa bằng dung dịch đệm tương ứng.
Điều kiện cần thiết để tiến hành điện di (pH, nồng độ dung dịch
đệm, điện th ế của dòng điện và thời gian thí nghiệm) được lựa chọn
qua thực nghiệm và tính chất của enzym nghiên cứu. Thông thường
từng thể tích nhỏ dung dịch đệm chứa enzym được đưa vào cột hoặc
khối để tiên hành điện di. Muôn vậy, dung dich enzym phải được cô
đặc đến một thể tích nhỏ và thẩm tích dôi với dung dịch đệm kể trên.
Những phân đoạn enzym thu được được xác định hàm lượng
protein, hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ.
T hu n h ậ n enzym từ n guồn thực v ậ t 209
d- Kết tinh
Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh.
Tuy nhiên, kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết.
Trước đây, khi thu nhận được những enzym kết tinh đầu tinh, người
ta cho rằng những chế phẩm đó là những enzym tinh khiết, nhưng
chẳng bao lâu người ta xác định rằng những tinh thể đầu tinh của
protein hay enzym thường có dộ tinh khiết không quá 50% và có thể
chứa nhiều loại enzym khác nhau. Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi
các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần được ỉặp lại nhiều
lần cho đến khi hoạt độ riêng tâng đến một giá trị cao nhất, không
tăng được nữa. Tuy nhiên khả năng của enzym đôi với sự kết tinỊi
chứng tỏ rằng dưới dạng đó các enzym tồn tại như là những chất
thuần nhất về m ặt hóa học, tách khỏi những protein lẹ khác.
Bề ngoài thuần khiết của những tinh thể hoạt động không có
nghĩa là chính bản thân enzym được kết tinh mà các tinỈỊ thể có thể
là các chất vô cơ hay các loại protein khác có chứa enzym. Tốt nhất là
ta nên tiến hành tái kết tinh, nếu hoạt độ chế phẩm giảm chứng tỏ
rằng enzym không được kết tinh trong tinh thể. Ngược lại, nếu hoạt
độ tăng lên đến một giá trị không đổi thì các tinh thể đó là do chính
bản thân enzym kết tỉnh.
Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh
chế enzym như làm một phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì
thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ
thể của quá trình phân đoạn, và dược sử dụng ở những giai đoạn tinh
chế cuối cùng.
Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch
ammonium sulfate. Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được
tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần. Phương pháp
thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho
đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao
từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm
tích (trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với
dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hỡặc dung
dịch đơn giản được làm bay hơi chậm. Sau đó, người ta dể yên các
210 Chương 4
dung dịch, không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó
những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muôn. Khi thêm nồng độ
muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình. Ngoài ra cần
thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết
tinh. Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ
muối n hất định bằng cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt
dộ. Ta không thể đưa ra những quy luật chung nhất và những điều
kiện tốt nhất cho từng quá trình kết tinh ở từng thời điểm khác nhau
mà chỉ có thể được dưa ra qua thực nghiệm. Người ta biết có những
trường hợp trong đó sự kết tinh sẽ tốt hơn ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm hoặc cao hơn (28-30°). Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung
dịch enzym loãng thì cần cô đặc dung dịch đó trước.
Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai
đoạn trước đó là quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Điều này
có thể tùy thuộc vào việc loại bỏ các chất lỏng gây trở ngại.
Enzym thường được kết tinh theo nhiều cách khác nhau. Ví dụ
như từ các dung môi hữu cơ. Khi những phương pháp này th ất bại,
người ta có thể kết tinh muối kim loại nặng của enzym. Chẳng hạn,
phosphopyruvate hydratase được kết tinh nhu là muối thủy ngân
không hoạt động, từ đó các enzym hoạt động có thể được thu nhận
thông qua sự loại bỏ kim loại bằng quá trình thẩm tích đối với dung
dịch ammonium sulfate chứa ammonia và cyanite.
Những tinh thể lắng xuống được tách riêng và được tái kết tinh
nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh được làm đi
làm lại cho đến khi hoạt độ riêng của những chế phẩm thu dược
không tăng ìên nữa.
e- Phối hợp những phưctng pháp phân đoạn khác nhau khi
tin h c h ế
Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương
pháp phân đoạn khác nhau phải được xác định. Không cố những
nguyên tắc đặt ra từ trước cho các thứ tự này mà thứ tự được thiết lập
tùy vào mỗi enzym khác nhau. Khi bắt tay chiết xuất một enzym mới,
cần tiến hành thành thạo thực nghiệm toàn bộ quá trình và bằng các
so sánh hoạt độ riêng cùng hiệu suất của enzym tiết ra theo những
giai doạn enzym riêng biệt mà quyết định xem những phương pháp
nào có hiệu quả nhất. Sự lựa chọn một phương thức nào đó để tinh
chế enzym không những dựa vào hiệu quả của nó mà còn do các giới
hạn về thiết bị dược sử dụng trong thí nghiệm. Dựa vào thực nghiệm
của việc chiết tách nhiều enzym, ta có thể xây dựng một trình tự mẫu
để tiến hành tinh chế enzym. Trình tự hiệu quả nhất được xác định
thông qua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm như sau:
- Hiển nhiên quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng.
- Quá trình đun nống nên được tiến hành đầu tiên do khả năng
tách riêng một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt
khi chế hóa những lượng lớn dịch chiết ban đầu. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp, phương pháp này không thực tế do tính kém bền
đối với nhiệt độ của enzym hoặc sự tồn tại của những enzym phá hoại
như proteinase.
- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulfate
hoặc kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu
tiên, khi đó ta có những thể tích dung địch lớn, cần phải nhanh chóng
tách riêng phần protein tủa xuống. Muốn vậy, người ta dùng máy ly
tâm tốc độ cao với những khối lượng lớn, hoặc máy tách tốc độ nhanh
(siêu ly tâm dạng Sarplex). Trường hợp phòng thí nghiệm không có
những thiết bị này tin dùng lọc Nutsehe, không lọc nén hoặc lọc gấp
nếp. Trong những giai đoạn đầu tiên khi phải xử lý một thể tích lớn các
dung dịch enzym, việc dùng dung môi hữu cơ ồ giai đoạn này bị giới
hạn vì sự hạn chế của kích cỡ thiết bị ly tâm.
- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính
trên aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được
khi đó dễ tách biệt bằng cách để lắng cặir hay ly tâm ở tốc độ nhỏ.
Tuy nhiên, những thiết bị thẩm tích tiện lợi và nhanh với một lượng
lớn chất lỏng còn rất hạn chế và cần phải sử dụng hàng ngàn mm
ống cellophane để xử lý 10-201 dung dịch enzym bằng phương pháp
thông thường. Thẩm tích được xem là quá trình chậm nhất trong tinh
chế enzym. Mặc dù không thể tránh khỏi, nhiữig chúng ta giảm đến
mức tối thiểu và giới hạn sự ảnh hưởng của quá trình thẩm tích đến
các giai đoạn tiếp theo khi mà thể tích dung dịch nhỏ hơn.
212 Chương 4
Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích
do enzym rấ t kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân
thông thường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim
loại ức chế có trong nước như Cu. Enzym thường có ái lực cao đối với
những enzym này ngay cả khi nồng độ của chúng trong nước rất thấp.
Điều này không quá nghiêm trọng đối với các chế phẩm thô như trong
các giai đoạn sau này.
Nếu quá trình thẩm tích sơ bộ ban đầu khả thi thì hấp phụ có
thể là phân đoạn đầu tiên tốt nhất. Chất hấp phụ thường được sắp
xếp nhanh chóng trong thiết bị. Do đó chỉ cần đợi một thời gian ngắn
thì hầu hết các chất lỏng chảy thông qua và ta có thể tránh được giai
đoạn ly tâm một lượng lớn chất lỏng.
- Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành
thẩm tích. Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách
nhanh chóng và hoàn toàn khỏi những thể tích dung dịch lớn. Tương
tự như trên, khi dung dịch enzym chảy qua sephadex, có sự giảm hoạt
độ do sự tách biệt các yếu tố phối hợp hoặc do sự kết hợp những
nhóm -SH của enzym với những ion kim loại hóa trị II có m ặt trong
sèphadex dưới dạng tạp chất. Ngoài ra cũng do sephadex đã hấp phụ
một phần protein do những nhóm aldehyde của jela dextran. Muốn
tránh khỏi sự ức chế các enzym, người ta khuyên dùng cột chứa
sephadex đã được chế hóa trước bởi dung dịch EDTA 0,5-1% và khử
những nhóm aldehyde bằng Na borhydrite rồi rửa cột cẩn thận bằng
nước cất.
- Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp
dụng trong phạm vi sản xuất \ờhr thế nó thícE hợp hơn cho những
giai đoạn sau của quá trình tinh chế. So với các phương pháp khác,
những phương pháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể cho
việc lắp cột, rửa và rửa giải cột, đồng thời sự hòa tan enzym trong quá
trình rửa giải có thể xảy ra.
* - Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những
enzym không có hoạt tính. Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số
enzym, do đó hoạt tính của enzym chỉ tăng lên rấ t ít.
Thu n h ận enzym từ nguồn thực v ật 2Ĩ3
- Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không
khí từ quạt máy vào dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm
đông đặc bằng cách làm bốc hơi chân không, làm đông khô,... thường
gây biến tính enzym và ngoài sự cô đặc enzym còn xảy ra sự gia tăng
nồng độ muôi. Tốt nhất để cô đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến
hành siêu ly tâm hoặc xử lý bằng huyền phù dextran sephadex yiô.
- Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn
chứa một lượng nhỏ protein không hoạt động, thì điện di có thể đưa
lại những kết quả mỹ mãn về mặt làm giàu enzym. Muôn vậy ta cần
có enzym với thể tích nhỏ.
• Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể
được sử dụng để chiết xuất sơ bộ các enzym. Từ hỗn hợp protein phức
tạp, ta có thể tách riêng từng phân đoạn protein enzym. Vì thế
phương pháp này cùng với sự sử dụng các chất trao đổi ion khác nhau
có thể được sử dụng trước khi điện dỉ hoặc sau khỉ điện di.
- Kết tinh thường được sử dụng như là phương pháp phân tách ở
giai đoạn tinh chế cuối cùng.
- Ở bất kỳ giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết
ra dưới dạng khô bằng cách kết tủa với ammonium sulfate, acetone
hoặc bằng cách đông khô. Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ
những chất lẫn theo, tính dễ hỏng của enzym cũng tăng lên. Việc làm
khô enzym cũng như sự bảo quản enzym trong những dung dịch rất
loãng hoặc sự làm lạnh các dung dịch đều có thể kéo theo sự ức chế rõ
rệt. Các chế phẩm enzym thô có thể được duy trì khá lâu ở 40°c
nhitag cũng có một số trường hợp cần phải bảo quản ở nhiệt độ từ -
20°c đến -50°c.
f- Các phương pháp khác
Bốn phương pháp chính và cổ điển thường được áp dụng khi
tinh chế enzym là kết tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate,
hấp phụ trên gel calcium phosphate hoặc alumina Cy, kết tủa bằng
dung môi hữu cơ (acetone hay alcohol) và cột sắc ký (ví dụ: DEAE-
cellulose). Hầu hết các enzym được tinh chế thông qua sự phối hợp của
cả bôn phương pháp trên. Tuy nhiên, cũng có một số phương pháp
khác sử dụng cho từng trường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi
bốn phương pháp nêu trên không đem lại hiệu quả cao.
214 Chương 4
Sử dụng các chất gây tủa khác: ở những giai đoạn đầu, nhiều
protein không mong muốn có thể ỉoại bỏ mà không kèm theo sự giảm
hoạt độ enzym nào bằng cách thêm vào một cách thận trọng muối
kim loại nặng (Pb). Nếu như cho quá nhiều muối này thi sẽ gây ra sự
giảm hoạt tính enzym.
Khi tinh chế glucose oxidase, người ta làm kết tủa enzym bằng
tannic acid và phức chất bị thủy phân bởi acetone. Trong nhiều trường
hợp, enzym cũng tủa do thêm vào nucleic acid.
Làm biến tính bởi cloroform: nhiều protein không hoạt động
thường được tách trước tiền bằng phương pháp Tsuchỉhashỉ nhờ quá
trình biến tính gây ra bởi việc lắc dung dịch enzym với hỗn hợp cồn và
cloroíorm. Phương pháp này đặc biệt hữu hiệu để loại bỏ tấ t cả
hemoglobin từ dịch chiết erythrocyte (hồng huyết cầu) và mô động vật.
Cô đặc: thông thường thể tích dung dịch enzym có giảm hay
không là tùy thuộc vào phương pháp phân đoạn, tuy nhiên cũng rất
cần thiết nên cô đặc dung dịch enzym tới một lượng nhỏ hơn để đạt
hiệu quả tinh chế cao. Ví dụ, khi có chất hấp phụ có ái lực cao với
enzym thì nước giải hấp chỉ chứa enzym với nồng độ thấp.
- Làm bay hơi thông qua quá trình chưng cất không được quan
tâm, vì sự tạo bọt có thể gây biến tính enzym.
- Có thể làm đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá.
- Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và dể nó trong dòng
không khí ấm.
- Phương pháp được sử dụng thông thường là làm đông khô.
Tuy nhiên, các phương pháp này không những làm cô dặc enzym
mà còn cả muối, và có thể xảy ra một ỉượng lớn muối chứa chỉ một
lượng rấ t nhỏ protein enzym.
- Một phương pháp có giá trị khác nữa là cô đặc dung dịch bằng
siêu lọc. Muối cùng với nước chảy qua màng lọc trong khi enzym bị
giữ lại, sau đổ rửa màng lọc thu nhận enzym.
- Một phương pháp cô đặc dung dịch enzym khác nữa là thêm
sephadex khô vào. Sephadex giữ lại cả muối và nước và làm táng
nồng độ enzym trong dung dịch.
Trong tấ t cả những thủ thuật về phân đoạn các enzym (điện di,
sắc ký...) thì những dung dịch muối trong nước cũng như những pha
rắn bất động đều phải được dùng những complexon, các thuốc thử
tiolic, chất chất khử thích hợp (EDTA, mercaptoethanoỉ, unitỉol) để
loại trừ cẩn thận những ion kim loại, những chất oxy hóa,... độc đối
với enzym.
g- Những tiêu chuẩn tỉnh khiết của enzym
Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzym
tinh khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không hoạt
động, người ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc
nghiên cứu những tính chất vật lý của protein.
- Làm lắng (kết tủa) dung địch protein trong phần quay phân
tích của máy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó ỉà
protein thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có
cùng trọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân (hoặc có khi có
sự bù phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có f
hằng số lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng
với tốc độ như nhau và cho một đỉnh chung!
- Điện di (phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất
hiệu quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau
về trị số di động điện di. Dung dịch enzym khi được điện di khu vực
trong jela tỉnh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì dó là dấu
hiệu của enzym thuần nhất. Thế nhưtig khi hàm lượng những protein
tạp nhỏ (< 1%) thì khổ phát hiện ra đúng.
- Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những
đỉnh quang phổ đặc trung cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu.
- Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của
enzym (cũng như protein khác) là &ết hợp sự phân tích điện di và
những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên
thạch theo grabar. v
- Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít
nhạy về độ thuần n h ất của protein là sự xác định độ hòa tan của
nó theo norchrop.
Thường để xét độ thuần nhất của enzym, người ta dựa trên sự so
sánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau.
216 Chươbg 4
"Cần lưu ý rằng, những chế phẩm enzym càng tinh khiết thì
càng dễ hỏng và khi bảo quản trong các dung dịch ở 4°c đều nhanh
chóng m ất hoạt tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzym lặp lại ta thường
thấy có sự giảm hoạt độ riêng vi các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần
enzym bị ức chế.
4.4 THU NHẬN ENZYM FICIN (E.c.3.4.22.3)
4.4.1 Đặc điểm enzym fic in

Ficin (ficain) là một protease được tìm thấỳ trong nhựa của cây
thuộc họ Ficus (sung, vả), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales.
Cây sung xuất xứ từ vùng Tây Á và phân bố khắp vùng Địa
Trung Hải. Có ít nhất khoảng 600 loài sung phân bố ở các vùng nhiệt
đới, cận nhiệt đới và ôn đới.
Ở Việt Nam cỏ nhiều loài sung khác nhau: sung (Ficus racemosa
L.); sung trổ (Ficus variegata); sung ba thùy (Ficus hirta); sung thằn lằn
(Ficus pumila L.); vả (Ficus auricuỉata lour) (Phạm Hoàng Hộ, 1962).
1- Lịch sử nghiên cứu
Cách đây hàng chục thế kỷ, con người đã biết sử dụng nhựa của
các cây thuộc họ sung để làm đông tụ sữa và sản xuất phomai.
ơ Trung và Nam Mỹ, nhựa của các loài sung Ficus glabrata và
Ficus laurifolia được dùng như một loại thuốc dể trị các loại bệnh gây
ra bởi ký sinh trùng đường ruột.
Năm 1930, B.H. Robbins nhận thấy trong nhựa của cây thuộc họ
sung có một loại enzym có khả năng tiêu diệt được giun tròn Ascaris.
Ông đặt tên cho enzym này là íìcin. Năm 1943, Caldwel thấy nhựa
này cũng có thể tiêu diệt được các loài sán dây Tríchuris trichura.
Năm 1939, Walti là người đầu tiên thu nhận được enzym ficin từ nhựa
cây thuộc họ sung.
2- Đặc điểm nguồn thu nhận Ịĩcin
Trong các cây thuộc nhóm sung, vả có vài loài có giá trị kinh tê
rấ t lớn mà cần phải kể đến là cây sung ngọt (Ficus carica) vì đây là
một loại cây ăn quả quan trọng ỏ một số nước như Hoa Kỳ, Tây Ban
Nha, Ý, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập.... Sản ỉượng hàng năm lên đến một triệu
tấn. Ở Việt Nam, loài sung này hiện nay mới dược đưa về trồng^ thử
nghiệm và bước đầu có kết quả tốt.
Cây sung ngọt có kích thước vừa hoặc nhỏ, cây cao từ 3-9m.
Đường kính thân chính thường nhỏ hơn 17,5cm, cành nhánh phát
triển mạnh. Cây có nhiều nhựa màu trắng đục có thể gây kích ứng da.
Lá dơn, màu xanh sáng, mọc xen, phiến lá dài, rộng, khá dày, mặt
trên lá nhám, mặt dưới có lông mịn. Phiến lá xẻ thùy chân vịt sâu, có
3-7 thùy chính và các thùy phụ cạn, có răng cưa không đều ở mép lá.
Hoa nhỏ, quả do cuông phù lên tạo thành. Quả dài từ 2,5-10cm, màu
sắc quả thay đổi từ vàng xanh đến đỏ đồng hay màu đỏ tía sậm. Hạt
có thể to, vừa hoặc nhỏ, có khoảng 30-1600 hạt trong một trái.
Theo tài liệu của Phân khoa Nông nghiệp Mỹ ở Washington
D.c, thành phần các chất trong lOOg trái như sau:
Bảng 4.15 Thành phần của các chất trong lOOg trái sung
Thành phẩn Quà tươi Quả khô Thành phẩn Quả tươi Què khô
Năng lượng 80 calo 274 calo Potassium 194mg 640mg
Độ ẩm 77,5 - 8 6 ,8 g 23g Carotene 0,013-0,195mg —
Protein 1.2-1.38 4.3g Thiamine 0,034 - 0,06mg 0,1 mg
Lipid 0.14 -0,3g 1.3g Riboflavin 0,053 - 0,079mg 0,1 mg
Carbohydrate 17,1 - 20,3g 69,1g Niacĩn 0,32 - 0,412mg 0t7mg
Chất xơ 1 .2 - 2 ,2 g 5,6g Ascorbic acid 12,2 - 17,6mg 0
Tro 0,48 - 0,85g 2,3g Citric acid 0,1 - 0,44mg 0
Calcium 35 - 78,2mg 126mg Chất tương tự vitamin A 20 - 270ul 80ul
Phosphorus 22 - 32,9mg 77mg Malic acid Vết Vết
Sắt 0,6 - 4t09mg 3mg Boric acid Vết Vết
Sodium 2 ,0 mg 34mg Oxalic acid Vết Vết
Hầu hết các bộ phận của cây có chứa nhựa bao gồm cao su 2,4%,
resin, albumin, cerin, đường, malic acid, rennin, protease, diatase,
esterase, lipase, catalase và peroxidase. Người ta nhận thấy rằng hoạt
tính của enzym flcin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm
do đó nhựa sung thường được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng
trong công nghiệp thực phẩm.
218 Chương 4
4.4.2 T ín h ch ấ t của enzym fic in

2- Cẩu tạo hoa học
Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa
nhóm sulfhydryl (-SH). Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản
ứng gần giếng với papain và bromeliii. Trình tự các amino acid ở gần
trung tâm phản ứng của flcin như sau:
Pro - Leu - Arg - Gln - Gly - Glu - Cys - Gly - Ser - Cys - Tryp -
Tùy theo nguồn thu nhận enzym flcin từ các loài sang khác
'nhau, tiến trình xác định khác nhau mà thành phần hóa học của
enzym ficin sẽ khác nhau.
Bảng 4,16 Thành phần amino acid của phân tử enzym ficin
Tèn tác giả nghiên cứu

s tt Amino acid
Marini bettolo Meỉrione Gouid Englund
1 Lysine 7 ỡ 9 5
2 Histidine 2 2 2 1
3 Amonỉa - - 52 25
4 Arginine 8 7 10 10
5 Aspartic acid 20 21 21 17
6 Threonine 10 8 10 8
7 Serine 13 10 16 14
8 Glutamic acid 22 23 25 25
9 Proline 11 12 13 11
10 Glycine 28 30 32 28
11 Alanine 19 21 21 20
12 Half-cystine 7 4 9 8
13 Valine 15 15 19 18
14 Methionine 3 3 4 5
15 Isoleucine 7 10 10 7
16 Leucine 14 17 17 15
17 Tyrosine 11 14 15 15
18 Phenylalanine 6 5 6 5
19 Tryptophan 3 - ỡ 6
Tổng số gốc amino acid* 206 211 300 243
‘ số luợng các gốc amino acỉd trôn 1 mol protein

T hu n h ậ n enzym từ nffuồn thực v ậ t 219
2- Tinh chất vật lỷ

Tùy theo nguồn thu nhận enzym ficin mà các tính chất vật lý
của chúng không giếng nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn
lắm. Một số tính chất vật lý của flcin có thể được trình bày như sau:
- Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000
- Nhiệt độ hoạt động: 30-80°C. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính
xúc tác: 50-65°C
- Hệ số sa lắng: 2,5-2,7S
- Điểm đẳng điện: 9-10
- Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần
trong nước và glycerine.
Tính chất vật lý của íỉcin ở các nguồn thu nhận khác nhau được
trình bày ở bảng 4.17.
Bảng 4.27 Tính chất vật lý của ficin
Nguồn PhiM ig p h ip H ệsốu

Trọng ; Điếm Hệ ư tinh Hệ BƯđc só n g
tượng d ỉn g MCh Am SỐ hấp thu Tác giả
thu nhện ttnh M ch lắn aíS -)
phần tử điện Am t lt x.(nm)
/
Tủa muổi sẳc kỷ
25.500±750
F.gtatxata trỗn CM~celhJk>6e,
23.8001700
1.95 21,1 267 Englund
pH 7
Bernhard
và
F.giabata Tủa muổi 2,56 26.000
Gutfreund
Liener
Tủa muói sắc ký

F.giabata trôn CM-cellulose, 2,61s
P H 4 .4
CAc hợp phán có V

hoạt tính được tách
F.carica war tử nhựa sung bằng Kramer và
>9.6 1,88 20,2
Kadota phưang pháp sắc Whitaker
kỷ trôn CM-
cellulose, pH 7
Marini
Eartheằrrứica Tủa muối 26.500
Bettolo
3- Tính chất hóa họe

pH hoạt động của ficin rộng: 4-9,5 (dịch nhựa sung có pH 5), pH
tối thích (pHopt ) của ũcin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzym:
geỉatỉn: pHopt = 5; casein: pHopt = 9,5; hemoglobin: pHopt = 7.
220 Chương,4
Đối với các cơ chất nhân tạo như benzoyl-L-arginine ethyl ester,
benzoyl-L-argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì
pH opt = 6 ,5 .
Ở dạng nhựa tươi, flcin dễ bị oxy hóa bởi không khí làm cho
dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt
tính xúc tác bị giảm xuống.
4- Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin
a- Các yếu tố hoạt hóa
Khi có m ặt của kim loại kỉềm, hoạt tính thủy giải protein của
flcin tăng lên. Hoạt tính của ficin cũng sẽ tăng lên khi nó kết hợp với
một trong số các nhân tố khử như: cyanide, cysteine, 1,2-
dimercaptopropanol hoặc mercãptoethanol.
Cysteine hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0,005-0,05M có
thể làm tăng hoạt tính của ficin ở dạng tinh thể và HCN 0,075M làm
tăng hoạt tính của ficin cao nhất so với các tác nhân hoạt hóa khác.
Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa khi phối hợp giữa HCN
với cysteine (cao hơn cả khi sử dụng HCN riêng lẻ).
6* Các yếu tố kìm hãm
Cũng như các loại enzym thủy giải protein khác, nhóm -SH tham
gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của ficin. Khi các chất ức chế
như HgCI2, N-ethylmalenide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay
iodoacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ílcin thì enzym sẽ
bị bất hoạt.
Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật khi liên
kết với gốc cystein của enzym flcin cũng có thể làm bất hoạt ficin như:
những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosyl-L-phenylalanine và N-
tosyl-L-lysine, diisopropylphosphofluoridae (DFP). 1,3-dibromoacetone
cũng gây ra sự bất hoạt íĩcin. Trong lòng trắng trứng có một ỉoại
protein có khả năng kìm hãm hoạt động của ficin. Người ta cho rằng
khi protein này kết hợp với ficin sẽ tạo ra một chất có hoạt tính kìm
hãm enzym.
c- Tính chuyên biệt
Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein
sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin,
fibrinogen và cả Ascaris sống dều có thể bị thủy giải bởi enzym ficin.
Ficin còn có thể thủy giải các liên kết peptide, ester, các liên
kết amide của cơ chất nhân tạo.
d- Tính bền vững
Bền vững vổỉ nhiệt độ: Khi khảo sát tính bền vững cjia enzym
flcin dạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt
tính trong hai giờ ở 50°c.
Dịch enzym ficin sẽ bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản
đông lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzym bị
chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxy hóa.
Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng (4,5-9,5) độ bền
vững của enzym ílcin đạt đến mức cực đại nhưng trong một vùng pH
hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu.
Nguyên nhân là do một nhóm -SH tối cần thiết bị oxy hóa. Tuy
nhiên, sự suy giảm tính bền vững ở pH này sẽ m ất đi khi gia tăng
nồng độ cysteinetừ 0,01-0,025M. Ficin có độ bền vững cực đại ở pH 7,5
và pHopt trưng bình ở khoảng 6-7,5.
Khi hòa tan các kết tủa enzym (sau khi tủa bằng muôi) vào
trong nước hay trong các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự
bất hoạt enzym. Do đó, để tránh được hiện tượng này người ta thường
hòa tan kết tủa enzym vào vào dung dịch đệm phosphate 0,0 IM, pH 7
có NaCI 0,1M và việc gắn enzym lên các nhân tố mang như Blue acid
83 (BB), Red acid 17 (BR), Brilliant Blue R, Bordeaux, Jurga’s Red... dể
làm tăng tính bền vững của enzym.
Cơ chế xúc tác của enzym: các loại enzym protease thu từ đu đủ,
sung, vả, dứa có tên gọi là thiol-protease, cysteintprotease hay
sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 60-80°C ở
pH tự nhiên. Tâm hoạt động của các enzym này gồm có hai amino
acid là cysteine và histidine.
Cơ chế thủy giải protein xảy ra qua hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hóa”
Gừd đoạn 2: giai đoạn “deacyl hóa” có sự tham gia của phân tử nước.
5- Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thủy phân
protein của ficin
ơ- Nhiệt độ: hoạt động thủy giải protein của enzym ficin chịu
ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ không làm
biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỷ lệ thuận với sự gia
tăng nhiệt độ và nhiệt độ.
222 Chương 4
Mỗi enzym có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc
tác của nó, tạ i đó tóc độ phản ứng của enzym đạt đến tối đa. Điểm
nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tối thích của hoạt động enzym.
6- Độ pH: độ pH của môi trường có ảnh hưởng rấ t lớn đến tốc dộ
phản ứng của enzym. Mỗi enzym có một trị số pH thích hợp nhất cho
hoạt động của enzym được gọi là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng
của enzym đạt đến mức cực đại.
Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym do:
- Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym
- Tác động vào trạng thốỉ ỉon hóa của cơ chất
- Tác dụng vào độ bền của phân tử enzym
- Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của
phân tử enzym....
4.4.3 Phương pháp th u nhận fìc ỉn
I- Phương pháp thu nhận ficin thô
a~ Thu nhận dịch enzym ficin từ các bộ phận của c&y sung
Từ lá và quả xanh: lá và quả sau khi hái về được rửa sơ, cắt nhỏ
và ngâm trong nước rồi xay nhuyễn. Lọc qua vải thường, ỉoại bỏ xác
và thu ỉấy dịch lọc. Dịch lọc được xác định đem đi xác định hoạt tính
enzym bằng phương pháp Kunitz, từ đó xác định hoạt tính của enzym
ficin chứa trong dịch lọc.
Từ nhựa thăn: nhựa sung được thu vào buổi sáng từ khoảng 6-8
giờ. Dùng dao rạch trên thân cây, cho nhựa chảy vào lọ thủy tinh cổ
màu và đậy kín. Nhựa sung được bảo quản ỉạnh à ngăn đông cố nhiệt
độ thấp hơn 0°c. Hoạt tính của protease trong nhựa tươi được xác
định bằng phương pháp Kunitz
b- Một số phương pháp chiết tách enzym
Phương pháp chiết tách enzym dựa vào tinh hòa tan
Người ta có thể sử dụng nhiều chất khác nhau để tủa protein như
muôi ammonium sulfate, pi, dung môi hữu cơ: ethanol 96%, acetone.
• Tủa phân đoạn enzym bằng dung mòi hữu cơ (ethanol 96%,
acetone)
Mục đích: thu nhận protein hay enzym từ dung dịch bằng cách
sử dụng các dung môi hữu cơ.
Thu n h ậ n enzym từ n g uổn thực v ật 223
Nguyên tắc: có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của
protein trong dung môi, trong đó có hằng số điện môi của dung dịch.
Những dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay
dimethylsulfoxide có thể ổn định mối tương tác giữa các phân tử của
dung môi với các phân tử protein, giúp cho sự hòa tan của protein
trong dung dịch. Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol..) ngược lại sẽ ngăn cản sự phân tán các phân tử protein trong
môi trường làm giảm khả năng hòa tan protein trong dung dịch. Vì
vậy, khi bổ sung dung môi hữu cơ vào dung dịch enzym sẽ làm giảm
khả năng hòa tan của enzym và dẫn đến sự kết tủa.
Ethanol 96% và acetone thường được sử dụng để kết tủa enzym
do chúng ở dạng tinh khiết, ít bị' lẫn tạp chất và giá tương đối rẻ. Mặt
khác, các dung môi này dễ bay hơi do dó dễ dàng tách bỏ dung môi ra
khỏi chế phẩm enzym bằng cách sấy nhẹ hay bằng quạt gió.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzym cần tinh sạch
- Acetone
- Ethanol 96%.
Cách làm:
- Hút 4ml dung dịch chứa enzym cần tinh sạch vào ống nghiệm.
- Vừa khuấy, vừa nhỏ từ từ dung môi (acetone hay ethanol 96%)
vào dung dịch enzym bằng ông hút có chia độ hay ống chuẩn độ cho
đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống
nghiệm). Chú ý khuấy mạnh tay để tránh hiện tượng kết tủa cục bộ.
- Để yên dung dịch sau khi tủa trong một khoảng thời gian từ
15-20 phút.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết
tủa thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
- Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết
tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzym trong dung dịch.
• Kết tủa enzym bằng muối ammonium sulfate
Mục đích: thu nhận protein hay enzym từ dung dịch bằng cách
sử dụng một lượng thừa dung dịch muối.
Nguyên tắc: tính hòa tan của enzym ngoài sự phụ thuộc vào
hằng số điện môi của dung dịch, nó còn phụ thuộc vào nồng độ muối
trong dung dịch. Khi nồng dộ muối trong dung dịch thấp, các phân tử
224 Chương 4
muối giúp ổn định các nhóm chức năng khác nhau của phân tử protein
do đó giúp cho tính hòa tan của enzym trong dung dịch và làm tăng
tính hòa tan của protein. Nồng độ muối tăng thì độ hòa tan của
protein càng tăng. Tuy nhiên khi nồng độ muôi tăng quá cao sẽ làm
giảm độ hòa tan của enzym và khi không còn đủ lượng nước cần thiết
để tương tác với các phân tử protein thì protein bắt đầu kết tủa.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzym cần thu
- Dung dịch (NH4)2S04 bão hòa.
Cách làm:
- Hút 4ml dung dịch enzym cần kết tủa và ống nghiệm.
- Vừa khuấy, vừa nhỏ từng giọt dung dịch (NH4)2S04 bão hòa vào
dung dịch enzym bằng ống hút có chia độ hay ống chuẩn độ cho đến
khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống
nghiệm). Để quá trình kết tủa protein đạt đến sự ổn định cần để yên
dung dịch sau khi tủa một khoảng thời gian 15-20 phút.
- Ly tâm hỗn hợp với tóc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết
tủa thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
- Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết
tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzym trong dung dịch.
Sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung Ficus racemosal thành chế
phẩm enzym ficin
- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ lg dịch nhựa
trong 2ml nước cất.
- Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để
enzym ficin hòa tan hoàn toàn trong nước.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ. 3000 vòng/phút trong thời gian 10
phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía
dưới, thu dịch nổi bên trên.
- Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzym bằng ethanol 96% để
thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzym trong các phân đoạn.
- Những phân đoạn có hoạt tính enzym được đưa qua lọc gel để
loại bỏ các tạp chất trong các phồn đoạn enzym.
- Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt
tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ '40°c. Chế
phẩm enzym thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0-4°C.
Hình 4.19 Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung
226 Chương 4
2- Các phương pháp tinh sạch enzym ficin

a- Phương pháp lọc gel (gel filtration)
Phương pháp lọc gel hay sắc ký rây phân tử là một loại sắc ký
được sử dụng để tách, phân tích, xác định kích thước, trọng lượng
phân tử của các chất caọ phân tử, nó cũng được sử dụng để điều chế
và tinh sạch protein.
Gel là một mạng Ịưới phân tử có cấu trúc không gian ba chiều
ghép hở ở dạng hạt. Trên hạt có những lỗ có kích thước u ong một
chừng mực nào đó mà ch! có những phân tử cỏ kích thước nhỏ hơn
có thể đi qua, còn các chất có kích thước lớn hem lỗ thì không thể đi
qua được.
Nguyên tắc: phương pháp này được sử dụng để tách các phân tử
có trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đỉ qua cột gel. Những
phân tử nào có kích thước nhỏ hcm lỗ trên hạt gel thì sẽ lọt vào trong
ỉỗ do đó khả năng di chuyển qua cột sẽ chậm đi, còn các phân tử lớn
hơn kích thước lỗ sẽ di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển
nhanh hơn và sẽ được súc giải ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ,
Hiện nay cổ các loại sephaáex được dùng để tách các chất có
trọng lượng phân tử khác nhau:
Sephadex G75: dùng để tách cốc hỗn hợp phân tử có trọng lượng
phân tử 10.000-40.000 Dalton.
Sephadex G I00: dùng để tách các hỗn hợp phân tử có trọng
lượng phân tử 20.000-50-000 Dalton.
Sephadeot G20Ồ: dùng để tách các hỗn hợp phân tử có trọng
lượng phân tử 30.000-100.000 Dalton.
Hỉện nay còn cố các loại sephadex từ G10-G200 có độ xấp
thay đổi từ độ xốp nhỏ n h ấ t đến độ xốp lớn n h ất để tách các chất
khác nhau.
Sephadex là tên thương mại của các dextran mạng alkyỉ hóa.
Khi các nhóm hydroxy được alkyl hóa thì sephadex sẽ trở nên kỵ
nước hơn nên sẽ trương nở khi được ngâm trong vài àìiíig môi phận /
T hu n h ậ n enzym từ n g uổn thực v ậ t 227
cực. Đây là một loại bột khô không tan trong nước và khi được ngâm
vào nước nó sẽ ngậm nước và trương nở. Các loại sephadex thường
được sử dụng hiện nay chỉ trương nở trong nước và một vài dung môi
phân cực và chúng không trương trong methanol, ethanol, acetic
acid. Sephadex không tương tác với các ion do nó trung hòa về điện
tích. Nếu sephadex bị oxy hóa mạnh trong các dung dịch thì hạt gel
sẽ bị phá vỡ, còn trong dung dịch acid mạnh thì các glucoside trong
gel sẽ bị thủy phân.
Cách làm:
Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 trong dung dịch NaN3 0,02%
trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn.
- Cho dung dịch đệm vào cột. Ị
- Cho một lớp gòn thủy tinh vào cột, đổ gel từ từ vào cột đếji
chiều cao cần thiết. Trong quá trình dổ gel vào cột phải khuấy đều để
gel được đồng nhất và chú ý ỉà luôn luôn phải có một lớp dung dịch
đệm trên m ặt để ngăn cản hỉện tượng khô gel. Đặt lên geì một lớp
giấy lọc.
- Để cột ổn định trong vài giờ, rửa cột bằng dung dịch đệm
phosphate.
Nạp mẫu: cân mẫu và hòa tan mẫu vào 3-5ml dung dịch đệm
pH 6,1 sao cho nồng độ protein khoảng 10mg/ml.
- Nạp mẫu vào cột, sau khi hết mẫu vẫn tiếp tục cho dung dịch
đệm qua cột.
- Thu mẫu vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 2,5ml. Mỗi
phân đoạn được thu trong thời gian 5-10 phút, đem các phân đoạn đi
đo OD 280nm. Dồn chung những phân đoạn nào có sự hiện diện của
enzym để đo hoạt tính và xác định hàm lượng enzym.
6- Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide
Phương pháp này có thể xác định được trọng lượng phân tử của
cổc protein cũng như có thể xác định được độ tinh sạch của chế phẩm
enzym khi kết hợp với phương pháp sắc ký.
Nguyền tắc: trong hệ thống này, khi cho hỗn hợp protein vào thì
các protein sẽ kết hợp với các chât bề m ặt mang điện tích âm là SDS
(Sodium Dodecyl Sulfate) để trỏ thành các phức hợp mang điện tích
228 Chương 4
âm bởi vì diện tích âm trên SDS lấn át các điện tich trên phân tử
protein. SDS sẽ kết hợp với protein do đó phức hợp này sẽ tỷ lệ với
kích thước của protein đó. Phức hợp này sẽ di chuyển về hướng cực
dương và tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phức hợp. Mặt
khác, các cầu nối -S-S- của phân tử protein bị phá vỡ bởi các chất khử
là mercapthoethanol và dithithreitol do đó khi ở trong cùng một điều
kiện thì sự di chuyển của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích
thước và những phân tử protein có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm
hơn các phân tử protein có kích thước nhỏ hơn.
Trong phương pháp điện di này, người ta có thể xác định trọng
lượng phân tử của protein và đánh giá độ tinh sạch của protein bằng
cách so sánh với một thang phân tử chuẩn, dó là một hỗn hợp gồm
nhiều prote^L có trọng lượng phân tử đã biết.
Như vậy, tốc độ di chuyển của các phân tử protein trong phương
pháp này phụ thuộc vào:
- Điện tích của mỗi phân tử (điện tích này thay đổi theo pH môi
trường, do đó cần phải sử dụng dung dịch đệm để ổn định pH)
- Hình dạng và trọng lượng phân tử
- Cường độ điện trường
- Nhiệt độ
- Tính chất của giá mang.
Người ta co thể sử dụng lớp gel gom để dồn các protein trong
mẫu lại thành băng mỏng hoặc sử dụng gel phân tích dể tách các
protein ra thành từng băng có kích thước khác nhau từ cùng một điểm
xuất phát ban đầu.
Cách làm:
• Chuẩn bị hóa chết:
Dung dịch acrylamide: 30g acrylamide (FW 71,08); 0,8g bis-
acrylamide ÍFW 154,2); 100ml nước cất. Hòa tan tấ t cả với nhau và chỉ
sử dụng 20ml dung dịch acrylamide để tiến hành thí nghiệm.
Chú ý, cần phải mang găng tay trong quá trình thao tác do chất
này có khả năng gây ung thư.
Thu n h ậ n enzym từ ng uồn thực v ật 229
Đệm geỉ phân tách Tris-HCl 1,5M; pH 8,8

- Hòa tan 3,63g Tris (FW 121,1) trong 15ml nước cất.
- Chỉnh pH xuống 8,8 bằng HC1 4m
- Thêm nước vào cho đủ 20ml'
Đệm của gel gom (Tris-HCl 0,5M, pH 6,8)
- Hòa tan l,5g Tris (FW 121,1) trong 20ml nước cất
- Chỉnh pH xuống 6,8 bằng HC1 4M
- Thêm nước vào cho đủ 25ml.
Dung dịch SDS(10%). Hòa tan lg SDS trong nước cất thành 10ml
dung dịch.
Dung môi pha mẫu: 2,5ml đệm gel gom; 4ml dung dịch SDS
(10%); 2ml glycerol; 2mg bromophenol blue; lml p-mercapto ethanol.
Thêm nước cất vào thành 10ml.
Đệm điện di: 3,028g Tris (FW121,1); 1*4,413 glycine; lg SDS. Hòa
tan với nước cất thành 11. pH dung dịch 8%.
Dung dịch nhuộm protein: 0,625 Coomassie Blue R250; 112,5ml
methanol tuyệt dôì; 2ỗml glacial acetic acid; 112,5ml nước cất. Tổng
cộng dung dịch là 250ml.
Dung dịch rửa mẫu: 100ml glacial acetic acid; 100ml methanol.
Thêm nước đủ 11.
• Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: hòa tan mẫu khô hay dung dịch trong dung môi
pha mẫu để có được nồng độ proteỉn khoảng lmg/ml dung dịch pha
mẫu. Đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, để nguội, cho vào các
>■
giếng của gel.
Chuẩn bị gel phân tách (lOmỉ)
Đệm gel phân tách: 2,5ml; nước cất: 3,2ml
Dung dịch acrylamide:4,15ml; SDS 10%: 0,lml
Amonium persulfate: ít tinh thể; TEDMED: 3,3|il
230 Chương 4
Lắc nhẹ cho tan hết rồi dùng pipette đưa gel phân tách vào
khoảng giữa hai tấm kính cho đến lúc gel cao khoảng 8cm (chú ý
không để có bọt khí). Cho một lớp nước cất lên gel, chờ gel đông lại.
Chuẩn bị gel gom
Đệm gel gom: 0,5ml; nước cất: l,18ml
Dung dịch acrylamide: 0,3 ml; SDS 10%: 20jil
Amonỉum persulfate: ít tinh thể (lpi); TEDMED: l|il
Lắc nhẹ cho tan hết.
Sau khi gel phân tách đông lại, hút bỏ phần nước cất à trên rồi
dùng pipette đưa gel gom vào khuôn. Lúc này đưa lược vào khuôn để
tạo giếng. Khỉ gel gần đông, nhẹ nhàng ỉấy lược ra rồi lắp khuôn gel
vào bộ điện di.
Tiến hành điện di: cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di.
Bơm từ từ 5-15^1 mẫu vào các giếng. Chạy điện di (điện th ế khoảng
150-200V và cường độ dòng điện khoảng 15-30mA). Sau khoảng 1 giờ,
khi thấy vạch màu chỉ thị di chuyển xuấng đến gần đáy của gel thì
ngắt điện và tiến hành nhuộm geỉ.
Nhuộm geỉ: ngâm gel trong dung dịch thuốc nhuộm protein, lay
động nhẹ cho thuốc nhuộm ngấm vào gel (1-4 giờ). Chuyển gel sang
dung dịch rửa màu, thay dung dịch vài lần đến khi gel trong suốt và
các vạch màu xanh xuất hiện tại các vị trí protein. Chụp hình và ghi
nhận kết quả.
Chương 5
THU NHẬN ENZYM TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT
Enzym từ nguồn động vật được loài người hiểu biết và sử đụng
trong chế biến sữa từ rất l&u. Người ta chỉ sử dụng động vật để thu
nhận protease.
5.1 ĐẶC ĐIỂM NGUỒN ENZYM ĐỘNG VẬT
5.1.1 K h ái n iệm chung

Hydrolase là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân. Ví dụ: amylase,
lipase, protease... trong đó quan trọng nhất là protease. Protease là
nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ
yếu trong phân tử protein và peptide. Cơ chế thủy phân như sau:
Endopeptidase
HO H HO H
NH2-C H CO-NHCH.... NHCHCO NHCHCO - NHCHCO ^ NHCHCOOH
I i I I I
Ri R2 R3 Rs
Amino peptidase HO H Carboxy peptidase
Exopeptidase"
Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt
động (zymogen) và có thể chuyển thành dạng hoạt động do chính
protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một sế liên kết
peptide trong phân tử của nó, khi đó sẽ iàm thay đổi cấu trúc phân tử
theo hướng cổ lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng
thái hoạt động.
Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình
phân gỉải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và
dimer của cơ chất dễ bị phân giải hơn dạng tetramer.
232 Chương 5
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lêp các liên kết peptide
trong phân tử protein, người ta chia protease ra làm hai nhóm chính:
Endopeptidase (proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết
peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có
trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton...). Nhóm
các protease tiêu hóa chủ yếu ở người và động vật gồm có: pepsin và
rennin có trong dịch dạ dày, trypsin và chymotrypsin của tuyến tụy và
niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm enzym này.
Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết peptide
ồ had đầu mạch. VI dụ; nhóm carboxypeptidase và amỉnopeptỉdase
phân giải liên kết peptỉde từ hãi đầu mạch polypeptide có nhốm
carboxyl và amine tự do. Ngoài ra còn có dỉpeptidase phân giải
dipeptide thành các amino acid tự do.
Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease,
người ta chia các nhóm:
- Protease acid: pepsin, renin,... hoạt động ở vùng pH acid.
- Proteose kiềm: trypsin, chymotrypsin,... hoạt động ở vùng pH kiềm.
- Protease trung tính: amylase, papain,... hoạt động ồ vùng pH
trung tính.
Bảng 5,1 Một vài enzym quan trọng trong công nghiệp
và nguồn thu nhận chứng
Mã SỐ Enzym Qul mỏ Ngành cồng nghiệp
Enzym động vật Nguổn thu nhận
phftn loại nộl/ngoạl bào sển xuất ửng dụng
Catalase 1 . 1 1 .1 . 6 Gan Nội bào - Thực phẩm
Chymotrypsin 3.4.21.1 Tụy tạng Ngoại bào - Da
Lipase 3.1.1.3 Tụy tạng Ngoại bào - Thực phẩm
Rennet 3.4.23.4 Dạ múi khế Ngoại bào + Cheese
Trypsin 3.4.21.4 Tựytạng Ngoại bàỡ - Da
5.1.2 N g u ồ n c u n g c ấ p enzym độ n g v ậ t
Các enzym thu từ động vật như: rennet, pepsin, cataỉase gan bò,
lipase, trypsin, pancreatin và lysozyme động vật. Rennet từ động vật
có tên gọi khác: rennet bò, rennin, chymosin, prorennin, rennase.
Thu n h ậ n enzym từ nguổn động v ậ t 233
I- Dạ dày và 8ự tiêu hóa ở dạ dày

a- Cấu trúc và chức năng của dạ dày
Cấu true: dạ dày là một đoạn phình ra của ông tiêu hóa có tác
dụng: chứa đựng thức ăn, nhào trộn thức ăn để thấm dịch vị. Thức ăn
sẽ chịu sự tiêu hóa của các enzym tiêu hóa chứa trong dịch vị, chuẩn
bị cho giai đoạn chính của việc tiêu hóa ở ruột non. Lúc đói dạ dày co
bóp, khi thức ăn vào cử động co bóp sẽ mạnh hơn và phức tạp hơn. Dạ
dày co bóp là nhờ ba lớp cơ khỏe: cơ dọc, cơ vòng và cơ chéo. Dạ dày
chịu sự chi phối của hai tổ chức thần kinh: một tổ chức nội tại có búi
neissner nằm dưới viêm mạc và búi auerbach nằm trong lớp cơ, hai là
tổ chức thần kinh ngoại lai gồm những sợi cảm giác và sợi vận động.
Chức năng cơ học của dạ dày bao gồm:
- Chức năng chứa thức ăn
- Chức năng co bóp để trộn thức ăn với dịch vị, tạo ra dịch trấp
- Đưa dịch trấp xuống ruột non với một tốc độ thích hợp cho sự
hấp thụ và tiêu hóa ở ruột non.
Các tuyến chính của dạ dày:
- Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhầy
- Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin, gelatinase
- Tế bào viền bài tiết HCI
- Tế bào bài tiết gastrin.
Dạ dày có thể mở rộng để giữ khoảng hai lít thức ăn. Dạ dày
chứa acid HC1 mạnh, đủ để hòa tan vật liệu (pH khoảng 1,5 đến 3,
thường là 2), nó tiêu diệt vi khuẩn và làm biến tính protein trong
thực phẩm, làm chúng mềm yếu để enzym tấn công. Dạ dày tiết nước
nhầy để bảo vệ bản thân tránh bị tác động do chính acid và enzym
của nó. Dạ dày cũng sản xuất pepsin, một enzym chuyên phân hủy
protein. Trung bình một người tiết khoảng 200^g/ml X 400ml dịch dạ
dày, có khoảng 80mg pepsin/bữa ăn. Đối với HCI ở nồng độ khoảng
6,08g/I X 400ml sẽ có 2,4g/bữa ăn. Sự phân hủy cơ chất làm giảm độ
acid trong dạ dày: làm thay đổi mạnh pH trong dạ dày, và nhờ fcoạt
động phân hủy protein của pepsin, khối lượng thức ăn- giảm và khả
năng tiêu hóa protein tăng lên.
234 Chương 5.
Pepsin phân bố trên các phần khác nhau của dạ dày và ở dạng
tiền pepsin (pepsinogen). Pepsinogen tập trung chủ yếu ở phần đáy
mỏng của dạ dày. Ở đây, pepsinogen chiếm đến 75%. Phần cơ màu
sẫm hơn là tập trung thức ăn của dạ dày.
6- Niêm mạc dạ dày - dịch vị dạ dày
N iêm mạc dạ dày: niêm mạc dạ dày là lớp màng nhầy bên trong
cùng của dạ dày, bên dưới lớp này có lớp trung gian giữa niêm mạc và cơ,
gọi là lớp nhầy cơ, bề dầy khoảng 0,5-2,5mm, có nhiều nếp nhăn khi dạ
dày lép và sẽ m ất nếp nhăn khi dạ dày chứa nhiều thức ăn.
Trong niêm mạc có những ấng bài tiết những chất khác nhau,
người ta chia dạ dày ra từng vùng:
- Vùng quanh tâm vị của niêm mạc bài tiết nhiều chất nhầy, ít
pepsinogen.
- Vùng giữa (đáy và thân dạ dày) bài tiết thành phần chính dịch
vị là HCI, pepsinogen, các enzym tỉêu hóa khác.
- Vùng dưới thân dạ dày là hãng vị, bài tiết chính là vị tố
gastrin và ít chất nhầy.
Dịch vị dạ dày: dịch vị
do các tuyến ống ỗ dạ dày tiết
1 - hành tá tràng
ra. Đó là một dịch khổng
2 - hang vj
màu, trong và không mùi.
3 - eo thắt góc
Trong dịch vị cổ hai chất hoạt
4 -thân
động chính ỉà HCI và pepsin,
5 - đáy
pH = 1*5-3, tỷ trọng 1,001-0,01.
Mỗi ngày dạ dày bài tỉết Dạ dáy iúc dói
khoảng 1500mỉ dịch vị.

Hình 5,1 Dạ dày
Thành phần dịch vị:
- Nước: 993g/lít dịch vị
- Chất vô cơ: gồm HCI và các muối clorua (NatK,Ca), các muốỉ
phosphat (Mg,Ca,Fe).
HCI là chất vô cơ quan trọng, chiếm 0,2-0,5% dịch vị dạ dày, có
tác dụng phân hủy các nucleo-protein của thức ăn và làm tan các chất
keo, thủy phân các loại đường có fructose, furanose như: saccharose
th àn h glucose và fructose. HCI còn cổ tác dụng sát trùng đối với một
sế vi trùng liên cầu, tụ cầu E.coli.
Thu n h ậ n enzym từ n g uồn động v ậ t 235
Tác dụng chủ yếu của HCI là tạo pH thích hợp cho pepsin hoạt
động và hoạt hốa pepsinogen thành pepsin.
- Chất hữu cơ, đặc biệt quan trọng là nhóm enzym tiêu hóa.
c- S ự tiêu hóa thức ăn ở dạ đày
Ở dạ dày, thức ăn được nhào trộn và thấm dịch dạ dày. Nỉêm
mạc dạ dày chứa nhiều tụyến bài tiết dịch vị. Các men tiêu hóa cơ
bản trong thành phần của dịch dạ dày là protease và lipase. Các
protease được tiết ra trong dạ dày là các enzym (men): pepsin,
gelatinase, cathepsin và rennin.
Ở động vật còn non, cấu trúc dạ dày có phần thay đổi và có hàm
lượng enzym khác nhau, phụ thuộc vào tuổi sinh lý và phụ thuộc vào
loài động vật. Dạ dày bê có cấu trúc khác so với dạ dày bò, đặc biệt là
ngăn thứ tư của dạ dày bê chứa lượng rennin rất cao giúp cho bê tiêu
hóa sữa. Cấu trúc của dạ dày bê được trình bày dưới đây:
Hình 5JZ Dạ dày bê, bò - loại động vật nhai lại, ăn cỏ

Bê mới đẻ nói chung, bộ máy tiêu hóa phát triển chuà đủ, dạ cỏ
và dạ tổ ong chiếm 30% tổng số dung tích dạ dày, dạ múi khế và lá
sách chiếm 70%. Sau 2 tháng, dạ cỏ và dạ tổ ong phát triển nhanh
nên lớn gấp đôi dạ mứi khế và lá sách. Đến 12 tháng, dạ cỏ chiếm
80%, dạ lá sách 8%, dạ múi khế 7%, dạ tổ ong 5%.
Dạ múi khế là dạ dày tiêu hóa chính của bò, còn ba dạ kia ỉà
hai nơi để chuẩn bị thức ăn sẵn sàng tiêu hóa ở dạ múi khế. Mặt
trong của dạ múi khế cổ nhỉều tuyến tiế t ra dịch vị tiêu hổa thức ăn.
236 Chương 5
ở bê, cừu Iĩ\ới đẻ, sự phát triển về hình thái và chức năng của
cơ quan tiê u iió a chưa đầy đủ, ở thời kỳ đầu sau khi đẻ, sự tiêu hóa
của chúng cũng giông như sự tiêu hóa của gia súc có dạ dày đơn. Bê ở
2, 3 tháng tuổi đang ở thời kỳ chuyển tiếp từ kiểu dạ dày đơn sang
kiểu dạ dày kép và đến 6 tháng tuổi chuyển thành kiểu tiêu hóa giống
gia súc trưởng thành. Do đó mới thích ứng việc tiêu hóa sữa trong dạ
múi khế của bê có men tiêu hóa là rennin trong giai đoạn bú mẹ.
Vị trí một số enzym được tiết trong hệ tiêu hóa động vật được
.tóm tắ t theo hình 5.3.
Dạ dày Tụyỉạng
1.
Dịch dạ dày Dịch tụy tạng
A + “Pepsinogen
HCI
Lipase
Amylase
J .
Tế bào vách
JTế bào đỉnh Trypsin
Chymotrypsin
ẴZ
Pepsin ịprotease)
Aminopeptidase
Carboxypepỉidase
Hình 5.3 Một số enzym được tạo ra trong hệ tiêu hóa của động vật
2- Đặc điểm nguồn thu nhận enzym từ tụy tạng

o- Câu tạo: tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang
phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng
khoảng 30-35cm, dày lcm và nặng khoảng 80-150g. Tận cùng bên
phải là phần đầu, lớn hơn và hướng xuống; tận cùng bên trái là phần
đuôi, nhỏ hơn, nằm ngang ở gần lá lách. Bên trong có những vách
ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức
năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết.
Tụy tạng được cấu tạo từ hai loại tế bào gọi là tế bào ngoại tiết và
tế bào nội tiết. 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc
là tế bào tuyến, các tế bào này tiết enzym tiêu hóa vào trong tá tràng,
27c còn lại của tụy tạng được cấu tạo bởi các tế bào nội tiết và các tế
bào này tiết hormone vào mạch máu để duy trì sự cân bằng glucose
Thu n h ậ n enzym từ nguồn động v ật 237
trong máu. Tế bào nội tiết có bốn dạng chính là tế bào a, p, ô và pp. Tế
bào a và p lần đầu tiên được mô tả bởi Lane vào năm 1907, tế bào ô lần
dầu tiên được mô tả bởi Bloom vào năm 1931. Các tế bào nội tiết kết
cụm lại với nhau thành một cấu trúc gọi là tiểu đảo langerhans.
Tiểu đảo langerhans có chứa những tế bào p sản xuất ra insulin,
các tế bào a tiết ra glucagon và tế bào ỗ tiết ra somatostatin, tất cả
những hormone này được tiết trực tiếp vào máu. Vài tiểu đảo còn chứa
những tế bào p p tiết ra các polypeptide của tụy. 70% tiểu đảo được cấu
tạo chủ yếu bởi các tế bào p, các tế bào này tập trung ở vùng trung tâm
của tiểu đảo, còn tế bào a chiếm khoảng 20% ở vị trí ngoại vi.
Phần ngoại tiết gồm các ống tụy tiết dịch tụy vào trong tá
tràng gồm các enzym (pancreatin) cần thiết cho quá trình tiêu hóa ở
trong ruột.
Đuôi
Thân Tụy tạng
Đẩu
Tá tràng
Hình 5.4 Tụy tạng
b- Đặc điểm một số enzym trong quá trình tiêu hóa của động vật
Rennin: vai trò của rennin là chuyển hóa sữa trong dạ dày ở
ngăn thứ tư của bê bởi sự thay đổi sữa từ dạng dung dịch sang dạng
khối (gel). Pang đã trình bày hoạt động đông tụ sữa diễn ra trong dạ
múi khế bào thai của bò khoảng 6 tháng và khả năng đông tụ tăng
dần từ tháng thứ 6, 7, 8, 9 với tỷ lệ tương ứng 2, 7, 12, 31% và thấy
cao nhất ở động vật non còn bú sữa 3-4 ngày tuổi. Hoạt động enzym
tăng cao trong khoảng giữa thai bò tháng thứ 9 và 3-4 ngày tuổi cửa
bê đang bú. Từ đó, có thể thấy có mối liên hệ khắc nghiệt giữa quá
trình sinh nở và sự kích thích bởi lượng sữa tiêu thụ.
238 Chương 5
Rennet: rennet là hôn hợp của chymosin (E.c.3.4.4.3), cũng được

gọi là rennin và pepsin (E.c.3.4.4.1) được trích từ dịch dạ dày của
động vật còn bú của bò, cừu. Tỷ lệ pepsin/chymosin (rennin) thay đổi,
vì chymosỉn chỉ hiện diện trong dạ dày của động vật chưa cai sữa và
sau đó được thay th ế bỏi pepsin, hàm lượng chymosin phụ thuộc vào
tuổi và loại động vật.
Pepsin: khi động vật ăn nhiều, cơ thể động vật thường đòi hỏi
lượng enzym tiêu hóa của bản thân nhiều hơn bình thường. Hệ thống
tiêu hóa chứa một lượng enzym ổn định và bền vững mà chúng được
sinh ra để xử lý những thực phẩm giàu dinh dưỡng và phá vỡ chúng
th àn h những phần tử nhỏ hơn. Pepsin ỉà enzym đầu tiên trong chuỗi
enzym phân giải protein. Trong bao tử, chuỗi protein liên kết ồ những
vị trí hoạt động sâu bên trong đường gấp nếp của pepsin, xem hình
5.5 (theo PDB - ngân hàng dữ liệu protein) và thức ăn được phá vỡ
thành những mẫu nhỏ. Sau đó, các peptidase và protease khác trong
đường tiêu hóa hoàn thành công việc tiếp theo. Những phân tử nhỏ
như amino acid và các dỉpeptide sau đó được tế bào hấp thu sử dụng
theo con đường trao đểi chất hoặc tham gia trong cấu trúc protein mới
cho chính cấu tạo cơ thể.
Pepsin là enzym quan trọng nhất của tuyến tiêu hóa. Pepsin
hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim bò sát và cá. Ở heo,
enzym tập trung ở những tế bào cỏạ phần đáy bao tử. Ở động vật có
vú, khu vực màng nhầy bao tử cổ những tế bào tập trung chứa
zymogen hay pepsinogen. Khi mới tiết, enzym ở dạng tiền enzym
không hoặt động gọi là pepsinogen.
Nhờ HCI, pepsinogen được hoạt hóa thảnh dạng hoạt động là
pepsin. Ở môn vị heo cửa bao tử gồm những tế bào đĩnh vách có thể
tiế t ra HCI- Chính acid này dẫn đến sự tiế t pepsinogen và chuyển
hóa bằng khả năng tự xúc tác để thành pepsin. Pepsin có tác dụng
tiêu hóa protein của thức ăn, hoạt động tối ưư ở môi trường pH = 1 ,7-2,2.
Pepsin tham gia các quá trình tiêu hóa đạm, phân hủy protein thành
pepton polypeptide mạch ngắn hơn. Tuy nhiên, quá trình tiêu hóa
của dạ dày chỉ là phân giải đạm đến dạng trung gian (pepton,
peptide) thủy phân proteỉn chưa hoàn toàn và chuyển thức ftn sang
dạng hòa tan thích hợp với quá trìn h tiẽu hóa triệ t để hơn ò ruột
non tiếp theo sau này.
Thu n h ậ n enzym từ ng uồn động v ật 239
Mức độ pepsinogen trong dạ múi khế dê là thấp nhất trong tế t

cả dạ dày động vật có vú được thí nghiệm. Mức độ cao nhất ở động
vật ăn cỏ như thỏ và khỉ được phát hiện khi số ỉượng lớn pepsinogen
có thể cần để tiêu hóa protein thực phẩm (nguồn gốc thực vật). Mặc
dù động vật nhai lại như dê và cừu cũng là động vật ăn cỏ, nhưng mức
độ pepsin thấp hơn ở động vật nhai lại, vì khi quá trình xử lý ỏ dạ
múi khế động vật nhai lại, còn thêm vào đó lượng lớn pepsinogen của
lysozym để xử lý vi sinh vật gia táng trong dạ cỏ. Để phân biệt mối
liên quan giữa thực phẩm thường xuyên và mức độ pepsinogen dịch vị,
nhiều phân tích cần thiết đối với động vật có vú khác nhau.
Ba loại pepsinogen A và hai loại pepsinogen c được tinh sạch từ
dạ múi khế của dạ dày dê. Tỷ số mức pepsinogen A và c gần 3:2. Cả
hai loại pepsinogen cho thấy sự hiện diện trong số ỉượng thích hợp ở
dạ dày động vật, ngoại trừ vài động vật như loài gặm nhấm và thỏ.
Loại pepsinogen c cho thấy chiếm 25% tổng ở người, kém hcm ở cừu
16% và ở khỉ 6-21% và cổ mối liên hệ tỷ số cao với pepsinogen A,
pepsinogen c ở dê có giá trị 40%.
Trypsin và chymochypsin: trypsin và chymotrypsin là nhữog
protease kiềm tiết ra từ tuyến tụy của động vật máu nóng. Các enzym
này khi mới được tiết ra đều ở dạng tiền enzym (proenzym) bất hoạt
(trypsinogen và chymotrypsinogen), sau đó chúng được hoạt hóa và trở
thành dạng hoạt động là trypsin và chymotrypsin à trong tá tràng.
Các enzym này thuộc nhóm enzym phân eắt các liên kết amide, liên
kết peptide. Ngoài ra chúng cũng cổ thể cắt cả liên k ết carbon-carbon.
Tuy nhiên, vai trò chính của enzym này trong cơ thể là thủy phân
liên kết peptide trong suốt quá trình tiêu hóa protein ỗ ruột non.
Bảng 5-2 Enzym từ nguồn động vật và khả năng ứng dụng
Enzym Nguđn gốc ứng dụng
Trypsin Tụy tạng động vật Y học, mềm thịt, làm trong beer
Pepsin Dạ dày động vật TrỢ tiêu hóa, mềm thịt
a-chymoỉrypsỉn Dạ dày động vật Y học
Rennet Dạ dày bô Sản xuất cheese
Protease tuyến tụy Tụy tạng động vật Trợ tiêu hóa, tẩy, thuộc da, tẩy lông, cải thiện thức ăn
240 Chương 5
5.2 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT
5.2.1 E nzym p ro te a se
Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và
động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin,
đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ
yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò,...).
I- Pepsin (E.c.3.4.4.1)
Vào năm 1713 Reaumur và Spallanzaai dã chứng minh bằng kết
quả thí nghiệm là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong
dịch vị”. Sau này, Braconnol và đặc biệt Paulo nghiên cứu về cơ chế
tiế t dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến 1836, Schwann mới phát hiện ra
là chất men phân giải protein của dịch vị.
Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, tiền pepsin
bằng cách trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm, sau đó dùng
acid để chuyển pepsinogen thành pepsin. Đến năm 1930, Nothrop đã
thu nhận được pepsin dạng tinh thể.
Pepsin là một enzym quan trọng của tuyến tiêu hóa dộng vật
thuộc nhóm enzym thủy phân (hydrolase). Số phân loại: E.c.3.4.4.1,
pepsin có tên hệ thống là peptide-peptidohydrolase.
Or Thành phần, cấu tạo: Pepsin hoạt động trong dịch vị của
động vật có vú, chim, bò sát và cá. ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu
ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase,
cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A,
pepsin phụ B, c, D và gastricsin (E.c.3.4.4.22).
Cấu trúc: Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn
lại làm thành hình cầu (từ kết quả phân tích cấu trúc tinh thể bằng
tia X), tỷ lệ bán trục = 3-3,6; rất ít xoắn dạng cấu trúc bậc hai, cấu
trúc bậc 4 cũng có gồm bốn tiểu phần; pepsin là một protein vững
chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S.
Chỉ có ba liên kết S-S trong phân tử pepsin, người ta nhận xét ít nhất
m ột trong những liên kết đó không cần thiết cho hoạt động enzym.
Liên kết hydro có thể không đóng vai trò quan trọng trong việc ổn
định phân tử.
Thu n h ậ n enzym từ nguồn động v ậ t 241
Cấu tạo: Pepsin gồm một mạch polypeptide họp thành bởi 329
amino acid, mà đầu c ỉà alanin và đầu N ỉà isoleucin. Theo
Williamson và Dassmamn, nhóm N cuối của pepsin là chuỗỉ liên kết
peptide gồm sáu amino acid như sau:
Leu - Gly - Asp - Asp - His - Glu
Thứ tự đầu cuối c của pepsin đã được xác định bởi VanVunatcis
và Herriott (1966) và bởi Willamson, thứ tự là:
Val - Leu - Ala
Nói chung, việc nghiên cứu cấu trúc của pepsin cho đến nay vẫn
còn nhiều vấn đề cần giải quyết, về cấu trúc bậc 1 , chỉ mới có phần
đầu 0 và N, cũng như phần của phân tử nằm kề các amino acid kiềm
tính (Arg, Lys) và gấc phosphoserỉn là được nghiên cứu chitiết (thếo
Korka và cộng sự 1970) với cấu trúc sau:
Glu - Ala - Thr - SerP - Glu - Glu - Leu
Thứ tự trong phần kề cận gốc phosphoserin của pepsin đã được xác
định bởi Flavin (1968) bằng phướng pháp sắc ký những phosphopeptide
sinh ra từ sự thủy phân acid, được biết là:
Thr - Ser - Phos - Glu
Trong phân tử pepsin có chứa s tạo thành ba cầu disulfua và
một gốc acid phosphoric kết hợp với nhóm hydroxyl của một trong các
gốc serin (Northrop 1930, Flavin 1954).
Sự hiểu biết về cấu trúc tâm hoạt động của pepsin cũng còn rất
hạn chế. Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm
carboxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin.
Hình 5 .5 a) Cấu trúc của pepsin; b) Cẩu trúc của pepsinogen

244 Chương 5
Trọng lượng phân tử của pepsin ỉà 34.500 Dalton. Pepsin của

heo lớn hơn một chút khoảng 35.000 Daỉton.
Bảng 5.4 Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin
Loại TLPT (daỉton) Amino acid ở đáu N
PepsinogenA 40.400 ± 1600 Leu

Pepsin A 32700 ± 1200 lie
Pepsinogen B 39.000 Met, His
Pepsin Đ 38.600 Ala
Pepsinogen c 41.400 Ser
Pepsin c 36.000 Ser và Leu hoặc He
Pepsinogen D 41.000 Leu
Pepsin 0 35.000 ile
Khối lượng phân tử của pepsinogen A-1/2/3 và Cl/2 được xác

định tương ứng là 41, 40, 40, 39 và 39kDa xác định bằng phương pháp
SDS-PAGE.
b- Đặc tinh: chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô
định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi dặc,
mừi đặc biệt giông mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose,
glucose hay saccharose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam).
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ,
không tan trong cồn 95°, ester, chloroform. Pepsin ỗ cả hai dạng: kết
tinh và thô (pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatin, cathepsin..).
Đỉểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 . Sở đĩ điểm đẳng điện
(pl) của pepsin thấp như vậy có thể do sự có m ặt của gốc phosphoric
acid trong phân tử enzym vì sau khỉ loại bỏ gốc này pH đẳng điện của
pepsin là 1,7 (Perlman 1955).
Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4. pH
hoạt dộng tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái
của cơ chất thường pH trong khoảng từ 1,8-2,2. Với cơ chất là protein
biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác của pepsin hơi chuyển về
vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể. Điều đổ cổ thể do sự biến
tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân
(theo Northrop, 1922).
Thu n h ậ n enzym từ ng uổn động v ậ t 245
Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4-5, nhitag trong vùng

pH này hoạt lực của enzym có phần thay đổi giảm đi. Từ pH = 5,5 trở
lên, pepsin không hoạt động.
Khả năng hòa tan pepsin phụ thuộc vào độ tinh khiết. Những
pepsin thu nhận từ các nguồn nguyên liệu có những đặc tỉnh khác
nhau. Pepsin heo và pepsin bò có những điểm khác nhau, pepsin cá
hồi (Salmon) có dạng hình kim. Pepsin bò không khác những pepsin
khác về m ặt hoạt động xúc tác.
Quá trình dự trữ pepsin
- Pepsinogen ổn định 12-18 tháng ở 2-8°C
- Pepsin Ổn định 1-2 nám ồ 2-8°C
- Dự trữ ở 2-8°C.
Chế phẩm pepsin thô có thể giữ hoạt tính được trong nhiều năm
ồ nhiệt độ 0-4°c. Pepsin dạng dung dịch không bền ở pH = 6 . Pepsin
ồ trạng thái khô khá bền, ngay cả trong đỉều kiện môi trường nhiệt
độ thường, dung dịch pepsin kém bền nhất là ồ pH quá thấp. Khi đó,
ta thấy xảy ra hiện tượng tự tiêu (tự phân giải) của enzym, kèm theo
sự tạo thành các phân tử nhỏ (Ceply và cộng sự, 1980). Bởi vì pepsin
là một protease hoạt động mạnh trong môi trường khá acid.
c- Sự hoạt hỏa pepsinogen thành pepsin
Như đã biết, enzym là chất xúc tác hữu hiệu nhất của cơ thể
sống, về bản chất enzym cũng là các protein. Enzym được tổng hợp ở
dạng bất hoạt phù hợp để dự trữ hoặc để vận chuyển từ vị trí tổng
hợp đến vị trí hoạt động mong muốn như trường hợp pepsin, trypsin,
chymotrypsin và carboxypeptidase. Sự hoạt động cỏa những enzym
thủy phân này được hoàn thành theo một trong hai con đường chủ yếu
là sự tự hoạt hóa như trường hợp của pepsin và trypsin... và nhóm
enzym thứ hai, loại exopeptidase, yêu cầu một hoặc vài ion kim loại
chuyên biệt để hoạt hóa. Phân tích dung dịch chứa enzym m ất những
ion kim loại là tiêu chuẩn xác định các ion kim loại cần thiết của
enzym và tế bào sống nói chung.
246 Chương 5
a) Từ enzym ban đầu

H+, pepsin
Pepsinogen Pepsin + X
MW = 42,000 MW = 38,000 MW = 4000
trypsin
Trypsinogen T rypsin
MW = 34,000 entero kinase MW = 34,000

trypsin
Chymotrypsinogen Chymotrypsln
trypsin
Procarboxypeptidase Carboxypeptidase
b) Khí có mặt ion kim loại
Glycylglycine dipeptỉdase (inactive) + Co*"* + Mg**

- ■» Glycylglycine peptidase (active) + Co++ + Mg*4
Leucine amínopeptidase (inactive) + (Mn** or Mg**)

-.... — » Leucine aminopeptidase (active)
Hình 5.7 Sự hoạt kốa emym thủy phân

a) Từ một enzym có sẵn; b) Nhở sự có mặt cứa ion kim loại
Pepsinogen: Pepsinogen được khám phá do Langley. Ở phần

màng nhầy dạ dày của động vật, có các tế bào chứa zymogen hay
pepsinogen (dạng tiền pepsin không hoạt động). Phần môn vị heo của
bao tử gồm những tế bào đỉnh vách, nó có thể tiết ra acid HCI. Chính
acỉd này dẫn đến sự tiết của pepsinogen và chuyển hóa nó bằng khả
năng tự hoạt hóa để thành pepsin với nồng độ acid tự nhiên của môi
trường trong dạ dày. Quá trình này xảy ra ồ pH < 6 . Khi trong môi
trường có pH cao hơn, có thể xảy ra sự tái kết hợp ngược lại.
Northrop và Herriot đã thu được pepsinogen dạng tinh thể hình
kim và xác định pepsinogen không những có trong dịch vị mà còn
hiện diện trong máu, nước tiểu, tinh dịch, lượng pepsinogen trong máu
tăng giảm theo một tỷ lệ nhất định với ỉượng pepsinogen trong dịch
vị. Từ môi trường trung tính chuyển sang môi trường acid, đầu tiên
pepsinogen sẽ chuyển thành pepsin ở pH = 5,1; 40°c. ở pH = 4,1 mức
độ chuyển hóa tăng gấp mười lần.
Trọng lượng phân tử pepsinogen heo khoảng 42.000 còn pepsin
heo khoảng 35.000Da. Theo Oke Khovitch thì trọng lượng phân tử
pepsinogen = 42.240Da; trọng lượng phân tử của pepsin = 39.930Da.
Pepsinogen bò có sự khác nhau về thành phần amino acid nhưng

hoạt động xúc tác thì như nhau. Tất cả pepsinogen có đầu N là Val và
đầu c là Ala. Pepsinogen là một protein được cấu tạo từ 400 gốc
amino acid và ở dạng mạch polypeptide dơn, tuy nhiên pepsinogen
chứa nhiều lysin hơn pepsin.
Pepsinogen được tách từ các động vật khác nhau (heo, dê, khỉ)
hay các pepsinogen (A,B,C,D) khác nhau của cùng một nguồn gốc thì
không có sự khác nhau nhiều về thành phần amino acỉd. Sự khác
nhau đáng kể nhất là tỷ lệ của Glx/Asx và Leu/lle trong các loại
pepsinogen. Sự khác nhau này được đặc trưng cho các loại pepsinogen
từ các nguồn động yật khác nhau.
Hình 5.8 Cấu trúc pepsinogen
Ở pH = 4,7 không có hoạt động-đông tụ, ở giá trị pH nhỏ hơn 6

pepsinogen có tính acid kém hơn pepsin. Pepsinogen ổn định được
trong môi trường trung tính vỉf kiềm yếu pH = 7-9, nhưng sẽ bị phá
hủy cấu trúc nếu pH lớn hơn 9 và bị hủy nếu ngâm trong dung dịch
etanol 50% trong 24 giờ, pepsinogen chỉ ổn định trong một thời gian
ngắn với pH môi trường nhỏ hơn 6 .
248 Chương 5
Pepsinogen bền trong dung dịch có pH thấp hơn 8,5. Trong vùng
pH =“*8,5-10,5 khi giữ trong một thời gian ngắn, sự biến tính kiềm của
pepsinogen thuận nghịch, nhưng giữ lâu trong môi trường kiềm thì sự
biến tính không thuận nghịch, về cơ chế, sự biến tính kiềm của
pepsinogen là sự phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử protein-
enzym. Trong hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ, phân tử pepsin và
pepsinogen m ất khả năng hoạt hóa thành pepsin hoạt động.
Sự hoạt hóa pepsinogen: enzym phải được hình thành bên trong
tế bào, nhưng được kiểm soát bên ngoài vì nếu không nó sẽ xử ỉý
ngay tức thì chính protein của tế bào. Để giải quyết vấn đề này,
pepsin và nhiều enzym phân cắt khác nhau được tạo ra ở dạng bất
hoạt “proenzym” mà nó có thể được hoỊt động an toàn bên ngoài tế
bào. Pepsin được hình thành từ hơn 44 amino acid, vị trí hoạt động
nơi gấp nếp và dây iiên kết của cả khối lớn enzym. Trong bao tử,
chuỗỉ không có tác dụng này bị cắt bỏ và enzym bắt đầu thực hiện
chức năng của mình.
Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức là pepsinogen bất
hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính
pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin. Quá trình hoạt
hóa pepsinogen là quá trinh thủy phân liên kết peptide giữa acid
glutamic 41 và izoleucin 42, giải phóng peptide kìm hãm (Ông và các
cộng sự viên 1968), thành phần amino acid của peptide kìm hãm này
tương ứng với 41 amino acid của pepsinogen (Koen và cộng sự, 1968)
và phản ứng được xúc tác bởi ion H+ và cũng chính bởi pepsin.
Pepsin dược tạo thành lại tiếp tục xúc tác quá trình giải phóng
peptide kìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy
quá trình này mang tính chất của một quá trình tự xúc tác. Sự hoạt
hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH<5 ,6 . Khi
pH>5,6 peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin
tạo thành phức hợp không hoạt động.
Việc hoạt hóa pepsinogen bao 'gồm sự ỉoại bỏ khoảng 1% phân
tử, như vậy phần dược loại bỏ đi là phải có tính kiềm trội hơn hẳn
phần còn lại. Quá trình động học của sự hoạt hóa này đã được nghiên
cứu, bắt dầu bằng sự acid hóa hoặc bằng cách cộng thêm pepsin vào
môi trường. Ở pH = 5,4 quá trình này xảy ra theo cơ chế tự xúc tác.
Kết quả trọng lượng phân tử giảm 20%.
Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen (heo) cổ thể

biểu diễn như sau: pepsin
Pepsinogen phửc hợp — -— ► pepsin - chất ức chế + 5 peptide

pH = 5,4
Phức hợp pepsin - chấỉ ức chế «« pepsin + chấỉ ức chế

pH = 5,4
Chất ức chế ----- — ► 4 peptide
Trong quá trình hoạt hóa pepsinogen, bằng phương pháp chuẩn
độ, người ta dã chỉ ra rằng, một phân tử pepsin được tạo thành kèm
theo với sự bẻ gãy chín liên kết peptide. Sáu peptide đã được sản sỉnh
ra trong quá trình hoạt hóa gồm năm peptide nhỏ và một peptide lớn:
- Peptide lớn nhất là một chất ức chế pepsin (trọng lượng phân
tử: 5.000); ỏ pH = 5,4 chất ức chế này vẫn kết hợp với phân tử pepsin;
do đó với những điều kiện như vậy, quá trình này không thể thực
hiện được C0 chế tự xúc tác. Ở những pH thếp hơn, chất ức chế có thể
phân ly thuận nghịch ra khỏi phân tử enzym. Dưới tác dụng của
pepsin, chất ức chế (inhibitor) được thủy phân thành 4 peptide nhỏ ở
pH khoảng từ -5; mức độ phân hủy cao ở pH gần bằng 4.
Cùng với chất ức chế này, quá trình hoạt hóa còn giải phóng ra
5 peptide nhỏ khác như đã nói trên. Đây là những peptide trung tính,
trung bình có khoảng 10 gốc amino acid; trọng lượng phân tử trung
bình của tập hợp cả năm peptide vào khoảng 4000. Như vậy, cùng vớỉ
sự thủy phân chất ức chế, toàn bộ quá trình hoạt hóa đã được thực
hiện với việc bẻ gầy chín liên kết peptide.
Sau đây là sơ đồ mô tả sự biến đổi pepsinogen thành pepsin:
Pepsinogen:
MW 42.000
Leu- lieu Leu- Glu lieu- Gly- Asp- Asp- His- Glu-.-. Val-Leu- Ala-
'TTTT3
MW 4.000 Mw 'V
MW 3.200 v----------------- 35 '-----------------
000 '
T 7
5 peptide chất ức chế
r
pepsin
250 Chương 5
Dựa vào cấu trúc của pepsinogen (H.5.8) cho thấy sự tấn công
chính của pepsin ở những điểm có đánh dấu p, phóng thích các
peptide hỗn tạp (A), chất ức chế (B) và pepsin (C).
Khi nghiên cứù cấu trúc của pepsinogen, nhận thấy trung tâm
hoạt động hình thành đầy đủ trong phân tử, nhưng trong môi trường
trung tính nó bị khóa chặt bởi một đoạn peptide kìm hãm (phần giữa
hình 5.5b, còn hình 5.5a là cấu trúc phân tử pepsin sau khi tách khỏi
đoạn peptide kìm hãm), trong đó 6 mạch nhánh lysin và arginin của
đoạn peptide kìm hãm hình thành các cầu nối với các chuỗi
carboxylate và của glutamate và gốc aspartate của pepsin. Đặc biệt là
sự tương tác tĩnh điện giữa một mạch nhánh lysine của đoạn peptide
kìm hãm với cặp gốc aspartate của trung tâm hoạt động. Kết quả là
pepsinogen không có hoạt tính thủy phân. Ở môi trường acid thì cầu
nối giữa đoạn peptide kìm hãm và pepsin bị phá vỡ nên pepsin trở
nên hoạt động.
d- Sự tự tiêu của pepsin: pepsin vừa là protein vừa là enzym
phân giải protein, pepsin có khả năng phân hủy chính nó. Sự tự tiêu
đã được coi là nguyên nhân của tính không đồng nhất khi điện di của
nhiều chế phẩm enzym pepsin.
Theo Ingram, trong quá trình pepsin tự tiêu hóa ở nhiệt độ
45°c, pH = 4 trong 24 giờ, nhận thấy có 45% tyrosin của phân tử
enzym được giải phóng và kết tinh, ngoài ra còn xuất hiện các peptide
có phân tử lượng nhỏ từ 1 .000-2 .000.
Theo Perlmann, sự tự tiêu hóa của pepsin tạo ra những sản
phẩm có thể thẩm tích và có hoạt dộng phân giải protein, tuy
nhiên sẽ chỉ còn được 64% hoạt tính gốc, hoạt tính này được thực
hiện trên hemoglobin.
Nói chung, sự tự tiêu của pepsin thường xảy trong trường hợp
pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp, nhiệt độ thích hợp, tạo ra nhiều
thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn pepsin, giảm lượng tyrosin và
chỉ thành phần nào có đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động.
e- Tinh chât đặc hiệu và khả năng thủy phân protein của pepsin
Pepsin là enzym quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào
dạ dày. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn, chuyển
Thu nh ộ n enzym từ n g uổn động v ật 251
sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hóa triệt
để ở những giai đoạn tiếp theo trong ruột non. Pepsin xúc tác sự thủy
giải protein, tạo thành chủ yếu những peptide ngắn gọi là pepton, có
ít hay không cá amino acid tự do.
Trong sự thủy phân liên kết peptide, hai gôc aspartate ở trung
tâm hoạt động pepsin hoạt hóa một phân tử nước và chính phân tử
nước này tham gia xúc tác phản ứng thủy phân.
Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin. Pepsin A và
D tính đặc hiệu xảy ra trong phạm vi rộng hơn pepsin B và c. Pepsin
A, D thủy phân lên cả hai cơ chất Hb và APD (acetyỉ-L-phenyỉalanyl-L-
diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên APD còn pepsin c chỉ
lên cơ chất Hb.
Chúng ta chú ý rằng những đặc tính về enzym của pepsinogen
và pepsin dê so sánh với những đặc tính của những động vật khác.
Hoạt động thủy phân Hb của pepsin c dê khoảng pH 3 cao gấp hai
lần so với pepsin A. Sự khác nhau về hoạt tính thủy phân Hb ở pH
khoảng 3 giữa pepsin A và c dược khảo sát nhiều ở động vật khác.
Khi so sánh hoạt tính thủy phân của pepsin A heo, những hoạt tính
của pepsin c dê khoảng pH 3 có thể so sánh hoạt tính cao nhâ't của
enzym heo ở pH 2. Hoạt tính pepsin A dê khoảng pH 2 bằng một
nửa của pepsin Ạ heo. Sự khác nhau về hoạt tính cũng được phát
hiện khi chuỗi insulin B oxy hóa được dùng như một cơ chất. Mặc dù
pepsin A dê thích hợp thủy giải hoặc phần thơm còn lại ở vị trí Pl và
pr của cơ chất cũng pepsin A khác, mức độ liên quan sự phân cắt của
những vị trí nhạy cảm cao là nối Leu1-Tyr16 và Ala14-Leu15 khác
nhau giữa pepsin A của các nguồn động vật cổ vú khác. Sự khác
nhau có thể dựa vào sự khác nhau về cấu trúc sơ sài của những vị trí
hoạt động của pepsin.
Dựa vào pepsin A dê có hai loại là pepsin A-2/3 giữ hoạt động
chủ yếu ở khu vực acid yếu pH>3 còn pepsin A-1 thì không. Điều này
cho thấy pepsin A 2/3 thích hợp để tiêu hóa thực phẩm hơn pepsin
A-1 khi pH của thành phần dịch dạ dày tăng khi số lượng thực phẩm
tăng. Pepsin A cổ hoạt tính thích hợp ỏ pH acid yếu như trường hợp
ồ thỏ. Những loại pepsin A này cổ thể thu nhận được từ những con
động vật già.
252 Chương 5
Hoạt động xúc tác của pepsin

Pepsin là một protease thuộc nhổm hydrolase có khả năng phân
cắt các liên kết peptide của protein. Pepsin tác động lên hầu hết các
protein tự nhiên và có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có
trong phân tử protein tạo thành chủ yếu các peptide chứa từ 5-8
amino acid.
Pepsin không có khả nãng phân cắt triệt để protein thành các
amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nấi liên kết peptide của
protein tạo sản phẩm pepton có trọng lượng phân tử nhỏ. Đôi khi
pepsin phân cắt protein tạo thành những dạng peptide đơn giản hơn
như: oligo-protein và một số ít amino acid tự do như leucin, alanin,
tỵrosin nhưng đây không phải là trường hợp thông thường.
Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, nó không phải ỉà
một esterase và không tác dụng vào những mối liên kết amid. Các kết
quả nghiên cứu cho thấy pepsin chỉ phân cắt chủ yếu các liên kết
peptide do nhóm amine của các gốc amino acid ky nước, đặc biệt ỉà
tyrosin, phenylalanine, leucin kết hợp với nhóm carboxyl của các gốc
acid glutamic, methionine, glycine, cysteine ... Các nhổm kỵ nước của các
gốc amino acid thơm góp phần quan trọng trong sự kết hợp với enzym.
Tính chất đặc hiệu của pepsin thể hiện ở chỗ là pepsin chỉ cắt
những liên kết peptide tạo thành do amino acid thơm như tyrosin,
phenylalanine, tryptophan liên kết với các amino acid khác.
- c o - NH - CH - c o i NH - CH - CO --------- ► - C O - N H - C H - COOH + NH2-C H - c o

I I Y T
Ri Rĩ Ri Rí
Ri: gốc tyrosin, phenylalanin, tryptophan; R2: Amino acid khác; ị : vị trĩ pepsin c ắ t
Ngoài ra pepsin còn thủy phân liên kết giữa Ala-Ala, Ala-Sèr, nó
cũng cắt liên peptide giữa Leu-Val, Val-Cis, Glu-Asn( Leu-Glu, nhưng ở
mức độ thấp hơn.
Pepsin phân cắt một cách dễ dàng các protein tan trong nước
như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, caxin... Còn những protein
không tan hay các nucleoprotein, protein hình sợi như keratin, neucin,
glagen, gluten, các nucleoproteia.. Pepsin phân cắt rất khó hay không
cắt được. Nó sẽ không cắt ở liên kết chứa valine, alanine và glycine.
Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxides.
Thu n h ậ n enzym từ nguổn động v ật 253
Đặc tính thủy phăn chuyên biệt đối với chuỗi insulin B
Chuỗi insulin B oxy hóa được thủy giải bằng pepsin A-1 và A-3.
Pepsin A trích từ khỉ heo, ngựa (ở Nhật) được dùng để so sánh. Kết
quả tóm tắ t bên dưới: hai vị trí nhạy cảm nhất để thủy giải được
khám phá là nối: Ala14-Leu15 và Leu15-Tyr16. Mức độ phân cắt nối
Leu15-Tyr16 là 930 nmol/mỉn/mg pepsin dưới điều kiện tiến hành bình
thường. Tỷ số của mức độ phân cắt nối Ala14-Leu15 và Leu15-Tyr16
khác nhau giữa pepsin các loài, và những giá trị này là 1:0,4, 1:0,6, 1:
0,25 và 1: nhỏ hơn 0,1 ở pepsin A của dê, heo, khỉ và ngựa (ở Nhật)
tương ứng. Vị trí phân cắt thứ hai là nối Leu1-Vai12 và Phe25-Tyr26.
Quá trình ủ lâu với pepsin có thể cắt những nối khác như Tyr16-Leu17
và Phe24-Phe25.
1 10 20 30
FNNEHLCaGSHL VEA L Y LVCaGERGF F YTPKA
t M : t
Xem vị trí cắt của chuỗi insulin B oxy hóa bằng pepsin A từ dê,
heo, khỉ (Nhật) và chuột xạ nhà. Vị trí cắt biểu diễn dưới chuỗi: ban
đầu ( |) lần hai (ị) và thứ yếu khác (:).
Tỷ số mức độ phân cắt của nối Leu15-Tyr16 và Alal4-leu15 khác
nhau giữa pepsin và những giá trị là 10:0,4, 1:0,6, 1:0,25 và 1: nhỏ
hơn 0,1 ỗ pepsin A từ dê, heo, khĩ (Nhật) và chuột xạ nhà tương ứng.
Cũng như nhiều protease khác, ngoài việc phân cắt được liên kết
peptid, pepsin cổ khả năng phân cắt cả liên kết ester (Losins và cộng
sự, 1954), hay nhũtag hợp chất ester sulfite có nhân thơm và có thể
làm đông tụ sữa (Teply và cộng sự, 1980). Ngoài ra pepsin còn gây ra
sự phân giải protein ở một số enzym như: trypsin, pepsin, amylase....
Ngoài khả năng thủy phân các protein tự nhiên, pepsin còn
thủy phân nhiều cơ chất tổng hợp. Trong đó các liên kết peptỉde
chứa p-nitrophenylalanine, 3,5-dibromotyrosine hay 3,5-dinitrotyrosine
và diiodtyrosine đều bị thủy phân và chúng được dùng trong nghiên cứu
động học phản ứng của pepsin. Pepsin không tác dụng lên nucleoprotein,
hoặc các protein không tan như: keratin, neucin....
Một số trường hợp đặc biệt trong sự thủy phân protein của
pepsin phải kể đến như sau:
254 Chương 5
- Chất tạo keo tự nhiên colagen natif chịu sự thủy phân của
pepsin, trong khi đó chất tạo keo tinh sạch lại tỏ ra kháng pepsin.
- Các peptide có phân tử lượng nhỏ đặc biệt có thể kháng
enzym.
- Một vài protein khác dễ bị tấn công khi ở dạng tự nhiên hơn
là khi đã qua một lần bị biến tính, trường hợp của ovalbumin là một
ví dụ điển hình cho nhận xét này.
S ự p h â n cắ t pep sin lên cơ c h ấ t tổng hợp
Bergmann và Fruton nghiên cứu những cơ chất nhạy cảm nhất
với hoạt động của pepsin là:
Carbobenzôxy - L - glutamin
Quá trình thủy phân diễn ra rõ rệt hơn khi cơ chất có hai nhóm
-COOH tự do. Chính vì vậy mà carbobenzoxyl-L-glưtamine — L-tyrosin
-glycin không bị tấn công dễ dàng như các cơ chất nói trên.
Pepsin có thể thủy phân các dipeptide đầu N có chứa hai gốc
amine therm, thực vậy ở khoảng 37°c và pH = 2 thì N-acetyl-L-Phe-
Tyr và N-acetyl-Tyr-Tyr bi phân cắt. Sự thủy phân nhũtag cơ chất như
vậy có đi kèm với nhũiig phản ứng dây chuyền tiếp theo (Newman và
cộng tác).
Trong quá trình tấn công của pepsin không có sự thủy phân,
đồng thời và tuần tự cùng với sự tạo cuối cùng các sản phẩm “trơ”.
Trái lại có một hoạt động protease tức thời, không nắm rõ được sản
phẩm trung gian và đặc biệt tạo thành pepton, tuân theo qui tắc “tất
cả hay không có gì* (theo Tiselius và Eriksson Quensel).
Pepsin bò cổ khoảng 20-40% hoạt tính của pepsin heo đối với cơ
chất N-acetyl-L-phenylalanyl-Lrđiiodtyrosin. Trên cơ chất Hemoglobin
pepsin bò chỉ có 60-70% hoạt tính của pepsin heo.
S ự chuyển peptide do pepsin xúc tác

Với sự có mặt của các chất nhận chứa một carboxyl tự do, pepsin
có thể thực hiện sự chuyển đổi gốc tyrosin, phản ứng này tiến hành
dựa trên sự chuyển amino của phần amine của chất cho là tyrosin
sang chất nhận (theo Newmann và cộng tác).
Sơ đồ phản ứng sau:
R - 1 - C O - N H - R 2 + R ^ - COOH -> R3 - c o - NH - R 2 + Rì - COOH
Ịt 't
Gốc R2 là: - C H - C H 2 - C 6H4 - O H
COOH
f- N hữ ng yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tin h của p ep sin

Ả nh hưởng của pH: pepsin là một protease acid điển hình,
hoạt dộng ở vùng pH acid từ 1 -> 4, pH thích hợp của pepsin khoảng
1,5 -> 2,4. Đối với mỗi cơ chất thì pH thích hợp cổ thể thay dổi.
Cơ chất là hemoglobin thì pH tối ưu là 2 ,2.
Cơ chất là albumin thì pH tối ưu là 1,5.
Pepsin bền vững ở vùng pH
rấ t acid, nó có độ bền tối đa ỗ
pH = 4 -> 5 nhưng trong vùng pH
này hoạt lực của enzym rất thấp.
Từ pH > 5,5 pepsin không hoạt
động vì có sự biến tính của protein
enzym mà cụ thể là phá vỡ một số
liên kết hydro trong phân tử làm
cho cấu trúc của enzym bị biến đổi. pH
Ở pH quá thấp thì pepsin xảy ra H ình 5.9 Đồ thị biểu diễn sự
hiện tượng tự phân. Pepsin đã bị vô phụ thuộc hoạt tính pepsin vào
hoạt trong môi trường kiềm, có thể pH với cơ chất hemoglobin
phục hồi hoạt tính một phần khi
đưa pH về vùng thích hợp với nó.
Pepsin có điểm đẳng điện pl khoảng 1-1,4* Pepsin của heo có điểm
đẳng điện p l là 1 .
Ảnh hưỡng pH lên các loại pepsin khác nhau, như pepsin B bền
à pH = 6,9 và 25°c và cũng điều kiện này pepsin c sẽ bền hơn pepsin
A. Còn ở pH = 8,5 pepsin c bị vô hoạtnhanh chóng, pepsin D thì
256 Chướng 5
khồng bền ở pH > 6 . Đối với pepsin có nguồn gôc khác nhau hay các
loại pepsin (A,B,C,D) có cùng nguồn gốc, pH tối thích cho chúng hoạt
động là khác nhau. Ví dụ, pepsin A và c tách chiết từ dạ dày dê có
hoạt tính thủy phân Hb cao nhất ở pH = 2-3; pepsin A-2/3 vẫn duy trì
hoạt tính ở vùng có pH > 3 nhưng pepsin A1 thì không. Tương tự pepsin,
pepsinogen khác nhau chịu ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau.
Pepsin dê A và c hoạt động ở pH thấp tương tự những enzym từ
nguồn động vật khác. pH thích hợp khoảng 2 đối với pepsin A và
khoảng 3 đối với pepsin c (H.5.10). Những hoạt tính của pepsin A chỉ
bằng khoảng phân nửa pepsin c, pepsin A thì có hai loại. Mặc dù pH
phụ thuộc hoạt tính pepsin A-2 và A-3 hoàn toàn giống nhau, chúng
khác với pepsin A-l. Hoạt tính của pepsin A-2 và A-3 mạnh hơn
pepsin A-1 , đặc biệt khoảng pH 3-4. Kết quả này cho thấy khả năng
hoạt động của pepsin A-2 trên sắc ký DEAE-Sephacel được khám phá
khi tiến hành ở pH 3,5. Chúng ta dùng pepsin A của heo để so sánh.
Hoạt tính cao nhất của nó tương tự như pepsin c của dê và cao gấp
hai lần pepsin À dê.
c
2
2
Cl
cn
I.
>
©
ơ
c>
4)
10
Pepstatin (mol/mol pepsin)
Hình ố.iO Ảnh hưởng pH lèn hoạt tính của pepsin dê tinh sạch và pepsin A
heo lèn cơ chất Hb ỏ pH khoảng 1 đến 5
Ảnh hưởng của nhiệt độ: đa sô' enzym hoạt động tốt ồ nhiệt độ
30-40°C, một số enzym chịu nhiệt cổ thể hoạt động ở nhiệt độ cao hơn
tới 70°c, khi nhiệt độ lên tới 90°c thì hầu như tấ t cả các enzym đều
ngitag hoạt động.
Pepsin chịu ảnh hưởng của nhiệt độ giấng như những enzym
khác nói chung. Pepsin cũng là một enzym hoạt động ồ nhiệt độ khá
cao. Pepsin hoạt động ở nhiệt độ thích hợp tối ưu khoảng từ 40-50S3.
Ở 70°c, pepsin mất khả năng tiêu đạm. Tốc độ xúc tác phản ứng thủy
phân của pepsin không cao bằng các protease khác nhưng độ bền
nhiệt của pepsin cao hcm, nhất là khi cơ chất có mặt một số ion kim
loại đặc biệt như Ca2+.
Ảnh hường của các loại muối và các dung môi hữu cơ
Tùy theo bản chết hóa học của muối mà ảnh hưởng ít nhiều đến
hoạt động tính xúc tác của pepsin. Ví dụ, các muếỉ trung tính như
NaCI, KBr, MgSCU ít tác động trên pepsin, chúng chỉ ức chế pepsin ở
liều cao.
Các chất hữu cơ kỉềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCOa ỉàm
chậm sự pepton hóa của pepsin. Trong sự pepton hóa, HCI là acỉd gây
ra sự thủy phân mạnh nhất, kế đó là HN03 HBr, H2SO4 H3PO4, các acid
lactic, formic,... gây tác động kém hơn.
Các muốỉ kim loại nặng như Pb, Hg, Pỉ ở nồng độ rất thấp vẫn có
thể gây kết tủa và làm biến tính enzym. Nguyên nhân là do muếỉ kim
loại nặng tạo nên các phức hệ với các nhóm quan trọng của proteỉn-
enzym, làm thay đổi cấu trúc protein dẫn tới sự biến tính của enzym.
Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất hoạt động
bề m ặt có tác dụng phá vỡ cấu tróc bậc III và làm tăng độ xoắn của
mạch polypeptide trong phân tử pepsin (theo Tizgensons và cộng sự),
do đó làm giảm hoạt tính của pepsin. Một ví dụ cho thấy pepsin bị bất
hoạt bởi sodium-lauryl-sulfonate hay bởi nitric acid.
Ảnh hưởng cửa chốt sát khuẩn: các chất sát khuẩn như HCN,
salisilic acid, cloroform... với ỉượng nhỏ thi không ảnh hựởng đáng kể
đến pepsin. Nhung khi với liều cao, chúng làm giảm đáng kể hoạt
tính của pepsin.
Ảnh hưởng của các chất kìm hâm: tấ t cả các chất gây biến tính
protein đều là những chất kim hãm không đặc hiệu của enzym nói
chung và pepsin nói riêng. Ngoài ra, có nhiều chất không làm biến
tính protein enzym nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác do cơ chế
kìm hăm cạnh tranh và kìm hăm không cạnh tranh....
258 Chương 5
Với chất kim hãm p-bromophenacyl bromide, hoạt tính của các
protease nói chung bị phá hủy từ 70-80%. Tương tự, hợp chất a-diazo-
p-bromoacetophenone cũng làm vô hoạt hoàn toàn pepsin. Nồng độ
vô hoạt của hai chất trên ỉà 1 mol/1 mol pepsin. Còn hợp chất
diphenyldiazomethane (2 moi ức chế 1 mol enzym) làm giảm 50% hoạt
tính của pepsin khi tác dụng trên cơ chất Hb, các chất này cũng ngăn
cản sự hoạt hóa của pepsinogen. Sự vô hoạt cũng xảy ra khí có ion
Cu2* trong các hợp chất béo diazocarbonyl, những hợp chất này có cấu
trúc tương tự các cơ chất của pepsin. Ví dụ: L-l-diazo-4-phenyl-3-
tosylamiđobutanone sẽ làm vô hoạt hoàn toàn pepsin khi có m ặt của
ỉon Cu2* với nồng độ lmol/lmol pepsin nhưng không ỉàm biến tính nó.
Benzylloxycarbon-L-phenylalnyldiazomethane cũng làm ức chế pepsin
mà không cần sự có m ặt của Cu2+.
Ngoài ra pepsin cũng bị ức chế bỏi pepetatin nhưng tùy mức độ}
pepsin A bị vô hoạt hoàn toàn khi nồng độ pepstatin khoảng 1 moỉ/mol
pepsin A, còn pepsin c phải cần khoảng 100 moỉ pepstitan/mol pepsin
c để vô hoạt hoàn toàn.
Ví dụ: pepsin dê bị ức chế bởi pepstatin (H.5.11).
Pepstatin (mot/mol pepsin)
H ình 5.11 Tác động ức chế của pepstatin lèn pepsin dê đã tinh sạch
(Chú thích giống hình 5.10)
Sự khác nhau về tính nhạy cảm của pepsin A và c đối với
pepstatin thì tương tự ở các động vật có vú khác. Sự khẩk nhan thuận
lợi để phân biệt ỉoại pepsin A và c như trường hợp trên. Sự nhạy cẳm
khác nhau có thể đoán chừng giới hạn thích hợp về cấu trúc khác
nhau giữa vị trí hoạt động của loại pepsin A và c.
g- Các phương pháp thu nhận pepsin
Thu nhận đung dich pepsin
Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự
phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzym.
Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp
chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ
màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid
ỉoãng (theo Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966) hay
nhờ sự tự phân trong môi trường acid (theo Covalenco, 1966). 1
Khi so sánh sự thu nhận pepsin của haỉ phương pháp cho thấy
phương pháp tự phân cho hỉệu xuất thu enzym cao hơn phương pháp
chiết là 5-7 lần (theo Teply và cộng sự, 1980). Nguyên nhân là do
phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào.
Mặt khác, phương pháp tự phân còn cỏ ưu điểm là cùng với pepsin, ta
còn thu được pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein của
dạ dày trong sản xuất.
Muốn pepsỉn cố hoạt tính cao thì phải ly tách từ niêm mạc dạ
dày lấy từ động vật mớỉ mổ hoặc có thể bảo quản nỉêm mạc d nhiệt
độ lạnh 0 -> 24°c trong một thời gian ngắn.
Phương pháp 1: phương pháp chiết
Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghỉền, ngâm vào nước cổ
5% butanol hay glycerin, cố cloroíorm để tránh nhiễm khuẩn sau chế
hóa bằng etanol đề pepsin kết tủa. Thời gian ngâm: 48-72 giờ, nhiệt
độ thường.
Phương pháp 2: phương pháp tự phân
Niêm mạc dạ dày bảo quản ỗ nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi
heo mới mổ, xay nhỏ, dừng HCỈ hay H3PO4, H2S04 với nồng độ thích
hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Theo nhiều
thực nghiệm, việc dùng HCI để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt
tính cao nhất. Nguyên nhân ỉà do HCI là acid vô cơ quan trọng có
trong thành phán dịch vị dạ đày động vật, trong cơ thể sống
pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCI dịch vị. Thời gian tự
phân: 48 giờ ở 40-42°C.
260 Chương 5
Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym

trên một chất kết tủa. Người ta cho hình thành chất kết tủa
phosphattrỉcalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có m ặt H3PO4.
Sau dó chất kết tủa được hòa tan bằng HCI và dung dịch thu được
mang đi thẩm tích (1d ialyz). Dung dịch pepsin thô thu được sẽ được
dẫn qua một chất kết tủa cholesterol. Chất kết tủa thu được sau khi
sử lý bằng eter sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ
lọc (phương pháp Bruché).
Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết
Phương pháp tủa
• Phương pháp tủa bằng muối (dỉêm tích)
Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch
các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Các
protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Do
đó khi táng dần nồng độ muếi, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo
các trình tự khác nhau.
Người ta thường dùhg các muối trung tính khác nhau như
(NH4)2S04, NaCI... ở nồng dộ gần bão hòa để làm tủa pepsin. Ly tâm
lấy tủa; trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất
phụ gia có tính chất ổn định enzym, đồng thời rút ngắn thời gian sấy,
hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy. Thường sấy ở nhiệt
độ < 45°c hay sấy kèm chân không.
• Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ
Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp
như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0-3°c. Với pepsin, người ta
tiến hành như sau: dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở
nhiệt độ <45°c đên khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban dầu thì dem
tua với cồn 95° hay aceton (tỷ lệ 1:3). Sau đó ly tâm, sấy tủa ở nhiệt
độ <45°c. Thường phương pháp tủa cần được tiến hành ở nhiệt độ
thấp 0-5°C để bảo đảm hoạt tính của enzym.
Ví dụ: Quy trình tách chiết, thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ
dày dộng vật của Payeba và cộng sự.
- Nguyên liệu: dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản
lạnh đông trước khi thực hiện (0-3°C).
Thu n h ậ n enzym từ nguổn động v ậ t 261
- Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trước khi lộn ngược dạ
dày, rửa th ật nhẹ tay màng nhầy bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức
ăn thừa không làm tổn thất lớp màng nhầy chứa pepsin và tiến hành
bóc màng nhầy.
- Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay
nhuyễn đồng nhất.
- Tự phân: màng nhầy sau khi xay cho thêm dung dịch HCI 0,5%
với tỷ lệ 1:2 theo khối lượng nhiệt độ: 40-50°C, khuấy đều; thời gian
24-28 giờ.
- Lọc: vớt bô hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp
vải mùn thu dung dịch.
- Kết tủa: kết tủa bằnglslaCl nồng độ bão hòa 2S%, Cho muối từ
từ, khuấy nhẹ cho đến khỉ dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân
30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt
đối, aceton, izopropanol, polyetylenglycol-PEG 6000.
Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt
lượng lớn, có thể làm m ất hoạt tính của enzferm. Do đó, dung dịch sau
tự phân đã lọc cùng dung môi được làm ỉạnh trước khi sử dụng và
dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt
độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5-10 phứt, trong lúc dó. nhiệt
độ không quá 5°c.
Tác nhân PEG 6000: cũng tương tự như kết tỏa bằng muối vô cơ.
Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzym và khuấy liên tục
cho tan hết.
- Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi để yên đem ly tâm 10-15
phút với tóc độ 5000-6000 vòng/phút.
- Sấy khô: sau khi ly tâm thu pl*ần kết tủa, đem sấy khô có thổi
khí ở nhiệt độ 30-40°C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông
khô. Để tránh bị mất hoạt tính người ta trộn thêm vào chế phẩm
enzym các chất độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin... trong quá
trình sấy.
- Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần được bảo quản ồ điều kiện
khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân lý,
hóa học có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.
262 Chương 5
Phương pháp hấp phụ: người ta có thể dùng một số chất hấp
phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. Cơ sở khoa học của phương pháp này
là cho enzym hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin, oxyd
sắt, than*... Sau đó, dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym
ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzym mong muốn. Sau đây là một
ví dụ về phương pháp hấp phụ pepsin.
Thêm NH4OH 0,1N vào dung dịch pepsin thô cho đến phản ứng
kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp phosphat gồm: dung dịch CaCI2 10%,
dung dịch dinatriphosphat 5,5% với tỷ lệ 1:1. Pepsin được kết tủa từ
từ nhờ dung dịch NH4OH và được hấp phụ trên m ặt mỏng của
tricalciphosphát và cùng với tricalciphosphat lắng xuống. Để sự nhả
hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH4OH dể giữ môi
trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với nước cất. Sau đó, lấy
tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%, tricalciphosphat sẽ chuyển
thành calcioxalat không tan, pepsin tan trong dung dịch, lọc lấy dung
dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2,4-2,6. Sau dó,
thêm 5 thể tỉch hỗn hợp cồn: ete (tỷ lệ 1 :1 ) để tủa pepsin. Kết tủa thu
được rửa với cồn, sau đó với ete và sấy khô ở nhiệt độ < 45°c.
Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dưng dich pepsin đậm
đặc: với phương pháp này người ta phải tiến hành ở nhiệt độ < 45°c,
áp suất thấp để enzym không bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin
thô sẽ đậm đặc, sau đó được trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy
nhẹ tạo dạng bột khô.
Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách
màng nhầy và trữ ở trạng thái đông, rồi đưa đến pH=2,7-2,9 bằng HCI
và được ủ ồ 50°c trong vài giờ. Dịch thủy phân trộn đều và để yên:
phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên mặt, để lạnh 4°c và cô đặc dưới áp suất
thâp, enzym bị tủa bởi alcoihoỉ và đứợc tách ra. Sau khi pepsin bị tủa
bằng alcolhol và đem lọc và làm khô.
Các phương pháp chiết tách trên đều cho phép thu chế phẩm
pepsin chưa tinh khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin
này hoàn toàn có thể sử dụng trong điều trị y học hay công nghiệp.
Thu n h ậ n enzym từ ng uồn động v ậ t 263
Phương pháp tinh sạch pepsin

Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop
Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và
Davis lấy dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgS04
bán bão hòa, chất kết tủa được rửa sạch với dung dịch MgS04, sau đó
hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách
gia them H2SO4 N/2. Kết tủa giữ yên vài giờ ở nhiệt độ 0°c, một lần
nữa lại được hòa tan bằng NaOH N/2 pha loãng trong nước 45°c, sau
một lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt
các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa trong acid sẽ điều chế
được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính cao.
Phương pháp qua lọc gel sephadex
• Nguyên tắc: khi cho một hẫn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa
gel sephadex đã trương nước, những phân tử nào lớn sẽ không chui
vào trong h ạt gel được mà chỉ di động ở ngoài gel, do đó di chuyển ra
khỏi cột sephadex nhanh. Còn những phân tử nhỏ hơn chui vào trong
các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Do đó
những kỹ thuật này dừng dể tách các chất có phân tử lượng khác
nhau, phân tử ỉượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh, phân tử lượng
càng nhỏ ra càng chậm.
• Hóa chất và dụng cụ: tùy theo đặc điểm cột và loại gel
sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng gel sephadex
thích hợp. Ở đây ta dùng 1 buret có đường kính lem, cao 35cm và gel
sephadex G-100, cân l, 2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch
NaN03 0,028 trong 72 giờ để gel trương nd hoàn toàn.
Gel sau khi ngâm NaNOa được rửa sạch bằng nước cất sau đó
nhồi vào cột, hay dùng gel sephadex G-75
- Dung dịch đệm Me Ilvaine pH 2,2
X: dung dịch citric acid 0,1 M (hòa tan 21,008g citric acid trong 1
lít nước cất); Y: dung dịch dinatri hydrophosphat 0,2M (hòa tan 35,63g
Na2HP04.2H20 hay 71,7g Na2HP04. 12H20 trong 1 lít nước cất). Pha 98ml
filing dịch X và 2ml dung dịch Y, ta dược dung dịch đệm pH ss 2,2.
- Chọn cột có o = l , 8cm; chiều cao h = 80cm.

264 Chương 5
• Kỹ thuật nhồi cột:

- Cột sau khi rửa sạch (rửa cột để đổ gel): cột được rửa sạch
bằng HN03 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng
aceton, đem sấy khô.
- Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm
vào dung dịch sulfo cromic trong một ngày, rửa sạch lại, tráng nước
cất vừa sấy khô.
- Tiến hành nhồi cột với G-75 dã trương nở hoàn toàn: gel được
đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh
tạo bọt khí và phân ỉớp.
Sau khi đã cho một ít geỉ vào cột cho tới khỉ geỉ lắng thành lớp
cao khoảng 5cm mới mở khóa cho dung dịch đệm chảy ra từ từ. Sau đó
tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt đến độ cao cần thiết. Bề mặt
dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên m ặt gel luôn có một lớp
dung dịch đệm cao khoảng 2cm để gel không bị khô.
- Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó
rửa cột bằng dung dịch đệm pH = 2,2 khoảng 24 giờ (thể tích dung
dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng ba lần thể tích cột).
• Đưa mẫu vào cột:
- Đem kết tỏa 50ml dung dịch enzym thu được sau quá trình tự
phân đã qua lọc bằng 283ml cồn tuyệt dối (nồng độ cồn trong hỗn hợp
khoảng 85%). Sau đó xử ly tâm, kết tủa được hòa tan lại bằng 50ml
dung dịch đệm pH 2,2 ta được dung dịch A.
- Hút 3ml dung dịch A, thêm vào 2ml dung dịch đệm pH 2,2; rồi
đem ly tâm bỏ cặn.
- Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung
dịch đệm vừa cạn đến m ặt gel thi cho mẫu vào cột, ỉượng mẫu cho vào
cột là 5ml (từ 1-5% thể tích cột).
- Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm
chảy qua cột.
• Thu mẫu qua cột: Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu
hứng dung dịch chảy qua cột. Số phân đoạn là n ống (ví dụ khoảng 30
ống), mỗi phân đoạn ta thu khoảng 4ml, các phân đoạn thu được, đem
đo m ật độ quang OD ồ bước sổng 280nm. Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan
Thu n h ậ n enzym từ n g uđn động v ậ t 265
hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng. Ghi nhận các peak
chính tạo thành. Sau đó xác định hoạt tính pepsin của các ống tương
ứng với các peak chính. Theo kết quả tính hiệu suất về hoạt tính
enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gél.
Ví dụ: Một số phựơng pháp và kết quả thu nhận tinh sạch
pepsin dê.
Tinh sạch pepsinogen: Pepsinogen là dạng zymogen của pepsin, là
enzym chính trong dịch dạ dày. Chúng được tinh sạch từ nhiều loài động
vật có xương sấng khác nhau. Có hai loại chính pepsinogen A và c được
biết đến hoạt động ở động vật trưởng thành, được tổng hợp ờ người, lừa,
cừu, heo. Thành phần ỉoại A chỉ duy nhất ở thỏ và gấu đen Asiatic.
Thành phần loại c cổ duy nhất ở loài gặm nhấm như chuột, heo....
Dạ dày dê được được cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Tất cả
những tiến trình được thực hiện ồ 0-4°C, ngoại trừ FPLC thực hiện ở
nhiệt độ phòng, sắc ký trên DEAE-Sephacel và lọc gel được thực hiện
trong đệm Na2S0 4 0,01M, pH 7,0. Thực hiện FPLC trong đệm Tris-HCI
0,01m; pH 7,0. Bản chất những tiến trình giống như những tiến trình
dùng tỉnh sạch pepsinogen Suncus (chuột xạ nhà) và được mô tả vắn
tắ t sau đây:
- Phần múi khế của dạ dày (tổng khối lượng trung bình 6 ,lg)
được đồng hóa với 20ml đệm Na2S0 4 0,01M, dung dịch dồng nhất
dược ly tâm ở 15.000 vòng/phút trong 50 phút. Phần bên trên đem
tiến hành qua cột DEAE-Sephacel (1,5x30cm). Protein đã hấp phụ
được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của NaCI từ 0-0,5M.
Hoạt động thủy phân Hb được phát hiện tạo thành ba peak. Peak I
chứa loại pepsinogen c và peak 2, 3 chứa pepsinogen A. Protein của
mỗi peak sau khi qua lọc gel trên cột sephadex G-100 (l,5xl00cm).
Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột Mono Q, HR 5/5
để tinh sạch lần cuối. Protein được giải phống theo chiều gradient
nồng độ của muấỉ NaCI từ 0 -> 0,5M hơn 30 phứt ở mức chảy thấp
l,0ml/phút. Hỗn hợp pepsinogen A và c được phân tách hoàn toàn
chia ra từng loại isozymogen.
266 Chương 5
Bảng 5.5 Phương pháp tinh sạch các pepsinogen

Protein Hoạt tính Hoạt tính rỉêng
BƯỚC Hiệu suất
(mg) (đơn vị) (đơn vị/mg protein)
1- Phần thô phía trên đổng nhất 321 64 1 .1 10 0

2- DEAE-Sephacel
pepsinogen A-1 9,2 11 Ọ,2 17
pepsinogen A-2+A-3 8 ,2 15 1 ,8 23
pepsinogen C-1+C-2 2 0 ,0 14 0,7 22
3- Sephadex G-100
pepsinogen A-1 0,82 8 ,1 9,9 13
pepsinogen A-2+A-3 1,3 11 8,5 17
pepsinogen C-1+C-2 1.4 4.8 3,4 7.5
4- Mono Q FPLC
pepsinogen A-1 0,43 5,6 13 8,8
pepsinogen A-2 032 4,4 14 6,9
pepsinogen A-3 0,21 3,1 15 4,8
pepsinogen C-1 0,23 2,4 10 3.8
pepsinogen C-2 0 13 1.5 12 2,3
Điện di các protein: Pepsinogen đã tinh sạch dược thực hiện để

không biến tính dựa theo phương pháp PAGE (polyacrylamide gel
electrophoresis) của Omstein và Davis, và SDS-PAGE theo Weber và
Osborn. Protein được nhuộm bằng Coomassie brilliant blue.
Deglycozyl hỏa: mỗi pepsinogen (khoảng 0,2|ig) được ủ với một
đơn vị tối thiểu của glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, việc
làm giảm khôi lượng phân tử của pepsinogen được phân tích bằng
phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen C-2 suncus được sử dụng như một
kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen.
Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch
các enzym ở mỗi bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry
và cộng sự và đo ở bước sóng 2Ỗ0nm với serum aỉbumỉn heo như một
tiêu chuẩn. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch được xác định bằng cách
tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối lượng
phân tử.
Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid (lOụg protein)
bị thủy phân bằng HCI bay hơi ở 150°c/lgiờ ở hệ thống Waters PICCO-
TAG™ Work Station (Miỉlỉpore Corp, Milford, MAX Mốu được phân tích
bằng máy phân tích amino acid (model 835, Hitachi, Tokyo, Nhật).
Sự tinh sạch pepsinogen dê: mặc dù sự tinh sạch các pepsinogen

từ ba dạ múi khế dê được thực hiện một cách riêng lẻ, về cơ bản kết
quả đạt được tương tự nhau trong mỗi trường hợp. Một kết quả tiêu
biểu của sự tinh sạch được tóm tắ t ở bảng 5.12. Sắc ký DEAE sephaceỉ
tách hoạt tính thủy phân ở pH = 2 thành 3 peak (H.5.12a). Khi thực
hiện ở pH 3,5, mối liên hệ kích thước của mỗi peak thay đổi đáng kể
khi so sánh với quá trình thực hiện ở pH = 2 (H.5.12b).
Hình 5,12 Sắc ký đồng nhất phần bên trên của dạ dày múi
khế trên 1 cột (1,5+30 cm) DEAE-sephacel
Cột được cân bằng vời đệm Na2S04 0,01m; pH = 7 và protein
được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của NaCl trong cùng
một đệm. Phân đoạn chọn là 10ml. Phân đoạn tạo thành A-1 f A-2,
A-3, C-1 , C-2 tương ứng pepsinogen A-1 , A-2, A-3, C-1, C-2. Quá trình thủy
phân được thực hiện bằng phương pháp thủy phân Hb ở pH 2
(H.5.12a) và pH 3,5 (H.5.12b).
Việc giảm đáng kể của peak thứ ba là giá trị đáng chú ý. Những
kết quả này cho thấy những đặc điểm của enzym thủy phân chứa
trong những peak này khác so với những enzym khác. Sự tinh sạch
cuối cùng của mỗi pepsinogen được thực hiện bằng FPLC trên cột
Mono Q. Sau đặc tính hóa, những pepsinogen đầu tiên trong ba peak
của sắc ký DEAE-Sephacel chia thành hai phần của pepsinogen c
(pepsinogen C-1 và C-2), hai phần của pepsinogen A (pepsinogen A-2 và
A-3) và một phần của pepsinogen A (pepsinogen A-1 ) tương ứng. Chỉ
định ra những pepsinogen phù hợp với những báo cáo của hội đổng
khoa học IUBMB. Mức độ liên quan của pepsinogen A-1 , A-2, A-3, C-l và
C-2 dựa trên trọng lượng trong phần múi khế dạ dày được tính là
27,19,14,25 và 15% tương ứng.
268 Chương 5
2- Rennin [E.Q.3.4.4.3]
a~ Khái niệm chung
Rennỉn được định nghĩa là enzym đông tụ sữa, được tìm thấy ở
dịch tiêu hóa của ngăn thứ tư dạ dày bê. Nó được khám phá bdi
Heinz, năm 1951.
Theo Holter và Anderson những động vật non khác cũng tiết ra
một enzym không khác lắm so với pepsin của con vật trưởng thành.
Rennin cổ trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê...
rpiới đẻ), đặc biệt ở ngăn thứ tư dạ dày bê. Enzym này do chính tế bào
chính của tuyến dạ dày tiết ra, enzym này dùng để tiêu hóa sữa cho
những con vật mới sinh. Khi con vật lớn, bắt đầu ăn, sự tạo rennin
được thay th ế bằng pepsin.
Phân loại: Rennin là một protease acid tính, số phân loại
E.c.3.4.4.3. Rennin là thành phần chủ yếu của rennet chiết rút từ
ngăn thứ tư của dạ dày bê dưới ỗ tháng tuổi. Càng gần 5 tháng tuổi,
thành phần rennin trong rennet càng giảm đi. Rennin đặc biệt có khả
* năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu là casein của sữa).
Ị Rennin là một enzym đặc biệt so với một sế protease acid tính
khác. Nó là enzym chuyên gây dông tụ sữa nên người ta còn gọi tên là
enzym đông tụ sữa điển hình.
6- Thành phần cấu tạo
Rennin có trọng lượng phân tử khoảng 33.000-34.000Da. về mặt
cấu tạo phân tử, các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng
trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động. Các
kết quả nghiên cứu về cấu trúc cho thấy, cấu trúc bậc nhất của rennin
có những nét tương tự pepsin ỏ phân đoạn mạch đâu c và ở đoạn
mạch gần các liên kết dỉsulíur. Phần đoạn mạch chứa aspartic acid ở
trung tâm hoạt động cũng có nét tương tự.
Trình tự amino acid đầu N của rennin được trình bày như sau:
N - Gly - Glu - Val - Ala - Ser - Val - Pro - Leu - Thr - Asn - Tyr * Leu -
Asp - Tyr - He - Lys - Gly - Phe - Tyr - Glu - Ser -
Đầu cuối c của rennin:
lie - Leu - Gly - Asp - Val - Phe - Ala - Arg - Asp - Phe - Val - Ser - Tyr - Tyr -
Glu - Arg - lie - Asn - Asn - Leu «Val - Gfy - Leu - Ala - Lys - Ala - lie - COOH
Trình tự amino acid của phần bên trong rennin không được
trình bày nhưtig trình tự trong khu vực của mỗi cầu nôi disulfur được
Foltmann và Hartley trình bày trong 270 amino acid còn lại:
Cầu nối A:
-asp-ile-asp-cys-asp-asn-leu-glu-gly-ser-
I
s
I
s
I
-tyr-thr-ser-gln-asp-gln-gly-phe-cys-thr-ser-gly-phe-
Cầu nối B:
-aía-cys-S-S-cys-gln
I I
glu-gly-gly
Cầu nối C:
-cys-S-S-cys-lys-asn-his-gln-arg-
I
lys ala
\ /
ser-asn
Thành phần hóa học, rennin chứa nhiều amino acid acid tính
hơn amino acid kiềm tính, nhung tỷ lệ thấp hơn so với pepsin. Ngoài
ra, trong thành phần của rennin còn chứa nhiều prolin, serin và trong
phân tử có chứa tới ba cầu disulfur. Do đặc điểm thành phần amỉno
acid, rennin thể hiện tính acid tuy yếu hơn so với pepsin.
Foltmann đã thành công trong việc tách phân đoạn rennin bằng
sắc ký trên DEAE cellulose và nhận thây có ba phân đoạn mà chúng
có những mối liên hệ đặc biệt, chúng được gọi là rennin A.B.C và được
sắp xếp theo đặc tính đông tụ sữa giảm dần.
c- Đạc tinh và khả năng thảy phân của rennỉn
Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Điểm
đẳng diện của rennin pl = 4,5. Hankinson đã tách được rennin ở dạng
tinh thể hình kim. Berridge thực hiện bằng phương pháp khác tách
dược tinh thể rennin dạng dĩa dẹp, còn theo Foltmann trinh bày dạng
dài sắc như kim và có thể thay đổi thành dạng dĩa.
270 Ch\AAì0 5
Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15°c. Dịch rennet được bảo
quản ở nồng dộ muối cao 14-20% và có thể thêm Na-benzoate và
propylene-glycol để bảo quản. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào
nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm.
Đặc hiệu thủy phân: Rennin là enzym thủy phân liên kết
peptide trong protein. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể hình lập
phương. Cấu tạo phân tử rennin có mạch polypeptide có gắn glycine
trong mạch vòng carbon. Rennin chỉ thủy phân các liên kết peptide và
không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine, Rerưxin dặc v iệt có
tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và
phenylalanine.
Rennin tác động trên cơ chất casein của sữa bò và những loại
sữa khác. Đặc tính thủy phân casein của rennin phụ thuộc rấ t nhiều
vào pH. ở pH = 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3
thì phân cắt 1/8 số’ liên kết peptide trong phân tử casein (Bangjensen
và cộng sự, 1964; Fish, 1980).
d- Sự hoạt hóa prorennin
Prorènnỉn: sự tồn tại của prorennin đã được Kleiner và Tayber
chứng minh từ năm 1932. Tương tự như pepsin, rennin có trong màng
nhày dạ dày ồ dạng tiền enzym là prorennin.
Foltmann và Rand đã trích được prorennỉn tinh sạch và thực hiện
sắc ký trên DEAE cellulose và thấy có hai phân đoạn gọi là prorennin A
và B. Asato và Rand cũng cho rằng tính không đồng nhất của proreimin
và rennin bởi điện di trên gel polyacrylamide với kết quả:
- Một dạng phụ và hai prorennin chính
- Hai dạng minor và hai rennin chính.
Prorennin ổn định ở pH = 5,3-9, dạng thô hoàn toàn ổn định ở
pH = 8 nhưng dạng tinh sạch hơn thì giảm sự ổn định hơn khi ở cùng
pH này. Prorennin s môi trường có ure 6M thì nhanh chóng bị phân
hủy và có thể trd thành dạng hoạt động.
Foltmann cho rằng prorennin có thể d dạng ổn định trong tình
trạng bất hoạt của một protein trong quá trình tự xúc tác hoặc sự tác
động điện tử đối với phân tử khi môi trường à pH trung ttah.
Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa ba cầu nối disuỉũte mà

nó còn được giữ lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của
enzym.
Quá trình hoạt hóa prorennin: trong môi trường acid ở pH = 5
sự hoạt hóa prorennin thành rennin xảy ra không đáng kể, nhưng ở
pH dưới 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh. Rennin được tạo từ
prorennin bởi tác động của acid, pHop (pH thích hợp) cho hoạt động
này là 5,25. Quá trình hoạt hóa prorennin xảy ra ồ pH < 5 và có
nhiều nét giống sự hoạt hóa pepsinogen. Một số tác giả cũng chỉ ra
rằng sự hoạt hóa prorennin cũng là một quá trình tự xúc tác do chính
rennỉn được hình thành chính trong quá trình hoạt hóa tạo nên.
Nhưng một sô" tác giả khác cho rằng khác với quá trình hoạt hóa
pepsinogen, quá trình hoạt hóa prorennỉn không phải là quá trình tự
xúc tác và peptide được giỏi phóng ra không thể có tác động kìm hâm
với rennỉn. Người ta cũng công bố rằng, prorennin được hoạt hóa bằng
“pancreatin” ở pH 5,5; ở pH này sự hoạt hóa bằng acid không thể xảy
ra được. Sự biến đổi prorennin thành rennin có thể được xúc tác bởi
pepsin, đặc biệt ở pH SB2 nhưng ở pH từ 5,5 đến 6 thì hoạt động tự
xúc tác không đáng kể.
Trong quá trình hoạt hóa prorennin, 10-15% protein được tách
ra dưới dạng peptỉde. Hoạt động của prorenmn bao gồm sự phân tách
chuỗi peptỉde từ đầu cuối N của prorennin, với sự giảm trọng lượng
phân tử từ 36.000 còn 31.000, đầu N của phân tử prorennin là alanỉne
(Bundy và cộng sự, 196) còn của phân tử rennin hoạt động là glycine
(Jirgensons, 1958). Cả hai đều có đầu c là asparagine (Bundy và cộng
sự, 1967). Người ta đã tách được một peptide có trọng lượng phân tử
bằng 4.000 có đầu N là Ala mà nổ có thể là đầu N của prorennin.
Trình tự amino acid của mạch peptide ở đầu N của prorennin
được Foltmann (1966) xác định như sau:
N - Ala - Glu - lie - Thr - Arg - lie - Pro - Leu - Tyr - Lys - Gly - Lys - Ser - Arg - Leu -
Kết quả sự thủy phân trong quá trình hoạt hóa làm cho mạch
peptỉde đầu N của rennỉn có trình tự amino acỉd như sau:
N - Gty - Qlu - Val - Aía - Ser - Val - Pro - Leu - Thr - Asn - Tyr - Leu -
Asp - Tyr - lie - Lys - Gly - Phe - Tyr - Glu - Ser -
272 Chương 9
Điều đó chứng tỏ trong quá trình hoạt hóa, peptide được tách ra
từ đầu N của phân tử prorennin. Khác với quá trình hoạt hóa
pepsinogen, quá trình hoạt hốa prorennin không phải ỉà quá trình tự
xúc tác và peptide được giải phóng ra không thể có tác động kim hãm
với rennin.
e- Các yếu tố ảnh hưởng
- Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưa của
rennin nằm ở vùng pH acid yếu hơĩi so với pepsin và thay đổi tùy theo
cơ chất vào khoảng 3,4-4. Đặc điểm của rennỉn là tác động ở môi
trường acid vừa phải và cần cổ sự hiện diện Ca2*. Ở pH = 3,7 các ion
Ca2* làm tâng hoạt độ rennin, những cation hóa trị +1 ỉàm giảm hoạt
độ của nó.
- Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung
dịch HịS 0,0001M và MgCỈ2. Không giống pepsin heo, rennin nhanh
chóng bị m ất hoạt bởi ure, prorennin cũng vậy. Chessman cho rằng
khả năng hoạt động bị m ất trong dung địch ure không liên quan đến
phần m ặt bên ngoài của phân tử tiếp xúc với môi trưởng nhưng phần
lộ ra đó là những nhóm có tính chất độc biệt mà nó nhay cảm với môi
trường ure.
- Rand và Em stron chứng minh rằng rennin hoạt động nhanh ở
pH = 2 trong NaCI và hoạt động chậm ỏ pH = 5. Tuy nhiên ở pH = 2
hình thể rennin không ổn định còn ở pH = 5 thì ổn định và được bảo
vệ tốt, thêm vào đổ ô nồng độ 2M NaCI sẽ tăng khả năng hoạt động
của enzym.
Foltmann cũng cho rằng, nồng độ muối thấp kìm hãm hoạt động
cho dù ở pH = 2. Tuy nhiên ở pH = 2 NaCI có tác động phá hủy sự ổn
định của rennin và prorennin sẽ hoạt động ở pH đổ với sự hiện diện
của NaCỈ. Ông thấy rằng pH thích hợp cho rennin ổn định là ở pH từ
5,3 đến 6,3. Khi pH tăng đến 6,3 làm trung tâm hoạt dộng của enzym
bị phân hủy dần dần và không ổn định d pH = 3,5 mặc dù có hiện
diện của NaCI vẫn xảy ra sự tự tiêu, điều này được chứng minh qua
việc tạo pH thích hợp cho hoạt động phân giải protein của rennỉn và
khi hoạt tính bị m ất ò pH = 3,8 và sự thủy phân rennỉn A thành
rennin c ở pH = 3,5 với sự giảm hoạt tính chuyên biệt rõ rệt.
Thu n h ậ n enzym từ n guồn động v ật 273
pH: Ở pH = 7 có sự tự phân hủy và hoạt tinh thủy phân của

rennin ở pH này rất thấp, việc bất hoạt có thể do liên quan đến sự
biên tính trong môi trường kiềm và quá trình tự phân giải của một
vài phân tử rennin. Hoạt tinh bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất
hiện protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
Rennin không bị mất hoạt tính nhanh khi ở môi trường kiềm
yếu pH = 9 nhưng bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh. Nhưng nếu
tiếp xúc lâu trong môi trường kiềm yếu sẽ làm bất hoạt rennin.
f- Phương pháp thu nhận rennin
Thu nhận dung dịch rennin: Ganguli và cộng sự đã tách chiết
rennet với động vật non còn sống và thường thực hiện hai lần đối với
những con vật non được 3-4 tháng tuổi và số lần thực hiện khoảng
30-40 lần/con. Cũng có thể thu rennin từ dạ dày bê con, thường được
chuẩn bị ngay ở lò mổ bằng một trong hai cách: sấy khô hoặc ướp
muối, lớp dạ dày được gỡ ra còn nguyên, được thổi phồng lên bằng
không khí và được làm khô. Ở Mỹ, người ta ướp muối dạ dày sau khi
rửa sạch, dạ dày cần làm sạch và khô trước khi tách chiết. Dạ dày
khô từ cả hai quy trình sẽ được chiết tách bằng dung dịch NaCI. Gần
đây, người ta thực hiện sau khi ướp muối bình thường có thể chiết
dịch dạ dày không khô một cách dễ dàng mặc dù mức độ chiết dịch
chậm hơn so với dạ dày khô. Thường người ta cũng tách chiết rennin
bằng HCI tương tự pepsin.
Dịch rennet được bảo quản ở nồng độ muấi cao 14-20% và thêm
chất bảo quản như sodium benzoate và propylene glycol. Dịch rennet
và rennet bò thu nhận có màu hổ phách nhạt dến màu nâu đậm hoặc
bột màu trắng đến nâu nhạt.
Dịch rennet được chiết chứa rennin hoạt động và tiền rennin
bất hoạt. Thêm acid vào để sự chiết đạt hiệu quả tối đa. Rand và
Emstrom cho rằng pH = 5 là thích hợp, mặc dù hiệu quả của quá
trình tách chiết ồ pH thấp hơn được nhanh hơn nhưng sự m ất ổn
định củ á rennin ở pH dưới 5 trong môi trường có NaCI cho hiệu suât
tách chiết giảm.
274 Chương 5
Quá trình thu nhận dịch rennin

- Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5
tháng tuổi.
- Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ
tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ
bằng nước lanh, sau đó rửa bằng dung dịch muấi NaCI 15%.
Hóa chất:
- Muối NaCI, HCi sử dụng để kết tủa thu enzym, nên hóa chất
phải tinh khiết, khô, không lẫn tạp chất, nhất là kim loại nặng vì gây
tủa và bất hoạt enyme.
- Natribenzoat: chất bảo quản.
Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt; máy ly tâm; máy quang phổ
kế; máy nghiền đồng hóa; máy đo pH; cân Mettler K7, cân Prolabo.
Phương pháp thu nhận dung dịch rennin
Có thể ỉàm một trong haỉ phương pháp sau.
• Phương pháp 1:
- Dạ dày bê xay nhuyễn
- HCI 0,2%
- Cho vào 0,7% acid boric trên tổng V.
• Phương pháp 2:
- Dạ dày bê xay nhuyễn
- Nước muếỉ 10%
- Chĩnh bằng HCI để về pH=4
- Cho 0,7% acid boric trên tổng V (cổ tác dụng bảo quản). Giữ ở
35-40°C cả hai mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đó dừng HCI N chỉnh
lại pH cửa dung dịch cả hai phương pháp vẻ pH=4 . Lấy ra đem lọc qua
vải m àn và vải nhiều lớp được dịch trích rennỉn thô (A) có chứa
rennin.
Phương pháp thu nhận rennin thô
Dịch rennet được thực hiện sự kết tủa bằng cách acid hóa dung
dịch hoặc dung dịch bão hòa với NaCI hoặc cả hai cách. Gelatin thường
xuyên được thêm vào để giúp sự kết tủa và tách rennỉn ra khỏi dung
dịch bằng sự ly tâm 45 phút ồ 5.000 vòng/phút.
Thu rennin dạng bột:

- Tiến hành tủa enzym theo phương pháp diêm tích với muối
trung tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch (A) một lượng NaCI tinh
thể nồng độ khoảng 22-23% cho đến khi đạt sự bão hòa NaCI.
- Để tủ lạnh 20 phút.
- Lấy ra ly tâm hay lọc. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri, sấy quạt
cho khô rồi để vào bình hút ẩm.
Cách thu nhận tương tự khác: dạ múi khế của dạ dày bê non
được cắt nhỏ. “brei* khá mỏng được điều chỉnh đến pH 2-3 bằng acid
HCI và ủ ở 42°c (110°F) để hoạt hóa dạng tiền enzym (dạng enzym
được tiết ra) prorennin thành rennin được điều chỉnh pH gần 5,5 với
Na2P0 4. Sự có mặt của phosphat, hỗn hợp trở thành dung dịch và làm
khô chân không hay dạng bột. Sản phẩm chứa ít chất béo, nó được
tách khỏi bột khô bằng cách trích bằng dung môi. Dung môi thường
dùng là acetone hoặc alcohol, phần còn lại dễ dàng tách từ dung dịch
chuẩn bị ban đầi^
Phương phấp chuẩn bị khác: dạ dày bê làm khô và nghiền. Bột
thì khuấy đều trong vài ngày với dung dịch HCI òhứa chất bảo quản.
Dịch chiết được tách khỏi phần không hòa tan, và được acid hóa bằng
dd HCI thích hợp để tủa phần nhầy. Enzym bị tủa kế tiếp bằng NaCI
vừa đủ để dung dịch bão hòa. Phần tủa đem lọc và ỉàm khô ở nhiệt độ
phòng. Sản phẩm chứa muối nhutig ít protein tinh khiết so với phương
pháp đầu.
Enzym chuẩn bị thường pha loãng, có chất bảo quản (tránh vi
sinh vật phát triển trong dung dịch chuẩn bị, chống oxy hóa,...). Trong
sô" cơ chất dùng trong rennet thương mại chuẩn bị chứa muối (NaCI),
propylene glycol, sodium benzoate và sodium propionate
Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion
Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có
phân tử ỉượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử
lượng lớn.
Cân chính xác một lượng enzym bột vào túi colodion (cellophane).
Cân trọng lượng túi có chứa enzym cho tói vào becher đựng nước cất
276 Chương 5
vào và cho thẩm tích trong môi trường nước lạnh 0-4°C. Khuấy và thay
nước lạnh thường xuyên (hai ngày đêm) làm khô nhanh túi bằng cách
sấy quạt gió, nhiệt độ 30-40°C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.
Hiệu số trọng ỉượng túi ban đầu và sau khỉ thẩm tích ỉà lượng NaCt:
t
m i -1712= m
m 1 - là trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích (g)
m 2 - là trọng ỉượng túi + mẫu thí nghiệm sau khi thẩm tích (g)
m - là trọng lượng muối NaCI đã thẩm tích qua màng (g).
Một số nghiên cứu tách chiết rennin:
Tauber và Kleiner đã mô tả phương pháp (lể lấy rennỉn yà
prorennin và tinh sạch chúng. Chymosin (rennin) chiết dược làm tinh
sạch bằng sắc ký DEAE-Sephadex được thực hiện bởi Dekoning. *
Nói chung, việc tách chiết và tinh sạch rennin cũng tương tự
pepsin, và người ta cũng đã được thực hiện đạt kết quả với nhiều
phương pháp khác nhau.
Tái chế: một cách khác để giảm vỉệc m ất rennet là tách enzym
từ nước sữa (dung dịch còn lại sauĩkhỉ tách phần đông tụ) và tái sử
dụng chúng bằng các phương pháp sắc ký.
Mặc dù những kết quả khoa học đầy hứa hẹn nhưng các phương
pháp này vẫn chưa được chấp nhận trong thực tế. Tóm lại, các
nghiên cứu về các enzym có khả năng đông tụ vẫn đang tiếp tục và
có nhiều tranh cãi.
5.2.2 E nzym p ro te a se kiềm *
1- Pancreatin
Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và người ta
thường trích pancreatỉn từ tụy tạng của heo.
o* Thành phần: Pancreatin là hệ enzym thủy phân xúc tác các phản
ứng chuyển hóa đạm, đường, chất béo và một số chất khác ờ trong ruột.
Các enzym này gồm có: trypsin, chymotrypsin, elastase, coỉagenase,
carboxyl-peptidase A và B, amỉnopeptidase, amylase, lactase, saccharose,
lipase, ribonuclease, desoxyribonuclease... Tỷ lộ các enzym này trong dịch
T h u n h ậ n enzym từ nguồn động v ậ t 277
tụy người không thay đổi ngoại trừ vài trường hợp thiếu hụt có chọn lọc của
lipase và trypsinogen. lmg pancreatin có khoảng £ 25 đơn vị hoạt tính
protease, > 25 đơn vị hoạt tính amylase và £ 2 đơn vị hoạt tính lipase.
Bảng 5,6 Lượng enzym của tuyển tụy
Lượng enzym Lượng enzym

tính theo phển tính theo phấn
stt Enzym trăm chất khữ stt Enzym trim chất khô
của tuyến tụy của tuyến tụy
(đã loại mỡ) (đả I0 9 Ì mờ)
1 Trypsìnogen 5,0 4 Lipase 2,5
2 Chymotrypsinogen 5,0 5 Ribonuclease 0,2
3 Amylase 5,0 6 Desoxyribonuclease 0,004
Pancreatin được thu nhận bằng cách xay nhuyễn tụy tạng còn
tươi, trích hết các chất trong tụy tạng với nước, lọc bỏ bã rồi hòa chất
trích với cồn dể bảo quản. Dịch trích này có hoạt tính cao hơn bột.
Bột pancreatin là dạng bột vổ định hình có màu xám nhạt hay vàng
nhạt, có mùi và vị đặc trưng, hòa tan trong nước, không tan trong cồn
và chloroform.
b’ Tinh chất của pancreatin: Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất
trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh và
nó hoạt động mạnh nhất từ 2 đến 3 giờ sau khi ăn để thực hiện quá
trình tiêu hổa ồ ruột non. Pancreatin cổ thể pepton hóa nhiều loại
thức ăn như sữa, thịt, cháo... và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ
tương để dễ tiêu hóa.
c- Thu nhận pancreatin
Nguyên liệu: tụy heo, bồ được lấy ngay sau khi con vật bị giết
hay bảo quản ồ nhiệt độ đông đá. Trước khi tách chiết để thu nhận
enzym, phần tụy phải được loại bỏ mỡ, mô liên kết và xay nhỏ bằng
máy xay đồng hóa.
278 Chươầig 5
Phương pháp
Tách chiết pancreatin với aceton và rửa tủa (lẩn 2) bàng aceton
Tụy heo bảo quản tươi ở nhiệt độ đỏng đá
Tách bồ mỡ và mô tiên kết, xay nhô dem cân trọng lượng
^ ______ NaCC>3 1,2% (tỷ kệ 1:2)

20 , khuáy 3 giở
Lọc lấy dung dịch bằng rây
Aceỉon lạnh (1:4) Khuấy 10 phút,

^ để lắng 15 phút ô nhỉột độ lạnh
Tủa thu lấy enzym
Ly tâm lấy tủa (lẩn 1)
Rửa tủa bằng aceton
Ly tăm lẩn 2 lấy tủa
Sấy tủa nhẹ d 30-35°C
Nghiển nhò
Sản phẩm Pancreatin thổ
Hình 5.13 Sơ đồ thu nhận pancreatin bằng phương pháp tách chiết với aceton
Thu n h ậ n fenzym từ ng uổn động v ậ t 279
Phương pháp tách chiết pancreatin bằng cồn

Các giai đoạn tách chiết với cồn tuyệt đối với những tỷ lệ
1:4; 1:5; 1:7 và cồn 96° tương tự như với aceton nhưng thay aceton
bằng cổn.
Phương pháp tách chiết pancreatin kết tủa bằng muối (NH^sSOé
Tụy heo bảo quản tươi
I
Tách bỏ mỡ và mổ liên kết, xay nhô đem cân trọng lượng
Pha với nưđc cất (1:1) b í phân ở 20°c

Đế tự phân 6 - 8 h
Lọc lấy dung dịch
H2SQ4 0.25N <2:1). pH a 3.5-4,1h

ị
Lọc lấy dung dỉch '
(NH4)2SQí ỈB0-70% (1:2)
Ly tâm lấy ỉũa
I
Sấy tòa nhẹ ở 40°c
......... I .........
Nghỉổn nhò được sản phẩm Pancreatin thô
Hình 5.14 Sơ đồ tách chiết pancreatin bằng

phương pháp kết tủa bàng muối (NHJJS04
Thu nhận pơncreatin thôrbằng phương pháp sấy: Lấy tụy tươi đã
được bảo quản, cân trọng ỉuợng và trộn với tinh bột một lượng bằng
10% Sồ với trọng lượng tụy tươi, sau đổ đem sấy ỗ những nhiệt độ
50°c, 60°c, 70°c. Sau một thời gian sấy ở những nhiệt độ trên thì ta
đem xay nhuyễn và được chế phẩm pancreatin thô.
280 Chương 5
2- Trypsin [E.c.3.4.21.4]
Or Khái niệm chung
Trypsin có trong dịch tụy của người và động vật. Trypsin được
Kiihne khám phá và chiết tách vào năm 1848. Năm 1931 Northrop và
Kunitz thu được trypsin và trypsinogen ở dạng tinh thể.
Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong môi trường kiềm
ở ruột nên được gọi là protease kiềm tính. Vai trò của trypsin là tiếp
tục thủy phân các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thủy phân một
phần ở dạ dày. Ở trong máu cũng cố một ít trypsin hoạt động.
b- Sự hoạt hòa trypsinogen
Trong tuyến tụy, đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không
hoạt động là trypsinogen, sau đó trypsinogen được chuyển hóa thành
trypsin hoạt động dưới tác động cửa enzym đường ruột enterokinase,
thrombin và bởi chính trypsin do nó có tác dụng tự xúc tác.
Trypsỉnogen là một chuỗỉ polypeptide mạch thẳng gồm 229 amino
acid và cố trọng lượng phân tử khoảng 23.048-23.800.
Trypsin
Trypsinogen -----------------► Trypsin
Trường hợp này được gọi là tự xúc tác. Hiện tượng tự xúc tác
này chỉ xảy ra khi có sự hiện diện cua một ỉượng nhỏ trypsin còn
lượng trypsin lớn sẽ làm ức chế hiện tượng này.
Enterokinase
Trypsinogen » Trypsin + hexapeptide
Sự chựyển hóa từ dạng không hoạt động trypsinogen thành

dạng trypsin hoạt động có liên quan đến sự thay đối trong cấu trúc
phân tử của nó. Liên kết giữa lysin và isoleucin ở đầu chuỗi
polypeptide bị cắt đứt, một đoạn peptide gổm 6 amino acid
(hexapeptide) tách ra khỏi chuỗi và trypsinogen không hoạt động
chuyển th àn h dạng trypsin hoạt động.
His.
Val Asp Asp ỉleu
\ ỵ \ / \ y Trypsỉnogen
Asp Asp> Lys Ser
/
Lvs
SS,á .
-JUUUUUUUUL Enterokinase
J
Val - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys + „ w -r

IleuH is S
Hexapeptide
Vsá ìĩ
Trypsin
JUUUUUUUUL /
J
H ìn h 5.15 Sơ đồ chuyển hổa từ trypsỉnogen thành trypsin
c- Tính chất
- Trypsin là một chuỗi polypeptide có 249 amino acid, trọng
ỉượng phân tử 22680-23400.
- pH tối uu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp của
trypsin là 7,8-9,5. Tuy nhiên hoạt tính của dung dịch trypsin vẫn có
thể Ổn định ở pH 3-5.
- Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ
thể nhưng nó vẫn có thể hoạt động tốt ở trong khoảng nhiệt độ 30-
40°c. Ở nhiệt độ này và pH 8,5-9 trypsin có khả năng thủy phân
mạnh các loại cơ chất như casein, hemoglobin hay gelatin. Khỉ đun
nóng dung dịch enzym lên đến 90°c và pH trong khoảng 6-8 thì dung
dịch enzym bị m ất hoạt tính hoàn toàn.
- Trong môi trường có pH 8 và có sự hiện diện của Ca thi enzym
ở dạng không hoạt động chuyển thành dạng hoạt động. Khi không cổ
sự hiện diện của Ca thì enzym bị mất 50% hoạt tính do tạo dạng
protein trơ và enzym chỉ còn lại 50% hoạt tính thủy phân. Như vậy
Ca được xem như là chất bảo vệ cho enzym khỏi bị biến tính và bảo
vệ chống lại sự tự thủy phân protein. Tuy nhiên Ca không có liên
quan gì đến tác dụng của trypsin.
- Các kìm ỉoại khác cũng có tác dụng hoạt hóa trypsin tương tự
như Ca đó là Co, Mn, ngược lại Cu, Ag, Hg cổ tác dụng ức chế enzym.
Sự ức chế này có thể thay đổi bdi một sô' tác nhân phức hợp, các chất
tẩy rửa anion thuộc nhóm alcoyl-sulfate, dodecyl-sulfate-natri cung có
282 Chương 5
tác dụng ức chế trypsin. Ngoài ra còn có các chất ức chế trypsin tự
nhiên như: qặc ctíất ức chế của tuyến tụy, đậu tương, đậu ván, các cây
' ‘họ đậu, mướp đắng.
d- Hoạt động và tính đặc hiệu: Trỵpsỉn cố tác dụng trên hầu hết
các cơ chất protein, bất chấp đó là protein có trọng lượng phân tử lởn
hay trọng lượng phân tử nhỏ nhung tác dụng của nó trên protein đã bị
biến tính tốt hem là trên protein chưa bị biến tính. Trypsin chỉ có tác
dụng trên hemoglobin, albumin biến tính của huyết tương, đếi với
collagen hay albumin của trứng thì cần phải xử lý sơ với nhiệt thi
trypsin mới cổ tác dụng. Trypsin không làm đông tụ sữa như pepsin,
rennin, chymotrypsin.
Trung tâm hoạt động của trypsin cổ thứ tự các amino acid:
- Gly - Asp - Ser - Gly - Pro -
Trypsin là một loại enzym thủy phân protein không triệt để. Khi
sử dụng trypsin thì chỉ có 1/3 liên kết peptide trong phân tử protein là
bị thỏy phân, phần còn lại là các peptide cố phân tử ngắn hơn.
Trypsin cắt các liên kết được tạo ra bởi nhóm carboxyl (-COOH) của
lysine hay arginine (ngoại trừ histidine) với nhóm amine (-NH2) của các
amino add bất kỳ và trypsin không cắt liên kết giữa lysine và arginine.
$
- C O - N H - C H - C O líXEĨÌH NH-CH--------► -CO - NH - CH - COOH + H2N - CH -

I A T I ỉ
Ri Oh | h+ Ri r2
trong đó: Rì - là gốc lysine hay arginine; R2 - là gốc amino acid bất kỳ.
Các phân tử protein khi bị phân cắt bởi trypsin sẽ tạo ra những
peptide cổ trọng lượng phân tử nhỏ và đôi khi cũng tạo ra các amỉno
acid tự do như tryptophan, tyrosine.
Ngoài hoạt động thủy phân lên kết peptide, trypsin còn có thể
thủy phân liên kết ester.
3- Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1J
Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tụy. Đây là
một protease kiềm tính quan trọng sau trypsin. Chymotrypsin được
thu nhận ở dạng tinh thể vào nãm 1933 bởi Kunitz và Northrop.
Chymotrypsin được tụy tiết ra dưới dạng không hoạt động đó là
chymotrypsinogen, sau đó chymotrypsinogen được chuyển sạng dạng
hoạt động là chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin.
O' Cấu trúc của chymotrypsin

Cấu trúc của chymotrypsin đuơc xác định vào năm 1967, do David
và các cộng sự phân tích tinh thể enzym bằng tia X. Chymotrypsin là
protease đầu tiên được biết rõ cấu trúc. Chymotrypsin được cấu tạo từ ba
sợi polypeptide:
Sợi A : các amino acid từ 1-13
Sợi B: các amino acid từ 16-146
Sợi C: các amino acid từ 149-245.
Các sợi này liên kết với nhau bởi cầu nối disulfite. Sự hiện diện
của cẩu nối disulfite là một đặc trưng của những protein có thể thể
hiện hoạt tính ngoại bào. Các sợi polypeptideliên kết với nhau tạo
thành dạng hình cầu. Cấu trúc thứ cấp củaenzym códạng p.Enzym
có bộ ba amino acid xúc tác phản ứng là Ser195-His57-Asp102. Những
amino acid này tạo thành vị trí hoạt động của protein hỗ trợ cho hoạt
động xúc tác.
6- Sự hoạt hóa chymotrypsinogen
Trong quá trình
chymotrypsinogen được chuyển if
Tfir y
Arfl
Chymotrysinogen A
hóa thành chymotrypsin hoạt
động nhờ trypsin cổ xuất hiện ị Trypsin
trung tâm hoạt động của
enzym. Khi trypsin phân cắt Tf * * -
Tfr Arfl
x^chymotrysin
Asp Ser
liên kết gỉữa hai amino acid

15 (arginine) và 16 (isoỉeucine)
trong chuỗi polypetide sẽ tạo
i * v &-chymoferysin
thành 7ĩ-chymotrypsin cổ hoạt Ajp
Arg-Ser
Ate Leũ
tính thủy phân nhưng không ^ A sp ‘ Cys+—^
bền. Đây là enzym cổ hoạt i

động tích cực nhất trong các Tyr- © **
a-chymotrysin
dạng khác nhau của AS*© ©L«|- Thr-Asp
^•Asp Cyrf-^
chymotrypsin. Sau đổ trypsin
tiếp tục cắt đứt liên kết giữa Hình 5.16 Sự hoạt hỏa
chymotrypsinogen thành chymotrypsin
amino acid 14 (serine) và 15
284 Chương ỗ
(arginine) để tạo ra ô-chymotrypsin. Sau cùng tách một dipeptỉde cua

đoạn amino acid 148 và 149 (ithreonine và asparagine) sẽ hình thành
a-chymotrypsỉn là một cấu trúc được giữ bằng 5 cầu nấi disulfur. Sự
thay đổi này cho tạo nên trung tâm hoạt động của enzym.
Từ dịch tụy bò có thể thu nhận được hai loại chymotrypsinogen
A và chymotrypsinogen B. Hai loại này có số ỉượng gần bằng nhau và
bằng khoảng 16% protein trong dịch tụy.
Chymotrypsinogen A là một trong những protein được biết đến nhiều
nhất. Nó được chiết tách từ tụy tạng bò ở pH acỉd Sau khỉ phân đoạn bằng
ammonium suỉiate thì nó bị tinh thể hóa dễ dàng (chymotrypsinogen A bị
tính thể hóa rất mạnh trong ammonium sulfate và trong ethanol).
Chymotrypsinogen B ít quan trọng hơn chymotrypsinogen A.
Khỉ chymotrypsỉnogen A được hoạt hóa sẽ tạo ra các chymotrypsin
dạng a, p, y, ô, £, 71.., chymotrypsinogen B được hoạt hốa thành dạng
chymotrypsin B hoạt động. Các enzym a, p, Ỵ-chymotrypsin cổ tính đặc
hiệu và hoạt tính đối với một số cơ chất rất giếng nhau do đố khó phân
biệt được chúng về mật enzym. Tuy nhiên, chúng lại khác nhau về tính
chất protein, dạng tinh thể, độ hòa tan, trọng lương phân tử....
c- Tinh chất cùa chymotrypsin.
Chymotrypsỉn là một protease hoạt động trong điều kỉện inôi
trường có pH kiềm nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương
tự như trypsin. Chymotrypsin hoạt động trong điều kiện pH 7-9 và pH
tối ưu là 8-9, điểm dẳng điện pl=5,4. pH 5 không thuận tiện cho hoạt
động của chymotrypsin nhưng ở pH này chymoỉrypsin lại bền vững
hơn trong môi trưởng pH 8 (môi trường kiềm dễ làm phân hủy trypsin
và chymotrypsin). Chymotrypsin là một chuỗi polypeptide có 245
amino acid, trọng lượng phân tử 22.500.
Trong ruột, chymotrypsin thủy phân protein và các sản phẩm đá
được tiêu hóa một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngấn và các
amỉno acid tự do. Hoạt tính của chymotrypsiíi tương đối hơi yếu hơn
trypsin nhưng nố lại có khả n&ng thủy phân protein sâu sắc hơn.
d- Cơ chế hoạt động

Chymotrypsin xúc tác sự thủy phân liên kết peptide của các phân
tử protein. Nó phân cắt có chọn lọc những liên kết peptide trong chuỗi
polypeptide ở vị trí đầu -C của amino acid có nhân thơm (tryptophan,
tyrosine, phenylalanine). Hoạt động xúc tác diễn ra như sau:
1 - Cơ chất khuếch tán đến tâm hoạt động của enzym, các amỉno
acid có nhân thơm gắn vào vị trí liên kết của cơ chất theo kiểu mà
liên kết peptide sẽ bị cắt có mặt tại vị trí gần bên bộ ba xúc tác.
2- Sau khi liên kết với cơ chất, proton H+ của Ser 195 bị His 57
thu lấy và kết quả là His 57 trở nên tích điện dương và điện tích này
được trung hòa bởi điện tích âm trên Àsp 102. Ser 195 mất đi proton
nên mang điện tích âm do đố nó có khả năng tạo vị trí kết nốỉ phân
tử trên liên kết peptide.
Nguyên tử o của serin 195 tạo nối với c của nhóm carbonyl của
cơ chất tạo thành một liên kết theo kiểu hình tứ diện (một nguyên tử
carbon tạo liên kết với 4 nguyên tử carbon khác) - đây là một dạng
trung gian. Nguyên tử o của cơ chất mang điện tích âm và được trung
hòa bởi các điện tích dương trên hai nhổm amine của enzym. Như vậy
cơ chất tạm thời tạo môi liên kết đẳng trị với enzym.
3- Trạng thái trung gian này bị phá vỡ khi liên kết peptide (C-N)
bị cắt đứt. Phần mang đầu C- của cơ chất khuếch tán ra khỏi tâm hoạt
động của enzym và mang theo nổ proton <nja His 57. Nhưng đầu N-
của cơ chất vẫn còn tạo liên kết đẳng trị, và trạng tháỉ này được gọi
là acyl trung gian.
4- Một phân tử nước khuếch tán đến trung tâm phản ứng của
enzym và tạo liên kết hydrogen với His 57. His lấy một proton và tích
điện dương, điện tích dương này được trung hòa bởi Asp 102. Nguyên
tử o của phân tử nước tách ra và mang điện tích âm.
5- Một liên kết theo kiểu hình tứ điện trung gian thứ hai được
tạo thành, lủc này phân tử nước tấn công vào cơ chất. Một lần nữa cơ
chất mang điện tích âm và được trung hòa bdi điện tích trên enzym (ỡ
vị trí nguyên tử oxy tách ra gọi là lỗ anion oxy). His 57 giữ lại proton
phân tử nước.
286 Chương 5
6- Liên kết theo kiểu tứ diện trung gian này bị phá vỡ tạo ra
đầu C- ở phần còn lại của cơ chất và cơ chất tách ra. Proton trên His
57 chuyển trở ngược lại Ser 195. Enzym được trở lại trạng thái cũ và
chuẩn bị thực hiện phản ứng xúc tác trên một cơ chất khác.
e- Tính đặc hiệu: Chymotrypsỉn hoạt động như một
endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành các peptide ngắn và
tác dụng trên những liên kết mà trypsin không pliân cắt. Những liên
kết này được tạo thành bởi nhóm carboxyl của amino acid có nhân
thơm như tyrosine, tryptophan, phenylalanine với nhóm amine của
amino acid khác.
Chymotrypsin i n i _ __
-C O - NH - CH - CO NH - C H --------- ►
I A ì I I
Ri OH' Ị H+ R2 R, R2
trong đó: Rì - gốc amino acid cố nhân thơm (Tyr, Trp, Phe)
R2 - gốc amino acid bất kỳ.
Tương tự trypsin, chymotrypsin ngoài khả năng phân cắt các
liên kết peptide, nổ còn có khả năng tác dụng lên các liên kết ester.
f’ Phương pháp thu nhận tách chymotrypsin ra khỏi trypsin
Chuẩn bị
Đệm Phosphate 0,067M, pH 7,0
- Hòa tan 4,54g K2HPO4 trong nước thành dung dịch 500ml.
- Hòa tan 4,73g NaH2P04 khan vào trong nước th àn h dung
dịch 500ml.
- Hòa chung 38,9ml dung dịch K2HPO4 với 61,1ml dung dịch NaH2P04.
Điều chỉnh pH bằng cách nhỏ từng giọt (nếu cần thỉết) dung dịch
NaH 2P 0 4 đến khi pH đạt đến 7,0.
Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23,7mg N-acetyl-D-tyrosin ethyl
ester (cơ chất thích hợp dùng để xác định chymotrypsin) vào khoảng
50ml dung dịch đệm phosphate 0,067M, pH 7,0. Giữ lạnh khi pha
ỉoãng với đệm pH 7,0 đến 100ml.
Dung dịch trypsin tinh khiết: Hòa tan một lượng chính xác
trypsin tinh thể vào hydrochloric acid 0,001N để thu được một dung
dịch chứa 650 đơn vị USP trvnsin trong mỗi ml.
Thu n h ậ n en zym từ n guổn động v ật 287
6- Cách thực hiện

Độ hấp thu được đo bằng quang phổ kết trong điều kiện nhiệt độ
mồi trường xung quanh không dược thay đổi quá 0,5°c và nhiệt độ
trong ngăn để mẫu là 25 ± 0,1 °C.
- Hút 2ỒOịiì dung dịch acid HCI 0,001N và 3ml dung dịch cơ chất
vào trong một cuvette lcm. Đặt cuvette này vào quang phổ kế và điều
chỉnh thiết bị để có được độ hấp thu 0,2 ở bước sóng 273nm.
- Hút 200p.l dung dịch trypsin tinh khiết vào một cuvette khác,
thêm 3ml dung dịch cơ chất và đặt cuvette vào quang phổ kế. Bắt đầu
tính thời gian từ khi bắt đầu thêm dung dịch cơ chất vào dung dịch
enzym. Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không kém hơn 5mn kể từ
khi cho cơ chất vào dung dịch enzym. Lập lại các bước trên ít nhất
một lần. Các giá trị của độ hấp thu tuyệt đối ít quan trọng hơn sự ổn
định của mức độ thay đổi độ hấp thu. Nếu mức độ thay đổi không ổn
định trong ít nhất 3 phút thì phải lập lại tiến trình trên và nếu cản
thiết thì thực hiện với một nồng độ thấp hơn.
- Lập lại quá trình trên lần thứ hai với cùng độ pha loãng, theo
dõi sự thay đổi độ hâp thu trong lần thực hiện đầu tiên. Xác đinh sự
thay dổi của độ hấp thu trung bình trong mỗi phút, chỉ sử dụng các
giá trị trong vòng 3 phút.
Cách tính số đơn vị USP chymotrypsin mỗi mg trypsin tinh
khiết theo công thức: (A2 - Ả l) (0,0075 TW)
với: A2 - là độ hấp thu lần dầu; A I - là độ hấp thu lần cuối
T - là thời gian tính bằng phút giữa lần đọc đầu và cuối
w - là trọng lượng (mg) của trypsin tinh thể trong thể tích dung
dịch được dùng xác định độ hấp thu.
Chương 6
THU NHẬN ENZYM TỪ VI SINH VẬT
6.1 NGUYÊN LÝ TổNG H ộp ENZYM ở VI SINH VẬT (VSV)

6.1.1 N guyên ỉý đ iề u hòa sính tổng hợp enzym ở v ỉ sinh v ậ t
Enzym là loại protein, xóc tác cho mọi phản ứng sinh học trong
mọi tế bào của sinh vật.
Ngoài cơ thể và tế bào, enzym không được tạo thành mà chúng
chỉ được tổng hợp trong tế bào. Khi nghiên cứu cơ chế tổng hợp
enzym, các nhà khoa học đã đi từ ngạc nhỉên này đến ngạc nhiên
khác khi phát hiện ra tính chính xác, nhạy cảm của quá trình tổng
hợp enzym.
Tế bào được cấu tạo và hoạt động như một nhè máy tự động hóa
hoàn toàn, sản xuất ra enzym. Ở đó có ty thể ỉuôn luôn sẵn sàng cung
cấp năng lượng thông qua phản ứng thuận, nghịch của ATP. Ngoài ra}
quá trình tổng hợp enzym được điều khiển và xác định chính xác
trình tự amino acid trong cấu trúc enzym tạo thành. Vật chất quyết
định đổ là DNA, cổ trong nhân của tế bào. DNA như bộ phận điều
khiển tấ t cằ các quá trình xáy ra trong khi tổng hợp enzym (hoạt hóa
amino acid, chuyển amino acid vào vị trí xác định trong một trình tự
xác định,.sửa chữa những sai sổt trong quá trình tống hợp). Nơi tạo ra
tiền enzym trong tế bào là ribosome. Đây được coi như phân xưởng
sản xuất chính các loại enzym.
Tính chính xác của quá trình tổng hợp enzym còn được thể hiện
ở chỗ trong cùng một thời gian, tế bào có thể tổng hợp hàng ngàn loại
enzym, trong đó mỗi loại enzym có tính chất, cấu tạo và chức năng
riêng. Về vấn đề này, thiên nhiên đã ban tặng cho sinh vật một bộ
máy và một cơ chế hoàn chỉnh nhất, cho đến nay chưa có một hệ
thống điều khiển và sản xuất nào lại đồng bộ và chính *ác đến như
vậy. Môi một enzym được tổng hợp ra bị điều khỉển bởi một gen. Sau
khi được tổng hợp nên, mỗi một enzym lại tham gia một phản ứng
Thu n h ậ n enzym từ v s v 289
sinh học, để cuối cùng tạo ra sản phẩm. Các nhà khoa học đã đưa ra
cơ chế chung như sau:
Một gen—►một enzym~*»một phản ứng sinh học —►sản phẩm
Như vậy, gen đóng vai trò quyết định đến cấu trúc enzym, chỉều
hướng phản ứng của enzym, tính chất enzym, chiều hướng phản ứng
cửa enzym. Nếu gen bị thay đổi cấu trúc, enzym sẽ bị thay đổi theo và
kết quả là phản ứng sẽ bị thay đổi hoàn toàn.
Hiện tượng gen bị thay đổi cấu trúc được gọỉ là hiện tượng đột
biến. Trong hiện tượng đột biến này có sự sắp xếp lại trậ t tự các
nucleotit, từ đó sự mã hóa sang trật tự các amino acid sẽ bị thay đổỉ
theo. Nếu các amino acid nằm ngoài trung tâm hoạt động bị ảnh
hưởng bởi tác động của sự thay đối gen thì chiều hướng và tốc độ
phản ứng enzym không bị ảnh hưởng.
Amino acld nằm
ngoài trung tâm
hoạt dộng của enzym
Amino acid nằm trong trung tâm

hoạt động của enzym
Trung tâm hoạt
động của enzym
Hình 6,1 Trung tâm hoạt động của enzym

Trong trường hợp các amino acid nằm trong trung tâm hoạt
động của enzym, hoạt động của enzym s£ bị ảnh hưởng mạnh bởi sự
biến đổi gen. Trung tâm hoạt động của enzym được cấu thành cấu trúc
không gian bởi các nhóm (-SH) và cấu trúc không gian này dễ phù
hợp với cấu trúc không gian của cơ chất mà chúng tham gia phản ứng,
Sự thay đổi trậ t tự các amino acid có trong trung tâm hoạt động sẽ
làm thay đổi cấu trúc không gian, từ đó làm thay đổi chiếu hướng và
tốc độ phản ứng.
Sinh tổng hợp enzym trong tế bào vsv còn bị điều khiển bởi cơ
chế thứ hai là cơ chế cảm ứng. Đây là đặc điểm điển hình của một
kiểu điều khiển ch! thấỹ có ò vsv.
Theo đố, những chất cảm ứng (cơ chất đặc hiệu) có trong môi
trường có tác dụng đặc hiệu lên tế bào. Từ đó hình thành chuỗi thông
290 Chương 6
tin. Các gen có trách nhiệm tổng hợp ra một loại enzym tương ứng với
chất cảm ứng đó sẽ được hình thành. Enzym này sẽ tham gia phân
hủy cơ chất, hệ thống diều khiển quá trình tổng hợp này sẽ hoạt động
liên tục. Trong trường hợp cơ chất hết hệ thống điều khiển sẽ không
còn hiệu lực và enzym sẽ không dược tạo thành. Toàn bộ quá trình
điều hòa này dược Mono-Jacob đưa ra và được thừa nhận như một yếu
tố rấ t quan trọng trong công nghiệp sản xuất enzym*
Trong thực tế sản xuất, quá trình điều khiển này cũng rất phức
tạp vì trong môi trường không chỉ tồn tại một loại cơ chất mà có rất
nhiều cơ chất khác nhau. Trong quá trình phát triển, vsv sẽ tiến
hành đổng hóa các cơ chất nào dễ đồng hóa trước, sau đó mới đồng
hóa đến những cơ chất khó đồng hóa hơn. Như vậy sẽ xuất hiện hiện
tượng có những enzym sẽ được tổng hợp trước với số lượng nhiều hơn
và có những enzym sẽ được tổng hợp với số lượng ít hơn ở giai đoạn
đó nhưng lại được tổng hợp nhiều hơn ở giai đoạn sau. Do đó, người
điều khiển quá trình sản xuất enzym không chỉ nắm rõ cơ chất cho
vào enzym sẽ được tạo thành mà còn biết cho vào khi nào với số
lượng bao nhiêu cho phù hợp với sinh lý của v s v .
Trong sản xuất enzym, ngứỉú ta còn diều khiển quá trình sinh
tổng hợp enzym bằng cơ chế kiềm chế tốc độ sinh tổng hợp enzyxn
bằng sản phẩm cuối cùng. Cơ chế này gọi là cơ chế ức chế ngược bởi
sản phẩm cuối cùng. Khi sản phẩm cuối cùng được tạo thành sẽ phong
tỏa toàn bộ hệ thông hoạt động điều khiển sự tổng hợp enzym tạo ra
sản phẩm cuối này. Từ đó ta thấy rằng, muốn cho quá trình tổng hợp
enzym đó xảy ra liên tục thì phải lấy sản phẩm cuối này ra khỏi quá
trình sản xuất enzym hoặc tìm phương pháp chuyển hóa tiếp sản
phẩm đó bằng sự chuyển hóa khác để tạo ra sản phẩm khác.
6.1.2 N guyên ỉý trao đổỉ chất của vsv trong sỉnh tổng hựp enzym
v s v có nhiều điểm khác với cơ thể động vật và thực vật. Điểm
khác lớn n hất d cơ thể v s v là chúng thuộc cơ thể đơn bào. Chính vì
chúng được cấu tạo từ một tế bào nên chứng có những tính chất
chuyên biệt. Ví dụ, sự trao đổi chất giữa tế bào vs v và môi trường
xung quanh là sự trao đổi trực tiếp. Do đó, v sv thường có khả năng
thích ứng rấ t nhanh với sự thay đổi của môi trường sống.
Trong quá trình thực hiện trao đổi chất với môi trường bên
ngoài, v sv biểu hiện quá trình đồng hóa và dị hóa bên trong và bên
ngoài cơ thể rõ hơn ở động vật và thực vật.
Sản phẩm thủy phân

(sản phẩm bậc 2)
—► Cơ chất
Dị hóa
Dị hóa Enzym trong
ngoài tế bào
tế bào
t Sản phẩm Sản phẩm thừa
thủy phân (sân phẩm bộc 2)
Hình 6.2 Trao đổi chất ờ vi sinh vật
Như vậy trong quá trình trao đổi chất ở vsv có haỉ quá trình dị
hóa (dị hóa trong tế bào, dị hóa ngoài tế bào) và quá trình đổng hốa
chi xảy ra ở trong tế bào.
Trao
_ đổi
_ chất d vi sinh vật
Đổng hốa Dị hóa -------- ► Ngoài tế bào
\ /
Trong ỉế bào
Để thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa đó, v sv sẽ phải tổng
hợp ra những enzym tương ứng.
Các enzym đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực
hiện các hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bào.
Các enzym dị hóa được tểng hợp trong tế bào nhưng có thể hoạt
động trong tế bào và hoạt động ở ngoài tế bào. Những enzym tham
gia quá trình dị hóa ngoài tế bào được gọi là enzym ngoại bào
(exoenzym), những enzym tham gia quá trình dị hóa trong tê bào được
gọi là enzym nội bào (endoenzym).
Theo nghĩa rộng, enzym nội bào còn bao gồm cả các loại enzym
tham gia tổng hợp, enzym tham gia các quá trình oxy hóa và các
enzym tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào.
292 Chương 6
Phần lớn những enzym ngoại bào thuộc enzym cảm ứng. Do đó,
việc điều khiển sinh tổng hợp enzym này ta áp dụng quy luật cảm ứng
sẽ thu được những kết quả như mong muốn.
6.1.3 N guyên lý đ iề u kh iể n quá trìn h kỹ th u ậ t sản xu ấ t enzym
tro n g quy mô công nghiệp
Enzym được sản xuất từ vsv ngày càng nhiều. Điều quan trọng
nhất là v s v là giới sinh vật duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất
enzym theo quy mô công nghiệp. Nguồn enzym là động vật và thực vật
rấ t khó triển khai theo quy mô công nghiệp vì những hạn chế sinh lý
và hạn chế về kỹ thuật. Do đó, ngày nay khi nói đến công nghiệp sản
xuất enzym là người ta hiểu ngay rằng, công nghiệp sản xuất enzym
dựa trên hoạt động sống của vsv. Như vậy, quá trình sản xuất enzym
từ v s v phải được điều khiển theo ý muốn của con nguởi. Quá trình sản
xuất enzym từ vs v được tóm tắ t trong hình 6.3. Ở đó, cần lưu ý tới kỹ
thuật điều khiển trong quá trình tạo giống (điều khiển genotype) và
điều khiển điều kiện tái hiện tính trạng hữu ích (trong trường hợp này,
tính trạng hữu ích là quá trình tổng hợp enzym).
Điểu khiến Bao gổm quá trình phân lập,

genotype Quả trình tạo giống tuyển chọn, gây dột bỉến,
táí tổ hợp
Bao gồm các quá trình nghiên

Quá trinh sản xuất ỉhử cứu các điểu kiện tòi ưu cho sinh
Điều khiển tổng hợp enzym
sự biểu hiện
phenotype Bao gổm các quá trình tối ưu
Quá ừình sản xuất theo hóa trong sản xuất theo quy mô
quy mô công nghiệp còng nghiệp
Đao gôm tất cả các phương pháp

Kỹ thuật Quá trình thu nhận cơ học, hóa lỹ dẩ thu nhận, tinh
enzym và tinh sạch enzym sạch enzym
Hình 6.3 Nguyên lý điều khiển sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp
Theo sơ đồ trên, trong sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp,
chúng ta tập trung vào hai quá trình điều khiển: quá trình điều khiển
genotype và quá trình điều khiển sự biểu hiện phenotype.
T hu n h ậ n enzym từ v s v 293
I- Điều khiển genotype

Quá trình điều khiển genotype là quá trình tạo giống, công việc
tạo giống có khả năng sinh tổng hợp enzym cao là hhỉệm vụ đầu tiên.
Việc làm thay đổi những base của gen trong cấu trúc DNA sẽ giúp ta
thay đổi hoạt động của gen. Công việc này giúp ta thu được những
giống vsv mới có khả năng sinh tổng hợp enzym cao hơn giống ban
dầu hàng ngàn lần. Trước đây, người ta thường chọn giống từ điều
kiện tự nhiên. Công việc chọn giống từ nguồn v sv tự nhiên đòi hỏi
nhiều công sức và thời gian. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp chọn
giếng này là dưa
• vào khả Aăng
Iff * tư• nhiên, nhiều loài vsv có
chon loc
tính chất vượt trội hơn loài khác ồ một tính trạng nào đó. Nhiệm vụ
của những người chọn giấng là phát hiện ra tính trạng đó và tách
giông có tính trạng đó, nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo để giúp
giống này biểu hiện tối đa tính trạng mà ta mong muốn. Trong công
nghệ sản xuất enzym ở đầu thế kỷ 20, nh^ều công trình nghiên cứu
theo cách này đã thu được những kết quổrrất tốt và đã áp dụng vào
sản xuất cho hiệu quả rất cao. Những năm giữa th ế kỷ 20, các nhà
khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp đỉ truyền đã cải thỉện tính
chất giống. Trong giai đoạn này phát triển rất mạnh phương pháp
gây đột biến bằng các chất hóa học và các yếu tố vật lý. Các phương
pháp này hiện nay được coi là các phương pháp di truyền cổ điển. Ưu
điểm của những phương pháp là dễ thực hiện, nhưng nhược điểm lớn
nhất là đột biến tạo ra không định hướng, do dó thường m ất nhỉều
thời gian và công sức.
Ngày nay, người ta áp dụng phvrơng pháp tái tổ hợp gen, phương
pháp này vừa nhanh và vừa thu được kết quả theo ý muốn (tham khảo
thêm giáo trình Công nghệ gefe, do Nguyễn Đức Lượng chỏ biên, NXB
ĐHQG TP HCM, 2002).
Trong công nghiệp enzym, người ta đặc biệt quan tâm đến chất
lượng giống v sv . Chính vi thế, việc quan trọng đầu tiên là phải điều
khiển được hệ gen của v sv có khả năng biểu hiện được tính trạng tốt
là tổng hợp enzym mạnh. Giống vsv trong sản xuất enzym qụyết
định những yấn đề quan trọng sau:
294 Chương 6
- Giống quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzym
" - Giống quyết định đến hoạt tính enzym
- Giông quyết định đến vốn đầu tư xây dựng nhà máy. Nếu có
giống tốt (khả năng sinh tổng hợp enzym, hoạt tính riêng của enzym
cao) sẽ giúp ta xây nhà máy nhỏ hoặc ít nhà máy mà vẫn đảm bảo
được mục tiêu. Trong khi đó, nếu giống không tốt ta phải xây dựng
nhà máy lớn hoặc nhiều nhà máy, kinh phí cho xây dựng sẽ rấ t lớn.
- Giống quyết định đến giá thành enzym. Khi giống cho năng
suất cao sẽ làm giá thành hạ xuống.
2- Quá trình điêu khiển biểu hiện fenotype
Điều khiển biểu hiện ^ õ ' uườn9 (^
phenotype là phương pháp sử
dụng các yếu tố bên ngoài, tác
động vào tế bào v sv theo hướng
tối uu hóa quá trình sinh tổng
hợp enzym. Trong sản xuất được
Yếu tố
hiểu như các quá trình kỹ thuật bên ngoài
lê n m e n . Tế bào vi sinh vật
Như vậy, ta có thể hiểu thêm: Hình 6.4 Các quá trình điều
Điều khiển hoạt động của khiển trong sản xuất enzym theo
gai là điều khiển bên trong tế bào (ỊUl mỗ côn£ n8hlệp
Điều khiển các yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ, lượng oxy, nồng
độ chất dinh dưỡng, cơ chất, chất kích thích...) là điều khiển bên
ngoài tế bào.
Điều khiển các yếu tố bên ngoài tế bào thường dựa vào những
thành tựu khoa học và kỹ thuật của ngành chế tạo máy (chế tạo thiết
bị lên men), ngành tự động hỏa. Ngày nay, người ta đã thiết kế và
chế tạo được những thiết bị lên men hoàn toàn cổ thể cơ giới hóa và
tự động hóa được các quá trình sinh học của vsv. Những thiết bị này
giúp ổn định các yếu tố ảnh hưởng ở giá trị tối ưu. Nhờ đổ, v sv phát
triển và tổng hợp enzym rất ổn địtíh và số lượng cũng như hoạt tính
riêng của enzym rấ t cao. Chính những tiên bộ của ngành chế tạo máy,
tự động hóa dã giúp cho công nghệ sản xuất enzym phát triển rất
nhanh. Ngày nay, việc sản xuất enzym dã không chỉ sản xuất theo
quy mô công nghiệp mà còn tự động hóa ở trình độ rấ t cao.
6.2 VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP ENZYM

Như phần trên đã trình bày, sản xuất enzym theo quy mô công
nghiệp chủ yếu dựa vào vsv. Như vậy, v sv đóng vai trò quyết định
đến hình thái sản xuất enzym hiện nay.
So với động vật và thực vật, vsv có rất nhiều ưu điểm. Những
ưu điểm đó được tóm tắt như sau:
1’ Tốc độ sin h sản của v sv rấ t m ạnh
Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh
khối rất lớn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm,
tốc độ tạo sinh khối ở VSV cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng
sinh khối của động vật và thực vật. Để đạt dược tốc độ tăng sinh khối
lớn như vậy, v sv phải chuyển hóa một khôi lượng cơ chất rất lớn.
Cũng từ những nghiên cứu trên E.coỉi, nhiều nhà khoa học cho thấy
rằng trong vòng 24 giờ, vi khụẩn E.coỉi có thể chuyển hóa được khối
lượng cơ chất lớn hem một ngàn lần khôi lượng cơ thể chúng. Để
chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp
ra được lượng enzym rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tê
bào là do enzym đảm nhận. Chính vì thế, nếu sử dụng vsv như nguồn
sinh học để sản xuất enzym rất có lợi. Trong một khoảng thời gian
ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzym nội
bào) mà còn thu dược lượng enzym ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt
tính riêng rấ t cao.
2- E nzym th u nh ậ n từ v s v cỏ h o ạ t tin h rấ t cao
Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền
với tô"c độ sinh sản và phát triển của v s v .
v s v ỉ à giới 9 Ình vật rố t th ích hợp cho sản x u ấ t theo quy
mô công n ghiệp
Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh
tổng hợp enzym của v sv hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên
ngoài. Trong khí đó, sản xuất enzym từ nguồn thực vật và động vật
không thể đưa vào quy mô công nghiệp được.
296 Chương 6
4- N g uồ n n guyên liệ u d ù n g sản x u ấ t enzym theo quy mô

công n g h iệp rẻ tiề n và dễ k iếm
Đây cũng'chính là lợi thế rấ t quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm
giảm giá thành sản phẩm và có thể sản xuất sản xuất ỏ mọi nơi trên
thế giới.
5- v$v có th ể sin h tổng hợp cùng m ộ t lúc n h iề u loại enzym
khác nhau
Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đem bào
phải thực hiện tấ t cả mọi chức nâng của sự sống, do đó chúng phải
tạo ra nhiều loại enzym khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt.
Trong khi đó, cơ thể đa bào được phân hóa thành các cơ quan riêng,
mỗi một cơ quan (hay mô bào) thực hiện những chức năng riêng.
Chính vì thế, ở động vật và thực vật, việc khai thác enzym có giới
hạn ở một vài enzym nhất định.
Đặc đỉểm này vừa có lợi và vừa bất lợi cho kỹ thuật tinh chế sau
này. Có lợi vì khi ta sử dụng một loạt phản ứng sỉnh hóa cần có sự
chuyển hóa liên tục theo một chuỗi phản ứng, ta không cần phải sử
dụng nhiều nguồn enzym khác nhau. Nhưng nếu ta chĩ cần thực hiện
một phản ứng, đòi hỏi phải làm tinh sạch enzym này bằng cách loại
các enzym không cân thiết khác. Nhiều trưởng hợp công việc này rất
phức tạp và tốn kém. Do đổ, những enzym sau khỉ được tinh sạch
người ta thường ứng dụng trong y học, trong phân tích và trong kỹ
thuật di truyền. Trong công nghệ thực phẩm, người ta chỉ sử dụng các
loại chế phẩm enzym tương đối sạch sẽ và th ế phẩm enzyxn thô.
6.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT CHUNG TRONG NUÔI CẤY vsv THU

NHẬN ENZYM
Trong nuôi cấy v sv thu nhận enzym cổ một số kỹ thuật chung

và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm:
- Kỹ thuật tạo giống
- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
- Thiết kế thiết bị nuôi cấy
- Kỹ thuật lên men
- Tách, tinh chế thu nhận enzym.
Thu n h ận enzym từ v s v 297
Phần cuối cùng là tách, tinh chế và thu nhận chế phẩm enzym
có nhiều điểm chung với kỹ thuật tách tinh chế thu nhận chế phẩm
enzym từ nguồn động vật và thực vật, chúng tôi đã trình bày ở chương
trước. Trong phần này, chúng tôi chì trình bày những kỹ thuật có liên
quan đến công nghệ sản xuất enzym từ vsv.
6.3.1 Kỹ th u ậ t tạo giống có khả năng sinh tổng hợp enzym cao
1- Vai trò của giống trong cồng nghệ enzym
Giống v sv đóng vai trò quan trọng trong công nghệ enzym.
Những vai trò quan trọng đó được tóm tắt như sau:
a- Giống v sv quyết định đến năng suất enzym của nhà máy.
Nếu chúng ta cố giống tốt, năng suất enzym thu được sẽ cao.
ò- Giống v sv quyết định đến hoạt tính emym. Người ta thường dùng
hoạt tính riêng của enzym để so sánh và đánh giá chất lượng enzym.
c- Giống v sv quyết định đến vốn đầu tư xây dựng nhà máy sản
xuất enzym. Nếu ta có giông vsv vừa có năng suất enzym cao, vừa có
hoạt tính enzym mạnh thì ta chỉ cần xây dựng một nhà máy cũng thu
được hiệu quả kỉnh tế cao. Nếu ta có giếng v sv có năng suất thấp và
hoạt tính enzym không cao, ta phải xây dựng nhiều nhà máy mới có
năng suất enzym tương ứng với một nhà máy trên. Do đó chi phí xây
đựng nhà máy sản xuất enzym với giống tốt sẽ thấp hơn nhiều lần so
với việc đầu tư xây dựng những nhà máy với giống không đảm bảo
chất lượng.
d,- Giống v sv quyết định đến giá thành sản phẩm . Giếng có
chất ỉượng cao, chi phí cho một đơn vị enzym sẽ thấp hơn trường hợp
sản xuất bằng gỉống kém chất lượng.
2- Yêu cầu giống vsv trong công nghệ emym
Công nghệ sản xuất enzym thuộc nhóm công nghệ ỉên men hiện
đại và được sản xuất theo quy mò công nghiệp. Do đó giống v sv ứng
dụng trong công nghệ enzym cổ những yêu cầu riêng. Những yêu cầu
cơ bản của giống ứng dụng trong còng nghệ enzym bao gồm:
298 Chương 6
a- Giống v s v phải có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzym mà

ta cần. v sv cùng một lúc có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzym
khác nhau. Nhiều trường hợp ta không cần tấ t cả các loại enzym đó
mà chỉ cần một hoặc hai loại enzym trong sô" đó. Những enzym ta cần
phải là những enzym có khả năng được tổng hợp bởi v sv đó, vượt trội
hơn các loại enzym khác.
b- Giống v s v phải có khả năng thích ứng rất nhanh và phát
triển mạnh, sinh tổng hợp nhiều enzym ta mong muốn trong diều
kiện sản xuất công nghiệp.
Các gỉống được phân ỉập trong điều kiện tự nhiên thường không
dễ dàng thích ứng với điều kiện sản xuất công nghiệp, do đó, muốn
thu được kết quả sản xuất tất đòi hỏi phải có thờỉ gian tạo tính thích
nghi, v sv là giới sinh vật có tính thích nghi rất cao, do đó công việc
tạo thích nghỉ không mấy khố khăn.
c- Ngoài khả năng sinh tổng hợp enzym mạnh, giống v s v ứng
dụng trong công nghệ enzym phải có khả năng sinh sản, phát triển
mạnh. Khả năng sinh sản, phát triển mạnh giúp ta dễ dàng trong
nuôi cấy.
d- Giống v s v ứng dụng trong công nghệ enzym phải là những
giống dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận
enzym ngoại bào và tế bào dễ phá vỡ để thu nhận enzym nội bào.
3- Kỹ thuật tạo giổng trong công nghệ enzym
Or Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
v sv phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng cổ mặt ỏ những
nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, nơi có nhiệt độ rất
thấp và cả những nơi có nhiệt độ rất cao. v sv có khả năng thích nghi
trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này
mà v sv có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt
nhất. Trong quá trình đấu tranh sinh tồn đó, v sv đã tiến hóa dần và
trong các loài, có nhữĩig cá thể v sv có khả năng sinh tổng hợp được
những enzym có hoạt tính rất cao. Việc phát hiện ra những loài và
những chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym mạnh được nhiều nhà
khoa học về v s v công bố vào những năm đầu thế kỷ 20. Trong những
năm đầu th ế kỷ này, người ta đã hoàn thiện nhiều phương pháp phân
lập v sv từ điều kiện tự nhiên. Có một sôx đặc điểm chung của vsv
được phân lập từ điều kiện tự nhiên cần được lưu ý để hoàn thỉện H4n
những đặc điểm có lợi trong sản xuất enzym.
- Các giông vsv có khả năng sinh tổng hợp enzym trong điều
kiện tự nhiên thường không có khả năng sinh tổng hợp một loại
enzym th ật sự mạnh và chưa thật đáp ứng đầy đủ cho quy mô sản
xuất công nghiệp. Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, v sv phải
cùng một lúc đốì phó với hàng loạt các yếu tô' ngoại cảnh và phải
phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nhau nên v sv bắt buộc phải
tổng hợp nhiều loại enzym khác nhau để đảm bảo sự phát triển. Sự đa
dạng này đòi hỏi người nghiên cứu phải tìm ra những đặc tính sinh
tổng hợp loại enzym riêng với một nỗ lực rất lớn.
- Các giống v s v có khả năng sinh tổng hợp enzym trong điều
kiện tự nhiên được gọi chung là các chủng v sv hoang dại, chúng đã
quá quen thuộc với sự thay đổi th ất thường của điều kiện tự nhiên.
Khi chúng ta đưa chúng vào diều kiện sản xuất công nghiệp với
nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài v sv giông phải
có một thời gian thích nghi với diều kiện sản xuất công nghiệp.
Huấn luyện chúng thích nghi với diều kiện sản xuất công nghiệp là
điều rấ t cần thiết.
- Các loài v s v có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym nào
đó thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng.
Đặc điểm này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định vị trí cần
phân lập loại v sv sinh tổng hợp enzym ta cần.
Ví dự, nếu ta muốn phân lập vsv có khả năng sinh tổng hợp
protease cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, ta
muốn phân lập v sv có khả năng sinh tổng hợp amylase ta phải tìm
nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên.
- Trong quá trình sinh sản, phát triển, v s v trong điều kiện tự
nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến (hiện tượng biến dị).
Những đột biến thường gây cho các cá thể chết, nhưng cũng nhiều đột
biến tạo ra những loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzym rất cao.
Việc tìm kiếm những đột biến kiểu này rất có ý nghĩa và rất .cần làm.
Những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Có nhiều nghiên
cứu trong thập niên 60 của thế kỷ 20 thu được những cá thể đột biến
tự nhiên và đã được đưa vào sản xuất enzym có hiệu quả rất cao.
300 Chưctag 6
Các bước tiến hành phân lập v sv có khả năng sinh tổng hợp
enzym từ điều kiện tự nhiên có thể tham khảo ở nhiều sách thí
nghiệm vsv học.
6- Phăn lập giống trong điều kiện sản xuất
So với gỉống dược phân ỉập từ điều kiện tự nhiên, giống được
phân lập trong điều kiện sản xuất có những uù điểm cơ bản sau:
- Các giống được phân ỉập trong điều kiện sản xuất thường đã
thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giấng
này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
- Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là
những giống đã được chọn lọc hoặc qua quá trình biến đổi gen và có
những đặc điểm sinh hóa hơn hẳn các giống v sv hoang dại.
- Mật độ tế bào v sv có trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên
men, dịch nước thải, chất thải của một <juá trình ỉên men) thường rất
cao. Do đó khả năng thu nhận được những chủng có khả năng sinh
tổng hợp enzym cao thường rất cao.
c- Phân lộp giống trong mẫu giống đã hư hồng
Các ống gỉống cổ thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị
nhiễm, có thể rấ t nhiều tế bào v sv giống bị thoái hóa, nhưng cũng
còn nhiều tế bào không bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn giông
này nhiều khi lại đạt được nhữ&g kết quả tốt.
4- Kỹ thuật năng cao chất lượng giống
Việc nâng cao chất ỉượng giống là công việc phổi được thực hiện
thường xuyên vì trong công nghiệp đòi hỏi tính cạnh tranh rấ t cao.
Trong các phòng thí nghiệm, người ta thường sử dụng những
phương pháp cơ bản sau:
fl- Phương pháp tạo khả năng thích nghi
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là v sv cổ khả năng thích
nghi rấ t cao, người ta huấn luyện khả náng thích nghi này của v sv
đối với nhữbg điều kiện tối uu trong sản ruất. Phương pháp này có uu
điểm là dễ thực hiện, nhưng đòi hỏi phải cổ tính kiên trì và quá trinh
huấn luyện phải được thực hiện liên tục vì tính thích nghi tạo ra
không thể di truyền cho th ế hệ sau.
6- Phương pháp thay đổi hệ thống di truyền

Di truyền học là môn khoa học đóng vai trò rất quan, trọng
trong việc khám phá bí mật sự sống và tạo ra những giống mới dùng
trong sản xuất công nghiệp. Theo đó, kỹ thuật di truyền được hình
thành và được hoàn chỉnh dần theo thời gian. Kỹ thuật dỉ truyền được
chia ra hai nhóm:
- Kỹ thuật di truyền cổ điển
- Kỹ thuật di truyền hiện đại.
Trong kỹ thuật di truyền cổ điển, người ta thường sử dụng các
phương pháp lai, các phương pháp gây đột biến bằng các yếu tố vật lý,
hóa học và sinh học.
Trong kỹ thuật di truyền hiện đại, người ta thường sử dụng các
phương pháp tái tổ hợp gen.
Kỹ thuật di truyền cổ điển phát triển rất mạnh trước nám 70
của thế kỷ 20. Kỹ thuật di truyền hiện đại phát triển mạnh từ 1974
đến nay.
Ưu điểm của phương pháp lai ỉà dễ thực hiện, nhưng phương
pháp có nhược điểm là chỉ có thể thực hiện trong cùng một loài.
Kỹ thuật gây dột biến bằng các yếu tố hóa học, yật lý và sinh
học không bị giới hạn bỏỉ loài, nhưng đột biến tạo ra thưởng không
phải ỉà những đột biến định hướng.
Kỹ thuật tái tổ hợp gen khác phục được nhữìig nhược điểm trên
của những phương pháp trên.
Bằng những kỹ thuật nâng cao chất lượng giống, người ta đã tạo ra
dược những giống có khẩ nÃng sinh tổng hợp enzym rất cao và được ứng
dụng mạnh trong sản xuất, tạo ra đươc ưu thế trong cạnh tranh.
6.3.2 Kỹ th u ậ t bảo quản giống vsv tổng hợp enzym

Mục đỉch của bảo quản-giếng v sv dùng trong sản xuất enzym ỉà
đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn
định của hoạt tính enzym.
Để thực hiện mục đích trên, người ta thường áp dụng những
\
phương pháp sau.

302 Chứơng 6
1- Phương pháp cấy truyền và bảo quản lạnh

Các phòng thí nghiệm và các cơ sở sản xuất thường áp dụng
phương pháp này. Phương pháp cấy truyền và bảo quản lạnh dựa trên
nguyên tắc là v sv sẽ hạn chế quá trình trao đổi chât trong điều kiện
lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong khoảng thời gian này,
v sv có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym.
Phương pháp này được thực hiện như sau: Ông giống v sv được
cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một
ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và
một ống dùng để bảo quản. Đối với những người mới làm công tác bảo
quản giông, cần cấy truyền vào năm ông để tránh sự sai sót khi thao
tác. Đối với những người đã làm quen công việc này chỉ cần cấy
truyền vào ba ống.
Sau khi cấy truyền, ống giống cần dược bảo quản phải dược đặt
trong điều kiện lạnh từ 4-7°C. Sau thời gian định kỳ (tùy loài VSV),
khoảng 15 ngày hay một tháng sẽ phải cấy truyền lại. Công việc cấy
truyền theo định kỳ được thực hiện liên tục.
2- Phương pháp bảo quản trong đất hoặc trong cát
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sau: Trong môi trường tối
thiểu có độ ẩm thấp, v sv có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng
hợp enzym trong một thời gian dài. Phương pháp này chỉ cổ hiệu quả
đối với v sv có khả năng tạo bào tử.
Trước khi sử dụng, đất, cát phải dược làm sạch và sấy đến độ
ẩm < 5%. Giấng v sv được nuôi cho đến khi tạo nhiều bào tử. Người ta
trộn bào tử với đất hoặc cát đã đựợc làm sạch và sấy khô. Sau dó hỗn
hợp này được cho vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.
3- Phương pháp bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phương pháp cũng dựa trên nguyên tắc bào tử v sv dược giữ
trong hạt ngũ cốc dã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% vẫn giữ được khả
năng sinh tổng hợp enzym trong một thời gian dài.
Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau:
Giống v sv được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo
nhiều bào tử. Đào tử cùng thành phần môi trường đươc sấy khô ở
nhiệt độ < 50°c cho đến khi độ ẩm < 8%, đưa vào bao, hàn Ịgín và bảo
quản ở nhiệt độ thường.
4- Phương pháp bảo quản giống trong lớp dầu khoảng

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc, nếu cách ly v sv với
không khí, nhiều v sv có khả năng giữ được hoạt tính enzym và khả
năng sinh tổng hợp enzym. Phương pháp này được thực hiện như sau:
Người ta nuôi v sv trên môi trường thạch nghiêng, khi v sv phát
triển, người ta đổ một lớp dầu lên phía trên khuẩn lạc đó.
5- Bảo quản giống theo phương pháp đông khô
Phương pháp này cũng dựa trên nguyên tắc khi môi trường nuôi
cấy giảm đến giới hạn ngưng phát triển của vsv, v sv có khả năng
bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzym và hoạt tính enzym.
Phương pháp này được thực hiện như sau: Sau khi nuôi cấy v sv
trong môi trường lỏng, người ta phân phối giống trong những ống
dùng cho phương pháp này và đưa vào máy tạo đông khô. Sau dó,
người ta hàn nắp ống nghiệm lại. Phương pháp này là phươQg pháp
hiện đại nhất, đảm bảo giông giữ được đặc tính nhiều năm.
6- Phương pháp làm lạnh đông
Có nhiều phòng thí nghiệm chọn phương pháp lạnh đông để bảo
quản giống. Người ta thường sử dụng phụ gia để bảo quản gỉống. Chất
phụ gia thường được sử dụng là glycerol 15%, huyết thanh ngựa, dung
dịch saccharose 10% + gelatin 1%, dung dịch glucose 10%.
Nhiệt độ bảo quản từ -15°c đến -70°c. Khi tiến hành lạnh đông
cần phải được cấy truyền thường kỳ. Chu kỳ cấy truyền phụ thuộc vào
nhỉệt độ bảo quản.
Bảng 6.1 Nhiệt độ và chu kỳ cấy truyền
Nhlệỉ độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian

Stt stt
bào q u in cấy truyền bảo quản cấy truyền
1 -15°c đến -20°c 6 tháng 4 -50°c đến -60°c 36 tháng
2 -30°c 9 tháng 5 -70°c 120 tháng
3 -40°c 12 tháng
304 Chương 6
6.3.3 T hiết kế công nghệ nuôi cấy (ỉên men) thu nhận enzym từ vsv
Khác với quá trình trao đổi chất ở động vật và thực vật, quá
trinh trao đổi chất của vsv trong một giới hạn môi trường nhất định
được gọi là quá trình lên men. Như vậy, ở một góc độ nhất định, quá
trình nuôi cấy v s v được coi như quá trình lên men.
Trong quá trình lên men, vsv tham gia quá trình tổng hợp
enzym. Quá trình tổng hợp enzym thường xảy ra liên tục và cả trong
điều kỉện yếm khí và trong điều kiện hiếu khí.
Trong công nghiệp enzym hiện nay, người ta thường áp dụng
quá trình nuôi hiếu khí để thu nhận enzym. Như vậy, trong nội dung
thiết kế công nghệ enzym, chúng tôi trình bày công nghệ hiếu khí thu
nhận enzym.
Thiết kế công nghệ enzym chỉ giới hạn ở việc xác định công
nghệ nuôi cấy, còn kỹ thuật xử lý chế phẩm enzym chúng tôi đã trình
bày kỹ ở chương 2 trong cuốn sách này.
1- Thiết k ế công nghệ
Cuối th ế kỷ 19 và đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vsv thường được
thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển
rấ t rộng rãi không chỉ để thu nhận chế phẩm enzym mà trước tiên đó
là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men
truyền thống.
Sau đó, người ta phát hiện ra tác động mạnh mẽ của oxy và của
cánh khuấy, hàng loạt các thiết kế về thiết bị lên men ra đời. Từ đó
hình thành phương pháp nuôi cấy chìm.
Như vậy, cho đến nay có hai phương pháp nuôi cấy vsv thu nhận
enzym: Phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
a- Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề m ặt là phương pháp tạo môi trường
cho v s v phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt,
người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (một
sô' sách còn gọi là môi trường bán rắn).
Môi trường lỏng

ở môi trường lỏng, vsv sẽ phát triển trên bề m ặt môi trường,
tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí
(khòng khí). Ở đây, vsv sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi
trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzym.
Enzym ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung
dịch môi trường. Enzym nội bào sẽ nằm trong sinh khối vsv.
Không khí Sinh khối v s v Không khí
enzym
ngoại bào
H ình 6.5 Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay
Nuôi cấy v sv thu nhận enzym trên môi trường lỏng theo phương
pháp nuôi cấy bề m ặt thường được tiến hành trong các khay có chiều
cao khoảng 12-15cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo
kích thước phòng nuồi sao cho thuận tiện trong thao tác.
Ở đây, người ta quan tâm nhỉều đến chỉều cao môi trường lỏng.
Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vsv sẽ không có khả năng
đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ỏ phía đáy khay nuôi cấy. Nếu
chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu
suất thu nhận enzym sẽ không cao.
Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong
khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7cm là hợp lý.
Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzym, khi nuôi cấy v sv thu
nhận enzym, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để táng khả
năng xâm nhập cỏa không khí vào trong lòng môi trường, người ta
thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
Trong trường hợp này, v sv phát triển trên bề m ặt môi trường,
nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzym
nội bào và ngoại bào. Các enzym ngoại bào sẽ thầm thấu vào trong
các hạt niôi trường, còn các enzym nội bào nằm trong sinh khối vsv.
306 Chương 6
vsv không chỉ phát triển trên bề m ặt môi trường, nơi ngăn
cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khi) mà còn phát triển
trên bề m ặt của các hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môi trường.
Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích
hợp. Nếu độ ẩm cao quá sẽ làm bết môi trường lại, không khí không
thể thâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu độ ẩm thấp quá sẽ
không thuận lợi cho vsv phát triển. Thông thường người ta thường
tạo độ ẩm khoảng 55-65%W là hợp lý.
Hạt môi
trưởng * V V / M ô i trường đặc
H ình 6.6 Nuôi cấy vi sinh vật trẽn môi trường đặc
Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vsv thu
nhận enzym, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi
trường, tạo điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàng xâm nhập vào
lòng môi trường.
Ưu điểm của phương pháp nuôi cếy bề mặt là dễ thực hiện và
khi bị nhiễm bởi v sv lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ, ta
rất dễ dàng xử lý.
b- Phương pháp nuôi cấy chim
Phương pháp nuôi cấy bề mặt có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều
diện tích và rất khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp này dần được
thay thế bằng nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn. Phương pháp nuôi cấy
bề m ặt chỉ thích hợp cho nuôi cấy nấm sợi (nấm mốc), xạ khuẩn, còn
nuôi cấy chìm lại thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng
môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men
(fermentorh Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ
thống diều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều
chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống diều
hòa không khí và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn.
Tác dụng của hệ thống thổi khí

Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằng máy
nén khí (compressor). Không khí sau khi ra khỏi máy nén khí được
làm nguội, làm sạch và khử trùng. Không khí được phân phối vào
thiẽt bị lên men bằng những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ. Khi không
khí vào trong bể lên men, chúng có những tác động trực tiếp sau:
- Làm xáo trộn môi trường. Nhờ dòng khí yận chuyển trong môi
trường lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào v sv sẽ phân phối đều khắp
môi trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động. Nhờ ở trạng thái
động như vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào v sv sẽ rất
cao. Khả năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu, khả năng sinh tổng
hợp enzym sẽ cao bấy nhiêu.
- Nhờ có máy nén khi hoạt động, không khí dược cung cấp
thường xuyên, oxy sẽ tan trong môi trường và vsv sẽ phát triển mạnh
hơn (đối với v sv hiếu khí). Như vậy, đây là quá trình thúc đẩy vsv
sinh sản và phát triển.
- Dòng khí được cung cấp liên tục và thải ra liên tục sẽ kéo theo
những chất khí dược tạo ra trong quá trình phát triển của vsv.
Những chất khí được tạo ra trong quá trình trao đổi chất này thường
gây ức chế quá trình trao đổi chât, sinh sản và phát triển của vsv.
Nhờ có dòng khí thổi vào môi trường sẽ hạn chế ảnh hưởng xấu của
các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đái chất.
Tác động cửa hệ thống khuấy trộn
Hệ thống khuấy trộn được thiết kế và lắp đặt trong các thiết bị
lên men không chĩ trong lên men hiếu khí mà cả trong lên men yếm
khí. Khuấy trộn là quá trình cơ học có ý nghĩa rất lớn trong thiết bị lên
men thu nhận chế phẩm enzym. Các tác động đó được tóm tắt như sau.
- Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm các thành
phần môi trường và các tế bào vsv không lắng xuống, tăng khả năng
tiếp xúc của các thành phần môi trường và vsv, từ đó làm tăng khả
năng trao đổi chất của vsv, lượng enzym được tổng hợp sẽ tăng lên.
- Trong lên men hiếu khí có thổi không khí, cánh khuấy hoạt
dộng sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy có trong không khí khi
được thổi vào môi trường. Khi đó, các bọt khí, một m ặt bị vỡ nhỏ
ra, tăng th iết diện tiếp xúc với dung dịch, một m ặt dòng thoát khí
308 Chương 6
khỏi dung dịch sẽ tồn tạ i lâu hơn trong môi trường nước. Thời gian
tổn tạ i của các bọt khí lâu sẽ ỉàm tăng khả năng tan của oxy. v sv
chỉ cố thể đồng hóa oxy hòa tan chứ không có khả năng đồng hốa
oxy ở dạng tự do.
- Cánh khuấy ỉàm tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tác
động cơ học.
Động học của quá trình lên men có cánh khuấy và hệ thống thổi
khí, chúng tôi đã trình bày kỹ trong sách Công nghệ vi sinh tập 2 và
Công nghệ sinh học, NXB ĐHQG TP HCM phát hành năm 2002 và
năm 2000.
6.4 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN MỘT s ố ENZYM QUAN TRỌNG TỪ v s v
Các nhà khoa học đã phát hiện ra hàng ngàn loại enzym khác
nhau, nhưng chỉ một số ít trong sấ đố được sản xuất theo quy mô công
nghiệp và được ứng dụng rộng răi trong công nghỉệp thực phẩm, trong
y học, trong nông nghiệp, trong phân tích và trong kỹ thuật di truyền.
Trong cổng nghiệp sản xuất eạzym, tùy theo mục đích sử dụng
người ta thường sản xuất các dạng chế phẩm sau:
- Chế phẩm enzym thô *
- Chế phẩm enzym bán tinh khiết
- Chế phẩm enzym tinh khiết
- Chế phẩm v s v có khả năng sinh tổng hợp enzym mạnh.
Đa dạng chế phẩm đầu thường sử dụng vào những phản ứng các
á íề phẩm enzym này người ta quan tâm đến hoạt tính xúc tác và độ
tinh sạch của enzym. Dạng sản phẩm sau cùng, người ta quan tâm cả
đến hoạt tính sinh học và khả năng sinh sản, phát triểp của v sv tạo
ra enzym đó.
6.4.1 Thu nhận enzym protease từ vsv
i- Nguồn thu nhận enzym proteose
Nhiều v s v cổ khả n&ng tổng hợp mạnh prôtease. Các enzym
này cố thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một
sấ protease ngoại bào đã sản xuất (Ịuy mô công nghiệp và được sử
dụng rộng râỉ trong nhỉều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và
trong y học. Các ỉoàỉ v sv có khả năng tổng hợp mạnh protease được
Thu n h ậ n enzym từ V8V 309
Bảng 6.2 Một số vsv có khả năng tổng hợp mạnh protease
vsv Ghl chú
Vi khuẩn Bac. subtilispha Protease trung tfnh, protease kiổm (subtilizin)
Bac. dreulans
Bac. sphaericus
Bac. thermophilus
Bac. aerothermophitus
Bac. thermoaảdurans
Bac.tíiermoproteoty tìcus Protease kiổm
Bac. brevis
Protease trung tính
Bac. licheniformis
protease trung tính, proỉease acid
Bac. mesenìericus
protease acid và protease kiổm
Bac. megaterium
Bac. cereus
Bac pumHus
{ colagenase
Ci. perfringens
Ci. histoỉyticum
Cl. sporogens protease trung tfnh, protease kiếm
Ps. aeruginosa
Xạ khuẩn Sir. griseus Dùng trong kỹ nghộ ở Nhật, Mỹ, gồm ít nhất là
Str. rimosus 11 enzym VỚI cơ chát procolagen phàn giải 70%
Sừ. fradiae đến amino add có 5 protease, haỉ peptidase
Sir. faeca is (lơxinamino- peptidase, cacboxypeptidase), hai
St.fB9ềJ3 var. fXD-teotrtcus protease: protease-serín.
Nấm mốc Asp, oryzae protease-kim lọaỉ protease serìn, cổ ba loại
Asp. satoi protease acid, protease trung tính, protease
kiềm. Protease acid (aspergilopeptỉ-dase A)
Asp. awamori Protease acid
Asp. nlegr Haỉ protease acid
Asp. shtrousami Protease acid
Asp. fumigatus Hai protease: protease acid, và protease klém
Asp. tericola Protease acid có tác dụng làm đống sữa
Protease trung tính
Protease kiểm
Asp.candidus
Hai protease: protease klổm vả protease
trung tính
Asp. ochraoeus
Protease acỉd
Protease kỉổm
Asp. sojae Protease acỉd có tác dụng làm dông sữa d&
Asp. tiavus dược dủng ở Nhật đổ thay cho rennin
pen. ịanthừìứtíum
Pen. chrysogonum.
Pen. cyaneo futvum
Mucor. pus&us
Rh. chinensb
Rh. delemar
Rh. niveus
Rh. nodous
Rh. pseudofdnensis
Rh. peka
Phvmstorrichum omnivontnt
310 Chương 6
2- Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các công trình nghiên cứu protease v s v ngày càng nhiều. Các
kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi
v sv cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chế
phản ứng, pH hoạt động thích hợp,,., các nhà khoa học đã phân loại
các proteinase v s v thành bốn nhóm như sau:
Protease-xerin; protease-thiol; protease-kim loại; protease-acid.
Một sế tác giả khác chia protease ra ba nhóm, dựa vào pH hoạt
động của chúng bao gồm:
Protease-acid; protease trung tính; protease kiềm.
Trong bốn nhóm protease kể trên , các protease-xerin và
protease-tiol có khả năng phân giải liên k ết este và liên kết
amide của các dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các
protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính
esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid. Nhiều
protease ngoại bào của v sv đã được nghiên cứu tương đối kỹ về
câu tạo phân tử, m ột số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng.
K ết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzym
này tương đổfi bé, n h ấ t là các protease-xerin.
Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng
20.000- 27.000datton. Tuy nhỉên, cũng có một số proteinase-xerin
có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzym của Penicillium
cyoneo’fulvum (44.000), Asp, oryzae OUT 5038 (52.000) (Martin
1962, M orihara và Tsuzuki 1969). Trọng lượng phân tử của các
protease kim loại lớn hơn so vđi protease-xerin, (vào khoảng
33.800-48.400). Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng
lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000.
Có th ể tóm tắ t những đặc tính của các nhóm proteinase này
ở bảng 6.3.
Bảng 6.3 Một số tính chất protease vsv

Đặc điếm trung pHttfi
Nhóm Nguén enzym Chất kìm hãm
tâm hoạt động thích
Proteinase Bac.subtilis DFP+ Xe rin Kiểm
Xerin Bac. pumilus
Sỉr.griseus
Str.fradiae
A rt hrobacter B22
Asp.oryzae
Asp.flavus
Asp.soịae
E.coli
Proteinase Streptococcus lodoaxêta-mit -SH 7.5
-tiol Clostridium histoly- ticum Ps.cloromer- 7,0
curbenzoat
Proteinase Bac.subtiius EDTA~ Kỉm loại Trung
kim loại Bac.eubtilus NRRL B3411 1,10octa-fenantrolin hoá trị 2 tính
Bac.subtilisam y
losaccarilicis
Bac.megaterium
Pseudomonasaeruginosa
Atreptomyces naraensis
Asp.oryzae
Acremonium kiliense
Clostridium histtolyỉicum
Proteỉnse Asp.niger Diazoaxetil COOH acid
acid Aspawam ori DI norlơx-inmetil este
Asp.sailoi, Penicittium
ịanỉhinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pusìllus
Endothia parasitica
Cách phân loại trên được nhiều tác giả nhất trí và được sử dụng
rộng rãi. Tuy nhiên, trong thời gian sau này, số protease v s v được
nghiên cứu ngày càng nhiều, ogày càng nhận được nhiều enzym mang
tính chất trung gian giữa các nhóm kể trên, nhất là giữa nhóm một
và nhóm ba. Do đó người ta bắt đầu có ý kiến về cách phân lọai trên.
Năm 1975 Morihara đã thử phân loại các protease v s v được chia
thành bốn nhóm lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối cơ chất
tổng hợp hoặc đối với chuỗi P-insulin đã bị oxy hóa. Nhóm một có tính
đặc hiệu dối với các gốc amino acid ở về phía nhóm -C02 của liên kết
peptide do đó còn được gọi là carbonxyendopeptidase. Nhóm ba có đặc
312 Chương 6
hiệu dối với các gốp amino acid về phía nhóm -NH - của liên kết
peptide (aminoendopeptidase). Nhóm thứ tư có tính đặc hiệu đối với
các gốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide. Mẫi nhóm này
được phân thành các nhóm nhỏ cũng dựa vào tính đặc hiệu của chúng
và một số tính chất khác.
Nói chung, tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện
dối với gốc amino acid chứa nhóm -CO - hoặc nhốm -NH - của liên
kết bị phân giải (đặc hiệu sơ cấp) mà còn cả đếỉ với các gôc amino
acid ở xa liên kết bị phân giải (đặc hiệu thứ cấp hoặc tương tác thứ
cấp). Các enzym trong cùng một nhóm, có tính đặc hiệu giống nhau
cũng chịu ảnh hưởng giông nhau của tương tác thứ cấp. Nối chung,
các enzym có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng của
tương tác thứ cấp ít hơn và ngược ỉại. Chẳng hạn các protease-xerin
giống trypsine của Streptomyces, protease kim loại trung tính,...
thường ít chịu ảnh hưởng cửa tương tác thứ cấp khi chúng tác dụng
với cơ chất phân tử bé cũng như các peptide phân tử ỉớn hoặc
protein. Ngược lại, các protease-xerin kiềm hoặc protease acid chịu
ảnh hưởng lớn của tương tác thứ cấp mặc dù các enzym này có tính
đặc hiệu nghiêm ngặt đối vởi cơ chất phân tử bé. Khi tác dụng trên
các cư châ't phân tử lớn. Tính đặc hiệu của các enzym này cũng được
xác định bởi tương tác thứ cấp.
Các protease của vsv mới được chú ý nghiên cứu từ năm 1960,
mặc dù từ năm 1918, 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng
phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm này, số công trình
nghiên cứu protease v s v táng lên đáng kể nhiều hcm các công trình
nghiên cứa protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt được
trong lĩnh vực nghiên cứu protease vsv đã góp phần mở rộng quy mô
sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong thực tế. Trong
thời gian gần đây, người ta cũng đã có được những phương pháp thích
hợp để nhận các chế phẩm không tan của protease. Kết quả này mở
ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng của protease.
3- Trung tăm hoại động
Trong trung tâm hoạt động "của các protease v s v ngoài gốc
amino acid đặc trưtig cho từng nhóm còn cổ một số gốc amino acid
khác. Ví dụ, His thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các
protease-xerin, protease tiol, tyrosine, trong trung tâm hoạt động của
các protease kim loại.
Các kết quả nghiên cứu cấu trúc không gian trung tâm hoạt
động của một số protease vsv cho phép rút ra một số nhận xét chung
như sau:
- Trung tâm hoạt động của các protease v sv đủ lớn và bao gồm
một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ
kim loại. Marihara và tập thể (1969, 1970) đã nghiên cứu cấu trúc
trung tâm hoạt động của 5 subtilisin và xác định rằng trung tâm hoạt
động của các subtilisin có kích thước giống nhau, vào khoảng 18°A,
tương ứng với 5-6 gốc amino acid.
Các protease kim loại có trung tâm hoạt động lớn hơn vào
khoảng 21°A, có thể phân bỉệt thành sáu phần dưới trung tâm hoạt
động (subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với một
gốc amino acid trong phân tử cơ chất.
Mathews và tập thể (1972) nghiên cứu cấu trúc trung tâm hoạt
động của thermolysin và thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym
này được tạo thành nhờ các gốc amino acid ỏ giữa chuỗi polypeptide,
tạo thành một rãnh sâu giữa phân tử. Nguyên tử kẽm ò đáy của rãnh
này. Theo các tác giả, các gốc amino acid trong trung tâm hoạt động
của thermolisin có thể là Glu-143, Asp-170, Arg-203, Tyr-157, His-231.
Histidin ở phía trước nguyên tử kẽmt kẽm tạo thành liên kết muối với
Asp-226. Về vai trò cửa gốc tyrosin trong trung tâm hoạt động của các
proteinase kim loại trung tính cũng được Tsuru và tập thể xác nhận
(1970). Các tác giả cho rằng, có thể có ba gốc tyrosin cùng với nguyên
tử kẽm tham già trong trung tâm hoạt động của protease trung tính
của Bac.subỉilừ. Protease kim loại của Boc. Pimiluc cũng vậy, m ật độ
phân giải casein của Ĩ1Ó bị giảm dưới tác dụng của tetranitrometan ỏ
pH trung tính.
Đối với các protease acid, theo nhiều tác giả đã nghiên cứu cấu
trúc trung tâm hoạt động của các tinh thể protease acid của Rhizopus
chinenis và Endothia parasiíica đã cho thấy phâố tử các protease này
gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hd vào khoảng 20°A. Khe hở này
là phần xúc tác của enzym, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện
nhau trong khe ấy. Theo tác giả, có lẽ kiểu cấu trúc trung tâm hoạt
động trên đây là đặc tntag chung cho các protease acid. Ngoài nhóm
-COOH theo Ichishida và Yoshida (1986), gốc tryptophan cũng đóng
vai trò quan trọng dối với aspergilopeptidase A.
314 Chương 6
- Đối với cáqj>rotease không chứa cysteine, trung tâm hoạt động
của chúng cổ' tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng
không được giữ vữrìg bởi các cầu disulphide.
Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease v sv có khác nhau
nhưng các enzym này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E+S » E-S -------► E - S + Pi -------► E + Pa
trong đó: E - là enzym; s - là cơ chất; E‘S - là phức chất enzym-cơ chất

E-S’ - là phức chất trung gian enzym cơ chất hóa (axilenzym)
Pi - là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do
mới được tạo thành)
p2 - là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do
mới được tạo thành).
Theo một số tác giả, cơ chế tác dụng của các protease v sv cũng
giống với protease xerin động vật, dều tiến hành theo kiểu xúc tác
acid-bazơ theo sơ đồ của Polgar và Bender (1969). Proteinase acid của
v sv có lẽ xúc tác cho phản ứng theo cơ chế giống với pepsin.
4- Các phương pháp thu nhận enzym proteose
Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vsv
đã gốp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng
enzym trong thực tế. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và ứng dụng của protease.
Để thu nhận chế phẩm protease từ v sv cũng như các enzym
khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt
(phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm).
Phương pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm sợi, phương pháp
bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn và nấm sợi.
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng phương pháp bề mặt kinh tế
hơn. Vì vậy các cơ sở sản xuất enzym mới xây dựng thường dùng phương
pháp này. Hiện nay phương pháp bề mặt được sử dụng rông rãi ở Nhật. Khi
sử dụng phương pháp bề sâu thường dễ bị nhiêm hơn phương pháp bề mặt.
Ở phương pháp bề mặt, người ta thường sử dụng môi trường có
độ ẩm và giữ ở nhiệt độ không đổi. Trong suốt quá trình nuôi, độ ẩm
của môi trường vào khoảng 50-55%w. Nhiệt độ nuôi cấy tùy thuộc vào
vsv , đối với nấm sợi trong thời gian đầu từ 10-18 giờ, giữ ở 29-31°C,
sau khi có mixen thì giảm nhiệt độ xuống 24-25°C. Đối với vi khuẩn,
nhiệt độ thích hợp là 37-38°C. Một số môi trường thường được sử dụng
B ảng 6.4 Một số môi trường thích hợp cho vsv tổng hợp protase ngoại bào
Thảnh phẩn m6i trường (%) Vi sinh vật Tác giả
1- Tinh bột khoai tây 2,00 Bac.meentericus Inỉis. 1969
Nưđc chiết ngô 1,00
(NH4)2HP04 0,90
ÒaCI2 0,10
KCI 0,50
MgSCU 0,15
2- Bột ngô 3.00
Nước chiết ngổ 0,50
CaCI2 0,10
(NH4)2HP04 0,90
Nước chiết ngô 0,32 Bac. mesenterìcu Gatrep và Lusik, 1970
Cám lúa ml 3,31
Bộỉ khoai tày 2,18
CaCQa 0,20
Dịch thủy phân enzym 0,30 Bac.subtìtis Ortrosoko, 1977
Gucose 1,00
MgS04.7H2C 0,05
KH2 P0 4 (tính theo phospho) Chứa 50mmg phospho
FeCl36H20 vệt
Bột ngô 2,00 Asp.oryzae Konovalov, 1972
Đột đậu tương 1,00 8FK pH ban đẩu 6.25
Nấm men ăn 0,50 pH cuối cùng 8,25
Nước chiết ngô 0,30
CaCOa 0,20
Đột mỉ 2.00 Asp.awamori 78.2 Konovalov
KH2PO4 0,500 Asp.oryzae 8F - 1 Sakhov, 1972
MgS04 |
ZnS04 Ị 0,600
FeS04 I
Casein 0,100
Độ đậu tương 1,120 Asp.oryzae Gatrep. Voịno. 1970
Nước chiết ngô 0,670 8f - 1
CaCOa 0,100
Bột đậu tương 1,000 Ad. Fradiae Konovalov 1972
Tinh bột 4,000
KH2PC>4
(N H 4) 2S 0 4 0,065
ZnS0 4 -7 H20 0,002
FeSƠ4.7H20 0,001
MnCMHsO 0,001
Glucose 7,001 Act. Sphereides Egorov và tập thể, 1976
CeHsOzNaa 0,425
k h 2po 4
(NH4)2S04 0,125
ZnSỏ4.7H20 0,001
FeSOiJHaO 0,002
MgSOậ.7H?0 0,575
Pepton 0,500 Sỉr.olivaceus 142 Wojstowiez J. 1977. pH = 7,2
Nưđc chiết nấm men 0,500
Casein thùy phân 0,100
NaCI 0,500
Fructose hoặc maltose 1,000
316 Chương 6
Or Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt

Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2 (đối với nấm
sợi) hoặc từ 6,2-7,2 (dối với vi khuẩn). Cho môi trường vào những
khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật,
do đó đối với mỗi vsv cần ỉựa chọn thời gian thích hợp nhất (thời
gian mà lượng enzym trong môi trường là lớn nhất). Nói chung, đối
với đa số nấm sợi mesoíĩl có thể nuôi từ 32-42 giờ. Sau đó dùng nước
hoặc dung dịch nuôi để chiết rút enzym khôi môi trường, loại bỏ
những phần không hòa tan, kết tửa enzym bằng muối vô cơ hay dung
môi hữu cơ.
b- Nuôi cấy bằng phương pháp bề 9âu
Chuẩn bị môi trường thích hợp ngay trong thùng ỉên men và
khử trùng. Sau khỉ làm lạnh, cấy vsv vào vđi tỷ lệ 1-10%. Sau một
thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi
trường nuôi cấy. Khi hoạt độ đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng
tách enzym ra khôi tế bào vsv bằng cách ly tâm hay lọc.
Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác
định cho được ỉượng oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng của
mỗi loài v sv . Thể tích thùng lên men càng lớn càng khó khống chế
yếu tô' này. Ở N hật thưởng dùng các thùng lên men 20-30m3. Theo
các tác giả N hật, nên cấy trực tiếp vi khuẩn vào thùng ỉên men (chứ
không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ bảo đảm môi trường
khôi bị nhiễm.
5- Thu nhận enzym proteose
Tách enzym: Như trên đă nói, để tách enzym từ môi trường nuôi
cấy v sv theo phương pháp bề mặt, cố thể dùng dung dịch đệm thích
hợp, dung dịch muếỉ loãng hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh
trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đă nói trên theo một tỷ ỉệ thích
hợp, khuấy đều lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, ỉọc
hoặc li tâm, thu lấy dịch trong. Trong sản xuất thường dùng nước máy
để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích môi trường, tiến hành
chiết rút enzym trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho
kết quả rất tất.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết
cần làm lắng tế bào v sv hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung
dịch enzym. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khổ
khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật Bản đã
tìm được phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi
trường nuôi cấy. Theo các tác giả Nhật thì nên lọc chứ không nên ly
tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzym.
Một số phương pháp thường dừng để xác định hoạt độ cửa các
protease v sv đã được giới thiệu cụ thể trong sách “Thí nghiệm công
nghệ sinh học tập 2” do NXB ĐHQG TP HCM phát hành nám 2003.
6.4.2 Thu nhận enzyxn amylase từ vsv

Hệ enzym amylase ỉà một trong số các hệ enzym được sử dụng
rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhỉều lĩnh vực kinh tế quốc
dân khác.
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nổi chung và
về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Những
nghiên cứu này gán liền vởỉ tên tuổi của nhà bổc học Nga-Viện sĩ K.S
Kirhoí. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tỉnh bột dưới tác dụng của
dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nlyận thấy rằng trong malt có
chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào
năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persoz dã tách
được chất phân giải tinh bột đó từ đại mạch nảy mầm. Các tác giả đă
dừng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và thu đươc enzym ở
dạng bột, đồng thời đặt tên là diaslase (xuất phát từ chữ Hi Lạp có
nghĩa là phân giải). Sau này theo đề nghị của Duclo, enzym phân giải
tỉnh bột được gọi là amyỉase.
Các enzym amylase có trong nilớc bọt, dịch tiêu hóa của người
và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi
khtiẩn Bây giờ, người ta thu chứng chủ yếu từ canh trường vi khuẩn,
nầỉm sợi và một số ỉoàỉ Dấm men.
318 Chương 6
Ở các nước phương Đông, nhất là Trung Quốc, Việt Nam, Nhật
Bản, nhân dân đã biết sử dụng amylase từ v sv hàng ngàn năm nay.
Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh
bột đã hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của
amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau:
a-amylase; P-amylase; P-gluco-amylase (y-amylaza); oligo-1,6-
glucozidase (dex-trinase)....
Những nghiên cứu về amylase v sv đã đặt nền móng cho việc
sản xuất các chế phẩm enzym này và là cơ sở khoa học để sử dụng
chúng trong sản xuất và đời sống. Những nghiên cứu cơ bản và ứng
dụng này ngày càng được xúc tiến mạnh mẽ hơn và đang mở ra
những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn đối với việc ứng
dụng amylase trong các ngành kinh tế quốc dân.
2- Nguồn enzym amylase từ vsv
Trong thiên nhiên enzym có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và
vsv. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài v sv mới là
những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzym
amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzym này
trong những điều kiện xác định.
Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vsv đã trở thành nguồn
thu enzym chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại v sv có khả năng tổng
hợp các enzym amylase. Những chủng v sv tạo nhiều amylase thường
được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi vi các loài khác nhau và
thậm chí các chủng v sv khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ
enzym khác nhau. Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus được tiến
hành thử nghỉệm thì chỉ có 34 loài tạo a-amylase và maltase với
lượng đáng kể. v sv tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,
giá nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thi ít hơn.
Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi
Aspergillus, Rhizopus. Nhiều loại thuộc các giống này (Asp. oryzae,
Asp. niger, Asp. uscanii, Asp. awamo-ri, Asp. Batatae, Rhizopus,
Delemar, Rh. lonnesis, Rh. neveus, Rh. japonicum, Rh. fonkinensis,
Rh. lopninen-sis) và một số loài của Neurospora và Mucor sinh tổng
hợp rế t m ạnh mẽ không những chỉ a-amylase mà cả glucoamylase
(Rodzevits, Butova 1965, Fenikxova. Rư-zakova 1966; Phillips,
Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948).
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida,

Saecharomyces. Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase (Gratrova
1975, Conovalov 1972, Fukumoto 1962, Hattori 1964). Đặc biệt người
ta đã tuyển chọn được chủng Endomycopsis species 20-9 có khả năng
tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase, a-amylase, glucoziltrans-ferase và
invertase (Gratrova và đồng sự 1970, 1971, Sadova 1970).
Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzym amylase
như Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bactcassavanum,
Clostridium acetobutyỉicum, Pseudomonas saccharophilcL... Các vi
khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả năng sinh trưởng nhanh (4-6 lần vi
khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương dối cao, nên khi nuôi
chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vsv khác. Những vi khuẩn ưa nhiệt
tạo nhiều amylase đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermo-
phiỉus, Bac. coaguỉans, Bac. circulans. Đặc biệt, Bac. circulans được
phân lập từ đâ't sinh trưởng tốt ở 65-70°C và tạo amylase mạnh nhất
ở 50°c. Vì vậy người ta nuôi vi khuẩn này để làm giống ở 70°c, còn
khi nuôi để thu enzym thì nuôi ở 50°c. Trong sô" vi khuẩn ưa ẩm tạo
amylase mạnh, thì Bac. subtilis được nghiên cứu chu đáo hơn cả và
được sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản
xuất tới hàng chục ngàn tấn chế phẩm amylase và proteinase từ loài
vi khuẩn ưa ẩm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của
Bac. subtilis là 37°c.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ,
tuy nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt.
Mỉcromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ
a-amylase hoạt động ở 65°c cùng vởi proteinase và các enzym khác
(Konovalov 1981).
Trong công nghiệp, các biến chủng tạo được bằng cách gây đột biến
nhờ tác động của các tác nhân lý học hay hóa học hoặc tác động phối hợp
của hai loại tác nhân trên là những chủng hoạt động rất có khả năng
sinh tổng hợp nhiều amylase. Chúng được sử dụng rộng rãi để thư chế
phẩm amylase. Đáng chú ý là những biến chủng của nấm mốc: Asp.niger
s, Asp. niger S-4Asp. niger S-4-10 (Stanlov 1959); Asp. usamii 3758-45
(Konovalov, Kotov, 1970). Asp. batatae 217-61 (Sili-senxkaia, 1966);
Asp. awamori 78-2 (Gendina 1967); Asp. oryzae 3-9-15 (Dvatsatova 1961),
320 Chương ỗ
Asp. oryzae N-475, Asp. niger ƯRRL-333 và Asp. niger NRRL-337. Phức
hệ amylase từ các nguồn khác nhau đều có đặc điểm riêng. Đối với
nấm sợi Aspergillus, trong canh trường của chúng thường có các
enzym Aau: a-amylase, glucoamylase, glucoziltransferase. Đa số các
chủng của loài Asp. oryzae tạo nhiều a-amylase song tạo rất ít
glucoziltransferase, ngoài amylase canh trường bề mặt của Asp. oryzae
còn protease acid và trung tính (Oresenko 1963). Trong canh trường
các loài nấm sợi đen (Asp. awamori, Asp. niger) hàm lượng
glucoamylase khá cao, hoạt lực transglucozilase khá mạnh, song lại có
ít a-amylase. Ngoài các enzym trên Asp. Awamori còn tạo protease
acid và hemicellulose (Oresenko, Frolova, Patenko, Sapogenkova, 1990).
Rhizopus và Endomyces không tạo transglucozilase. a-amylase có trong
mọi chế phẩm trừ các chế phẩm từ Endomyces (Kooi, Armbruster, 1985).
Trong các canh trường vỉ khuẩn thường không tạo thành một phức hệ
enzym amylase như là ở nấm sợi mà chỉ có một a-amylase. Hoạt lực
protease của canh trường vi khuẩn cũng rất cao.
2' Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase
Amylase là hệ enzym rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các
enzym này thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác sự phân giải các
liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước.
cR.R/ + H - OH -------- ► RH + R’OH
Hiện nay người ta đã biết có sáu loại enzym amylase, trong đó Bac
subliUs amylase (a-amylase, (3-amylase, Ỵ-amylase hay glucoamyỉase) thủy
phân các liên kết a-1,4 glucosỉde của tinh bột và các polysaccharide
đồng loại. Bac. sublilis amylase còn lại (dextrin-6-glucanhidrolase,
amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6- glucanhydrolase hay
dextrixiase) thủy phân các liên kết a-1,6 glucozit trong polisacarit và
các dextrin cuối. Nhiều v sv tạo các enzym transglucozilase cùng vớỉ
amylase. Các enzym amylase từ các nguồn khác nhau thì thưởng khác
nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của
sự thủy phân. Ngay cả các amylase cùng loại di v sv tổng hợp nên
cũng có nhiều đỉểm khác biệt nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và
điều kiện hoạt động.
Thu n h ậ n enzym t ừ v s v 321
Or cnanylase: (a-1,4 glucan-4-gìucanhydrolase, 3.2.1.1). a-amylase từ

các nguồn khác nhau có nhiều điểm rấ t giống nhau, a-amylase có
khả năng phân cách các liên kết a-1,4 glucozit nằm ở phía bên trong
phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polịịose đồng loại) một cách
ngẫu nhiên, không theo một trậ t tự nào cả. Vì th ế người ta gọi nó là
enzym amylase nội phân (iendoamylase). Khi tác dụng lên tinh bột
enzym này giải phóng ra glucose ở dạng a-mutamer, nên năm 1924
Kuhn gọi nó là a-amỵlase. a-amylase không ch! thủy phân hồ tinh
bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ
rấ t chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bỏi a-amylase là quá trình đa giai
đoạn. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một sấ phân tử cơ
chất bị thủy phán tạo thành một ỉượng lớn dextrin phân tử thấp
(a-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amyỉase và
ạmylopectin đều bị dịch hóa nhanh) sang giai đoạn thứ haỉ (giai đoạn
đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân
tiếp tục tạo ra các tetra-trimaỉtose không cho màu với iodine. Các
chất này bị thủy phân rất chậm, bởi a-amylase cho tới di và
monosacaride. Dưới tác dụng của a-amyỉase, amylose bị phân giải khá
nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose, (vì vậy mà người ta
cho rằng a-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc
glucopiranose một). Sau đó các poỉỉgỉucose này lại bị phân cổch tiếp
tục nên các mạch poỉiglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải
chậm đến maltotetrose và ma£tótrỉose, và maltose. Qua một thời
gỉan tác dung dài, sản phẩm thủy phân cửa amylase chứa 13% glucose
và 87% m altose. Tác dụng của a-amylase lên amylopectin cũng xảy ra
tương tự, ntiiflftg vì a-amylase không phân cắt được liên kết a-1,6
glicozit ở chã mạch n h á n h trong phân tử amylopectin nên dù có chịu
tác đụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên
(72% mantose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và izomaltose
(8%). Tóm lại, dưới tác dụng của a-amyỉase, tinh bột có thể chuyển
thành m aỉtotetrose, ma&ose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy
nhiên, thông thường a-amylase chỉ thủy phân tỉnh bột thành chủ yếu
là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose.
322 Chương 6
Khả năng dextrin hóa cao của a-amylase là tinh chất đặc trưng
của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase
dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Tinh bột + (x-amylase + a-dextrin + maltose + glucose (glucogen) + H20
(nhiều) (ít)
Tâm hoạt động của a-amylase có chứa các nhóm -COOH và

NH 3.CC amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muôi và rượu
loãng. Protein của các a-amylase có tính chất acid yếu và tính chất
của globulin. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7 (Bemfeld
P.,1951). Phân tử lượng của các a-amylase từ các nguồn khác nhau rất
gần nhau (của nấm mốc 45.000-50.000, của malt: 59.000) (Knin 1956;
Fischer, Stein, 1970).
a-amylase là một metaloenzym (enzym cơ kim). Các a-amylase
đều chứa 1 từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1-6
nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzym thì
a-amylase m ất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào
sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Bac. subliỉis của enzym, duy trì
cấu hình hoạt động của enzym (^lolodova 1965). Ca còn có tác dụng
bảo đảm cho a-amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây
biến tính và sự phân hủy bởi các enzym phân giải protein.
a-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Người ta cho
rằng đặc tính này của a-amylasé có liên quan tới hàm lượng của
calcium trong phân tử của nó (a-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có
chứa canxi nhiều hơn amylase của nấm mốc 3-4 lần nên nó bền nhiệt
hơn). Tất cả a-amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại năng (Cu2+,
Amyloglucozidase+, Hg2*. Một loạt kim loại như: Li+, Na+ Mg2+,Cr3+,
Mn2+, Zn2+, Co2\ Sn2+, Cr3+, Mn2+ không có ảnh hưởng mấy đến
a-amylase. a-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino
acid khác nhau: mỗi loại a-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu
riêng, song chúng đều khá giàu tyrosine và tryptophan. Các glutamic
acid và aspartic chiếm « 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành phân tử
enzym. Trong a-amylase rất it metíonin và chĩ có khoảng 7-10 gốc
cysteine, trừ amylase của Bac. subtiỉỉs không có các liên kết sulfhydryl
và disulíhydryl. Thành phần amino acid của a-amylase của
Asppergillus như sau (g/100 gam protein ): alanine = 6,8; glycine-6,6;

valine-6,9; leucine-8,3; isoleucine-5,2; prolin-4,2; phenylalanine-4,2;
tyrosine-9,5; tryptophan-4,0; xerin-6,5; trionin-10,7; cysteine+cystine-1,6;
methionine-2,2; arginine-2,7; histidine-2,0; lysine-5,9; aspactic acid-Í6,5;
glutamic acid-6,9; amide-1,5) (Akabori et amiloza.,1954). Nhiều
a-amylase đã biết hiện nay đều hoặc là thu được ỗ dạng tinh khiết cao,
hoặc là ở dạng tinh thể.
Phần lớn a-amylase có phân tử lượng tuơng đối gần nhau (« 40.000)
song có những trường hợp như a-amylase của Bac stearothermophilus có
phân tử ỉượng là 15.600 (Campbell, Manning 1964). Người ta có
nhận xét rằng, phân tử lượng của a-amylase giảm đi (chỉ ctfn
khoảng 14.00-15.000) còn hàm ỉượng Ca trong phân tử lại tăng lên
theo nhiệt độ nuôi vsv.
Không giống các a-amylase khác, amylase của Asp. oryzae có
chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này baồ gồm 8 mol
maỉtase, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzym (Akabori
et.amiỉoza..l965), vai trò cỏa poliose này vẫn chưa rõ, song đã biết
được rằng nó không tham gỉa vào thành phần của trung tâm hoạỉ
động và nằm ở phía trong phân tử enzym.
Ion Ca2+ làm ổn định các a-amylase của malt, của v sv trong đó
có cả ba amylase từ Asp. flauus, Asp. awamori và Asp. oryzae, nhưng
giống thì chỉ làm ổn định có a-amylase của Asp. flavust còn a-amylase
của Asp. oryzae và Asp. awamori lại được ổn định bỏi Amilozse3*, ion
sắt ức chế hoạt động của a-amylase từ Asp. awamori và Asp. oryzae.
Về cơ chế tác dụng, trong một thời gian khá dài người ta cho
rằng a-amỵlase ỉà enzym dextrin hóa điển hình, thủy phân tinh bột
thành dextrin và chỉ tạo rế t ít đường. Tuy nhiên gần đâỵ người ta
thấy trong nấm mốc cổ a-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dexrtin hóa
cao vừa tạo ra một ỉượng lớn glucose và maltose.
Fukumoto và cộng tác viên cho rằng trong số các a-amylase
của vi khuẩn có loại a-amylase dextrin hóa, có loại a-amylase đường
hóa. Khi thủy phân tinh bột bằng a-amylase đường hóa thì có tới
60% (và hơn nữa) tinh bột bị phân giải, còn bằng a-amylase dextrin
hóa thi mức độ depolime hóa không vượt quá 30-40% (Robyt, French,
1963). So với a-amylase của nấm mốc, amvỉase vi khuân có hoạt lực
324 Chương 6
dextrin hóa trội hơn là hoạt lực đường hóa, theo sô' liệu của Liphis,
khả năng dextrin hóa của chế phẩm từ Asp. oryzae cao hơn khả
năng đường hóa 1,75 lần, còn ở Bac. subtilis cao hơn hai lần (Lifsitx,
Baznit-senko, 1967).
a-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh
bột bị thương tích, còn a-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy
cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ tinh bột. Chế phẩm amylase
của Bac. subtilis phân giải tinh bột nguyên vẹn 2-2,5 lần, nhanh hơn
so với a-amylase của nấm sợi. Ở các giai đọ an thủy phân cuối, tác
dụng của a-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của amylase vi khuẩn.
Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra (khi phân giải tinh bột) có mạch
dài hơn dextrin do a-amylase của malt và nấm mốc tạo ra một số lần.
a-amylase của vi khuẩn Bac. subtilis tác dụng amylase tạo ra các
dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose (Gelatin6, Gelatiri7,
Gelatins). Cácdextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G6 --------► Gi + G5; ì . G7 ---------► Gì + G6 hay G2+G5(ít)
G0 » G2 + G6 hay G3 + G5 (ít)
Sản phẩm cuô'i cùng của sự thủy phân amylase là glucose và

maltose. Đối với amylase vi khuẩn tỷ lệ glucose: maltose là 1:5; còn
đối với amylase của nấm sợi, tỷ lệ là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell,
1953). Fenikxova và Ermosina (1991) cho biết rằng các maltopentose
và maltohexose bị thủy phân theo sơ dồ sau:
G5 —*-Ge4 + Gi; G6—►G2+ G4 hay 2 G 3 (chính) hoặc G5 + Gì (ít)
a-amylase của nấm sợi, và vi khuẩn không tấn công liên kết
a-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành
các dextrinttới hạn phân nhánh. Sản phẩm đầu tiên của sự phân giải
amylopectin bỏi amylase vi khuẩn là dextrin có 6 gốc glucose dài hơn,
còn sản phẩm cuôì cùng là glucose, maltose và các maltodextrin
(saccharide có phân nhánh) từ maltose đến maltohexose. Sản phẩm
thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi,
chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ
a-amylase v s v tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột
thành đường lên men. Với amylase vi khuẩn tinh bột bị thủy phân
thành glucose và maltose đến 70-75%. Òòn với a-amylase của nấm mốc
thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Vận
tốc thủy phân tinh bột bởi a-amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao
hơn của a-amylase Asp. oryzae tới 25% và giảm mạnh khi dạt được
30-32% sự thủy phân.
Điều kiện hoạt động của a-amylase từ các nguồn khác nhau thưởng
không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của a-amylase từ nấm sợi
là 4,5-4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5-5,8), của đại mạch nảy
mầm và thóc mầm là 5,3 (hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,7-5,4) và của
vi khuẩn là 5,8-6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8-7,0).
Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa
và đường hóa cửa chế phẩm amyỉase từ Asp. oryzae và Bac. subtilis
giấng nhau và nằm tro n f vùng pH 5,6-6,2. Còn theo số liệu của
Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0.
Độ bền đôi với tác dụng của acid cũng khác nhau, a-amylase của
nấm sơi (Asp. oryzae) bền vững dối với acid tốt hơn là a-amylase của
malt và vi khuẩn Bac. subtilis, Ở pH 3,6 và 0°c, a-amylase của malt
bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; a-amỊylase vỉ khuẩn bị vô hoạt
50%, trong khi đó hoạt lực của a-amylase ảia nấm sợi hình như không
giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinơi 1989). Trong đung dịch, a-amylase
nấm sợi bảo quản tốt d pH 5,0-5,5, a-amylase dextrin hóa của nấm sợi
đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8* ở 0°c và pH 2,5 nó chỉ bị vô hoạt
hoàn toàn sau 1 giờ. Ngoài a-amylase không bền acid ra, các loài nấm
sợi, Asp. awamori, Asp. butatae, Asp. usamii còn tạo tới 5-10% a-amylase
bền acid. Trong khi đó nấm sợi, Asp. niger 475 lại chỉ tạo ra có một
mình a-amylase bền acid. Nó không bị mất hoạt tính ở pH 2,5; nhiệt
độ ở 30°c trong vòng 1 giờ.
Ở pH < 4,0 a-amylase của vi kbuẩn bị vô hoạt hoàn toàn (Virits,
1971). Theo Sprosler Ưhlig, a-amylase của nấm bền ở vùng pH 5,3-8,0
còn a-amylase của vi khuẩn bèn ở khoảng 5,0-10,0 (hoạt độ a-amylase
xác định bằng phương pháp của Rukhlia-deva và Goriatseva, 1985).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của a-amylase từ các nguồn
khác nhau cũng không đồng nhất, a-amylase của nấm sợi rất nhạy đối
với tác động của nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nổ là 50°c. Amylase của
thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ỏ 58-60°C
(trong sản xuất rượu người ta thường đường hóa bằng canh trường nấm
326 Chương 6
sợi ở 50-52°C và bằng malt ở 60-65°C). Amylase của vi khuẩn có độ bền

nhiệt* cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70-75°C (Amos, 1965,
Liphsis, Bragnitsenko, 1977). a-amylase của Bac. slearothermophiỉus,
Bac. dwstasa... vẫn giữ được hoạt lực trong một thời gian dài d 85°c
và cao hơn nữa (Logina, Karpukina, 1988, Manning, Campbell, 1981).
Amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92°c, trong khi dó
amylase của nấm sợi bị vô hoạt ở 70°c (Kozmina, 1991).
B ả n g 6 .5 Độ bền n h iệ t của a-am yỉase từ các nguồn k h á c nh a u
(theo M iller, Johson và P alm er)
Hoạt độ a-amylase, % so vđi hoạt độ ban đấu

Nhỉệt độ °c
của nấm sợi của malỉ của vi khuẩn
65 100 100 100
70 52 100 100
75 3 58 100
80 - 25 92
85 - 1 58
90 - - 52
95 - 8
Trong dung dịch hồ tinh bột, a-amyỉase vi khuẩn chỉ bắt đầu bị
vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 77°c. Ở 70°c a-amylase của nấm
sợi đã bị m ất 50% hoạt lực còn amyỉase của malt hầu như chưa bị m ất
hoạt lực.
Trong dung dịch đệm pH 4,7, a-amylase của Asp. oryzae rất nhạy
với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ồ 40°c trong 3 giờ hoạt lực
dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. ở
50°c trong 2 giờ a-amylase của nấm này bị vô hoạt hoàn toàn. Miller
và cộng tác viên còn cho biết thêm rằng a-amylase của vi khuẩn có
thể giữ được một phần hoạt ỉực thậm chí ngay cả khi đun sôi trong
nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt cao cửa amylase vỉ khuẩn là
một ưu điểm lớn. Trong một loạt sản xuất, amylase vi khuẩn được sử
dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phái dùng nhiệt độ cao.
Gần đây ở tây Đức đã tuyển chọn được một chủng Bacillus subtilis mà
amylase của nó không khác gì amylase của vi khuẩn thông thường vẻ
đặc tính tác dụng lên tinh bột song ỉại có độ bền nhiệt như amylase
T hù n h ậ n enzym từ v s v 327
của nấm sợi (Srisler, ưnlig, 1972). Tính chất a-amylase của chủng bền
nhiệt này cũng đặc trưng cho Bacillus subtiỉis: pH tối thích 6,0, bị vô
hoạt hoàn toàn ở pH = 4,0 và bị vô hoạt một nửa ở pH = 8,0.
Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ và pH tối thích), mức độ
thủy phân và đặc tính thủy phân) của a-amylase từ các nguồn khác
nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng dụng chúng
một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của
quá trình sản xuất.
b- p-amylase (a-1,4-glucan-mantohidrolase 3.2.1.2). p-amylase xúc
tác sự thủy phân các liên kết a-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và
polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từiig gốc maltose một từ
đầu không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình p, vì thế
amylase này đựơc gọi là p-amylase.
Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, p-amylase khác a-amylase
ở một số điểm: khác a-amylase, nó hầu như không thủy phân hạt
tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. p-amylase
phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58%
amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylopectin được
tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh
ngoài có từ 20-26 gốc glucose nên tạo thành được 10-12 phân tử
maltose. Khi gặp liên kết a-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết a-1,6
glucoside thì p-amylase ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là
dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết a-1,6 glucoside và được
gọi là p-dextrin, a-dextrin cho màu tím đỏ với iodine. Độ nhớt của
dung dịch giảm chậm. Tác dụng của p-amylase lên tinh bột có thể
biểu diễn bằng sơ đồ sau:
6 -amylase
Tinh bột — — —-------► 54-58% maltose + 42 - 46% p - dextrin
(Glucogen)
Nếu cho cả a-amylase và p-amylase cùng đồng thời tác dụng lên
tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%. p-amylase là một albumin.
Tâm xúc tác của nó có chứa các nhóm -SH và nhóm -COOH cùng với
vòng imidazol của các gốc histidin. P-amylase là enzym ngoại phân
(exoenzym), có ái lực với các liên kết a-1,4 glucoside cách đầu không
khử của mạch một liên kết a-1,4.
328 Chương 6
Khác với a-amilasse, nó rế t bền khi không cố Ca2*, p-amylase bị

kìm hãm bởi Cu2+, Hg2*, urea, iodoacetamide, iodine, ozon... pH tối
thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết cua p-amylase ỉà 4,6 còn
trong dung dịch nấu (không sôi) là 5,6. Nhiệt độ tối thích trong dung
dịch tinh bột thuần khiết 40-50°C, song trong dịch nấu lại là 60-65°c,
p-amylase bị vô hoạt ở 70°c. (3-amylase chĩ phổ biến trong thế giới
thực vật, đặc biệt cố nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn
không có P-amylase. Còn sự tồn tại của p-amylase trong nấm sợi cho
đến nay vẫn chưa được chứng mỉnh hoàn toàn.
c- Glucoamylase (a-l,4-gỉucan-glucohydrolase, 32.1.3)
Glucoamylase thủy phân liên kết a-1,4 glucan trong
polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử
cửa mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thỏy phân đă liên kết
ct-1,4 lẫn a-1,6 glucan. Vì thế, các nhà nghiên cứư N hật Bản (Ono et
amylose, 1964*1984) đề nghị đặt cho nó một tên phân loại khác là
a-l,4:l,6-glucan-4:6-glucohydrolase. Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề
nghị này (Dobrolinxkaia, 1965, Fenikxova, Ruza-kova, 1976).
Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ
Asp. awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó nó được tìm thấy
Rhizopus delemar, Asp: niger, Asp. oryzae Tồi ở các nhóm v sv khác và
ở mô động vật. Enzym mang nhỉều tên gọi khác nhau: glucoamylase,
amyloglucozidase, taka-amylase Bac, Ỵ-amylase, matulase...
v Glucoamylase là enzym ngoại phân iexoemym) nó thủy phân
polysaccharide từ đầu khống khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân
tinh bột cùng với glucose còn cổ thể tạo thành các a-oigosaccharide.
Ngoài các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucoside, glucoamylase còn cổ khả
năng thủy phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 gỉucoside nửa (Sawasaki
1960, Ưeyama et al, 1965, Watanabe, Fukimbara, 1965, 1966).
Gỉucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột,
gỉucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới
glucose (Azarova 1981, Jerebtxov, Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia,
Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo
phân nhánh (amijlopectin, glucogen, p-dextrín) bị glucoamyỉase tấn
công với vận tốc khá ỉớn. So với vận tốc thủy phân các cơ chất khác
nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide
phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn là các chất phân tử thấp.
Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzym “acid”. Thể hiện
hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So với a-amylase, glucoamylase bền
đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic,
aceton không được bảo vệ bằng Ca2+.
Các chế phẩm glucoamỵỉase, từ các nguồn khác nhau tuy có
những tính chất chung, song cũng khác nhau ở nhiều điểm. Ngay cả
các chế phẩm được tách ra từ các loài Aspgiỉỉus khác nhau về một loạt
tính chất lý hóa học như phân tử lượng, thành phẩn amino acid, tính
đặc hiệu cơ chất, mức độ phân giải cơ chất và điều kiện hoạt động....
Glucoamylase vsv thuộc các loài khác nhau thì khác nhau về mức độ
phân giải tinh bột.
Fukumoto đề nghị chia glucoamyỉase của vsv ỉàm hai ỉoại theo
khả năng thủy phân tỉnh bột cửa chứng (bảng 6.6).
Bảng 6.6 Glucoamyỉase từ các loài nấm mốc khác nhau
% tình bột
Kiếu Hoọt lực
Nguổn enzym Tên gol bỊttiủy Tắc giả
enzym mantase
phân
Rhizopus Rh. delem ar Glucoamylase 92 + Caldwell, 1954

delemar Glucoamylase 100 + Fukumuto.1953
Rh. delemar
Asp. awamori Amylase udeebraandingu 100 + Ueda.1956
Asp. niger Amyloglucosidase 100 + Veill, 1956
- Glucoamylase 100 + Barker, 1957
- Amyloglucosidase 100 Pazur, 1959
Aspergillus Asp. usam ii y-amylase “glucogenase” 70 - Kitahara, 1949

niger 80 + Corman,1048
Rh. tonkinensis Amyloglucosidase
Asp. niger Amyloglucosidase 80 + Kerr.1951
Asp. niger taka - amylase 78 + Fukumuto,1956
Asp. oryzae amylase- sacarogenase 78 + Okazaki, 1954
Asp. awamori Amyloglucosidase 80 + Haiasida, 1957

Amyloglucosidase 75 + Fukumuto, 1960
Neurospora
74 + Fukumuto, 1961
Monaseus
330 Chương 6
Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosacarit
và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng
tác viên thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế
“đa mạch” mà không phải theo cơ chế “đơn mạch”. Sơ dồ thủy phân
glucid bởi enzym glucoamylase như sau:
Glucoam ylase kiểu
Tinh b ột hay oligosacarit R h.delem ar ' ì 00% glucose

(Có liên kế t a - 1 , 4 và a - 1 6 )
Glucóamylase kiểu
Asp.niger
Tinh bột hay olỉgosacarit — —■— -------► 80 - 85% glucose + oligosacarit
Khác nhau
Khả năng thủy phân mạnh mẽ cả liên kết a-1,4 lẫn a-1,6 và
thậm chí cả liên kết a-1,3 glucosỉde nữa của glucoamylase để tạo
thành glucose đã đưa enzym này lên vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy
phân tinh bột. Vì thế việc dùng các chế phẩm glucoamylase tách từ
các chủng v sv trong sản xuất rượu, bia mật tinh bột, glucose,... có một
ý nghĩa triển vọng vô cùng lớn lao. Điều kiện hoạt động của các chế
phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không giống nhau.
Các chế phẩm glucoamylase tách từ nấm sợi được nghiên cứu khá đầy
đủ về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ. Đặc tính của glucoamylase tinh
thể tách từ Asp. awamori đã được xác định, khi so sánh tính chất của
glucoamỵlase từ Rh. deỉemar và Asp. niger ở dạng kết tinh người ta
thấy chúng có những khác biệt lớn.
Tuy thế, glucoamylase của các giống nấm sợi Rhizopus và
Aspergillus đều có độ ổn định cao đôi với ion hydro (RozentalPopova,
1965; Fenikxova, Rtteakava 1996).
Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng
không đồng nhất: glucoamylase từ Asp.niger là 6,5; của glucoamylase
từ Asp.awamori là 7,5; của glucoamylase từ Rh. delemar là 7,4.
Đa số các chế phẩm glucoamylase của v sv (vi khuẩn, nấm sợi,
nấm men) và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ồ vùng
acid trừ glucoamylase của Saccharomyces italicus và một số mô động
vật (gan chuột, niêm mạc ruột non chuột) có pH hoạt động tối thích ồ
vùng trung tính. Vì vậy, người ta phân loại glucoamylase cổ nguồn gốc
động vật theo pH tôi thích mà không theo đặc điểm tác dụng lên cơ
chất: glucoamylase acid có pH hoạt động tối thích là 4,0-5,0;
glucoamylase trung tính pH tối thích là 6,0-7,5.
Các glucoamylase acid của nâm sợi và mô động vật (y-amylaza)
rất bền và có độ ổn định cao trong mõi trường acid. Chẳng hạn,
glucoamylase của Rh. deỉemar do Phillips và Cardwell tách được, chỉ
mất có 20% hoạt lực sau khi bảo quản chín ngày ở pH 2,4 và nhiệt độ
5-10°C. Các Ỵ-amylase của mô động vật không bị giảm hoạt lực khi
bảo quản ở pH 4,8 và nhiệt độ 37°c cũng như ở 0-i-2oC trong một thời
gian khá dài. Nếu bảo quản ở acid thấp hơn, enzym bị m ất một phần
hoạt lực pH 7,0 hay kiềm hơn sẽ làm vô hoạt enzym nhanh chống.
pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi theo nhiệt
độ và thời gian tác dụng. Azepoba (1971) cho biết gỉucoamylase của
Rh. delemar có hiệu lực cao nhất ở pH 4,7-5,0 và nhỉệt độ là 55-60°C,
nhưng khi nhiệt độ giảm xuống 40°c thì pH tối thích là 4,5. Chế
phẩm glucoamylase từ Endomycopsis có pH tối thích rất hẹp từ 5,4-5,6
với thời gian tác dụng là 30 phứt. Nếu tăng thời gian tác dụng lên thì
vùng pH tối mở rộng từ 4,7-5,6.
Không riêng gì mô động vật mới có hai loại glucoamylase:
glucoamylase acid và glucoamylase trung tính, mà gần đây người ta đã
tạo được các biến chủng của nấm sợi cũng có khả nặng tổng hợp cả
hai loại glucoamylase này (Watanabe, Fukimbara, 1975). Biến chủng
Asp. awamori l-p-42 thu được bằng chiếu phóng xạ Co60 có khả năng
tổng hợp cả hai loại glucoamylase: bền và kém bền trong môi trường
acid. Lượng glucoamylase cực lớn được tạo nên ở pH 4,5-5,0. Trong đó
gần 65% enzym là glucoamylase bền acid, còn khoảng 35% không bền
đối với tác dụng của acid và bị vô hoạt hoàn toàn sau 1 giờ ở 30°c và
pH 2,5. Nếu nuôi nấm sợi ở môi trường có pH 2,5 thì chỉ có một loại
enzym bền acid được tạo thành. Enzym này còn giữ được hoạt lực xúc
tác ở pH đó trong vòng 48 giờ. Nếu nấm sợi sinh trưởng ở môi trường
gần trung tính (pH = 6,0-6,5) thì nó chĩ sản sinh ra một loại
glucoamylase không bền acid. Nhiệt độ hoạt động tối thích của
glucoamylase loại bền acid là 50°c (Barker và Fleetwood, 1957) của Rh.
Delemar (theo Azarova 1971) là 55-60°C, còn của Endomycopsis sp. 20-9
(Gratrova, Sadova, 1959) là 40-50°c. Hầu hết các glucoamylase bị mất
332 Chưctag 6
hoạt tính khi đun nóng khi trên 70°c. Trên đây đã nêu một số ví dụ
cụ thể về ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền của glucoamyỉase tinh thể
tách từ Asp. awamori.
Hiện nay người ta mới chỉ biết được phân tử lượng của một số chế
phẩm glucoamylase tinh thể. Chẳng hạn phân tử lượng của glucoamylase
tách từ Asp. niger 97.000 (Parzur, 1962) của glucoamylase từ Asp.
(Uưamori là 62.000 (Durmỉsidse và đồng sự, 1974) của Taka-amylase Bac
là 33.000 (Hartman, 1958). Giống P-amylase, glucoamylase bị các chất
Mộc sulfhydryl kìm hãm, do chúng liên kết với nhỏm -SH trong trung
tâm hoạt động của enzym.
Các chế phẩm glucoamylase của nấm sợỉ và của mô động vật
khác nhau về độ bền vững đốỉ với tác động của kìm ỉoại nặng -
Amyloglucozidase, Cu, Fe Hg.
Một số tác giả cho rằng gỉucoamylase có tính chất của
transglucozilase, nghĩa là cố khả năng tổng hợp nên các izosaccharide
ỏ nồng độ glucose hay maltose cao. Thật ra ở nồng độ cơ chất rất cao
(50-60%) glucoamylase có thể biểu lộ hoạt tính transferase, song sự cổ
m ặt của các izosaccharide ở nồng độ cơ chất thấp (10-15%) đã chứng
tỏ hùng hồn rằng trong dung dịch nghiên cứu cổ hai enzym độc lập:
glucoamylase và transglucosilase (Koltxơva, 1971).
d- 0Ỉig0-l 96-gltíC08Ìlítse hay dextrinnase tới hạn
(dextrin-6-glucanhydroỉase, 3.2.1AO)
Enzym này thủy phân các loại liên kết a-1,6 glucoside trong
izomaltose, panose và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ
chất này đến các đường lên men được. Các loài nấm sợi Asp. awamori,
A sp. oryzae, Asp. usamii sinh tổng hợp enzym này m ạnh hơn cả
(Karpukhina, Xoxfenov, 1977; Pankratov, Kirxanov, 1969; Rukhli-
deva, Goriatreva, 1967).
Có tác giả thu được enzym này ở dạng kết tinh (Under-kofler,
Roy, 1951), nhưng sự tồn tại của nó vẫn chưa được chứng mỉnh triệt
để (Rodzevit, Butova, 1965; Do-brolinskaia, 1966; Fenikxova,
Molodova, 1961). Enzym này cũng có trong hạt nảy mầm (dại mạch
nảy mầm và thóc mầm). Ngoài oligo-l,6-glucosidase ra, phức hệ
dextrinase của h ạt cốc nảy mầm, của mô động vật và nấm men, còn
có chứa amylopectin-6-glucosidase hay R-enzym (amilopectin-6-

glucanhydrolase, 3.2.1.9) và dextrin -1, 6-glucosidase hay amylo-1,6-
glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.33), cả hai enzym này đều
phân cắt các liên kết a-1,6 glucoside trong amylopectin, glucogen và
dextrin tới hạn. Chúng thủy phân dextrin sâu sắc hơn là a, P-amylase, do
vậy mà maltose được tích tụ nhiều trong dịch thủy phân. Các
dextrinnase hoạt động tối thích ở nhiệt độ 40°c và pH 5,1.
Ngoài các enzym được kể trên, trong họ hàng của amyỉase còn
có các enzym đồng loại nữa. Dưới đây sẽ điểm qua một vài enzym đó.
e- Pullulanase
Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy các enzym có
khả năng thủy phân liên kết a-1,6 glucoside trong các polyosể và
oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen. Cơ chất đặc thù của enzym
này là pullulan - một polysaccharide được tách ra từ giả nấm men
Aureobasidỉum punỉỉana sym. Puỉlulasia pulỉulans. Vì vậy mà enzym
này được gọi ỉà pullulanase. Phân tử lượng của nó ỉà 145.000, chế
phẩm enzym thu được khi kết tủa bằng acetone có pH hoạt động tối
thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 47,5°c. Pullulanase phân giải các
liên kết a-1,6 glucosỉde bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết a-1,4. Nó
còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp ch! gồm có
hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết a-1,6 glucoside. Tác dụng
hiệp đồng của a-amylase và pullulanase lênap làm nó bị thủy phân
hoàn toàn.
g- Ch glucosiduse hay m altose (a-Dglitcosỉde-glucohydroỉase, 3.2.1.20)
Nhiều loài nấm sợi sản sinh enzym này. Giống như glucomylase,
nổ thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột
(Green Wood, 1964; Sugawara et-al.,1959). Một số tác giả cho rằng nó
còn có hoạt tính glucosyltransferase^ tức là có khả năng chuyển các
gốc glucosyl sang đường và rượu (Sugawara et al.,1959; Pazur, Ando,
1961). Khi nghiên cứa cặn kẽ về tính chất của maltase tách từ canh
trường bề m ặt của Asp. oryzae, các nhà nghiên cứu Nhật cho biết rằng
m aỉtase và glucozyltranferase là một enzym đồng nhất vừa có khả
năng thủy phân liên kết a-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả
năng chuyển các gốc glucosjjde sang đường và rượu.
334 Chttóhg 6
f- T ra n sglu cosyld ase (a-l,4-glycan:D-glucose-4-glucozUtransferase,2.4. L3)

Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, transglucosyldase luôn luôn
tương tác với glucoamylase. Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt
tính thủy phân. Vì thế sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây
nên những nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosyldase
thực hiện việc chuyến các gốc glucosyl sang các nhóm mono, di - và
oligosaccharide, xúc tác tạo thành các liên kêt a-1,4 và a-1,6
glucoside. Pazur (1961) đã tách được enzym này từ Asp.niger bằng
phương pháp sắc ký hấp thụ trên DEAE-cellulose và cho biêt cơ chê
tác dụng của nó. Transglucosyldase không những chỉ thủy phân
m altose th à n h glucose m à còn tổng hợp izom altose, izotriose và
panose, tức là có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử
maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết a-1,6 để tạo
thành panose hoặc izomaltose.
Rodzevit và Butova (1965) tìm thấy trong canh trường nấm sợi
Asp. nigery và Asp. oryzae Asp. awamori có glucosyltransferase, đồng
thời cho biết rằng enzym này xúc tác sự tổng hợp các olygosaccharide
với các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucoside từ maltose. Các tác giả cho
rằng, trong các vsv trên có hai hệ transglucosyldase. Một hệ tổng
hợp các sản phẩm có liên kết ct-1,4 glucoside kiểu maltose và
chuyển các gốc glucose từ maltose tới vị trí c thứ 4 của gốc glucose
cuôi: n-maltose-(l,4-a-glucose)n + n-glucose. Một hệ chuyển các gốc
glucose tới vị trí c thứ sáu khi tổng hợp các sản phẩm kiểu
izomaltosẻ: n-maltose-(l,6-glucose )n + n-glucose. Hệ thứ nhất bền ở
pH 8,5 còn hệ thứ hai thì vô hoạt hoàn toàn ở pH này trong hai giờ.
ơ pH 3,3 trong thời gian một giờ, hoạt lực transglucosyldase của cả
hai hệ đều không thay đổi. Transglucosyldase của nấm sợi bị vô hoạt
hoàn toàn ở pH = 1,9-2,0 sau 24 giờ. Các chủng nấm sợi khác nhau thì
khác biệt về hoạt lực transglucosylđase (Buger, 1956) các loài
Rhizopus có ưu thê hơn các loài Aspergillus là không tạo
transglucosyldase.
Sự có m ặt của transglucosyldase trong các chê phẩm amylase
(dùng trong công nghiệp mật tinh bột, đường glucose, công nghiệp
rượu..,) là điều không mong muốn. Glucoamylase xúc tiếíi sự thủy
phân tinh bột, còn transglucosyldase lại tổng hợp các izosaccharide từ
các sản phẩm thủy phân này, do đó mà nó làm giảm bớt mức độ thủy
phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy phân có vị đắng.
3-Hoạt lực của các enzym amylase
Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzym nào cũng cần biết rõ
hoạt lực xúc tác cỏa nó. Các chế phẩm cổ hoạt tính phân giải tinh bột
thường chứa một loại enzym amylase. Vì vậy hoạt lực tổng hợp của
chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm.
Tuy nhiên, tùy thuộc vào cơ chất và phương pháp xác định mà người
ta có thể biết được sự có mặt của một enzym nhất định nào đó trong
chế phẩm bằng cách gián tiếp, cần nhớ rằng, mọi hoạt độ của chế
phẩm enzym đều không phải là một đại lượng tuyệt đối, mà chỉ là
cách biểu thị quy ước của hoạt lực xúc tác thu được trong những điều
kiện thực nghiệm đã cho mà thôi. Do tính đa dạng của enzym, đặc
tính của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của
enzym cũng rất khác nhau.
Chẳng hạn như ta đã biết, a-amylase dễ dàng thủy phân tinh
bột thành các dextrin không cho màu với iodine, còn glucoamỵlase lại
phân giải tinh bột tới glucose và làm thay đổi màu với iodine chậm, vì
lẽ trong dung dịch luôn có một lượng nhỏ dextrin phân tử lớn. Do vậy
mà người ta đánh giá sự có mặt của a-amylase trong chế phẩm (hoặc
canh trường v s v ) bằng sự thay đổi màu với iodine, còn đánh giá sự có
mặt của glucoamylase bằng sự tích tụ glucose, mặc dù rõ ràng là hiện
diện đồng thời của cả hai enzym này đã làm tăng hiệu quả phân giải.
Hoạt độ th ật của từng enzym một thấp hơn so với số liệu thu được.
Cho nên, nếu như ta làm việc với chế phẩm phức hợp thi phải
luôn luôn xác định hiệu lực tác dụng tổng hợp của mọi amylase lên cơ
chất và nghĩa là chỉ thu được đặc tính cỏa chế phẩm một cách gián
tiếp qua hoạt độ tuyệt đối của nổ. Để xác đinh hoạt độ của các enzym
amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:
• Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho
amylase tác dụng lên hồ tỉnh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị
cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần.
• Đo m ật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng
màu với iodine. Khỉ có amylase tác dụng thì các sản phẩm phân giải
của tinh bột sẽ cho màu khác nhau đối với iodine.
336 Chương 6
• Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho
enzym tác dụng lên cơ chất. Đáng chú ý hệ enzym amylase có các
hoạt dộ đặc trưng sau:
- Hoạt độ amylase (HĐA) đặc trưng cho khả năng thủy phân
tinh bột bởi các enzym amylase (chủ yếu là của a-amylase) tới
dextrin cho màu với iodine khác với màu của tinh bột ban đầu. Hiện
nay phương pháp so màu quang điện của Rukli^deva và Goriatreva
(1985) được xem là phương pháp xác định hoạt độ amylase tiêu
chuẩn. Theo phương pháp này, dơn vị HĐA là ỉượng enzym xúc tác
thủy phân 1 gam tinh bột tan ở 30°c, trong một giờ với pH xác định
(đối với chế phẩm enzym của nấm mốc của vi khuẩn thi pH = 4,7
còn dối với a-amylase của m alt hay thóc mầm th ì pH ss 4,8-4,9).
Mức độ thủy phân cơ chất « 30%.
- Hoạt độ glucoamylase (HĐGI) đặc trưng cho khả năng của chế
phẩm thủy phân tinh bột đến glucose. Muấn xác định HĐGI cần đo
được lượng glucose tạo thành. Glucose trong hỗn hợp các đường
thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu như phương
pháp Zikhetar -Bleyer hoặc phương pháp dùng glucooxydase. Đơn vi
hoạt độ glucoamylase là lượng chế phẩm enzym khi tác dụng lên tinh
bột ở 30°c và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1 mg glucoza (xác định
bằng phương pháp Zikhetar-bleyer) hay cũng trong những điều kiện
nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được 1 micromol glucose (xác
định bằng phương pháp glucooxydase).
- Hoạt độ đường hóa (HĐĐH) phản ánh khả năng của các enzym
amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường
hóa là lượng chế phẩm enzym trong 1 giờ ỏ 30°c và pH thích hợp làm
phân giải được 1 gam tinh bột thành đường khử khi mức độ thủy
phân cơ chất không vượt quá 30%.
- Hoạt độ maltose (HĐM) đặc trưng cho khả năng thủy phân
maltose tới glucose của chế phẩm enzym. Đơn vị hoạt độ maltase lồ
lượng chế phẩm enzym phân giải được 1 gam maltose tới glucose
trong vòng 1 giờ ở 30°c, độ thủy phân maltose trong phản ứng này
không được vượt quá 30%.
- Hoạt độ dextrinase (HĐDEX) đặc trưng cho khả năng thủy phân
“các đextnn tới hạn* tới đường khử của chế phẩm enzym. Đơn vị hoạt
độ dextrinase là lượng miligam cơ chất (phospho-dextrin tới hạn) bởi
thủy phân bôi 1 gam hay 1 ml chế phẩm enzym trong một giờ ồ 30°c.
Hiện nay người ta không dùng hoạt độ này để đánh giá các chế phẩm
enzym nữa.
4-Thu nhăn enzym amylase từ vsv
Or Sinh trường và 9Ình tổng hợp amylase ở v sv
Khỉ nuôi v sv tạo amylase có hai quá trình liên quan m ật thiết
với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối vsv và quá trình tích tyi
enzym trong tế bào hay ngoài môi trường. Hai quá trình này không
phải bao giờ cũng trùng khớp với nhau về thời gian, nhất là trong
phương pháp nuôỉ chim.
Ở một số vsv, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành ẹong
song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzym phụ thuộc
tuyến tính vào sự tâng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp
enzym amylase kết thúc ở pha ỉogarít cùng đồng thời với sự ngừng sinh
trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp sau. Khỉ đó vận tốc
sinh trưởng và vận tốc tổng hợp enzyxn amylase ngoại bào của một số
nòi Bac. subtiỉis (Coleman, Elliot, 1962) và Bac. slearothermophilỉus
(Welker, Campbell, 1964) người ta đã phát hiện ra quy ước trên. Ngay
cả khi nuôi vi khiiẨn Bac. slearothermophiỉus trên một môi trường
dinh dưỡng tối thiểu có bể sung glucose cũng thấy diễn ra quy luật
tương tự.
Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase
cực đạỉ thường xảy ra sau khi quần thể tế bào v sv đạt điểm sinh
trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của v s v hầu như không
kèm theo sự tích lũy enzym amylase trong canh trưởng, chỉ sau khỉ
kết thúc pha sinh trưởng mđỉ xảy ra sự tổng hợp enzym cực lớn.
Chẳng hạn như amyỉase của Bac subtiỉis được tạo thành ở vi khuẩn
đã hoặc dang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường
nuôi cấy lẫn trong bản thản tế bào vỉ khuẩn “trẻ* đều không tìm
thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ỡ tế bào đang
chuyến sang thời kỳ tự phân (autolysis). Nhiều tác giả cho ỉà quá
338 Chương 6
trìn h tổng hợp enzym trên màng tế bào (Nomura, 1958), và người ta
lập luận rằng ở gần màng tế bào tập trung enzym phân hủy, nó ở
trạng thái không hoạt động chừng nào amylase chưa được tạo thành.
Khi bắt dầu tổng hợp amylase enzym phân hủy trở nên hoạt động
và làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tới độ cho phép các phân tử
amylase đứt ra ngoài môi trường được. Song th ật ra, amylase ngoại
bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Sự tiết
amylase vào canh trường nuôi cấy bị ức chế hoàn toàn bởi các chất
kìm hãm trao đổi chất như cyanide, cloramphenicol, streptomysin,
toluen. Trong các tế bào dược phân hủy sơ bộ bằng hjSozim chỉ chứa
một lượng amylase rấ t nhỏ, không thể đáp ứng được amylase ngoại
bào hoạt động m ạnh mẽ như vậy.
Người ta cho rằng, sự tổng hợp các enzym amylase bắt đầu khi
mà việc tạo protein của tế bào đã kết thúc hoặc gần kết thúc và cạnh
tranh với quá trình này. Quá trình sinh tổng hợp amylase ngoại bào
và sự tạo các enzym xúc tác quá trình tự phân tế bào là các quá trình
độc lập do diều kiện sinh trưởng tạo nên.
Theo lý thuyết hiện đại thì giữa vận tốc sinh trưởng riêng của
v sv và vận tốc sinh trưởng tổng hợp enzym có mốỉ tương quan phụ
thuộc. Người ta phân biệt hai kiểu phụ thuộc giữa các quá trình này:
Kiểu phụ thuộc thứ nhất: Vận tốc sinh trưởng v sv hoàn toàn
phù hợp chính xác với vận tốc sinh tổng hợp enzym.
Kiểu phụ thuộc thứ hai: Ngoài sự tổng hợp enzym trong pha
sinh trưởng, còn có “sự tổng hợp enzym với them” không liên quan tỷ
lệ thuận với sinh trưởng của vsv. Sự "tạo thêm” enzym này được thực
hiện bằng các tế bào đang chuyển sang quá trình tự phân và phụ
thuộc vào độ bền vững của ribonucleic acid thông tin (ARNi). Như vậy
là khả năng không trùng khớp của các giai đoạn sinh trưởng với giai
đoạn sinh tổng hợp enzym được xác định bằng sự bền của ribonucleic
acid thông tin hay ribonucleic acid khuôn.
Nồng độ tinh bột và các nguồn carbon khác cũng có ảnh hưởng
lớn đến sự tạo thành các enzym riêng biệt của hệ amylase khi nuôi
chủng Asp. oryzea 3-0-15 đột biến thể hiện ở bảng 6.7.
Bảng 6,7 Ảnh hưởng cơ chất đến sinh tổng hợp

các enzym amylase bởi nấm mốc Asp. oryzae
Nguồn Hoạt độ của enzym, đv/100ml Nguổn Hoạt độ của enzym, đv/100ml
carbon carbon
a-amylase Oligo-1,6 glucozidase a-amylase Olỉgo-1,6 glucozidase
Tinh bột % Bột
6 300 800 Ngô 250 760

4 220 800 Mi 250 760
2 110 800 Mì đen 300 770
1 70 710 Đậu nành Vết 810
Để đảm bảo có hoạt ỉực a-amylase cao phải cần có 6% tỉnh bột,
còn muốn hoạt lực oligo-1,6-glucosidase cao chĩ cần 2% tinh bột. Bột
đậu nành ức chế hoàn toàn sinh tổng hợp a-amyỉase, nhưng lại kích
thích sinh tổng hợp mạnh mẽ oligo-l,6-glucosidase. Nuôi Asp. oryzae
trong môi trường có chứa bột ngô cũng tạo nhiều amylase ngoại bào,
kết quả thể hiện trong bảng 6.8.
Bảng 6.8 Ảnh hưởng của nồng độ bột ngô
tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp. oryzae
Hàm lượng bột Hoạt độ Hàm lượng bột Hoạt độ

pH pH
ngỏ ừong môi amylase ngố trong mối amylase
mốl trường mỏi trường
trường (%) đv/100ml trường (%) đv/100ml
8 330 8,1 4 213 8,0
6 330 8,1 2' 195 * 7,6
5 250 8,0
Tinh bột, dextrin, maltose cũng là nguồn carbon tốt để nuôi

Puỉlulari pulluỉans bằng phương pháp chim, vsv này sản sinh
amylase bền acid. Cùng với tinh bột, dextrin và maltosan, các manide,
maltose, glucose, insulin, silose, lactose, glyxerin, galactose, axetat
natri, xitrat natri cũng có thể dùng làm nguồn carbon rất hiệu quả.
Hoạt lực amylase của vsv trong môi trường có glucose fructose và
silose thấp hơn nhiều. Muối kiềm của các acid hữu cơ (lactate, malate,
succinate, nitrate) chỉ cố thể dùng với nồng độ thấp bởi vì môi trường
bị kiềm hóa theo mức độ tiêu thụ chúng. Manit là nguồn carbon rất
340 Chương 6
tốt, còn sorbic ít hiệu quả hơn. Etanol, glicol, glyxerine, socbit, inoxit
không thể dùng làm nguồn carbon duy nhất. Nhung etanol và
glyxerine lại là nguồn bổ sung carbon rấ t tốt. Glycerine, glucose,
saccharose, maltose và tỉnh bột dùng làm nguồn carbon để nuôỉ Bac.
stearothermophilus tạo ' ct-amylase bền nhiệt. Dịch thủy phân casein
kích thích tổng hợp a-amylase khi dừng các nguồn carbon này. Các vi
khuẩn ưa nhiệt, cụ thể là Bac. slearothermophiỉus cũng như các vi
khuẩn ưa ẩm thường được nuôi trên các môi trường ổn định tổng hợp
gồm glucose và các muốỉ vô cơ có thêm amino acid và vitamin với
ỉượng tương đương với 0,3% dịch tự phân. Vi khuẩn ưa nhiệt nói trên
dược nuôi trên mòi trường có tinh bột hay maltose vừa sinh trưởng tốt
vừa tạo a-amylase nhiều. Bac. coagulans cũng sinh trưởng tốt trên môi
trường cố glucose và muối vô cơ, nhưng nhất thiết phải có thêm một số
amino acid hay vitamin. Bac.dừistaỉicus tổng hợp nhiều a-amylase khỉ
nuôi bằng nước nấu khoaỉ tây 5%. Vi khuẩn ưa nhỉệt tạo amylase hoạt
động cổ tên gọi là superbiolase. Hoạt lực của a-amylase khi nuôi nó
trên môi trường có chứa rượu (1,4%) và bột (1,2%) đạt tới 450
đv/lOOml. Xạ khuẩn bao gồm cả những loài ưa nhiệt đều sinh trưởng
tốt trên môi trường cổ tinh bột hay glycerine.
b- Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enxym amylase
Ảnh hưởng cửa nguồn nitơ dinh dưỡng
Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng của phương pháp nuôi
bề sâu có thể là muối vô cơ hay các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Khi
chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi v sv tạo amylase người ta
dùng múối vô cơ. NaN03 là nguồn nitơ dinh dưỡng để nụôi nhiều loại
nấm sợi tạo amylase. Hàm lượng thường được sử dụng là 0,91%.
NaN03 và NH4NO3 có hiệu quả hơn so với các loại muối khác (KNO3,
Mg(N03)2, (NH4)2S04, (NH4)2HP04) khi nuôi Asp. oryzae -3-9-15 trên môi
trưởng bột ngô (Fenikxova, Dvatxatova, 1960) chủng này tạo a-amylase
hoạt động khi có mặt (NH4)2HP04 và NH4NO3, ngoài ra còn các chủng
của nấm sợỉ Asp. oryzae 153 lại tổng hợp manh mẽ amylase khỉ có
(NH4)2S04. Asp. awamori sinh trưởng tốt và tạo nhỉều amylase trên
môi trường Sapeck có NaNOa hoặc NH4NO3, kết quả nhận được trình
bày ồ bảng 6.9.
Thủ n h ậ n enzym từ v s v 341
Bảng 6.9 Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp
các enzym amylase bởi Asp. awamori
Khối lượng Hoạt độ enzym, đv/100ml

Nguổn nitơ
sợi khố a-amylase Oiigo-1 ,6 glucosidase Glucoamylase pH
NaNOs 1,76 23 2240 372 5,2
NH4NO3 1,20 23 3165 528 5,6
Theo N
“0,2%” 1,27 0 2489 399 5.8
“0,15%” 1.31 13 1428 399 5.4
(NH4)*SC>4 2,16 5 1245 239 6,1
Tuy nhiên, nấm sợỉ Asp. atvamori lại tạo enzym có hoạt tính
mạnh hơn cả trên môi trường có chứa hỗn hợp NaN03 và KNO3 với
nồng độ nitơ là 0,15% (Fenikxova, Muraeva, 1967), đối với
Asp.awamori 22, glucoamylase được tạo nhiều nhất khi thêm
(NH4)2S04 vào môi trường (Blieva, Fenikxova, 1967).
Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trưởng có thể kích thích tổng
hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu
thụ muô'i, môi trường bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía
tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp a-amylase.
Fenikxova và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và
thấy rằng sinh tổng hgp a-amylas6 giảm đi 10 lần mà sự tạo thành
glucoamylase hầu như không bị ảnh hưdng. Kết quả thí nghiệm được
Bảng 6.1Ồ Ảnh hường của nguồn nitơ tới sinh tồng hợp các emym amylase
1
Nguổn nitơ Liểu lượng muối, Hoạt độ enzym MU 6 nQày nuôi đv/IOOml
% theo N a amylase Glucoamylase
NaNOa 0,30 145 8000
NaNCb 0,15 26 3300
(NH4)2S04 0,15 - -
NH 4 NO 3 0,15 98 4100
NH4NOa 0,30 45 4900

n h 4h 2p o 4 0,30 5,5 8000
342 Chương 6
Sự tạo glucoamylase cũng như a-amylase cực đại thường thấy ở

các nồng độ nitơ cao (0,25-0,4%) khi làm môi trường nuôi vi khuẩn tạo
amylase người ta thường dùng (NH4)2HP04. Nhiều nguồn nitơ hữu cơ
(gelatin, casein, nước chiết ngô) đảm bảo cho Asp. awamori sinh
trưởng tốt, nhitag không tăng cường tổng hợp các amylase. Thêm nước
chiết mầm mạch hay nước chiết ngô cũng như các amino acid riêng rẽ
đều làm tăng sinh tổng hợp a-amylase ngoại bào, song hiệu quả đều
kém thua NaN03. Tỷ lượng giữa carbon và nitơ trong môi trường. Tính
cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối v sv và sự tạo thành amyỉase. Chỉ khi
nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tích
lũy được enzym cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này khồng thể bù đắp
được bằng sự dư thừa của cấu tử kia. Tỷ lượng tối ưu của carbon và
nitơ (C:N) cho sinh tổng hợp amylase là 10:1-5-40:1. Nói cách khác,
hàm lượng c trong môi trường phải 100-40 lần hcm hàm lượng nitơ.
Trong môi trường zapeck, tỷ lượng giữa tinh bột và NaN03 tối uu cho
sinh tổng hợp các enzym amylase vào khoảng 18:1.
Ảnh hưởng của amino acid
Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym. Mặt
khác các amino acid lại không đồng nhất về giá tri dinh dưỡng nên sử
dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn và cho những chất
lượng mới. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của vsv cũng như
sinh tổng hợp enzym amylase do mấy nguyên nhân sau:
- Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ, và
là nguồn năng lượng. Nhiều v sv có thể đồng hóa trực tiếp amino acid
(Kônvalov, 1967).
- Một số amino acid riêng lẻ (glutamic acid, aspatic acid...) đóng vai
trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng
hợp nhiều amino acid khác và trong quá trình chuyển amỉne hóa. Nhờ
một sô amino acid trước hết là glutamic acid và aspatic acid mà thực
hiện đồng hóa dị dưỡng C02 (Araiet al, 1968).
- Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin
tan trong nước như pantotenic acid, biotin, folic acid,... các vitamin
này có ý nghĩa sinh học rấ t lớn. Ngoài ra có những nhận xét cho rằng
sự tổng hợp ARN trong tế bào một số v sv phụ thuộc vào sự có mặt
của amino acid trong môi trưởng nuôi (Kurland, Marloe, 1962).
Thu n h ận enzym từ v s v
Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh
tổng hợp enzym. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh
tổng hợp các enzym amylase, một số thì ức chê quá trình này, một số
khác lại không có ảnh hưởng gì cả. Chẳng hạn, sự tổng hợp tt-amylose
khi nuôi chủng Asp. aivamori 78-2 được kích thích bởi hai amino acid là
glutamic acid và tyrosine. Sự tổng hợp gluco amylase được tăng cường
bằng 4 amino acid: glutamic acid, tyrosine, aspatic acid và p-alanine.
Còn sinh tổng hợp oligo - 1,6 - nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ tới sự tống
hợp glucoamylase của Asp. atvaniori.
Ả nh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tô" đa lượng và vi lượng có ảnh hương lớn tới sinh
trưởng và tổng hợp các enfcyjn, amylase của vsv. Trông số các câu tử
vô cơ của môi trường nuôi Bac. subtilis và vsv khác cho hoạt lực
amylase cao cần phải có muối của mangan, kẽm cùng các nguyên tố vi
lượng khác.
Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgS04 sẽ '
có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi aiĩ^lase bởi nấm sợi. Khi đó
sự tổng hợp a-amylase bị ức chế hoàn toàỉí, còn lượng gluco amylase
giám xuống hàng chục lần (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối
ưu của muôi này cho sinh tổng hợp a-amylase và gluco amylase là
0,05%. Thiếu muối này cùng như phosphate kali không có ảnh hưởng
mấy đến sự tạo thành oligo-l,6-glucosidase (Silova, 1967).
Phospho cần đế tổng hợp các hợp phần quan trọng cùa sinh chất
(nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzym (adenosine-phosphat,
thiamine), đồng thời để phosphoriì hóa glucide trong quá trình oxy
hóa sinh học. Phospho ảnh hướng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi
và các v sv khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzym amylase.
Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới
0,15M. Hoạt độ a-amylase và oligo-l,6-glucosidase tăng cao khi có
0,1% KH2PO4, còn hoạt độ gluciổ amylase tăng cực lớn khi có 0,2% muối
này. Sinh tổng hợp a-amylase bởi Asp. aivamori nuôi bằng phương
pháp chìm tăng lên hai lần khi có K2HP04 (lg/100ml môi trường).
Nhiều nhà nghiên cứu cho biết, thêm phospho hữu cơ (ơ dạng íltin
chẳng hạn) vào môi trường sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng của nó và
làm tăng sự tổng hợp amylase lên 2-3 lần.
344 Chương 6
Calcium cần cho tổng hợp và ổn định a-amylase hoạt .động vì nó

là câu tử không thể thiếu được của enzym này. Calcium còn có tác dung
bảo vệ amylase khỏi tác động của proteinase (Hsiu et amiloza, 1964).
Muốn tích lũy nhiều a-amylase cần có lượng Ca trong môi trường là
0,01- 0,05%. Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase (S có trong thành
phần của các amino acid quan trọng: methionine, cystein, cystine).
Lưu huỳnh với hàm lượng 0,04g/ml môi trường là thích hợp nhất
cho Asp. oryzae 3-9-15 tạo amyỉase (300 -* 350 đv/lOOml). Giảm hàm
lượng lưu huỳnh tới 0,004% thì hoạt lực amylase tụt xuống hai lần.
Nguồn s tốt nhất là methionine, có thể dùng các muối sulfate, song
không được dùng CuSCV
Nhiều nguyên tố vi lượng có ảnh hưởng tới sự tăng sinh khối và
tống hợp các enzym amylase. Ngoài Ca2* ra, trong phân tử a-amylase
của Bac. subtilis còn có chứa các ion Zn2+. Zn2+ là cầu nối để tạo thành
dimer của a-amylase Bac.subtilis. Sự có m ặt của Zn2+ trong dimer là
đặc điểm khác biệt của a-amylase.
Coban cũng có tác dụng kích thích tổng hợp amylase, vai trò của
vi khuẩn Bac. subtilis. Không có một a-amyiase nào khác dã bièt có
chứa Zn2+ cả của các nguyên tố vi ỉượng và nhất là của coban vô cùng
quan trọng trong sinh sản và hoạt động sống của vsv. Trong tế bào có
khoảng 50 tỷ phân tử protein, song chỉ có một số nguyên tử coban,
trong tê bào có thể giảm tới một nguyên tử coban, nhưng tế bào vẫn
sống, còn nếu tế bào không có coban thì tế bào sẽ chết (Purmal, 1963).
Mangan, đồng, thủy ngân kìm hâm sinh tổng hợp amylase ở
v sv pH môi trường. Nuôi cấy bằng phương pháp bề m ặt thi pH môi
trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm
thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban
đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển
của nấm sợi và sự tạo enzym.
Sự tạo glucoamyỉase cũng như a-amylase cực đại thường thấy ở
các nồng độ nitơ cao (0,25-0,4%) khi làm môi trường nuôi vi khuẩn tạo
amylase người ta thường dùng (NHĨ)2HP04 Nhiều nguồn nitơ hữu cơ
(gelatin, casein, nước chiết ngô) đảm bảo cho Asp. awamori sinh
trưởng tốt, nhưng không tăng cường tổng hợp các amylase. Thêm ĐƯỚC
chiêt mầm mạch hay nước chiết ngô cũng như các amino acid riêng rẽ
đều làm tăng sinh tổng hợp a-amylase ngoại bào, song hiệu quả đểu
Tha n h ậ n enzym t ừ v s v 346
kém thua NaNQ,. Tỷ lượng giữa carbon và nitơ trong môi trường. Tính
cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vsv và sự tạo thành amylase. Chỉ khi
nào trong môi trường có dỏ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tích
lũy được enzym cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này không thể bù đắp
được bằng sự dư thừa của cấu tử kia. Tỷ ỉượng tối ưu của carbon và
nitơ (C:N) cho sinh tổng hợp amylase là 10:1-540:1, nổi cách khác hàm
lượng c trong môi trường phải 10-40 lần hơn hàm lượng nitơ. Trong
môi trường zapeck, tỷ lượng giữa tinh bột và NaNOa tối ưu cho sinh
tống hợp các enzym amylase vào khoảng 18:1.
Ảnh hưởng của pH nguyên liệu
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề m ặt pH môi trường ảnh
hưỏng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH
không thay đổi mấy trong quá trình nuối. Tuy nhiên, pH ban đầu của
môi trường cũng có ảnh hưdng không nhỏ tới sự phát triển của nấm
mốc và sự tạo enzym. Nếu dùng nưởc máy để làm ẩm cám thì pH môỉ
trưởng là 5-6. Nếu dùng HCI, H2S04 và lactic acid để làm ẩm môi
trường thì pH của cám ẩm xuống tđi 4,5-5,0 tạo điều kiện chọn lọc cho
nấm mốc phát triển (đa số nấm mốc sinh trưởng tốt và tạo enzym
trong môi trưởng acid yếu) trong khi đó vi khuẩn hầu như không có
thể phát triển ở điều kiện này. ở pH 4,5-5,0 nấm mốc tạo hệ amylase
tốt nhất, thứ mới đến hệ pectinase còn proteinase thì kém hơn thể
hiện ở bảng 6.11.
Bảng 6.11 Ảnh hưởng của PH cám ầm tới sinh tổng hợp amylase
Các ditft pH Ho«t độ enzym trong mốc thành phẩm đv/g
làm ẩm cầm Môi trường MỐC a - amylase Olỉgo-1,6 Maltase
mi tdi độ tfm thành glucoSỉdase
60% Trưđc Sau
phắm
thanh thanh
trùng trùng
Nước máy 6.0 6.1 6.4 25,0 1008 130
HCI (0,1 N) 5,0 6.7 6,7 27,3 1230 134
HCI (0.2N) 4,5 6,8 6,8 24,7 1172 127
HCI (0.25N) 4.0 6,1 6,1 10,4 1100 134
HCI (0.3N) 3,6 6.0 6.0 8,7 1130 133 .

346 Chương 6
Đối với Asp. awamori pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo
V
a-am ylase cực lớn. Nếu pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo nhiều
oligo-l,6-glucosidase và a-l,4-anujloglucasidase. còn pH = 7,4 thì sinh
tổng hợp cả Bac. subỉilis enzym đều giảm (Grigorev, 1916Í). Đối với vi
khuẩn pH tốt nhất để tạo enzym là 6,6-7,4.
c- Các phương pháp thu nhận enzym amylase
Muấn thu dược các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải
tiến hành phân lập, và chọn giống v sv để tuyển lấy những chủng
hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng
và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hóa các điều
kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉ
phụ thuộc vào các tính chất di truyền của v sv mà còn phụ thuộc vào
việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu.
Ngoài các yếu tố hóa học (thành phần môi trường) ra, các điều
kiện lý hóa của quá trình nuôi cũng có một ý nghĩa rấ t lớn đối với
sinh tổng hợp các enzym amylase. Người ta đã chứng minh rằng có
thể dùng điều kiện nuôi khác nhau để thu các chế phẩm có tỷ lệ và
thành phần enzym khác nhau ở quy mô công nghiệp. Ví dụ, có thể
dùng Bac. sublilỉs dể thu chủ yếu là phức hệ amylase hoặc chủ yếu là
phức hệ protease.
Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các
enzym amylase trong quá trình nuôi vsv, thi thành phần môi trường,
tính chất cơ lý của m ôi. trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ
thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường... là những yếu tố ’cơ bản
tối quan trọng. Có hai phương pháp nuôi v sv là phương pháp bề mặt
(phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm). Phương
pháp nuôi quyết định sơ đồ công nghệ nuôi, về nguyên lý, ưu nhược
điểm của các phương pháp nuôi, sơ đồ công nghệ của từng phương
pháp và các yêu cầu chung đã đề cập đến ồ phần đầu của cuốn sách, ở
đây chỉ trình bày một số yêu câu cơ bản đối với thành phần và tính
chất cơ lý của môi trường cùng là các điều kiện nuôi cổ ảnh hưởng
trực tiếp đến sinh tổng hợp các enzym amylase bằng vsv.
Nuôi v s v tạo amylase bằng phương pháp bề mặt

- Yêu cầu đối với thành phần môi trường dinh dưỡng. Yêu cầu cơ
bản đối với thành phần của môi trường nuôi v sv tạo amyỉase cũng
giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi v sv tạo các enzym khác là
tính hoàn thiện. Hầu hết vsv tạo amylase đều hấp thụ carbon chỏ
yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tỉnh bột, dextrin...) hydro ở dạng H20
và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của
môi trường và ở dạng oxy phân tử.
Cấu tử chính của môi trường vsv tạo amylase bằng phương pháp
bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và
có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vsv không cần bổ
sung thêm các chất khác nữa. Cám mì cố 16-22% tỉnh bột, 10-12%
protein, trong đó có các amino acid quan trọng như methionine (0,19%),
cystine (0,3%), arginine(l%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3-4% chất
béo, 10,3% celulose, các nguyên tố tro (Na-0,09%, K-1%, Ca-0,16%,
P-0,94%) và nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo cổ khoảng
20% tinh bột 10-15% chất béo, 10-14% protein, 8-16% celulose, các chất
hòa tan không chứa nitơ (37-59%).
Chất ỉượng của cám gạo, cám mi có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực
của các enzym amylase. Cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%.
Nên dùng cám tốt, cám mới không cổ dư vị chua hay đắng, không hôi
mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá
0.05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng
tương dối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vsv, các chất dinh
dưỡng không được sử dụng hết, vi thế cổ thể thay cám bằng một số
cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử bổ sung được đưa vào có thể là chất làm xốp
môi trường hoặc làm giàu thêm các chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng
mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm mạch (15-20%), trấu
(2-25%), mùn cưa (5-10%).... Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau
khi trích ly enzym) làm cấu tử chính của môi trường (Silova,
Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia
chứa nhiều bào tử v sv khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo
chúng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất khồng
348 Chương 6
chứa v s v ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong
vòng 4-6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 120°c
trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8%
HCI kỹ thuật theo khối lượng môi trường.
- Độ ẩm tối thích của môi trường: Trong điều kiện sản xuất, đ
ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp. niger, Asp. cuvamort, Asp. flavus,
Asp. oryzae) của môi trường là 58-60% và phải giữ cho môi trường có
độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ
làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sinh
trường và phát triển của vsv cũng như sự tạo enzym amylase. Trong
điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường hình tam giác, trong tủ ấm phòng
thí nghiệm hoạt lực amylase cao nhất thu được ỏ độ ẩm 65-68%). Cần
nhớ rằng khi nuôi trong diều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên
các khay), thì độ ẩm môi trường sau khỉ cấy giếng không được vượt
quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được
độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hong khô của canh trường)
trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợỉ lại còn có ý nghĩa to lớn
hơn đối với sự tạo thành enzym. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường
đến sinh tổng hợp enzym amylase được trình bày trong bảng 6.12.
Bảng 6.12 Ảnh hường của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự
tạo a-amylase cửa Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt
20 gld 34 gld 42 giờ
Phương án
Độ ẩm Hoạt độ Độ ẩm Hoạt độ Độ ẩm Hoạt độ
thỉ nghiệm % amylase đv/g % amylase đv/g % amylase đv/g
canh trường khô canh trường khò canh truờng khô
Khaydểhơ* 27,8 15,0 23.8 18.0 22.0 20,5
Khay đậy nắp 46,4 20,4 42,4 32.9 42,4 36,7
Qua bảng số liệu trên thấy rỗ là hoạt lực a-amylase của canh
trường nuôi nấm sợi, khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó
khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trưởng ở mức độ tối
thích- Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của vsv.
Trong quá trình sinh trưởng của mình v s v tiêu thụ 25-35% chất dinh
dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CƠ2-
Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trừng
có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục,
gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày của lớp
môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay.
Thường là ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng
nuôỉ khoảng 4-5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong
một giờ, còn ở giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không khí trên thể
tích phòng nuôỉ/l giờ,còn ở giai đoạn thứ ba giảm đỉ chỉ còn 10-12 thể
tích không khí mà thôi.
Nhiệt độ nuôi: Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên
cám có thể chia làm ba thời kỳ:
- Thời kỳ trương và nảy mầm của đírih bào tử (đối với nấm mốc
10-11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3-4 giờ). Trong thời kỳ này phải
đốt nóng khồng khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không
thấp hơn 23-30°C đối với nấm mốc và duy trì nhỉệt độ 32-38°C cho vi
khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%.
- Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4-18
giờ), ở giai đoạn này nếm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một ỉượng
nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ
tăng lên đến 37-4Ó°C, đôi khi cao hơn tới 47°c. Vì vậy cần phải hạ
nhiệt dộ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc 'đều và đẹp. Ở nhà máy
người ta thổi khổng khí vô tròng cổ nhiật độ 28-29°C và độ ẩm cao
vào phòng nuôi.
- Thời kỳ tạo enzym amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10-20 giờ).
Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất đần dần yếu đi, sự tỏa
nhiệt giảm mạnh. Các enzym amylase được tổng hợp m ạnh mẽ. Theo
Rodxevits (Pozerur,1967) trong một ngày đầu ỗ giai đoạn sinh trưởng
thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Asp. oryzae chỉ tạo được cổ 7,5-8%
enzym, trong vòng 12 giở sau, hoạt lực của a-amylase tăng 9-12 lần
hoạt lực đường hổa táng hai lần và hoạt iực của oligo-l,6-glucosidase
tăng lên 10 lần. Đối vởi đa số v sv ỏ giai đoạn này nên hạ nhiệt độ
xuống 3~4°c so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng
cửa đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28-30°C, cho Bac. subtiỉis
là 35-37°C.
350 Chương 6
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn: Thời gian nuôi để
có lượng enzym cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy
thuộc vào tính chất sinh lý của chủng sinh vật và sự ngừng tổng hợp
enzym mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào
thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muến vì
thường làm giảm hoạt lực của enzym. Đối với đa sô' nấm mốc
Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại tỈẶƯỜng kết thúc khi nấm
mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí
tốt thì thời gian nuôi để có tích lũy amylase cực đại đối với từng loại
nấm sợi và vi khuẩn như sau:
Chủng Thời gian nuôi (giờ)
Asp. oryzae - 476 24-25
Asp. oryzae - KC 30-36
Asp. oryzae 8Fj 24-30
Asp. awamori 22 36
Bac. subtilis 68 - 72 (Ở 30°C)
Nuôi v s v tạo amylase bằng phương pháp bề sãu
Môi trường dinh dưỡng: Đặc điểm chung cho mọi môi trường
nuôi v sv tạo amylase là cố chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay
maltose. Nguồn ni tơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô cơ (NaNƠ3).
Sinh tổng hợp a-amylase hoạt động ỗ cấc chủng Aspergillus thường
chỉ thấy trong các môi trường có các muếi cỏa acid sulfuric. Đối với
sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo-l,6-glucoamylase
hoạt động lại rất cần có Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho
v sv phát triển tốt và sinh nhiều amylase người ta cho thêm vào môi
trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,
nước chiết đậu nành,... đó là nguồn bổ sung amino acid, vitamin và
các tạp chất sinh trưởng. Dưới đây là một số môi trường lỏng dùng để
nuôi v sv tạo các enzym amylase. Đối với Aspergillus, người ta thường'
nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm: 6% tinh bột; 0,9% NaN03;
0,001% FeS04; 0,1% KH2P 0 4; 0,05% MgSƠ4; 0,05% KC1 và nước máy.
Để tăng cường khả năng sinh trường của v s v và khả năng tạo
enzym có th ể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám
nấu nước chiết bột đậu nành.
Ở Trung Quốc, người ta thường dùng môi trường có thành phần như
sau: bột ngô - 6%; NaNOa - 0,3%; MgS04.7H20 - 0,05%; HC1 (36%) - 0,1%.
Để nuôi Asp. oryzae 3-9-15 với mục đích thu a-amylase,
Fenikxova và Dvatxatova (1959, 1960) chọn môi trường có: 65% bột
ngô; 0,9% NaNƠ3; 0,005%MgS04, và 10% nước chiết mầm mạch
(100g/llít H20), pH môi trường 6-7. Môi trường dể nuôi các chủng nấm
sợi tạo amylase dùng trong công nghiệp rượu iAsp. niger s 4, S4-IO-IO-III,
Asp. niger NRKL-337, Asp. balatae 61 Asp. usamỉi 1788/45) là dịch lọc
bã rượu có hàm lượng chất khô 4-6% và thêm 0,2% MgO, 1-2% bột
ngô hay bột mì (theo nghiên cứu của Viatkin, Rodzevits. Smirnova,
Stankova).
Trong công nghiệp bia, dể nuôi Asp. oryzae, Phedo-rov dùng dịch
lọc bã bia nghiền vụn (phế liệu của nhà máy bia) và thêm vào các
chất sau: 1,5% bột đại mạch; 1% mầm mạch; 0,9%NaN03‘, 0,1% KC1;
0,1%KH2P 0 4; 0,01%MgS04.7H20; pH môi trường là 5,6-5,7.
Môi trường để nuôi Asp. aivamori nhằm thu glucoamylase ở Liên
Xô cũ người ta thường dùng là: dung dịch nước có chứa 3% bột ngô;
0,91%NaN03 (theo nitơ 0,15%); 0,05% KC1; 0,1%KH2P 0 4;
0,05%MgS04; 0,001%FeS04. pH môi trường là 7,0-7,2 (Silova,
Iarovenko và cộng sự 1970).
ở Nhật, Fukanehara nuôi Asp. awamori bằng môi trường sau:
bột ngô - 3,9%; cám mì - 1,56%; cám gạo - 0,56%; Na(H2PƠ4)2 -
0,28%; NaNOă - 0,28% và nước máy.
Để nuôi Endomyces sp. Hattori (Nhật) dùng dung dịch nước có
6% cám mì, dừng môi trường lỏng cổ 2,5% bã ngô, 0,1-0,5% acid oleic
để nuôi Endomycopsis sp. Imsenetxki dùng môi trường lỏng có chứa
nước nấu khoai tây 5% và 0,1% CaC03 để nuôi Bac. diastalicus với
mục đích thư amylase bền nhiệt.
Ở Anh, Pháp, Đan Mạch, Nhật Bản người ta dùng Bac. subtiỉis với
tư cách là v sv tạo amylase chủ yếu. cếu tử chính của môi trường nuòi
Bac. subtilis là bột ngô. Ngoài ra còn có các chất hiệp trợ khác như
K2SO4, lactoza, NaCl, MgS04. Fenikxova đề nghị nuôi vi khuẩn
Clostridium pasterianum để thu amylase trong môi trường lỏng có chứa
1% khoai tây thái vụn, 0,5% phấn (pH 6,0-6,5). Có thể nuôi Bac. subtiỉis
bằng nước chiết cám 20% hay bằng môi trường. Nomura cải tiến: 2% tinh
352 C h ittàg e
bột; 0,067M (NH4)2HP04; 0,2%MKCL; 0,002M; MgS04.7H20; 0,001M

CaCl2 và dịch chiết đậu nành 5%. pH môi trường - 7,2 (Fenikxova,
Tikhpmirova, 1960).
Môi trường Nomura có thành phần sau: tinh bột-8% xitrat n;
Natri-0,04%; (NH4)2HP04 0,15M; KCI-0,02 maltose; MgS04.7H20-
0,002M; CaCl2-0,001M; rượu etylic-1%; nước chiết đậu nành 5%.
Logina nuôi Bac. mesentricus bằng môi trưởng có chứa: nước nấu
khoai tây 120%; nước nấu ngô 4% vàCaCOa 0,1% (pH-7,0).
Người ta phân biệt các phương pháp nuôi chìm sau:
- Phương pháp gián đoạn
- Phương pháp tuần hoàn - liên tục
- Phương pháp dòng chảy liên tục.
Một trong các điều kỉện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh
tổng hợp các enzym amylase ở các chủng v sv nuôi chìm là nồng độ
ion hydro trong môi trường và sự biến dổi của nó trong quá trình sinh
trưởng cửa chủng nuôi.
Độ acid của canh trường được xác định bởi thành phần và tính
chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các
muối này bởi vsv. Trước hết, pH của canh trường phụ thuộc vào tính
chết của nguồn nitơ vô cơ. Nếu như thêm vào môi trường các muối
ammonium, thì khi v sv tiêu thụ ion ammonium, các anion được gỉắi
phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho thêm CaC03 vào
dể trung YỈba môi trường hoặc duy trì tự động gỉổ trị pH thích hợp cho
việc tổng hợp các enzym amylase.
Khi nguồn ni tơ vô cơ được đùng là các muối nitrate, thì trong
quá trình v sv tiêu thụ anion (NOa’) sẽ giải phóng ra các ion kim loại
và môi trường bị kiềm hóa pH tăng lên. pH ban dầu của môi trường
để nuôi Asp. oryzae 3-9-15 nhằm thu a-amylase ỉà 5.5-5.7 (mòi trường
sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mắm mạch và NaNOía)-
Trong quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần Hfln và tới cuối kỳ
sinh trưởng canh trưởng có pH 7.8-8.2. Trong trường hợp này, sự
kiềm hóa tự nhiên môi trường khỉ v sv sử dụng NaNOa làm nguồn
nitơ vô cơ cố ảnh hưởng tốt tđi sinh tổng hợp a-amylase. Không cẩn
cố m ột sự đỉều chinh pH nào cả. Ở đây giá trị pH tối thỉch cho tống
hợp a-amylase (là 7-8) khác hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt
động của enzym (pH 4,7-4,9). Khi điều chỉnh pH tới giá trị ban đầu
hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH = 6) thì hoạt lực a-amýlase cũng
giảm đi nhiều (gần bằng 23%). Khi dùng các muối ammonium
phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mô'c này thì pH tối thích
của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu gỉucoamyỉase người
ta nuôi Asp. awamori 22 trong môi trường Sapeck cố 6% tinh bột.
Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại
pH = 8. pH tối thích ban đầu cho chủng này sinh trưởng là 7,0-7,2.
Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0 (Fenikxova.Silova,1960). pH
môi trường để nuôi vi khuẩn Bac. subtilis nhằm thu a-amylase thích
hợp nhất là 6,8-7,5, còn để tổng hợp protease lại là 7,0-7,8. pH ban
đầu tối thích cho sinh tổng hợp các enzym là 7,0-7,8, cồn pH cuối
khi nuôi lại là 6,3-7,9. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0
đều làm giảm vận tốc sinh tổng hợp enzym, còn nếu pH bằng 8,8-9,0
thì vi khuẩn hầu như không phát triển.
Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối
với sinh trưởng của v sv và sự tạo thành các enzym amylase. Không
tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lực các
enzym amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống
Aspergillus là 30-32°C (trong đó có Asp. oryzae 3-9-15 và Asp.
awamori 22), Bacillus subtiỉis. Môi trường thích hợp nhất và tạo
nhiều amylase ở nhiệt độ 37°c. Một số vi khuẩn khác lại có nhiệt độ
sinh trưởng tối thích cao hơn. Bac. diastaticus sinh trưởng tốt ở nhiệt
độ 60-65°C. Bac. circuỉans phát triển mạnh ở nhiệt độ 65-70°C song
lại tạo nhiều amylase hoạt dộng ở 50°c vì vậy người ta thường cấy
giống ở nhiệt độ 70°c còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 50°c nuôi
chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và
phấn. Nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym
tạo thành amylase của Bac. coaguỉans và Bac. slearothermophỉlus được
nuôi ô 35°c và 55°c có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ ở 90°c
trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 35°c bị mất
90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở
354 Chương 6
nhiệt độ 55°c chỉ bị vô hoạt có 10-12% (Campell, 1955). Các v sv Ma

nhiệt (vi khuẩn) sinh tổng hợp nên các amylase bền nhiệt. Enzym với
độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra
nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp. Vì
nuôi ở nhiệt độ cao tạq ra điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt
yêu cầu khắt khe về độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi dỡ bị nhiễm.
Sục khí và khuấy trộn. Phần lớn v sv tạo amylase là những
v sv hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy
phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng
của mình, v s v sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng
oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung.
Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt
tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sình tổng hợp các
enzym của v sv .
Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi vsv
có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau:
- Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi
- Bằng máy các kiểu chuyên dùng
- Bằng tác dụng hiệp đồng cỉa cả sục khí lẫn máy khuếy
- Bằng tác dựng của các khí sinh ra khi lên men.
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi vsv
tạo enzym (cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) cổ hiệu suất cao thì
phải khuấy đảo môi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm
việc liên tục trong suốt cả quá trình nuôi. Việc chọn chế độ sục khí
thích hợp sẽ cổ tác dụng khá quyết định khổng chỉ đối với sự sinh
trưởng và phát triển củạ v sv hiếu khí trong điều kiện -nuôi chìm mà
còn đối với sự sinh tổng hợp enzym amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí
vô trùng (cổ nhiệt độ không cao quá 40°G) trên lm 8 môi trường trong
1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-72 giờ. Với thời gian nuôi
ngắn hơn ồ các thùng lên men nhân giống (48 giở) và trong các thùng
lên men sản xuất (48-52 giờ) thì lượng khổng lchí cần sục vào môi
truờng để nuôi Asp. oryzoe (3-9-15) phải là 30m8/m3môi trường/giờ đối
với thùng nhân giống và 40m3/m3mòỉ trưởng/giờ cho thùng sản xuất.
Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp, oryzae (3-9-15) tương ứng với 180
micromol Oa/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ
với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan
cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ 0 2 giảm
dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi v sv ưa nhiệt đòi hỏi nhiều
không khí hơn là nuôi vsv ưa ẩm. Điều này cũng dễ hiểu thôi, bỏi lẽ
ở nhiệt độ tương đối cao (50-65°C), độ hòa tan của oxy trong môi
trường giảm xuống, mặc dù nhu cầu của v sv ưa nhiệt về oxy cho các
phản ứng oxy hóa có tăng lên.
Người ta nuôi Bac. subtilis trong thừng nhân gỉống (15 giờ ồ
37°C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào
môi trường với lượng là 40m3/m3môi trường/ giờ. Còn nuôi vi khuẩp
này trong thùng lên men sản xuất (trong 48 giờ ở 37°C) cổ cánh
khuây làm việc liên tục và sục không khí vô trừng với lượng 60m3/lm 3
môi trưởng/giờ. Thời gian nuôi vsv để có lượng amyỉase cực lớn trong
phương pháp nuôi chìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng, vào
phương pháp nuôỉ và một số yếu tố liên quan. Việc xác định thởỉ gian
nuôi tối thích cũng được tiến hành bằng thực nghiệm. Chẳng hạn
người ta nuôi Asp. oryzae (3-9-15) trong thùng lên men nhân giống 48
giờ, còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ.
Lượng giếng đem cấy vào thùng lên men là 8-10% 80 với thể tích môi
trường dinh dưỡng.
Trong công nghiệp rượu, khỉ nuôi nấm Aspergillus bằng phương
pháp gián đoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ. Tuổi của nấm
tốt nhất là 24-30 giờ và lượng vật liệu gieo cấy là 10% 80 với thể tích
môỉ trường dỉnh dưỡng. Khi nuôi bằng phương pháp tuần hoàn liên
tục và phương pháp dòng chảy liên tục, thời gian nuôi sẽ ngắn hơn
rất nhiều (30-40 giờ). Asp. awamori 22 sản sinh glucoamylase cũng
được nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men
sản xuất 52 giờ hay hơn nữa (Fenikxova, Silova). Thời gian nuôi Bac.
diastaỉicus (để thu chế phẩm superbiolase dùng trong công nghiệp bia
và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống cũng như trong thùng lên
men sản xuất chỉ cổ 5-6 giờ (Iarovenko và đồng sự năm 1970). Thời
gian nuôi Bac. subtilis trong thừng nhân giống kéo dài 15 giờ, còn
trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% 80 với
thể tích môỉ trường dinh duững. Đấi với Endomycopsis sp. thời gian
nu6ỉ để có lượng amylase cực lớn phải tới 80 giờ.
356 Chươầig 6
6.4.3 Thu nhận enzym pectỉnase từ v ỉ sinh vậ t

2- Cơ chất
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp
của các add galacturonic qua các liên kết a-l,4-glucoside. Tùy thuộc vào
nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80000-200000.
Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác.
Pectin hòa tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonate
natri và trong glycerine nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng
lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tảng và khỉ khấi
lượng phân tử pectin giảm.
Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành
phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid ỉà thành phần chủ yếu.
Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các
cấu trúc polyssacharide và protein để tạo thành các protopectin không
tan. Có thể phân hủy để ỉàm chọ pectin tan trong nước bằng cách đun
nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận
được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng
không đồng dạng với nhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hòa tan,
pectinic acid và protopectin.
Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin,
trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic
acid được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel
đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%.
Enzym pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân
tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ
bản của pectin là a-D-galacturonan hay a-D-galacturonoglycan, mạch
thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết
theo kiểu a-1,4). Mặt khác, mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer
này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị
ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng
hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl
và các nhóm acetyl.
Thu n h ậ n enzym từV SV 357
Pectimc acid là polỵgaỉacturonic add có một phần nhỏ các nhóm

carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic
acid. Pectic acid ỉò polygalacturonic acid đâ hoàn toàn giải phóng khỏi
nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên
một đơn vị galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid.
Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và
có cấu tạo hóa học phức tạp. Trong thành phần pectin cổ các phân tử
pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2*, các gốc phosphoric
acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phán bằng acid thì
giải phóng pectin hòa tan.
2- Pectìnase
Enzym pectỉnase ỉà étưym xúc tác sự phân hủỹ-của các polymer
pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thưởng xảy ra khi trái cây
chín. Những enzym này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong
quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các enzym này
trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng
RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen. J^nzym pectinase cũng được
ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến ^hực phẩm, đặc biệt là khả
năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzym
pectỉnase cũng có thể điều chinh được độ nhớt của sản phẩm.
Enzym pectinase cồ th i được phân ỉoại theo cơ ché tác dụng của chúng.
• Pectinesterase (PE) (pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11): xúc
tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzym thường tấn công
vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị
không bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh
các nhóm - COOH tự đo, tạo thành acid pectỉnỉc hoặc acid pectic và
methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị
pH tối till khác Nếu thu từ nguồn v sv thi pH tối ưu từ 4,5-5,5,
còn nếu từ nguồn thực vật th^có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase
từ n ắ m mốc cổ nhiệt độ tối liu là 30-45°C và bị vô hoạt ở 55-62°C.
Pectỉnesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Ca2+và Mg2+.
• Polygalacturonase cồn có tên gọi là poly ct-1,4-
galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết a-1,4-
glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-a-D-galacturanide) galacturonohyđiulase,
358 Chương 6
EC 3,2.1.67) phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly

1,4-a-D-galacturonide) glycanohydrolase, EC 3.2.1.15) tấn công ngẫu
nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật
nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase
là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu
cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ
chất, enzym polygalacturonase được chỉa làm bốn loại:
- Polymethylgalacturonase hay còn gọi là a-1,4-galacturonite-
methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polỵgaỉactorunỉc acid đã được
methoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này lại được phân thành hai nhóm
nhỏ phụ thuộc.vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay cuối mạch
trong phân tử pectin, đó ỉà endo-glucosidase-polymethyỉ galacturonase
kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III.
- Polygalacturonase, enzym tác dụng trên pectỉc acid hoặc
pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-
polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-poỉygalacturonase kiểu
IV. Enzym endo-glucosidase-polymethyl-galaturonase kiểu I là enzym
polymethylgalacturonase dịch hóa pectin có mức độ methyl hóa càng
cao thì bị thủy phân bởi enzym này càng nhanh và càng có hiệu quả.
Trong dung dịch, khỉ có m ặt của enzym pectinesterase thì hoạt độ của
enzym này thường bị giảm. Enzym này rất phổ biến trong các vsv,
đặc biệt là nấm mốc A. niger, A. awamori.
• Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn v
gaỉacturonate không bị ester hóa. Cả hai enzym exo-PEL (exo-poly(l,4-
a-D-galacturonide) lyase, EC 4.23.9) và endo-PEL (endo*poly( 1,4-a-D-
galacturonỉde) lyase, EC 4.2.2.2) đều tồn tại. Pectate và pectin có
lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzym
này. Nói chung, cả hai enzym này dậu cổ khoảng pH tối đa nằm trong
khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không
được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nếm. Các
enzym v sv ngoại bào này đóng một vai trò rết quan trọng trong quá
trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào,
ỉàm mềm và làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:

• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly a-1,4-
galaturonite -methylesteglucanoliase, là enzym tác dụng trên pectin và
pectinic acid.
• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly a-1,4 D-
galaturonỉte -glucanoliase, là enzym tác dụng trên pectỉc acid và
pectinic acid.
• Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate
dã bị ester hóa. Tất cả các PNL đều là endo-enzym.
3’ v s v tổng hợp pectinaae
Nguồn giàu enzym pectinase là nấm mấc, nấm men và vi khuẩn.
Nấm mốc: Penicillium glaucum, p. ehrỉichii, p. chrysogenum, p.
expanam, p. ciỉrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A.
terrus, A. saitoiy Fusarium moniliforme,...
Nấm men; Saccharomyces fragilis
Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum,
Klebsiella aerogenes,...
Các loài v sv này thưởng có trong bề mặt tấ t cả các loại quả, các
bộ phận khác của thực vật. Khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết,
chúng sẽ cùng các loài vsv khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ
phận của thực vật.
Or Pectinesterase
Bên cạnh pectineaterase (PE) vsv, hầu hết các loại cây cho trái
đều chứa enzym PE. Enzym này thường tán tại dưới nhiều hình thức
khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở nấm là các enzym ngoại
bào. PE ở thực vật nổi chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi
kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có
khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của enzym.
Đặc điềm cửa pectineaterase thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai
loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình
chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzym PE1 giảm xuống,
nhưng PE2 tích lũy dần cho đến khi trái cây có màu dặc trưng của
trái chín. PE2 cổ khối ỉượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzym này
bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ỏ 67°c. Các ion Ca2+ và Na+ làm
tăng hoạt độ của enzym lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M,
theo thứ tự.
360 Chương 6
PE của dậu nành là protein có khối luợng phân tử 33kD, hoạt

động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành
do quá trình dề methyl hóa, là một chất ức chế cạnh tranh.
Trong th ịt quả chuôi có hai isoenzym PE. Cả hai có cùng khối
lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và
9.3. Các enzym này hoạt động tối đa ở pH 7,5. Hoạt dộ enzym tăng
lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của
dung dịch về 6,0. Các enzym này bị ức chế ở bởi nhiều loại poỉyol
cố khôi lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose,
và galactose.
PE trong quả cam cỏ hai loại: đó là hai isoenzym PE1 và PE2 có
khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau ỉà 10,05
và > 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn cỏa PE2 là 8,0.
Thịt quả cũng chứa hai isoenzym, một trong hai enzym này có
tính bền nhiệt hơn, còn enzym kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động
của protease. Độ ổn định của enzym cổ thể liên quan tới mức độ
glycosyl hóa của các phân tử enzym. Enzym bền nhiệt hơn và enzym
còn lại có khôi lượng phân tử là 51kD và 36kD, theo thứ tự.
Cả táo và kiwi cũng chứa hai ỉoại isoenzym. Các isoenzym của
kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là
7.3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt.
Một điểm đáng luu ý là tấ t cả các enzym vsv đều không phải là
protein kiềm. PE của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm
trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối tfti là 7,6. Tuy nhiên, PE của
Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid.
Hoạt động của enzym PE sinh ra bởi A niger đạt tối đa ở pH 4,5 ò
40°c. Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hóa cơ chất pectin theo
cùng một kiểu. PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hóa
và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra pectin
bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium.
Trình tự amino acid: Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa
305 amino acid với khối lượng phân tử 33 239. Enzym này có chứa
hai cầu nối disuỉíỉde (Cys98-Cysl25 và Cysl66-Cys200). Cysl66 có
m ặt trong tấ t cả các enzym pectỉnesterase. Trình tự amino acid suy
luận trên cơ sở các nucleotide cDNA cho thây sự không nhất quán,
18 trong 27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của
protein. M ặt khác, chỉ cổ khoảng 94% trình tự amino acid trong
một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự
của cDNA. Sự không n h ất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của
các isoenzym, mặc dù chỉ có hai isoenzym trong cà chua được biết
đến. Một số gen mã hóa cho các enzym PE đã được tách dòng và
nghiên cứu đặc điểm. Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hóa cho
PE có chứa 396 amino acid vđi khối lượng phân tử là 41 004.
Cơ chế đề methyl hóa: PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân
tử pectin bằng tương tác ái nhân của enzym lên ester, làm hình thành
hợp chất trung gian acyl-enzym và phóng thích methanol. Tiếp theo sau
là phản ứng đeacyl hóa, là phản ứng thỏy phân của hợp chất trung gian
acyl-enzym, để giải phổng enzym và carboxylic acid (H.6.7).
o)
E-N C - 0 -C H 3
MI Su
E-N-Ộ ^ ^ o H
I N
o R H
E-N + R-C-OH
R
Hình 6.7 Cơ ché phản ứng của peetinesterase
Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình
thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch
pectin. Enzym của Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu
phản ứíig tương tự. Enzym của các loài Asperigillus với pH tối đa
trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.
362 Chương 6
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzym
pectinesterase có thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất.
Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh tran h trong phản
ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE. Pectin chứa các nhóm
carboxylate dược sắp xếp như hình khôi có thể tác dụng theo cách
tương tự. Sự liên k ết của ion kim loại vào các nhổm carboxylate
trong trường hợp này có khuynh hướng trung hòa ảnh hưdng ức chế
của cơ chất pectin lên enzym. Tuy nhiên, lượng dư các ion này trên
thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây quanh
bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần
th iế t cho phản ứng thủy phân xảy ra.
b- Polygalacturonase
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn vsv. PG
thường dược tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm
và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacckromyces fragilis,
Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochliobolus carbonum,
Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Rhizopus arrchizus, và
Fusarium oxysporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc
cao được nghiên cứu rấ t nhiều à cà chua chín.
Các enzym trong cà chua chín: Các enzym PG trong cà chua chín
tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzym. PG1 có khối lượng
phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78°c. PG2 có khối
lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ỏ 57°c. PG1 có độ án
định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. Sự phân tích
sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tụy nhiên các
nghiên cứu khác lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2
với một P-subunit. Các chuỗi polypeptide của PG đều bị glycosyl hóa. PG2
chứa 4,6% đường trung tính (D-mannose, Lrfiicose, D-xylose) liên kết với
nhau thông qua cầu nối N-acetylglucosaminylasparaginyl. Có sự khác
nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzym của PG2,
PG2A và PG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD. Sự
khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl
hóa sau dịch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng
minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hóa khác nhau
của cùng các polypeptide.
Trình tự amino acid: Các trình tự amino acid được suy luận trên
cơ sở các nucleotide của cDNA phân lập không những từ trái cà chua
mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas soỉanacearum, Oenothera
organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân lập từ cà
chua mă hóa cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng
phân tử là 40 279. Enzym này được tổng hợp như là một tiền chất,
sau đó đi qua quá trinh sửa chữa sau dịch mã, gồm cả quá trình ỉoạỉ
bỏ các peptỉde tín hiệu, bị glycosyl hóa tại bốn điểm có khả năng
glycosyl, và sửa chữa ở đầu c cuối. Các gen PG đơn mã hóa cho các
loại isoenzym khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất
phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ
sự kết hợp của PG2 với p-subunit.
p-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà
chua là một vấn đề gây được nhiều chú ý. P-subunit, một yếu tố bền
nhiệt, dầu tiên được phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đái
PG2 thành PG1 trong ống nghiệm. Yếu tô" này sau đó được xác minh là
một glycoprotein rất đặc trưng với polypeptide PG về m ặt miễn dịch.
Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2 và một phân tử
p-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypepide PG có hoạt tính enzym.
cONA mã hóa cho p-subưnit có trong cà chua là một tiền chất cố
kích thước phân tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này,
thêm vào phân tử protein hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kị nước
(30 amino acid), một polypeptide chứa đầu cuối N-(78 amino acid), và
một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid). Protein hoàn
chỉnh chưa glycosyl hốa ỉà chứa 289 amino acid nặng 31,5kD, và điểm
đẳng điện 4,9. Protein này chứa lượng lớn các amino acid gly, tyr,
phe, và một motif lặp cổ cấu trúc liên ứng FTNYGxxGNGGxxx, trong đó
"x* phần lớn là các amino acid phân cực. Chức năng của motif này
trong protein vẫn chưa được biết rõ.
364 Chương 6
Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây. Hoạt độ của
enzym trong giai>-đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ
-PG1. PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có m ặt trong tấ t cả
các giai đoạn của quá trình chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn
và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện trong giai đoạn cuối của quá trình, và
chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín. Sự xuất hiện kế tiếp nhau của
hai enzym này là kết quả của hoạt động điều hòa của p-subunit, yếu tố
này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó tăng lên
trong giai đoạn chín.
% PG2 chỉ được coi như là một endo-enzym trong cà chua chín, PG1
được hình thành trong suốt quá trình chín khi p-subưnit được sinh ra
để phản ứng với PG2. Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các
phân tử PG trong các dịch chiết khác nhau có các nồng độ khác nhau
của NaCl và pH đệm khác nhau. Trên thực tế, gen mã hóa cho
polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh điều
này. Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của p-subunit
và các phân tử PG cho thấy mRNA của p-subunit xuất hiện sớm trong
quá trình phát triển của trái cây (10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng
đến mức tối đa sau 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng
mRNA của p-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của
PG táng một cách đáng kể.
Vì tấ t cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho
rằng endo-enzym PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của
quá trình chín phải được chuyển về PG1 do sự có m ặt của p-subunit.
Sự tích lũy của PG2 trong các giai đoạn sau của quá trình chín là do
p-subunit bị cạn kiệt. Vai trò của quá trình chuyển đổi này là nhằm
điều hòa hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá trình chín.
P-subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân
tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin. Một số nghiên cứu
khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2, có chức
năng trong việc làm phân hủy và ổn định polyuronide, có nghĩa là sự
phân hủy cỏa polyuronide dưới tác động cỏa enzym PG là nguyên
nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua. Tuy nhiên, khi nghiên cứu
về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà chua chuyển gen thì
kết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái
cây mềm đi.
Cơ chế và kiểu tác dụng: Exo-PG thủy phân các đầu không khử
của chuỗi polygalacturonic, tạo ra gaỉacturonỉc acid là sản phẩm thủy
phân chiếm ưu thế (H.6.8). Sự phân hủy polymer này bị gián đoạn bởi
sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thủy phân tăng
tỷ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hóa 20 đối với
các exo-PG ỏ cà rốt và đào. Hoạt động của exo-enzym làm tăng nhanh
sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch
cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra
sự tích ỉũy gaỉacturonic acid, và chỉ có endo-enzym PG là có liên quan.
COOH COOH COOH COOH
OH OH OH OH
Hình 6.8 Tác động phân hủy của polygalacturonase
Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm
nhanh độ nhớt của dung dịch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng
của endo-enzym được xác định bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức
độ thủy phân của endo-PG ở nấm men giảm cùng với sự giảm độ dài
mạch cơ chất. Vị trí liên kết của endo-PG ở Aspergillus niger được cấu
thành từ bốn điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các đỉểm 1 và 2 (H.6.9).
Một cơ chất tetram er chịu sự phân cắt (3+1) thành trigalacturonic
acid galacturonic. Một cơ chất pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp
hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của bốn điểm liên
kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2). Cũng tương tự, đối với cơ chất là
hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành theo lối phân cắt (5+1),
(4+2) và (3+3). Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo
thành các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích. Liên kết hữu ích
trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1). Liên kết không
hữu ích được tạo thành khi ba đơn vị đơn lẻ bám vào ba điểm 2, 3 và
4, mà không hề tương tác với các nhóm xúc tác định vị bên trong
điểm 1 và 2. Cơ chất trong trường hợp này dóng vai trò là một chất
ức chế cạnh tranh (Ki = 0,67mM).
366 Chương 6
â a a e ,
rQOQ*Qĩ^
QfQ O O Q i^ r6 Õ Q Q f t ^
ĩ^s&Qfi9n
Kiểu phản ứng B
QjQQ*fti
o o ĩQ Q & i
Kiểu phàn ứng c
p
tu Q Q Q ft
QQQQQfti íOôQ^QQi^
Hình 6.9 Kiểu tác dụng của enzym endo-polygaỉacturonase
từ (A) Aspergillus nỉger, (B) cà chua, và (C) Erwinia carotovora
c- Pectate lyase
Pectate lyase (PEL) là các enzym v sv ngoại bào. Các enzym của
giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng
soft-rod ở thực vật. Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở
Aeromonas, Pseudomonas, XanthomonaSj Aspergillus và Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzym pectate lyase ỗ dạng
is o e n z y m có th ể được p h â n th à n h các n h ó m trê n c ơ BÒ đ iể m đẩag
điện của chúng: acid (pH 4-5), trung hòa (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10).
SỐ lượng các isoenzym trong mỗi nhóm có thể thay đổi tùy theo loài.
Đa sô" các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzym:
một acid (PELA), hai trung hòa (PELA và c), hai kiềm (PELD và E).
Tất cả các isoenzym này đều cần Ca** để làm tàng độ hoạt động và có
pH tấi ưu 8-10. Các nghiên cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tấ t cả
bốn isoenzym trôn đều là endo-enzym (PELA (pl 4,2), PELA (pl 8,8),
PELC (pl 9,0), và PELD (pl 10,0)). Cấc PEL kiềm r í t đặc hiệu trong
việc gây ra §ự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo là các
isoenzym trung hòa, trái lại các PEL acid khòng gây ảnh hudng gì.
ở các chủng Erwinia carotovora, có ít nhất ba PEL được tiết ra,

tất cả đều có điểm đẳng điện ở pH kiềm: PEU (pl 9,7), PELII (pl 10,2),
và PELIII (pl 10,35). Cả ba isoenzym này đều có pH tối ưu là 9,0.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PEưi và PELHI là 50 và 60°c, theo
thứ tự. PELI có độ bền nhỉệt thấp. Ở chủng GIR726, có bốn loại endo-
PEL isoenzym với các điểm đẳng điện ở các pH rấ t kiềm (10,0, 10,6,
10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD.
pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII, 9,5 cho PELIV và 9,7 cho
PEL I và III. Cũng như với các PEL từ các nguồn khác, những
isoenzym này dược kích hoạt bởi Ca**. Hoạt độ enzym tàng 50-70%
khi có mặt của Ca** ở nồng độ 0,5mM. Isoenzym với pl > 10 chứa 2,5-4,8%
đường trung tính. Các PEL từ một số ỉoài Bacillus cũng có khả nãng
gây ra sự giầm nước ỏ mô thực vệt.
4- Các độc tính kỹ thuật quan trọng eảa enzym pectinase
Or Pectinesterase
Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với
nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn,
tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hóa rất mẫn cảm với
calcium. Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như
các monomer acetyl hóa, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amỉde hay
bị khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại củạ các vùng có nhỉều -mạch
nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm
methylester của polygalacturonic acid. Cấc ester khác chỉ bị tấn công
rất chậm, còn các nhóm methỹỉester của polymanuronic acid thì không
hề bị tấn công. Tốc độ đề ester hóa trên mạch pectin phụ thuộc vào độ
dài của mạch; trỉmethỹl trìgaỉacturonate không bị tấn công. Các PE của
nấm khác với PE cửa thực vật theo cơ chế da mạch, các nhóm methoxyl
bị lấy đi một cách ngẫu nhiên.
6- Polygalacturonase
Việc xác đỉnh hoạt tính cửa enzym này bằng cách đo độ nhớt
của dung dịch pectic acỉd gồm methylester và glycoỉester cho thấy sự
gỉảm nhanh tốc độ và mức độ thủy phân, đồng thởi tảng mức độ
ester hóa. Các nhóm acetyl có m ặt làm giảm mức độ thủy phân bằng
cách giảm áỉ lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm
368 Chương 6
liên kết. Sự thủy phân bị hạn chế do sự có m ặt của các nhóm acetyl
có thể được xác minh bằng cách sử dựng pectin cỏ cải đường làm cơ
chất. PG tạo bởi nấm có thể phân hủy đến 70% pectin bị acetyl hóa.
Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các nguồn
khác nhau thì khác nhau.
Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của enđo-pectin-lyase ở pH > 7
là pectin hoàn toàn bị ester hóa. Tuy nhiên ở các ‘giá t ộ pH nhỏ hơn,
enzym này vẫn hoạt động đối với pectin bị ester hóa ít hơn, đồng thời
cần Ca++ để kích hoạt. Điều này có ý nghĩa thực sự đối với các quá
trình chế biến trái cây. Những enzym này cần các nhóm methylester
để hoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có m ặt các nhóm gỉycol
ester và các pectate bị amidate hóa.
c- Endo-pectcUe lyates
Trái lại, endo-pectate-lyase không phân biệt methylester và
glycolester của pectic acid. Điều thú vi là pectate không phải là cơ
chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vi khuẩn. Chúng có hoạt độ cực đại
(tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) lên pectin có hàm lượng
methoxyl thấp.
d- Rhamno-galacturonase
Gần đây, rhamno-galacturonase là enzym được phát hiện có khả
năng phân cắt liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều
của phân tử galacturonic rhamnose acid có trong pectin của táo với
hoạt tính rế t cao khi những phân tử này bị đề ester hóa và arabinose
bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều bị sửa
chữa). Enzym này có mặt trong các chế phẩm thương mại của
pectinase và chắc chắn phải được phân loại là pectinase. Sản phẩm
cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose và galacturonic acid,
trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử.
e- Pectinase thương mại
Enzym thương mại là các chê phẩm enzym của nấm mốc, được điều
chế chủ yếu từ các loài Aspergillus. Chúng thường là hỗn hợp của các PE,
PG và PL, hemicellulase và, endo-p-glucanase (C-x-cellulase). Hoạt tính
của ba chế phẩm thương mại khác nhau được trình bày ở bảng 6.13. Các
enzym đều được thu nhận từ nấm mốc dược sử dụng để sản xuất chế
phẩm pectinase, trừ enzym C-l-cellulase (cellobiohydrolase) là được thêm

vào để chế phẩm đạt được mục đích kỹ thuật. Enzym arabinanase
đóng vai trò rấ t quan trọng trong quá trình chế biến nước ép trái cây.
Bảng 6 .1 3 H oạt tín h riên g cửa các p h ứ c hợp đ a enzym
tro n g các c h ế p h ẩ m pectinase được sả n xu ấ t từ n ấ m
Ho«t lỉnh enzym Cơ chất A B c
PG Polygalacturonic acid 1982 3314 1878

PL Pectin DE 90 43 53 74
PE Pectin DE 65 548 448 227
Combined pectolytic Pectin DE 75 198 290 274
1
C-a-cellulase CMC 998 180 1228
C-l-cellulase A vicel 99 1 22
Arábanase: linear arabỉnan 1-5-a-L-arabinan 9 10 16
Arabanase: branched arablnan 1,3; 1,2; 1,5-a-L-arabinan 14 « 16
a-L-Arabinofuranosidase PNP-Arabỉnofuranoside 35 37 333
Gaỉactomannanase Galactomannan 3 4 9
Mannanase 1,4-p-D-Mannan 7 0 0
Galactanase 1,4-p-D-Galactan 11 58 91
Xylanase 1,4-p-D-Xylan 4 0 2
Có một điều chắc chắn ỉà kỹ thuật gen sẽ được sử dụng nhằm

mục đích sản xuất cổc chế phẩm enzym, mở ra những khả năng mớỉ
cho các ứng dụng công nghiệp của các chế phẩm enzym này.
5- Thu nhẠn
Hiện nay, người ta thư nhận pectỉnase chủ yếu từ vsv. Có haỉ
phương pháp sản xuất pectinase:
Or Thu nhộn chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt
Môi truờng sử dụng để nuôi cấy vsv để thu nhận pectinase
thường ỉà cám gạo, hay cám mì, bã cử cải hoặc thóc mầm. Nguồn dinh
dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphoric... Độ ẩm
môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm mốc A. aioamori thường
được nuối cấy à 30°c trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 24°c và
nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau lên men được sấy khô thành chế
phẩm enzym thô và đem tỉnh chế.
370 Chương 6
Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym
thồ phải dược trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ
hay muôi ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa
enzym pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol
(55-57%). Muôi ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa 0,79. Khi kết
tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu được có độ tinh khiết
khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%.
Nhiệt dộ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-5°C, thời gian tiếp xúc với
rượu càng ngắn càng tết. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung
dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi
nghiền nhỏ và đem bảo quản.
b- Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sáu
Phương pháp hiếu khi: Sự tích tụ enzym trong môi trường được
bắt đầu khi sự phát triển của vsv gần đạt đến pha ổn định, khi môi
trường bị acid hóa mạnh và kljfci lượng phospho vô cơ được sử dụng
hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường dạt từ 6-7,2 là thích
hợp. Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự
tích lũy enzym pectinase. pH 5= 4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym
pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong
khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng
sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các
trường nuôi cấy A. ĩiiger và A. awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và
2,9-3,2, theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm
lượng từ 2-Ị0%. Đối với A. niger và A awamori, vật liệu gieo cấy là sợi
nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt
nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h. Lượng sợi nấm đem
gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất
hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1 ,5- 1 ,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách s ợ i nâm ra khỏi canh trường
lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chết
khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị 8ấy phun. Điều kiện sấy phun
là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt
60-70°c. Thời gian luu của chế phẩm enzym trong thiết bị sấy phun
phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không
quá 40°c. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để trán h
hút ẩm. Có thể thu chế phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa
enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1, với
aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối
ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol,
hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% 80 với hoạt độ
của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium
sulfate, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích
(với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khỉ độ bão hòa của
(NH4)2SC>4 bằng 0,5 thi sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectỉnase thấp
(đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưtig nếu kết tủa bằng
(NH4)2S0 4 cố độ bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11%
nhưng lại có hoạt độ pectỉnase cao.
Phương pháp yếm khi
Môi trường: Bã củ cải: 2%; (NH4)2HP 0 4: 0,75%
KH2P 0 4:0,1%; CaC03: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%
Clostridium pectinofermentants 15 cổ khả năng tổng hợp
pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh
trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym sẽ *
tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban
đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu
được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào Sjf và được cấy với lượng 4%
theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35°c.
C l felsineum cũng cồ thể được nuôi cấy yếm khí để thu
pectinase. Thành phần môi trường gồm có: Lactose: 2%; pectin củ cải:
1%; (NH4)2HP 0 4: 0,4%; K2HP04: 0,7%; KH2P 0 4: 0,3%; NaCl: 0,1%;
MgS04: 0,025%; FeS04: dạng vết; CaC03: 0,5%; dịch nấm meĩi tự
phân: 0,05%; ascorbic add: 0,5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng
cách kết tỏa enzym vđi dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium
sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý
là 6,5-6,8- Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích ạceton thì hoạt độ cửa
enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
372 Chương 6
Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ
thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khỉ độ
bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase
và exopolygalacturonase.
Phương pháp hiệiỊ đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase
thường theo các bước cơ bản sau đây:
- Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)
- Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel
A), hay trao đổỉ cation (CM Bỉogel A)
- Tách enzym pectinase bằng alginate l i ê n kết ngang
- Tinh sạch bằng FPLC.
Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh
hưởng tĩnh điện và thay th ế pectate liên kết ngang.
c- Ý nghĩa vê mặt kỹ thuật của các endo-enzym
Pectinesterase: Ethanol có m ặt trong phần chưng cất được từ
th ịt quả lên men là do pectin methylester bị phân cắt bởi endo-
enzym PE. Trong suốt quá trình lên men, ethanol được sinh ra và
các đơn vị sản xuất cần phải thanh trùng th ịt quả trước khi lên men
để nồng độ ethanol cổ m ặt trongỉ sản phẩm không vượt quá giới hạn
cho phép. Sự có m ặt của PE trong trái cây họ citrus là nguyên nhân
gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghiệp thực phẩm,
tức là sự m ất đi của các vết vẩn đục trong dịch ép. Nếu PE không bị
ức chế trực tiếp sau khi tách chiết dịch quả bằng cách bất hoạt bởi
nhiệt hay làm đông, các phân tử pectin sẽ bị đề ester hóa và sẽ bị
đông tụ bởi sự có m ặt của các ion Ca** trong dịch ép. Để ngăn chặn
điều này, nước ép dược tách thành phần cặn và phần trong. Nếu
nước ép quá đặc, gel pectate sẽ được hình thành và do đó nước ép sẽ
không được hoàn nguyên lại nữa. Những vấn đề này làm giảm chất
lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của
nước ép trá i cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm vội nhiệt, vì th ế các
phương pháp sản xuất sản phẩm trái cây đông lạnh đang rấ t cẨn
th iết. Phức hợp của ỉon Ca** cố thể ngăn ngừa sự biến m ất của các
đám m ây vẩn đục do hoạt động cửa PE, nhưng lại làm phát sinh các
vấn đề mang tín h chất pháp ỉý. Polyphenol cổ thế ức chế hoạt động
của PE nhưng lại gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan, chẳng hạn
về vị và tính đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức
chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm pectic acid vào lại ỉàm nước ép
bị phân lớp, th ế là lại tạo ra một vấn đề không mong muôn khác.
Tuy nhiên, việc phân hủy pectic acid, đến mức polymer hóa 8-10, có
ảnh hưởng ức chế của các chế phẩm polymer cao phân tử nhưng lại
không đông tụ với Ca++. Việc thêm các chế phẩm như th ế sẽ không
ngăn ngừa được nhưng sẽ trì hoân được quá trình tự phân lớp, có lẽ
đủ lâu để phân phối nhanh các loại nước ép trái cây tươi được làm
tan giá. Một khả năng khác là việc thêm các exo-enzym (H.6.10): PG
làm phân hủy pectin có mức ester thấp hình thành trước khi sự
đông tụ với Ca++ xảy ra, hay PL phân hủy các pectin trong nưđc ép
trái cây đến các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các
hợp chất không mẫn cảm với Ca++, dù là đề ester hóa và thực tế
cũng có thể thực hiện chức năng ức chế PE. Hoạt động phân hủy
pectin bởi enzym như th ế đã được ứng dụng trọng việc làm giảm dộ
nhớt của nước trái cây, vì th ế làm tăng nồng độ các thành phần
chất chiết đến các giá trị Brix cao hơn như bình thường có thể. Cũng
cần phải lưu ý việc sử dụng các giai đoạn bay hơi nhiều lần nhằm tối
ưu hóa quá trinh xử lý nhiệt và khôi phục hương vị sản phẩm, kết
hợp với việc bảo quản trong điều kiện đông lạnh và vận chuyển sản
phẩm nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác
động của nhiệt độ. Tuy nhiên, đối vđi các nước đang phát triển, vẫn
đang tồn tại vấn đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trá i cây
họ citrus và các loại nước ép vắn đục khác có hoạt lực PE cao và các
chất tạo hương rấ t mẫn câm với nhiệt, chẳng hạn như ổi và xoài.
PL
Pectin hòa tan Các ester olỉgogalacturonic aid
PE
PG
Các olígogalacturonic aid tan
Các pectate khổng tan
Hình 6,10 Ngăn ngừa sự đông tụ của Ca**

với pectin bị đề ester hóa bởi PE trong serum cam
374 Chương 6
Các PE từ được phân lập từ cam có hình thức khác nhau và có ái

lực khác nhau đối với pectin và pectate. Mặt khác, chúng cũng khác
nhau về độ bền nhiệt, và cũng dễ hiểu rằng chúng đóng vai trò khác
nhau trong hiện tượng làm trong dịch quả ép. Một loại được phân biệt
bởi khối lượng phân tử của nó rất cao, chỉ chiếm khoảng 5% hoạt tính
toàn phần và mang một sô" đặc điểm nổi bật. Loại này bền nhiệt và vì
th ế đóng vai trò chínỊi yếu trong việc làm trong dịch quả ép đã thanh
trùng với lượng nhiệt không du. Enzym này cũng hoạt động ở nhiệt
độ thấp và pH thấp và do đó được coi là có vai trò quan trọng trong
quá trình tự tách lớp của nước chanh trong và nước ép từ quả chanh
thu được bằng cách để lắng nước ép trong tank có chất bảo quản là
sulfur dioxide. Những dịch trong từ quả ép như thế vẫn đang là những
sản phẩm có giá trị thương mại được sản xuất với việc ứng dụng các
chế phẩm pectinase thương mại.
Trong số hai isoenzym trong bảng 6.13, chỉ có isoenym PE loại I
có khả năng làm tách lớp. PE loại II không có khả năng này; lượng
methanol tự do được thoát ra ít hơn so với methanol tạo bởi các
enzym tách lớp. Bảng 6 cho thấy khả năng ức chế rất cao của pectate
có lẽ đã ức chế sự hoạt động của enzym ở một mức nhất định trong
quá trình ester hóa. Ảnh hưởng này được tăng lên bởi sự đóng góp của
các nhóm acid tạo thành. Hình 6.11 cho thấy, nếu thêm PG vào thì
khồi pectate lại bi phân hủy tiếp và trên thực tế tốc độ phản ứng mà
tại đó methanol tự do hình thành trong nước cam ép có PE hoạt động
được tăng lên bởi PG. Các sự khác nhau về mặt động học như thế
cũng có thể giải thích tính ức chế không hoàn toàn bởi
oligogalacturonate. Một loại PE khác trong nước cam ép không gây ra
sự tự phân lớp, thậm chí ngay cả sau khi giải phóng một lượng
methanol bằng với lượng methanol mà PE phóng thích. Các kiểu tấn
công của enzym phải được giả định sao đó để pectin với hàm lượng
ester thấp được sinh ra mà có tính mẫn cảm với Ca++ giảm đi, có lẽ
bời sự phân bố ngẫu nhiên của các nhóm carboxyl tự do. Cơ chế này
thường thấy ở các PE của nấm, chẳng hạn như ở A. japonicus, enzym
này được sử dụng để sản xuất pectin có mức ester hóa thấp đùng
trong chế biến mứt ít đường. Những pectin như vậy thường được sản
xuất nhờ quá trình thủy phân nhờ acid. Pectỉnesterase của nấm cũng
được sử dụng để tách lớp rượu táo Pháp. Hai isoenzym với đặc tính
làm tách ỉớp nước cam này được tìm thấy trong tấ t cả các thành phần
của quả cam. Có đến 12 loại PE được tìm thấy trong quả cam trồng và
các loại quả họ citrus khác và chúng được tách trên cơ sở áỉ lực của
chúng đối với pectate. Điều cần luu ý ỉà hoạt dộng của các PE bị ức
chế bởi nồng độ cao của đường để tạo nước ép cô đặc đến 60°Bx, tại đó
các enzym này không hoạt động nhimg lại có thể hoạt động sau khỉ
hoàn nguyên (pha loãng trong nước).
Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bị đẻ ẹster hóa bởi PẼ
được khai thác khi sấy khô Arỏ trái cây họ citrus sauTchi ép làm thức
ăn cho gia súc. Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ
trong khi nghỉền để đưa pH về giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao,
và nồng độ ion Ca++cao, làm kích hoạt- PE, quá trình dề ester hóa xảy ,
ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcúim xảy rar Chất lỏng được
tiết ra và được ép, để chỉ có một phần ít gubc còn lại cần được loại bỏ
nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nước ép có thành phần tương tự
như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được làm thức ăn cho
gia súc. Dĩ nhiên, vỏ trái cây họ citrus khô được sử dụng làm nguyên
liệu thô để trích chiết pectin, do đó cần phải ngăn chộn hoạt tính của
PE bằng cách tẩy trắng vỏ ngay lập tức, nếu không, pectin được chiết
ra, cho dù bị đề ester hóa ít thôi, sẽ chứa các khối galacturonic acid tự
do và sẽ rấ t mẫn cảm với Ca** và vì vậy không sử dụng được dể làm
yếu tố tạo đông.
Endo-PE cũng được khai thác âp bảo vệ và cải tạo kết cấu và dộ
chắc của nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng
hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tâ y ^ à đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ
thấp, thờỉ gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hóa một
phần, sau đó pectin bị đề ester hóa này phản ứng với Ca**, tạo nên sự
kết dính nội bào mạnh hơn.
376 Chtfcfag 6
Mức độ ester hóa (%) Mức độ ester hóa (%)
Hình 6.11 Kích th ích pectinesterase bằng PG (------) và bằng PL (----- )
Sự kích thích mạnh hơn đếỉ với PG và m ạnh hơn trong thí
nghiệm b, troiĩg đó enzym, esterase bị ức chế mạnh hơn bái sản phẩm
cuối so với trong thí nghiệm a. Rõ ràng PL (-—) không phân hủy đuợc
các vùng ức chế đề ester hóa nên không có ảnh hưởng gì.
Pectỉnesterase và polygalacturonase
Hai enzym này có m ặt cùng nhau rấ t nhiều trong cà chua, có
ảnh hướng r ấ t lớn trong quá trình chế biến cà chua. Việc gây bất
hoạt các enzym này bởi nhiệt ngay lập tức là cần th iế t để có được
nước ép có độ nhớt cao như ngưởi tiêu dùng mong muốn hay nước ép
dạng paste, sử dụng làm nước chấm, soup, nước sất cà chua nấm và
một số sản phẩm tương tự. Những loại nuđc quả này được xử lý
n hiệt trong một th iết bị đặc biệt mà trong đó cà chua được nghiền
trực tiếp th àn h cà chua nóng dạng nhão. Rõ ràng, quá trình xử lý
nhiệt tạo ra một số các hương vị đặc trưtig cho các sản phẩm cà chua
chế biến. Trong trường hợp các thành phần cà chua được sử dụng để
tạo màu và hương vị, còn phần chính của sản phẩm là do các thành
phần khác, như tinh bột tạo nên thì nguyên liệu nước ép phải ỏ
trạn g thái nguội hơn, đồng thời phẳỉ cố một thởi gian nghỉ giữa hai
giai đoạn nghiền ép và xử lý nhiệt để pectin cổ thể bị phân huy
nhiều hơn nhờ tác động kết hợp của PG và PE. Còn trong những trái
cà chua được cải tạo gen để giảm hàm lượng PG, phần rắn và độ
chắc cũng như độ nhớt của quả được táng lên.
Hoạt tính pectinase từ nguồn vsv gây nhiễm

PG từ n ấ m m en v à PAL từ vi k h u ẩ n cùng với các endo-PE đều
có liên quan đến quá trình làm chín dưa chuột và ô liu ngâm trong
nước muôi. Sự hao hụt về chất lượng này có thê tránh được bằng
cách sử dụng các chât ức chế, chẳng hạn như các polyphenol rò ri ra
từ lá nho vào trong nước muôi. Nước muôi có thể được sử dụng để
thanh trùng nấm mốc bền nhiệt Byssochỉamys fulva. Nấm mốc này
sinh enzym làm hỏng dâu tây trong xi rô (syrup) hay mứt. Một loại
PG bền nhiệt có từ loài Rhizobium có thể làm hỏng kết câu của thịt
quả mơ đóng hộp. Sự nhiễm nấm có thể gây ra hiện tượng tách lớp
của nước cam vô khuẩn và đã đóng chai, không rõ là do tác động của
PE, PG h a y cả h ai, nh ư n g m ộ t lượng lớn m eth an o l tự do được tìm
th ấ y tro n g lo ạ i nước quả p h â n lớp này. PG n ấ m m en có th ể .phân
hủy pectin trong quá trình lên men bột táo nghiền, là m cho bã táo
bị mất đi một lượng lớn pectin nếu được đem làm nguyên liệu thô để
sản xuất pectin.
Lên men cà phê và cacao là m ột lĩnh vực ứng dụng nhiều triển
vọng của enzym pectinase có từ nguồn vsv. Trong quá trình lên men,
lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị
rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô. Một ứng dụng khác là sự tạo
hương đặc biệt cho sản phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm
trao đồi chất của nấm mốc nhiễm vào trái nho chín có hàm lượng
dường cao bằng cách đâm thủng vỏ trái nho và để nước trong nho bay
hơi, và để nho bị nhiễm nấm.
6.4.4 Thu nhận enzym cellulase từ vsv

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật và chúng được thực
vật tổng hợp với số lượng nhiều nhất trong tự nhiên. Cellulose cũng là
một trong những chất hữu cơ có trong tự nhiên chỉ bị v sv phân giải.
Thực hiện quá trình phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên là
các loại enzym cellulase.
378 Chươhg 6
2- vsv sinh tổng hợp cellulose

Trong âiều kỉện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bôi v s v cá trong
điều kiện hiếu khí và cả trong điều kiện yếm khí. Các loài v sv thay
phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Tuy
nhiên, trong thiên nhiên không có một v sv nào có khả năng cùng
một lúc sinh tổng hợp tấ t cả các loại enzym cổ trong phức hệ enzym
cellulase. Có ỉoàỉ này có khả nảng sinh tổng hợp mạnh loại enzym
*Jlày, loài khác lại tổng hợp mạnh loại enzym khác. Chính vì thế, sự
phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và
thưởng không triệt để.
Số lượng các loài vsv tham gia sinh tổng hợp enzym có trong
điều kiện tự nhiên rấ t phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vỉ
khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm
men cũng tham gia quá trình phân giải này. Trong đó, những v sv sau
được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất:
Aỉtenaria tenuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus syđovỉi, Aspergillus
terrus, Celỉuvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Furarium oxysporum,
Fusarium solani, Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum,
Trichoderma roseum, Trichoderma reesei, Actinomyces spp.
Penicillium spp.
Enzym cellulase là một trong những enzym cố vai trò rấ t quan
trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên
nhiên và cố ý nghĩa rấ t lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi
trường. Enzym này cũng là enzym được nghiên cứu và ứng dụng chậm
hơn rấ t nhiều so với enzym amylase và protease.
Bảng 6,14 v s v phân hủy ỉignocellulose
Nấm sợi x« khuẩn Vi khuẩn
Aspergillus nige'1* Actinomyces cellulose Preudomonas

A. oryzae A ct diastaticus fluorescens
A.terreus Acf. roseus Bac. Megaterium
A. syndovii Act. griseus Bac. mensenteroides
A. flarus Act. melamocylas Clostridium sp.
.Pen. notatum Act: coelicolor Ảcetobacter xyỉinum
Cephalosporium A ct sulfureus Vi khuẩn dạ cỗ
Mucor pusilus A ct aureus Ruminoccus albus
Neurospora A ct verne Ruminobacter parum
Trichoderma resoii Act. glaucus Bacteroides
Trichoderma viride Act. candidus Am ytophillus sp.
Trichoderma lignomm A ct chromogenes CỈOS. butyricum
Trichoderma hazianum Act. hygroscopicus CỈOS, locheheadii
Basii diomycetes Act. griseofulvm. Ceflulosemonas
Rhizopus species Act. ochroleucus
Fusarium culmorum Act. thermofuscus
Chrysosporium A ct xanữtosừmus
ligaorum A ct fiarochromogenes
Act. sampsonii
Thermonospora curvata
2- Tinh chất và cơ chế hơạt động của cellulose

a» Phán loại enzym
Enzym tham gia phân hủy cellulose được các nhà khoa học phân
ra làm ba nhóm chủ yếu sau đây:
1,4 ậ-D-gỉucan cellobiohydroỉase (EC.3.2.1.91). Enzym cắt đầu
không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn
có một loạt các tên khác nht£ cellobiohydrolase, exoglucanase,
exocellulase, cellobiosidase và avicellase.
Enzym này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tỉnh
mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa ỉý của chúng, giúp cho enzym
endocellulase phân giải chúng.
380 Chương 6
1,4 p-D-glucan 4 glucanohydroỉase (EC.3.2.1.4). Enzym này tham

gia phân giải liên kết P-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và
p-Dglucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin,
cellobiose, và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô
định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.
Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo
1,4 p-glucanase, C-celluỉase.
P-D glucoside glucohydrolase (EC. 3.2.1.21X Enzym này tham gia
phân hủy cellobiose, tạo thành glucose. Chúng khống có khả năng
phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng
còn có tên là cellobiase và p-glucosidase.
6- Tính chất của enzym cellulose
Cellobiohydrolase. Enzym này được tổng hợp bởi Trìchoderma
reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm
hai loại: Cbh I và Cbh II.
Cbh I chiếm đến 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy
Trichoderma reesei. Chúng cổ trọng lượng phân tử khoảng 65KD,
điểm đẳng điện là 4,4 (PI = 4,4). Loại enzym này tác động cả lên
cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng chúng lại không
tác động đến cellulose biến tính như CMC hay hydroxyethylcellulose,
cellohexaose P-nitrophenyỊ, p-glucoside hay P-glưcan.
Cbh II cổ trọng lượng phân tử là 53KD} PI = 5,0. Chúng cũng
không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose
hòa tan và cả cellulose không hòa tan. Cbh I chứa khoảng 496 amino
acid, Cbh II chứa khoảng 471 amino acid.
Ceỉỉobỉohydrolase của Ceỉỉulomonas fimi có một số tính chất
khác với cellobiohydroỉase của Tĩichoderma reesei. Cellobrohydrolase
của ceỉỉulomonas fĩmi cổ chứa 443 amino acid. Enzym này có ba cẳu
nôi disulfide. Hai cầu nôi disulfide nằm trong trung tồm hoạt động)
còn một cầu nối nằm ngỡài trung tâm hoạt động.
Cellobiohydrolase của Clostridium thermocelỉum cổ trọng lượng
phân tử từ 68 đến 75KD.
Endoglucanase. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy

Trichoderma reeseL Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại Egl I
và Egl II. Egl I chứa 459 amino acid, trọng lượng phân tử 48,212KD.
Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử là 42,2KD. Các
enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Ngoài ra
endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium thermocelỉum,
Celỉuỉomonas fim i và các v sv khác. Các enđogỉucanase của các v sv
thường có tính chất không khác biệt nhiều.
p-glucosidase. p-glucosidase là nhóm enzym khá phức tạp, chúng
có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4-8,4), trọng lượng phân
tử 50-98KD; PI 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
(3-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amỉno acỉd
với trọng lượng phân tử là 75,341KD. Trong dịch chiết, chúng chiếm
khoảng 1 % so với tổng lượng protein thu được.
p-glucosidase của Clostridium thermocellum dược chia ra làm hai
loại bgl A và bgl B. Loại bgl A chứa khoảng 448 amino acid và có
trọng lượng phân tử là 51,482KD. Chúng hoạt dộng mạnh ở pH 6,0-
6,5 và ở nhiệt độ 60°c. Chúng tham gia thủy phân cellobỉose nhưng
không thủy phân CMC.
c- Cơ chất cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, ngưởi ta
còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số Ịoài vsv. Ở tế bào thực vật
và ở tế bào một số loài v s v , chúng tồn tại à dạng sợi.
Cellulose không có trong tế bào dộng vật. Chúng là một
homopolỉmer mạch thẳng, dược cấu tạo bởi các p-D glucose-pyranose
Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết
các glucose này với nhau bằng liên kết á-1,4 glucoside. Tinh bột
cũng được câu tạo bởi các glucose này bằng liên kết a-1,4 glucoside.
Tỉnh chứa các gốc glucose phân nhánh. Cellulose chứa các
glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường
lệch một góc 180° và cổ dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose
thưởng chứa 10.000-14.000 gốc đưởng và được cấu tạo như hình 6.12.
382 Chương 6
H ình 6.12 Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian
(trong ngoặc là một đơn vị của cellobpose)
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000-2.500.000

Dalton. Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der
war và liên kết hydro.
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp cổ đường kính khoảng
3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin).
Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất. Chúng
thường tồn tại hai vùng:
Vùng kết tinh. Ở vùng kết tinh, cellulose cổ cấu trúc trậ t tự rất
cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài. Enzym
cellulase chỉ có tác dụng bề m ặt hệ sợi ồ vùng này.
Vùng vô định hình. Ở vùng này, cellulose có cấu trúc không chặt
và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị
trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn
bộ cấu trúc của chúng.
H ình 6.13 Vàng kết tinh và vừng vô định hình của cellulose
Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vồ định hình thường lớn
gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các
cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây
thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình.
Trong thiên nhiên, khi thực vật và vsv có chứa cellulose bị chết,
cellulose của chúng ch! bị phân hủy bởi cả một tập đoàn vsv. Các loài
v s v sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các
thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển
hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên.
Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rấ t lớn. Số
lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực
vật. Người ta cho thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất
ở thân cây, dặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm tới 80-95%.
Bảng 6.15 Thành phần cellulose, hemwellulose và lignin trong một số thực vật
stt Thực vật Cellulose Hemlcellulose Llgnln
1 Cây hạt kỉn (gỗ cứng) 4 0 -5 5 24 - 40 1 8 -2 5
2 Cây hạt trán (gỗ mềm) 4 5 -5 0 2 5 -3 5 2 5 -3 5
3 Cây một lá mẩm 2 5 -4 0 2 5 -3 0
00 1 0 -3 0
00
cn
4 Tế bầo nhu mổ của lá 1 5 -2 0 1 0
0
5 SỢỈ bông ■ 8 - 95 5 -2 0 0
Ở vsv, cấu trúc của cellulose

không bền và không theo một trậ t tự
như ồ thực vật. Ở đổ, cellulose thường
thuộc ỉoại cellulose vô định hình.
Chính vì th ế việc phân hủy chúng
thường rất dễ thực hiện.
d- Cơ chế tác dụng của cellulose
Trong thiên nhiên, thủy phân
cellulose có sự tham gia của tất cả ba
loại enzym cellulase như endoglucanase,
exoglucanase và p-glucosidase. Một
trong ba loại enzym trên không thể tự
thủy phân đến cùng phân tử cellulose.
Mỗi một loại enzym chỉ tham gia thủy
phân một phần nào đó trong cellulose.
Trong thiên nhiên cũng tồn tại
những loài vsv chỉ cổ khả năng sinh
tổng hợp một loại enzym trong hệ
enzym cellulase. Hoạt tính enzym này H ình 6-14 Cấu tạo cellulose
thường mạnh hơn các lôại enzym còn cứa m$t sô ỉoài sinh vật
lại. Chính vì thế, trong điều kiện tự nhiên, một loài v sv không thể
tham gia thủy phân triệt để cellulose được.
384 ChiỆỊng 6
Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym đến nghiên cứu
tác đống tổng hợp của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều
đưa ra kết ỉuận chung ỉà các loại enzym celỉulase sẽ thay phiên nhau
phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có
nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của
ceỉỉulase do Erikson dưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.
Vùng kết tỉnh Vùng vô định hình
\
1
Hình 6.15 Cơ chế tác động của enzym cellulose theo Erikson
Các loài v s v có khả năng sinh tổng hợp ceỉlulase trong điều
kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều m ặt của các
yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rấ t mạnh, cổ loài lại phát
triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được
tiến hành không đổng bộ, xảy ra rất chậm.
Ta £Ó thể mỉnh họa tóm tắ t toàn bộ quá trình thủy phân
cellulose như hình 6.16.
Cellulose
ktfttinh
Enzym cellulase c,
Endoglucanase
Cellulose
Oligomer
vò định hỉnh
I— j = j j ĩ ............. ,
I Các
Cá( oiigomer chuỗi ngẮn
Exocellulase ì
CettobiOM
Glucose
Hình 6.16 Cơ chế chuýển hổa cellulose

H ình 6*17 Mô hình tác động của exoceỉỉuỉase lên cellulose

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp,
việc phân hủy cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như
nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzym..., một yếu tô' hết sức quan
trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzym
cellulase từ nhiều nguồn v s v khác nhau. Quá trình thủy phần
cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử
dụng đồng bộ ba loại enzym celỉulase trong hệ enzym cellulase. Mỗi
loài v sv chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loại enzym. Chính
vì thế ta phải khai thác euzym cellulase từ nhiều nguồn vsv.
3- Phương pháp thu nhận enzym cellulose
v sv có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm
sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất enzym
cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn,
còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất.
Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta
thường nuôi cấy theo phương pháp bề m ặt'bằng môi trường xôp (còn
gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển
rất tốt trong môi trường xốp có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất là
cellulose. Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất
đa dạng, trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là
cellulose và phải có độ xốp nhất định dể không khí có thể lưu thông
từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường. Cả hai nhóm xạ
khuẩn và nấm sợi đều là những vsv hiếu khí nên trong quá trình
nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy.
Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là
xạ khuẩn phát triển mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid
yếu, còn nấm sợi phát triển ồ môi trường acid. Do đó, khi chế tạo môi
trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ khuân từ 6 ,2-7,6 ,
còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5.
386 Chương 6
Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzým cellulase của xạ
khuẩn và nấm sợi cũng khác nhau. Xạ khuẩn thường có thời gian
phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường,
nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đă cho hoạt tính enzym
cellulase rất cao. Trong khi đổ, xạ khuẩn phải m ất ít nhất là 72 giờ
mới tổng hợp cellulase nhiều.
Điểm khác cuếi cùng là khả năng chịu nhỉệt của cả haỉ nhóm
v s v này, các loài xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm
sợi. Enzym cellulase của xạ khuẩn cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn
enzym cellulase của nấm sợi.
Sau khi nuôi cấy trong những diều kiện kỹ thuật tối ưạ, người ta
thụ được chế phẩm ceỉlulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước,
sinh khối v sv , thành phần môi trường và enzym.
Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa, lý tách
nước, sinh khối v sv sẽ thu dược enzym dạng bán tinh khiết. Enzym
bán tinh khiết còn chứa nước, protein không hoạt dộng và enzym.
Bằng những phương pháp hóa lý đã trình bày ở chương 2, ta sẽ loại
được nước, protein không hoạt động. Khi đó ta thu được chế phẩm
enzym tinh khiết.
Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công
nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc
biệt các chế phẩm ceỉỉulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô
nhiễm môi trường.
Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ
thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta
thường dùng chế phẩm enzym cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế
bào thực vật. ứ n g dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực vật không
làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn
các nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay
th ế các phương pháp cơ học và hóa học.
4- Một 8ố ỉoọi enzym được vsvtổng hợp đấng thời với cellulose
a- Hemicellulase
Cùng với quá trình sinh tổng hợp cellulase, một số v sv có khả
năng sinh tổng hợp hemiceliulase. Hemicellulase là enzym thủy phân
hemicellulose với cơ chế gần giống ceỉlulase.
Ở thực vật hemicelluỉose chiếm một số lượng rấ t lớn.
Hemicellulose được cấu tạo từ các loại đường khác nhau. Vì th ế tên gọi
của chúng thường theo tên một loại đường nào đổ chiếm tỷ lượng lớn
trong thành phần của hemỉcelỉulose.
Phân tử lượng của hemicellulose nhỏ hơn phân tử lượng của

cellulose rất nhiều. Hemỉcelỉuỉose thường được cấu tạo từ 150 gôc
đường. Các gốc đường này được nối với nhau bằng các liên kết p-1,4;
p-1,3; (3-1,6 glucoside. Chúng thường là những mạch ngắn, phân
nhánh. Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng dễ dàng bị phân
giải bdỉ acid loãng hoặc kiềm. Khi hemicellulose bị phân hủy, chúng
tạo thành các mono saccharide.
Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan
thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng
(chiếm khoảng 20-25%). Ở những cây lá kim thường chưa ít xylan.
Trong tế bào thực vật, xylan thường nằm xen kẽ giữa các bó sợi
cellulose tạo nên một dạng cấu trúc bền vững. 7
Các hemicellulase là enzym phân giải cellulose thường được vsv
tổng hợp với số lượng khá lớn. Các cấu trúc của chúng cũng đơn giản
hơn và kém bền vững hơn enzym cellulase.
Trong khi nuôi cấy vsv theo quy mô công nghiệp, enzym
hemicellulase thường được vsv sinh tổng hợp sớm hơn enzym
ceỉlulase. Quá trình tổng hợp này có liên quan đến cơ chất mà chúng
tham gia phân hủy. So với cellulose, hemicellulose kém bền hơn, do đó
chúng bị phân hủy trước cellulose.
6- Lignase
Nhiều nhà khoa học cho thấy rằng, có nhiều enzym tham gia
quá trình oxy hóa đều có khả năng phân hủy lignin. Lignin là một
hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao (cả ở thực vật
hạt trần và thực vật hạt kín), có trong các cây dương xỉ. Trong rong
rêu, địa y và tảo chưa thấy có lignin.
Ở cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30%. Trong thành phần của lignin,
carbon chiếm 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24%.
Lignin cổ cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và trong
acid vô cơ. Dưới tác dụng của Jbisulflte natri và H2SO4, lignin bị phân
giải, tạo ra những hợp chất thơm. Trong thực vật, chúng như chất xi
măng liên kết các tế bào lại với nhau, làm táng độ bền cơ học cho tế
bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các v sv
từ bên ngoài.
Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra,
không bị biến đổi sinh lý. Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ
sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau.
388 Chương 6
H3C0
CH2OH H-COH
I
-C H HỘ
I
HCOH
L I
6= 0
HXO OCH,
o —c Hình 6.18 Công thức cấu tạo ỉignin
Trơng đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, cynafilic, cưmaiylic.
Các loại rượu này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-C và C-0.
OCH CH,0 OCH

OH OH OH
Hình 6.19 Công thức của ba loại rượu chủ yếu trong ỉignin
Thu n h ậ n enzym từ vsv 38d
Quá trinh phân giải lỉgnỉn là một quá trình rất phức tạp, có rất
nhiều ý kiến nhutig những kết luận sau được nhiều nhà khoa học đồng
tình hơn cả. Quá trình này qua các bước sau:
- Lignase oxy hóa mạch bên của phenylpropan
- Hình thành nhóm carboxyl thơm
- Tách nhóm methoxyỉ
- Hydroxyl hóa vòng thơm.
Cũng giếng như hemicelỉulase, những vsv tham gia phân giải
cellulose cũng thường tham gia tổng hợp enzym lignase. Do đó khi thu nhận
chế phẩm ceỉlulase, người ta đồng thời thu nhận hemicellulase và lỉgnase.
6.4.5 T hu n h ậ n enzym lỉpase từ vsv
1- Trình tự amino acid
Chuôi amino acid đầy đủ của lipase đã được xác lập năm 1981 (De
Caro). Cấu trúc iipase tuyến tụy ở ngựa, chó và người thể Kĩện qua hình 6.20.
Enzym tuy heo là polypeptide đơn có 449 amino add với MW = 49.859.
Chuỗi carbonhydrate gồm fucose, galactose, mannose và N-acetylglucosamine
được kèm vào Asn 166 thành khối lượng phân tử tổng cộng = 52KD.
Lipase tụy heo có hai dạng là La và Lb tùy thuộc vào thành
phần carbonhydrate. Lipase tụy của ngựa, cỉfu và bò tin không phải là
glycoprotein (Plummer..., 1973). !
Enzym này ỏ heo chứa sáu nhổm disuflde và hai nhóm
sulíhydryl. Vị trí của sáu nhóm dỉsuỉíỉde là Cys 4-Cys 10, Cys 237-Cys
433, Cys 433-Cys 499 Cys 285-Cys 296, Cys 299-Cys 304, Cys 90-Cys
103 (hoặc là Cys 90-Cys 101).
Liên kết disulfide thì nối chuỗi polypeptide thành những vòng
nhỏ liên tiếp nhau, tạo sự mềm mại nhất định để hình thành hợp
chất nền enzym trên m ặt phân cách.
Hai nhóm sulfhydryl khác nhau bởi tính phản ứng; Cys 181 sẵn
sàng phản ứng với các chất phản ứng sulfhydryl khác nhau, nhóm
sulíhydryl còn lại (Cys 101 hoặc Cys 103) thì yêu hơn. Phân tích chi
tiết câu trúc của lỉpase tụy heo cho thấy Cys 103 có thể là Cys tự do,
và disulfide là Cys 90-Cys 101.
Lipase tụy ngựa, bò và người thi có tương ứng là 68%, 67%, và
86% là giống với lipase tuyến ỉụy từ heo.
Mã di truyền cho một dải rộng các lipase khác nhau đã được nghiên
cúu, và cấu trúc của chúng được xác định từ các chuồi nucleotide tương ứng.
Các loai lipase khác đã được nghiên cúu gồm Stetphylococcus hyicus
(Gotz, 1985), Pseudomonas fragi (Kugimiya, 1986), Staphylococcus aureus
(Lee, 1986), Geotrichum Candium (Shimata, 1989), Rhừomucor miecher
(Boel, 1988) và Candida antarctica (Ưppenberg, 1994).
390 Chương 6
CPL K—YEQL---- AE-A-TAI"

tf>L N—YERL---- DS--A-IVE--
HPL MLPLWTLSLLLGAVAG K-YERL-— DS--S-ITE--
PPL 25 LKILPP DKDVDTRELLYTNQNQNNYQELVADPSTITN s
CPL 25 -KV--WSPERIG------- K-PN-F-TLLPSDPSTIEA-
EPL 25 -Kl -WSPEKVN------- E-PD-F-E1VADPSTIQS -
HPL 25 -HI -WSPKDVN------- E-PN-F-EVAADSSS1SG-
PPL 63 NFRMDRKTRFIIHGFIDKGEEDWLSNICKNLFKVESVNCI
CPL 65 -QTDK—-T---- N— N--LDM-K-M-----E—
EPL 64 --NTGR-—1---- D S--STM-Q-M-----s ---
HPL 64 --KTNR— 1---- D — N-ANV-K-L-----s —
PPL 103 CVDWKGGSRTGYTQASQNIRIVGAEVAYFVEVLKSSLGYS
CPL 105 ..... K-Q-S-T-AN-V-V-Q-QMLSM-SANYS--
EPL 104 ..... S-R-A-S-SQ-V-I—E-YLVGV -QSSFD -
HPL 104 ..... G--R-G-T--SQ-I-I—E--YFVEF - QSAFG -
PPL 143 PSNVHVIGHSLGSHAAGEAGRRTNGTIERITGLDPAEPCF
CPL 145 --Q-QL—S-A-V-— S--P-LG -— 0 -V-AS-
EPL 144 --N-HI—S--S-A---- R--N-AVG---- D-A-PC-
HPL 144 -N-HV-'-S--A-A..... R-N-TIG-— D-A-PC-
PPL 183 QGTPELVRLDPSDAKFVDVIHTDAAPHPNLGFGMSQTVG
CPL 184 —P-E---- T -D ------- A--LI-F—-T--QM-
EPL 184 —P-L..... S--Q------- 1--FI-N-—M--TA-
HPL 184 —P-U-— S -K .........G-IV-N-—M--VV-
PPL 223 HLDFFPNGGKQMPGCQKNILSQIVDIDGIWEGTRDFVACN
CPL 224 .......... EE—-K--A-— NL— E-----V—
EPL 224 —.......KE---Q--V......DI— Q-— A—
HPL 224 .......... VE ---K-I -— DI —-E-— A ~
PPL 263 HLRSYKYYADSILNPDGFAGFPCOSYNVFTANKCFPCPSE
CPL 264 H........SE--L------SYP-A-RA-ES----- PDQ
EPL 264 H........TD-L----- GFS-A--SD-TA.......SSG
HPL 264 H........TD--V----- GFP-A-NV-TA.......PSG
PPL 303 GCPQMGHYADRFPGKTNGVSQVFYLNTGDASNFARWRYKV
CPL 304 ........... KFAVK-SDET -KYF-N—s --------GV
EPL 304 ........... RFPGR-KGVG-LFY ‘N—A------- RV
HPL 304 ........... RYPGK-NDVG-KFY-D—A--------KV
PPL 343 SVTLSGKKVTGHILVSLFGNEGNSRQYEIYKGTLQPDNTH
CPL 344 s\ -— RA-QAK-A---SK--TH-FN-FK-I -K-GS-H
EPL 344 DV..... KV--HVL-S—NK--SR-YE-FQ-T-K-DN-Y
HPL 344 s v ..... KV--HIL -s— NK-SK-YE-FK T-K-DS-H
PPL 383 SDEFOSDVEVGDLQKVKFIWYNNNVINPTLPRVGASKITV
CPL 384 -N—AKLD--TIEK —L-N—V-P-F'K—A~T*
EPL 384 •N—SDVE-DLEK—1-Y--I -L-L-K—S-T-
HPL 384 -N—SDVD-DLQM—l*Y—1-P-L-R—S -l-
PPL 423 ERNDGH VYDFCSQETVREEVLLTLNPC 449
CPL 423 QKGEEKTVHS—ES— D---- TP- 449
EPL 423 ERNDGS VFN—EE-—D---- TA- 450
HPL 423 ETNVGN QFN—PE-—E..... TP* 449
H ình 6.20 So sánh trình tự amino acid của lipase từ các nguồn khác nhau
N ấm Geotrichum candium sản sinh ra extracellular lipase ở các

dạng lipase I và II với pl là 4,56 và 4,66 tương ứng.
Cấu trúc gen của hai loại lipase I và II thể hiện trong 4 chuỗi
khác nhau đã được phân tích lipase I với MW = 59.085, chứa 5 Cys,
7% carbohydrate, phần lớn là mannose tại hai vị trí N-glycosyl.
Lipase II chứa 554 amino acid với MW = 59.550. Enzym này chứa 4
Cys, 6,5% carbohydrat. Hai isozyme này có 84% là giống nhau trong
chuỗi. Rhizomucor miehei cũng chứa ít nhất hai dạng ỉỉpase A và B,
thể hiện tính đa dạng ở lipase vsv.
2- Cấu trúc không gian ba chiều
Các lipase cố cấu trúc dạng a/p gổm lưới p song song ở trung
tâm thể hiện qua hình 6.21 .
Hình 6.21 Cấu trúc không gian ba chiều của lipase từ các nguồn khác nhau
a) Rhizomucor miecheiỉ b) Tuyến tụy ở người; c) Geotrichum candỉum.
Ở Rhizomucor miechei, lipase chứa vùng đơn - lưới p trung tâm

của tám dải p liên kết. Ba disulfide được xác định: Cys 29-Cys 268,
Cys 40-Cys 43, Cys 235-Cys 244* Ser 144 hoạt động được phân bố
trong chuỗi xúc tác Gly-His-Ser-Leu-Cly. Bộ ba xúc tác bao gồm His
257, Ser 144 và Asp 203.
392 Chương 6
Cấu trúc của lipase B nhận được từ Candida antarctica thì có

nhiều điểm thường gặp: liên kết a/p ở vị trí trung tâm, bộ ba vị trí
hoạt động là: His 224-Ser 105-Asp 187. 9
Lipase trích ly từ Geotrichum Candidum gồm cấu trúc cơ bản của
phân bố a/p với lưới hỗn hợp p hình thành bởi 11 dải song song (H. 6.22).
Hình 6,22 Cấu trúc ỉipase cửa vi khuẩn
Vị trí hoạt động bao gồm bộ ba xúc tác His 463-Ser 217-Glu 354.
Sự đổi Asp bằng Gỉu trong bộ ba xúc tác cũng được tìm thấy từ lipase
của Candida cyỉindracea. Trong lipase vsv, các vị trí Asp/Gỉu được
tìm thấy trong ngã rẽ p liên kết dãy p số 6 và số’ 7 .
Cấu trúc của lỉpase vi khuẩn từ Pseudomonas gluma chứa ba
vùng: Vùng lớn nhất và phân bố a/p cổ lưới trung tâm p sáu nhánh:
Cấu trúc ba vùng này cũng được tìm thấy ở Candida rugose
(Grochulski..., 1993)
3- vsv tổng hợp lipase
Trong thiên nhiên có nhiều loài vsv cổ khả năng sinh tổng hợp
lipase. Chúng bao gồm cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn.
Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lỉpase bao gồm: Aspergillus
spp., Mucor s p p Rhizopus spp., Peniciỉlium spp.t Geotrichum spp.
Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Troruỉopsỉs
spp., Candida spp.
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm:
Pseudomonas spp., Achromobacter s p p Staphylococcus spp. Các nhà
khoa học nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình tổng hợp
lipase của những v sv trên và đã đưa ra những giá trị tối ưu về pH và
nhiệt độ như bảng 6.16.
Thu n h ậ n enzym từ vsv 393
Bảng 6.16 pH và nhiệt độ tối ưu của một số VSVsinh tổng hợp lipase
stt vsv pH tối ưu Nhiệt độ tốl ưu
1 Penìèillium chrysogenum 6,2 -6,8 37

2 Pseudomonas fragi 7 0 - 7 ,2 32
3 Rhizopus defemar 5.6 35
4 Aspergillus niger 5,6 35
5 Peniciliium roquefortri 8.0 37
6 Staphylococcus aureus 8,5 45
7 Geotrichum candidum 8,2 37
8 Achromobacter lipolyticum 7.0 37
9 Candida u tilis 6,8 - 7,2 32
Trong đó các loài Aspergillus, Mucor, Rhizopus và Candida được

sử dụng trong sản xuất lipase theo quy mô công nghiệp.
4- Cơ chế xúc tác
Phản ứng xúc tác bởi lipase giống với tác động thủy phân của
Serine protease. Sự hình thành chất trung giaii acyl lipase được chỉ rõ
trong sự thủy phân p-nitrophenyl acetate bdi lipase tuyến tụy heo
(Semeriva, 1974). Các nghiên cứu động học quá trình thủy phân của
p-nitrophenyl acetate bởi lipase tuyến tụy cho thấy: phản ứng tuân
theo cơ chế acyl enzym với ki = kcat = 0,11 ± 0,02/phút; k 2 = 7 ± 0,7/phút;
kmapp = 0,22 ± 0,02 mM; ks = 15 mM (Chapas, 1976).
Tỷ lệ kcat /km = kiì/ks là thích ứng với sự hình thành acyl enzym.
Bằng chứng gần đây được xác lập từ cấu trúc tỉnh thể của hai
lipases qua sự hiện diện của bộ ba xúc tác Asp-His-Ser trong tâm hoạt
dộng cung cấp thêm cho cơ chế phản ứng.
Giả sử lipase hoạt động qua sự hình thành acyl-enzym và từ bộ ba
Asp-His-Ser cùng liên quan, thì cơ chế sau có thể xuất hiện (H.6.23).
ACYLATION o c9 n R
■ o /v i
R ,snx \s n 1
©
coo - HN
^ 2 C OQ
.. H — o —
.A ?. 1 _ ©
O ..HN @ N .. H - O - r - c o o .. HN
A N >9
Asp s*r Asp ) ==^ s .r R,OH Asp Ser
His His His
' _ o0
deacylation 0 I
H *c ho^ | “ R2
c o c ? •’ H ^ *H* c o o ..... H N ^ ^ I ......HO
Asp Ser Asp < =^ s * r RjCOOH Asp <i Set

His His His
H ình 6.23 Cơ chế xúc tác của lipase

394 Chương 6
Acyl-enzym có liên kết cộng hóa trị được hình thành. Các ion 0"
phát hiện trong các chất trung gian được ổn định bởi liên kết hydro.
Sự có m ặt của các chất trung gian này và sự ổn định của nó được xác
lập bởi các nghiên cứu về tinh thể học lipase từ Candida rugose.
Quá trình xúc tác của ỉipase là quá trình xảy ra thường rất
chậm nếu sơ với quá trình xúc tác của các enzym khác như protease
hay amylase. Sản phẩm của quá trình thủy phân nhờ sự xúc tác bởi
ỉipase là monoglyceride và acid béo. Cơ chế chuyển hóa được tóm tắt
như hình 6.24.
o o c h 2- oh
II II I
/ w w c -o - c h 2 /s a a a /S -o -ỏ h
A A A /V C -O -C H Upase- + CH* °"

o 2HaO
A A A /V C -0 -C h 2 2 A A A A /Ịỳ -O H
o
H ình 6,24 Cơ chế tác động của lipase
5- Thu nhộn enzym lipase
Trong công nghiệp, người ta sản xuất lipase chủ yếu bằng
phương pháp nuôi cấy bề mặt. Trong môi trường có bổ sung chất béo
như một cơ chất cảm ứng. Tuy nhiên, hàm lượng chất béo cho vào môi
trường với số lượng rấ t nhô (khoảng < 1 %) vì chất béo thường không
hòa tan trong nước, nếu sử dụng số ỉượng lớn sẽ ảnh hưởng rất lớn
đến tính chất môi trường.
Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzym
k h ỏ i m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y v à t i ê n h à n h lo ạ i cá c t ạ p c h ấ t, c u ố i cùng
là là m k ế t tủ a , t i n h c h ế v à th u n h ậ n e n z y m t in h k h iế t. E nzym
lip a s e đ ư ợ c ứ n g d ụ n g n h iề u t r o n g s ả n x u ấ t cá c c h ấ t t ẩ y rử a , tro n g
s ả n x u ấ t p h o m a ỉ.
6.4.6 Thu nhận enzym glucose isom erase

Enzym glucose isomerase còn được gọi ỉà D-glucoseketoisomerase.
Enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất dịch
đường glucose.
2- vsv tham gia tổng hợp glucose isomerase
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện rấ t nhiều v sv có khả
năng sinh tổng hợp enzym glucose isomerase. Các loài v sv dó dược
liệt kê trong bảng 6.17.
Thu n h ậ n enzyra từ vsv 395
Bảng 6*17 vsv tổng hợp glucose isomerase

stt vsv stt vsv
1 Bacillus coagulans 8 Micromonospora coervỉa
2 Streptornyces phaeochromogenes 9 M icrocllospora ttavea
3 Streptomyces olivaceus 10 Nocardia asteroides
4 Streptomyces clivochromogenas 11 Nocardia dassonvillei
5 Arthrobacter sp. 12 Brevibacterium im periale
6 Actinoplanes missouriemsis 13 Micrococcus coagiiis
7
M icrospora rosea
Trong đó các chủng thuộc Bacillus và Streptomyces được ứng dụng

nhiều trong sản xuất glucose isomerase theo quy mô công nghiệp. Hãng
Novo của Đan Mạch sản xuất enzym này từ Bacillus coagulans. Ngoài
ra rất nhiều hãng sản xuất enzym glucose isomerase cũng bằng Bacillus
coagulans ồ các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên.
2- Cơ chế tác động của glucose isomerase
Enzym glucose isomerase tham gia quá trình isomer hóa glucose,
tạo thành fructose. Fructose là loại đường có độ ngọt cao hơn glucose
rất nhiều. Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường thu nhận hỗn
hợp glucose-fructose. Hỗn hợp này có ứng dụng nhiều trong công
nghiệp thực phẩm và đồ uống.
Cơ chế isomer hóa đường glucose được biểu diễn như sau.
D- glucose D- mannose
Hn *° I
C -O H c
C II 1
I
H -C -O H CI -O H HO—C—H
O H -ệ -H --------- * O H -C -H — ----- ► H O -C -H
I ĩ
I
H -Ộ -O H H -C -O H H -C -O H
I I 1
H -C -O H H -C -O H H -C -O H
CH2OH CH2OH CH2OH
L
c h 2oh c h 2oh c h 2oh
ọ=o C -O H c=o
I II 1
H O -Ò -H HO—C H -C1-O H
I
H -C -O H --------- * H - C1- O H — ----- ► H -C1-O H
I
H -Ộ -O H H -C -O H H - C -O H
1
I
ò h 2oh c h 2oh CH2OH
D- fructose D- psicos
396 Chương 6
Trong sản xuất siro glucose-fructose, nhiều nơi áp dụng một

trong hai phương pháp sau:
Phương pháp "đi từ nguyên liệu ỉà mật rỉ
Đường ừong mặt rỉ Tính bột
(khoai tây, bắp,khoai mì)
Inventase
Thúy phân băng acid hoặc bang enzym
Glucose/fructose
(s 50:50 đường nghịch đảo) Glucose
Gluco. isomerase
Tỳ lệ 60:40 isosiro
3- Thu nhận enzym glucose isoầnerase

Lượng siro glucose/fructose được sán xuất trên th ế giới rất lớn.
Trong đó, glucose/fructose được sản xuất nhiều nhất d Mỹ, Đức, Nhật,
và một sô" nước châu Âu. Đức và Mỹ ỉà những nước sản xuất glucose-
fructose lớn n h ất (hàng năm Đức sản xuất khoảng 10 .000-20000 tấn
glucose/fructose). Nhu cầu về glucose/fructose trên th ế giới rất lớn, vì
th ế người ta sản xuất enzym glucose isomerase với sô" lượng nhiều để
đáp ứng cho nhu cầu trên.
Ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên, người ta sản
xuất enzym glucose isomerase chủ yếu bằng vi khuẩn Bacillus
coaguỉans. Vì khuẩn này được nuôi bằng phương pháp chìm trong môi
trường nuôi cấy thích hợp, chúng có khả nâng sinh tổng hợp enzym
chỉ trong 24 giờ nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy người ta thường
cho muôi cobalt và magỉe. Hai loại muối này kích thích quá trình sinh
tổng hợp glucose-isomerase.
Ngoài Bacillus coagulans, nhiều nước còn sản xuất glucose-
isomerase từ Actinoplans missouriensis. vsv này có ưu điểm là chúng
Thu n h ận enzym từ vsv 397
CÓ khả năng phát triển ở rất nhiều loại môi trường khác nhau và khả
năng sinh tổng hợp glucose-isomerase cũng rất mạnh.
Bảng 6.18 Ảnh hưòng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp
glucose-isomerase của Actinoplans missouriensis
Hoạt tính
stt Nguổn nitơ Hãng sản xuất
Gl/ml (%)
1 Dịch chiết ngô Anheuser-Busch 17,8 100

2 D.M.peptone Amber Lab 13.4 75
3 Casein thủy phân Amber Lab 13,0 73

4 Bacto-soytone Difco 11,8 66
#
5 Dịch chiết nấm men (BYF-100) Amber Lab 10.3 58

6 Dịch chiốt nấm men (BYF-300) Amber Lab 5.8 33
7 Dịch chiết malt Difco 2.5 14
8 Atlantic Menhaden peptone Haynie 1.1 6
Ghi chú: Hoạt tính enzym nuôi trên dịch chiết ngô được xác
định là 100%.
Để thu nhận glucose-isomerase từ loài Streptomyces, người ta
thường nuôi chúng trong những bình lên men có pH 8,5. Trong số các
chủng thuộc loài Streptomyces, người ta thường nuôi ở nhiệt độ rất cao
(nhiệt độ nuôi trong khoảng 60-70°C). Các thiết bị lên men thường
được thiết kế và chế tạo có dung tích 22m3.
Sau 24 giờ nuôi cấy, người ta tiến hành ly tâm, thu dịch chứa
enzym ngoại bào và sau đó là áp dụng những phương pháp đã trình
bày ở chương 2 để thu nhận enzym tinh khiết.
Chương 7
ỨNG DỤNG ENZYM
7.1 ỨNG DỤNG ENZYM TRONG CÔNG NGHIỆP THựC PHAM

7 .1.1 T ìn h h ìn h ứ n g d ụ n g enzym tro n g công n g h iệp tr ê n th ế
giởi v à V iệt N am
Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym,
loài người dã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong
công nghiệp. Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng
enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Các
enzym quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được
trình bày trong bảng 7.1.
Bảng 7.1 Mửc độ ứng dụng của một số enzym
quan trọng hiện nay trên thế giới
s tt Loại enzym Tỷ lộ ứng dựng (%)
1 Enzym protease 59%

* T rypsỉne 3%
- Rennet 10%
- Protease acid 3%
- Protease trung tính 12%
- Protease kiểm yếu 6%
- Protease kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa 25%
2 Carbohydrase 28%
- Pectinase 3%
- Isomenase 6%
- Cellulase 1%
- a-amylase 13%
- p-amylase 13%
3 Lipase 3%
4 Các enzym khác sừ dựng trong y học và trong phân tích 10%
Qua bảng trên ta thấy các enzym thuộc nhóm protease hiện
đang được ứng dụng nhiều nhất. Trong đó enzym protease kiềm được
ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn nhất so với các loại
enzym khác.
Trong số enzym được sản xuất và ứng dụng trên thế giới, các nước
châu Âu sản xuất và bán ra thị trường thế giới số lượng nhiều nhất.
ứ n g dụ n g enzym 399
Bảng 7JÈ Thị trường enzym ở châu Ấu

Giá tri buôn G li trỊ buôn
Stt Loại enzym ban enzym stt Loại enzym bán enzym
(triệu USD) (triệu USD)
1 Carbohydrase 83,2 4 Pectinase 41,6
2 Protease 187,2 5 Những loại enzym đặc biệt 208
3 Lipase 31,6 6 Cốc loại enzym khác 41,6
Nguồn: Frost và Sullivan, 1992.

Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzym được tiêu thụ
nhiều nhất. Số ỉượng enzym được ứng dụng trong công nghiệp thực
phẩm chủ yếu ở các nước châu Mỹ, châu Âu.
B àng 7.3 Thị trường enzym trong công nghệ thực phẩm ,
thức ăn gia súc trên thế giới
Giá trl buôn Giá ỪỊ buôn

Lĩnh vực công nghỉệp và ưnh vực công nghiệp và
Stt bán enzym Stt bán enzym
enzym enzym
(triệu USD) (triệu USD)
1 Chuyển hóa tin h bột 140 5 công nghiệp bảnh kẹo 15
Amylo giucosidase 55 Amylase nấm sợi 1 0 -1 2
a-amyiase 40 a-amylase 1 -2
Glucose iso me rase 20 Protease 1 -2
Cellulase, hemicellulase 5 Cellulase-hemicellulase 1 -2
Enzym nấm sợi 3
Pullulanase 1
p-amylase 1
2 Công nghiệp sữa 110 6 Thực phẩm hỗn hợp 15
Rennet dộng vật 75 Invertase 8
Rennet VSV 20 Upase 2
Lipase-esterase 8 Bromelin 3 -4
Lysozyme 6 Glucoseoxidase 1 -2
3 Rượu, bia, nước g iả ỉ khát 46 7 Thức ăn gỉa súc 8
Pectinase 10 p-glucanase 3 -4
Papain 8 Cellulase-hemicellulase 2 -3
p-glucanase 4 a-amylass <1
Cellulase - hemicellulase 3 -4 Glucoseoxidase <0,5
a-amylase 2 -3 Protease vi khuẩn <0,5
Amyloglucosidase 1 -2
Glucose oxidase 0.5
4 Cồn 32
a-amylase
Amyloglucosidase
Pullulanase
p-glucanase
Cellulase-hemicellulase
Nguồn: A.Wiseman, 1998.

400 Chương 7
Ở Việt Nam, công nghệ enzym chưa phát triển. Các nghiên cứu
có đề cập đến hầu h ế t các loại enzym của động vật, thực vật và vsv,
nhưng chưa có enzym nào dược sản xuất theo quy mô công nghiệp.
Việt Nam vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzym từ nước ngoài.
Trong đó các loại enzym đang được sử dụng nhiều ở Việt Nam là các
loại enzym của hãng NOVO của Đan Mạch. Điều đó cho thấy việc
hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzym tại Việt Nam là
điều rấ t cần thiết.
7.1.2 M ột số enzym quan trọ n g ứng dụng tro n g công nghiệp
thự c phẩm
I* Enzym amylase
Enzym amylase ỉà enzym tinh bột, đóng vai trò rất quan trọng
trong công nghiệp thực phẩm. Cơ chế tổng quát của amylase, như sau:
a. amylase
Dextrin + oligosaccharid
Tỉnh bột--- [
Dextrin
Pulluulanase
p- amylase
Maltose
Dextrin
Glucose
Amyloglucosỉdase
Enzym amylase chia ra làm hai nhóm:

Endoamylase (a-amyỉase, EC.3.2.1.1). Nhóm này lạỉ chia ra làm
hai nhóm nhỏ:
- a-14-glucano hydrolase
- a- 1,6 glucano hydrolase. Nhóm nhỏ này bao gồm: isoamylase
(EC.3.2.1.68) hay pưllulanase (EC.3.2.1.41)
Exoamyỉase. Nhóm này gồm có:
- p-ầmylase (EC 3.2.1.2)
- Amyloglucosidase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3)
Or a-amylase (EC 3.2. l.ỉ)
a-amylase có nhỉều trong malt. Tuy nhiên trong công nghiệp,
người ta thường sản xuất a-amylase từ nuôi cấy vi sinh vật (VSV) hay
từ tuyến tụy (pancreasX Mỗi một loại oc-amylase có tính chất enzym
riêng. Điều đó phụ thuộc rất nhiều vào nguồn khai thác a-amylase.
a -amylase vi khuẩn. Trên thị trường enzym thế giới có bán hai
dạng sản phẩm: sản phẩm a-amylase dạng lỏng và a-amylase dạng
bột. Enzym a-amylase dạng bột có hoạt tính 20.000-30.000SKB/g, pH
hoạt động m ạnh ở giá trị 5, enzym a-amyỉase dạng lỏng cố hoạt tính
3 .000- 12 .000SKB/g. Đặc biệt, a-amylase dạng bột được sản xuất từ vi
khuẩn Bacillus amylolÙỊuefaciens có hoạt tính rất cao, vào khoảng
500.000SKB/g. Dựa vào khả năng chịu nhiệt, a-amylase của vi khuẩn
chia ra làm hai ỉoạỉ:
- Loại a-amylase vi khuẩn chuẩn (Standard- a-amylase), loại này
được sản xuất từ Bacillus subtilis, nhiệt độ hoạt động tối ưu là 70-85°C.
- Loại a-amylase vi khuẩn chịu nhiệt (head stable a~amylase),
thường được sản xuất từ Bacillus licheniformis, cố nhiệt độ hoạt đội}g
tối ưu là 90-105°C.
Khả năng chịu nhiệt cửa a-amylase phụ thuộc vào pH, hàm
lượng muối canxi, nồng độ cơ chất. Ví dụt ở pH 7,0 enzym hoạt động
mạnh ở nhiệt độ 103-105°c trong 7-11 phút; ở pH 3,5-4,5 enzym hoạt
động mạnh ở 80-90°C trong 5-30 phút.
a-amylase của vi khiiẩn bền trong ion calcium. Một số được hoạt
hóa bỏi NaCl.
Các ion kim loại nặng như đồng, sắt thường ức chế hoạt động
cửa enzym. Khi thủy phân tính bột, a-amylase thường tạo ra các sản
phẩm có tỷ lệ như sau:
Gi (glucose) 5% Gs (maltopentaose) 16%
G2 (maltose) 7% G6 (nưứtohexaose) 22%
G3 {maltotriosé) 13% G7 {dextrin cao phân tử) 33%
G4 (maỉto tetraose) 4%
Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng DE
(dextrose eqiùucdent) để biểu thỉ khả năng phân cắt tinh bột. Người ta
thường sử dụng enzym a-amylase của vi khuẩn để thu nhận
maitodextrin có DE là 20, còn khi cần thu nhận maỉtodextrin 40,
người ta sử dụng enzym của nấm sợi.
a-amyỉase của nấm sợi. Người ta thường thu nhận a-amylase của
B ấ m s ợ i t ừ Aspergillus ĩĩiger v à Áspergiỉỉus Oiyzae. a -a m y la s e củ a n ấ m
sợi thường kém bền nhiệt hơn a-amylase của vi khuẩn và rấ t dễ bị
biến tính trước khi tinh bột được gelatin hóa. Khi cho enzym
amylase cửa nấm sợi thủy phân tinh bột sê tạo ra các sản phẩm có tỷ
ỉệ như sau:
Gi: 8%; G3: 32%; G4: 18; G5: 9%; Gé 4% và dextrin phân tử cao 17%.
402 Chương 7
Các chế phẩm a-amylase của nấm sợi được bán trên thị trường
hiện nay có hoạt tính từ 500-100.000SKB.
b‘ p-amylase (EC 3.2.1.2)
Enzym này có trong hạt đậu, khoai tây.,.. Enzym này tham gia
phân giải chuỗi amylase, còn đối với amylopectin, enzym này tham
gia phân cắt glucose thứ hai, thứ ba từ điểm liên kết a- 1,6 glucoside.
Nhiệt độ hoạt động tối ưu của P-amylase là 55°c, pH 5-5,5. p-amylase
trong m alt thủy phân tinh bột tạo ra maltose. Maltose là sản phẩm
chủ yếu của hoạt động p-amylase.
c- Pancreatic amylase
Pancreatic amylase có nhóm (-SH) vì th ế enzym này rất dễ bị
biến tính bởi ion kim loại nặng. Khi có m ặt của ion chloside hoạt tính
m ạnh nhất của chúng ỏ pH 7.
Bảng 7A Một số tính chất của a-amylase từ các nguồn khác nhau
Khoàng pH Khoầng nhiệt độ
s tt Loại enzym Nguổn enzym
tối ƯU tối Ưu (°C)
1 Pancreatic enzym Tuyến tụy động vật 5,5 - 8,5 40 - 45

(6,0 - 7,0) Mất hoạt tính ò 75°c
2 a-amylase vi khuẩn Bac. subtilis 4,5 - 9,0 70 - 85
Đac. amyloliquefucieins (6,5 - 7,5) Mất hoạt tính ở 95°c
3 a-amylase Bac. licheniformis 5,8 - 8,0 90 -105
của vi khuẩn Ưa nhiệt (7,0) Mất hoạt tính ở 120°c
4 a-amylase Asp. niger 4,0 - 7,0 55 - 60
của nấm sợi Asp. oryzae (5.0 - 6,0) Mất hoạt tính ở 80°c
5 a-amylase của malt Malt dại mạch, tiểu mạch 3,5 - 7,5 60-70
(4,5 - 7,0) Mất hoạt tính ở 85°c
d- Isoamylase và pullulanase
- Isoamylase (EC.3.2.1.68) là enzym thu nhận từ nấm men và
nấm sợi.
- Pullulanase (EC.3.2.1.41) là enzym thu nhận từ vi khuẩn
Aerobacter aerogenes hay từ Klebsiella.
Dưới tác động của iso amylase hay puìlulanase, sản phẩm tạo
th àn h sẽ là glucose. Trong quá trình thủy phân, người ta thường sử
dụng enzym này với amyloglucosidase. Hoạt tính tối ưu của chúng à
pH 6 và nhiệt độ 60°c. Khi thủy phân cùng amyloglucosidase, hoạt
tính tôi ưu cíỉa chúng ở pH 4-5 và nhiệt độ 45°c.
e- G lu c o a m y la s e (EC. 3.2.1.3)
Enzym này còn có tên là amyloglucosidase. Enzym thuộc nhóm

exo-a-1,4 D.glucan glucohydrolase. Theo lý thuyết, enzym này có thủy
phân tinh bột để tạo ra glucose có hiệu suất đến 100%.
Bảng 7,5 Một số tính chất của gluco amylase
stt Nguổn enzym Khoảng pH tối Ưu Nhiệt độ tỐiưu(°C)
1 Aspergillus niger 3,0-6,0 55-60

Tối ưu ở 4,5-5,0 Mất hoạt tính à 90°c
2 Aspergillus awamori 2,0-7,0 55-65

Tối ưu ở 3,0-5,0 Mất hoạt tính ở 85°c
3 Rhizopus niveus 3,0-6,0 55-60

Tối ưu ở 3,0-5,5 Mất hoạt tính ở 70-80°C
Phần lớn những sản phẩm thương mại của glucoamylase ở dạng
dung dịch đã được ổn định với NaCl hay glycerol. Những sản phẩm
thương mại glucoamylase có hoạt tính 200-600 đơn vị trên gam. Hoạt
tính riêng vào khoảng 4000ƯI/g protein.
Hiện nay người ta sản xuất nhiều enzym glucoamylase dạng cố
định {immobilized glucoamyỉase). Phương pháp cô' định thông dụng
nhất đối với enzym này là phương pháp tạo cầu nối đồng hóa trị. Sử
dụng enzym glucoamylase không tan thường thực hiện phương pháp
liên tục ở nhiệt độ 55°C; pH 4,5.
Bảng 7.6 Một số tính chất của gỉucoamylase hòa tan và không hòa tan được
sử dụng nhiều trong thảy phân tinh bột
stt Tính chất Glucoamylase hòa tan Glucoamylase không hòa tan
1 Nổng độ cơ chất 35% 35%
2 pH 4,5 4,5
3 DE 10-15 3 0 -4 0
4 Thể tích thùng phản ứng 60000I 5000 I
5 Thời gian phàn ứng 48 - 72 giờ 0,5 giò

404 Chươbg 7
f- Glucose isomerase (EC.5.3.1.5)

Đường glucose có độ ngọt khoảng 65% độ ngọt của đường saccharose.
Đường fructose có dộ ngọt khoảng 120-180% độ ngọt của saccharose, do đó
việc isomer hóa glucose thành fructose có ý nghĩa rất lớn.
Những nghỉên cứu' về enzym isomerase xuất hiện không lâu.
- Năm 1957, khái niệm glucose-isomerase mới thấy xuất hiện
trong một số tài liệu.
- Năm 1960, Marshall lần đầu tiên đưa ra phương phằp sản xuất
fructose bằng gluco-isomerase từ glucose và đây cũng là patent đầu
tiên được công bố.
- Năm 1965, Takasaki và những cộng tác viên đã công bố công
trình nghiên cứu sản xuất glucose-isomerase không tan tại Nhật Bản.
- Năm 1967 tại Mỹ, còng ty Clinton Com Processing đã sản xuất
theo quy mô công nghiệp siro fructose bằng công nghệ enzym cố định của
Takasaki.
- Năm 1970, phương pháp sản xuất fructose theo phương pháp
liên tục cũng được thực hiện tại cáng ty Clinton Com Processing.
- Năm 1975, xuất hiện những bể phản ứng cố định có dung tích
rất lớn dùng để sản xuất siro fructose.
- Năm 1978, xuất hiện phương pháp tinh sạch siro-fructose.
- Năm 1984, hai hãng Coca cola và Pepsi cola đã sử dụng siro
fructose vào các sản phẩm của mình.
- Năm 1989, xuất hiện nhiều báo cáo về sử dụng các tác nhân
gây dột biến, thu nhận giống v sv có khả năng sinh tổng hợp glucose-
isomerase cao.
- Từ năm 1990 đến nay, toàn bộ công nghệ sản xuất glucose
isomerase đã được sản xuất bằng enzym gỉucose isomerase không tan.
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều sản phẩm enzym không hòa
tan dùng trong sản xuất glucose-fructose. Các sản phẩm thương mại
đó được trình bày trong bảng 7.7.
ứ n g d ụng enzym 405
Bảng 7.7 Sản phẩm thương mại glucose isomerase không hòa ton
(theo Pedersen, 1991)
Tên Gỉá trị hoạt

Nơi s in xuất Nguđn enzym Phương pháp cố định
thương mạí tínhở60°/giờ
CPC.(enzym G-zyme S. olivochromogens Trao đổi anion Resin 6

Bio -systems) G.994
Genencor Int Spezyme S. rubiginosus Hấp thụ trên OEAE cellulose 3,9
(600 IGIU/g) với polystyrene và TiQ?
Godo Shusei AGI - S-600 s . griseofuseus Chitosan 3,1
IBis Maxazyme Actinopiartes Tạo màng bọc gelatin 1,2
(1100 MGíu/g) m issouriensis
NAGASE Sweetase S. phaechromogenes Trao dổi anion, tạo hạt 1,4
NOVO Sweetzym S. murinus CỐ định ỉrên glutaraldehyde 2,1

Nordisec A/S (300 IGlu/g)
Solway Optisweet 11 $. rubigino sus CỔ định trên glutaraídehyde 6,8
Sotway Takasweet Flavobacterium CỐ định trên polyamin 2,0

(200 MIGic/g) arbơuscens
UOP Ketomax 100 S. oiivochromogenes Cổ định ỉrên ceramic 5,2
2- Enzym cellulose
Cellulase là một phức hợp gồm nhiều enzym. Các loại enzym
trong phức hợp này sẽ phân hủy lần lượt cellulose thành sản phẩm
cuối cùng là glucose.
Theo Wood và Mc Crae (1979), quá trình thủy phân cellulose
được thực hiện bởi ba nhóm enzym sau:
- Exocellulase hay exobiohydrolase (EC.3.2.1.91)
- Enđocellulase hay endoglucanase (EC.3.2.1.91)
- P-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21).
• Exocellulase còn gọi là 1,4 P-glucan cellobiohydrolase. Enzym
này thủy phân cellobiose từ dầu không khử của chuỗi glucan và
cellodextrin. Exocellulase được sản xuất từ Trichoderma và
Aspergillus.
• Endoglucanase còn gọi là 1,4 p-D-glucan-4-glucano-hyđrolase.
Enzym này được sản xuất từ nhiều v sv khác nhau như: Aspergillus,
Triẹhoderma, Peniciílium và rất nhiều vi khuẩn khác nhau. Khối
lượng phân tử vào khoảng 12.000-50.000.
406 Chương 7
• Cellobiase còn gọi là p-glucosidase hay p-D gỉucosỉde glucohydrolase.

Enzym này tham gia phân hủy cellobiose và cellodextrins đến cellohexose
và cuối cùng thành glucose. Enzym này được sản xuất từ Trichoderma, đặc
biệt là từ Aspergillus niger. Khối lượng phân tử của chúng vào khoảng
35.000 (đối với Trỉchoderma) và 218000 (đối với Aspergillus oryzae).
Các loại cellulase thu nhận từ nấm sợi Trichoderma spp. hoạt
động mạnh ở pH 3-7, nhiệt độ tối ưu là 40°c. Các loại enzym thu
nhận từ nấm sợi Aspergillus spp. hoạt động mạnh ở pH 4-6 còn
cellulase thu nhận từ Penicillium hoạt động mạnh ở pH 5-8.
Các loại cellulase của vi khuẩn hoạt động ở pH rất rộng (pH 5-10).
3-Hemicellulase
Enzym hemicellulase là một phức hợp gồm nhiều enzym và được thu
nhận từ thực vật, nấm sợi Aspergỉỉus, Trkhoderma, nấm men và vi khuẩn.
a- Dextranase (EC.3.2.1.11)
Enzym này thu nhện từ Penỉciỉỉium. Chúng phân hủy liên kết
1,6 D-glucoside của dextran. Chúng hoạt động mạnh ở pH 5-5,5 và ở
nhiệt độ 45-55°C.
b- Inulinase (EC.3.2.1.7')
Enzym này được thu nhận từ Aspergillus, nấm men. Chúng hoạt
động mạnh ở pH 3,0-6,0 và ở nhỉệt độ 35-50°C. Chúng chuyển hóa
inulin thành fructose với hiệu suất 99% trong 24 giờ.
c- p-glucanase từ nấm sợi
Enzym này thu nhận từ Aspergillus niger và Penicilỉium emer
sonii. Các chế phẩm thương mại của enzym này có chứa cả a-amylase.
P-glucanase của Asp.oryzae hoạt động mạnh ở pH từ 4-6 và nhiệt
độ 60°c. p-glucanase của Peniciỉỉium emesomi hoạt động mạnh ở 70°c.
d- p-glucanase từ vi khuẩn
Enzym được thư nhận từ Bacillus subtiỉis, có chứa một ít enzym
a-amylase và protease. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6-7 ,5 , dễ dàng
mất hoạt tính > 60°c. Tuy nhiên, người ta hiện cũng đã tìm được
những p-glucanase của vi khuẩn rất bền nhiệt, có thể giữ được hoạt
tính ở 80°c.
e- Xylanase và pentosanase
Người ta đã sản xuất xylanase và pentosanase theo quy mô công
nghiệp từ Aspergillus spp. và Trichoderma. Enzym hoạt động mạnh ô pH
3,5-6,0 và ở 50-55°C. Các enzym này còn được phối trộn với pectinase
dùng trong sản xuất nước quả.
4- Pectinase
Người ta chia pectinase ra làm ba nhóm:
- Pectin methylesterase
- Pectin depolymerase
- Exoenzym.
a- Pectin methylesterase (EC.3.1.1.11)
Enzym này tham gia thủy phân pectin tạo thành acid pectic và
methanol. Enzym này có một tên khác là pectiesterase (PE). Đây là
enzym rất đặc hiệu, hiệu suất phân giải pectin cổ thể đạt 98%.
Người ta thường thu nhận pectiesterase từ nấm sợi. Các
pectiesterase của nấm sợi hoạt động mạnh ở pH 3-5, còn pectiesterase
của vi khuẩn lại hoạt động mạnh ở pH 7-8. Chúng bị mất hoạt tính
khi đun nóng 85°c.
b- Pectin depolimerase
Enzym này có trong thực vật. Trong tông nghiệp, người ta sản
xuất enzym này từ nấm sợi và từ vi khuẩi£- Tùy thuộc vào cơ chế phân
giải và cơ chất mà chúng tác động, enzym pectin depolimerase được
chia làm bốn loại sau:
* Endo-pectin transeliminase (EC.4.2.2.3), PTE
- Endo-pectic acid transliminase (EC.4.2.2.1), PATE
- Endo poly galacturonase (EC.3.2.1.15), PG
- Endo-poly methyl galacturonase, PMG.
Đặc tính của một sô' pectin depolimerase được trình bày trong
bảng 7.8.
B ảng 7.8 Giá trị pH tối ưu của một số pectin depolymerase
stt Nguồn cho enzym Loại enzym pH tối Ưu
1 Aspergillus niger Endo * PMG 5,2
2 Aspergillus niger Endo - PMG 55
3 Flavobacterium pectinovorum Endo - PMG 7.4 - 8.2
4 Aspergillus nỉger Endo PG 47 -48
5 Aspergillus species Endo - PG 3,7 - 4,2
6 Coniothyrum diplodiella Endo - PG 4.4
7 Aspergillus sojae Endo - PTE 5.5
8 Bacterium polymyxa Endo PTE 8.9-9,1
408
1___
Chương 7
-5 - Proteinase
Proteinase ỉà enzym protease thủy phân các peptỉđe bên trong
protein. Proteinase được chia ra một số loại dựa trên những đặc điểm
riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động của enzym.
• Một số proteinase chứa lưu huỳnh (nhóm SH) ở trung tâm hoạt
động, chúng bao gồm:
Papain; bromeiin; íìcine; một sấ enzym từ vsv.
• Metallo proteinase cần ion kim loại như kẽm, magiesium, hay
cobalt. Các loại proteinase trung tính của vi khuẩn thuộc nhóm này,
chúng bị ức chế bởi EDTA.
• Proteinase có chứa histidine trong trung tâm hoạt động. Chứng
bao gồm proteinase vi khuẩn, trypsin, chymotrypsin. Chúng bị ức chế
trong môi trường kiềm.
• Proteinase acỉd: Nhóm này gồm pepsin, trong trung tâm hoạt
động có chứa asparagyỉ hay glutamyl.
a- Pancreatic proteinase
Trong công nghỉệp sản xuất enzym, người ta thường sản xuất
chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin và chymotrypsin. Chế phẩm thương
mại này được sản xuất từ tuyến tụy. Trong chế phẩm thương mại này
còn chứa cả peptidase khác, enzym amylase, lipase. Chế phẩm hỗn
hợp này hoạt động mạnh ồ pH 8,5-9,0; nhiệt độ từ 30-40°C. Tuy
nhiên, người ta cũng có thể sử dụng pH ỉà 7,5 và nhiệt độ 45-50°C để
thực hiện các phản ứng.
Chế phẩm hỗn hợp bền vững trong dung dịch ở pH 3 -5 . Nếu đưa
nhiệt độ lên. 90°c ở pH 6-8, chế phẩm enzym hỗn hợp sẽ bị m ất hoạt
tính. Khi cho l- 2g CaCla/l chế phẩm enzym hỗn hợp và hàm lượng cơ
chất cao sẽ làm ổn định enzym.
Trong sản xuất công Đghỉệp, người ta thitfmg sử dụng cơ chất là
cazein hay chromogen như là cơ chất để xác fljnh hoạt tỉnh của chế
phẩm enzym.
Pepsin (EC.3.4.4. IX Pepsin được thu nhện từ màng nhầy dạ con
của heo con và bê. Pepsin thưởng được sử dụng chung vởỉ rennet trong
sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh
ở pH 2-4 và nhiệt độ 50°c.
R ennet (rennin) (EC.3.4-4.3). Rennin thường được sản xuất từ bao

tử của cừu. Đây là enzym có hoạt tính đặc biệt rất cao. Người ta
thường phối trộn với pepsin theo tỷ lệ 1:1 đé sử dụng trong công
nghiệp chẽ biến sữa.
Papain (EC.3-4.22.2). Người ta thu nhận chế phẩm papain bằng
cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ quả đu đủ có chứa
papain, chymopapain và một lượng nhỏ proteinase khác.
Trèn th ế giới có chế phẩm thương mại papaỉn dạng bột và chế
phẩm thương mại dạng lỏng. Chế phẩm thương mại dạng lỏng thường
được làm ổn dinh hóa b:íng glycerol.
Cả hai dạng chê phẩm thương mại trên được ứng dụng nhiều
trong sản xuất bánh, trong sản xuất bia, và trong công nghiệp chế
biên thịt.
Ngoài ra, papain còn được sử dạng trong y học để làm lành các
vết thương ngoài da.
Papain thô có hoạt độ khoảng 400-600mƯI/g, papain tinh khiết
có hoạt độ khoảng lOO.OOOmưI/g. Papain hoạt động ở khoảng pH rất
rộng (pH 4,5-10). pH tôi ưu cho hoạt động của papain là 7-8, nhiệt
độ tối ưu cho phản ứng là 55-60°C. Papain rấ t dễ bị m ât hoạt tính ở
pH 3,0 khi có m ặt của oxy. Dung dịch papain ổn định khi cho
cysteine hay sulfite.
B rom elin (EC.3.4.22.5ỉ. Bromelin được sản xuất từ vỏ và chồi của
quả dứa. Chế' phẩm thương mại bromelin thương có hoạt độ vào
khoảng 5 .000- 10.OOOƯI/g (cơ chất là hemoglobin). Tuy nhiên, chê
phẩm bromelin thường không ổn định bằng papain.
Ficin (EC.3.4.22.3). Ficin có nhiều trong nhựa của cây sung. Đặc
tính enzym của ficin gần giống papain. Ficin được ứng dụng nhiều
trong công nghệ chế biến sừa.
Proteinase của vi khuẩn. Người ta thường sản xuất proteinase từ
vi khuẩn và nấm sợi.
Proteinase từ vỉ khuẩn. Có hai loại proteinase từ vi khuẩn dược
bán trên thị trường enzym thế giới. Hai loại này khác nhau râ t nhiỏu
về khoáng pH hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc tm ng ta UI
hoạt động.
410 Chương 7
- Proteinase kiềm (EC.3.4.21.14): Chế phẩm này có tên thương

mại là SUBT4LISIN. Chế phẩm enzym này có khoảng pH hoạt động
7 - 1 1 , trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Chế phẩm
enzym này dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1-6 đơn vị Anson/gram.
Chế phẩm enzym này dạng kết tinh có hoạt tính 25-30 đơn vị
Anson/gram. Chế phẩm subtilysine còn được gọi là enzym tẩy rửa vì
được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa.
- Proteinase trung tính (EC.3.4.24.4): Proteinase trung tính là
metalloenzym, chúng có pH hoạt động 6-9. Chế phẩm enzym này
được sản xuất từ Bacillus subtilis, B. thermoproteolyticus và
Streptomỵcesgriseus.
Chế phẩm enzym thương mại thường là dạng bột, có hoạt tính
0,5-2 đơn vị Anson/lgam. Ngoài ra, chế phẩm thương mại của enzym
này cũng có dạng dung dịch lỏng. Chế phẩm proteinase trung tính
được ứng dụng trong công nghiệp da, bia, và công nghiệp sản xuất
protein thủy phân.
Bảng 7.9 Tính chất của proteinase kiềm và trung tính

stt Tỉnh chất Proteinase kỉềm Proteinase trung tính
1 Khoảng pH hoạt động 7.0-11,0 6,0 - 9,0
2 pH ổn định tối ƯU 7,5 - 9,5 6,0 - 8,0

3 Chất kìm hãm DIFP, PMSF EDTA
Chất kìm hâm khoai tây + đậu nành Sodium dodecylsuifate

4 Cơ chất đặc hiệu Ester khác nhau, amide, peptide Một sổ peptide, ester
DIFP: Diisopropyl fluorophosphate; PMSF: Phenylmethane sulfonyl fluoride

EDTA: Ethylene díaminetetrá acetic acỉd.
Proteinase từ nấm sợi. Proteinase nấm sợi thuộc proteinase acid,

kiềm và cả trung tính. Enzym proteinase thu nhận từ Aspergillus
thường thuộc proteinase acid và trung tính. Các proteinase acid và
trung tính được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo.
Các proteinase kiềm được ứng dụng trong công nghệ thuộc da.
Bảng 7.10 Tính chất proteinase của nấm sợi

Khoảng pH hoạt động pH Ổn đĩnh
stt vsv Chất ức chế
Hemoglobin Casein tối ưu
1 Aspergillus saitoi 3,0 - 4,5 2,5 - 3,0 2,0 - 5,0 NBS
2 Aspergillus oryzae
3,0-4,0 2,5 - 3.0 5.0
(proteinase acid)
5,5 - 7,5 7,0 EDTA
(proteinase trung th h)
6,0 - 9.5 6,5-10,0 7,0 - 8,0 DIFP
(proteinase kiềm )
5 Paecilomyces varioti 3,5 - 5,5 3.0 3,0 - 5,0
6 Phizopus chinensis 5.0 2,9 - 3.3 3 8 - 6,5
7 Mucor pusillus 3,5 4,5 5,6 3,0 - 6,0
6 - Lipase (E C .3 .1 .1 .3 )
Lipase là enzym carboxylesterase tham gia thủy phân gluceride.

Tùy thuộc nguồn thu nhận và tính chất, người ta chia enzym này ra
những ỉoại sau.
fl* P an creatic ỉip a se
Enzym này thu nhận từ tuyến tụy của heo. Chế phẩm enzym có chứa
cả esterase, protease, amylase và các zymogen. Enzym này tham gia phân
hủy triglyceride tự nhiên, dầu, chất béo, acid béo đơn giản và aryl ester.
Các sản phẩm lỉpase thương mại thường trộn ion calcium. Các
ion calcium ảnh hưởng rất tốt đến hoạt tính enzym và tính bền vững
của enzym.
B ảng 7.11 Tính chất lipase từ nhiều nguồn khác nhau
Khoáng pH hoạt động NhiẬtđộ pH Ổn định
stt Nguổn llpase
vồ pH tối ưu hoạt động (°C) hoạt tính
1 Pancrease 6,5-9,5
40-45 5 ,5 -7 ,5
heo non {7,5 - 8,5)
2 Phữopus sp. 6.0 - 7.5
35 - 40 4,0 - 8,0
(7.0)
3 Mucor favanicus 5,5 - 8.0
4 0 -4 5 4,5 -6,5
(7.0)
I
4 Aspergillus niger a- 3,0 - 7,0

Ừ1
5,0 - 7,0
o
o
b- 7,5 * 9,0
5 Pseudomonas sp. a- 4.0 - 5,0
5 0 -6 0 4 ,5 -1 0 ,0
b- 7 0 - 8,5
6 Candida cylỉndracea 5,0 - 7,5 4 0 -4 5 4,5 - 8.5
G h i c h ú : pH: 3,0*7,0 đối với acid béo chuỗi ngắn; pH: 7,5-9,0 đối với dẩu và chất
béo; pH: 4,0-5,0 là pH tối ƯU đối với cà hai isoenzym.
412 Chương 7
-------------------------------------------------------;----------------------------------------------r~
lon caláum tác động đến hoạt tính và sự ổn định của lipase phụ
thuộc vào NaCl có trong chế phẩm. Hàm lượng ion calcium tối ưu là 0,5g/l.
6 - Pregaxtric upase
Enzym này được sản xuất từ nguồn động vật, từ cừu, dê. Enzym
này tham gia quá trình thủy phân acid béo chuễi ngắn trong chất béo
của sữa. Chúng được sử dụng nhiều trong sản xuất phomai đặc biệt.
c- Lipase từ vi 9Ình vật
Nhiều nước trên th ế giới sản xuất lipase từ v s v bằng phương
pháp lên men. v s v sử dụng để sản xuất lỉpase theo quy mô cồng
nghiệp là nấm sợi và vi khuẩn. Các chế phẩm thương mại này
thường chứa lipase và estease.
Lipase từ Aspergillus sp. Trong công nghỉệp người ta thường sử
dụng Aspergillus niger và Aspergillus để sản xuất lipase. Khối lượng
phân tử cửa lipase nấm sợi vào khoảng 20.000*25.000. pH tối ưu nằm
trong khoảng 4,5-6,5. Loại enzym này tham gia phân giải dầu dừa,
dầu ôliu với hiệu suất 48-93%. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong
sản xuất phomai.
Lipase từ Candida cylindracecL Khối lượng phân tử của enzym
này vào khoảng 120.000, pH tối ưu của chúng từ 5,2-7,2. Enzym này
thủy phân dầu ôlỉu đến 95-97%.
Lỉpase từ Rhizopus.sp. Người ta sử dụng nhiều giếng Rhizopus
để sản xuất lỉpase như Rhừiopus arrhizus, R. javanicus, i?. nivens,
R. delemar. Trong đó, giống R.arrhizus được ứng dụng nhiều hơn
cả. Lipase từ Rhizopus cổ khốỉ lượng phân tử 43.000. Enzym này ỉà
glycopeptide chứa 13-14% mannose, chúng hoạt động m ạnh ở pH
5,0-7 0 và n h iệ t độ 30-45ơC.
Lipase từ Mucor sp. Enzym này xúc tác cho chuyển ester hóa
trong vị trí 1,3 của glycerol. Chúng tham gia thủy phân cả acid béo
dài và acid béo ngắn.
Lỉpase từ Pseudomonas sp. Khối lượng phân tử của enzym này
vào khoảng 29.000. Chúng tham gia phân giải chất béo ở pH kiềm.
Phospholỉpase từ heo con. Người ta thường sản xuất
phosphoỉipase A. Chúng tham gia phản ứng chụyển hóa ester hóa của
lecithin th ản h lysoleathin.
ứ n g d ụ n g enzym 413
7- Lactase (EC.3.2.L23)
Enzym này còn được gọi là p-galactosidase. Chúng tham gia thủy
phân lactose thành glucose và galactose. Người ta sản xuất enzym này
từ nấm mem và nấm sợi. Nấm sợi được sử dụng nhiều ỉà Aspergillus
oryzae và Asp. niger.
Bảng 7,12 Tính chất của lactase
Nguổn lactaae
s tt Tỉnh chất lactase
Nấm men Nấm sợi
1 pH hoạt dộng 6.5 - 7.0 4,5 - 6.5
2 Nhỉột độ tối ưu 30 - 75°c 4 0 -5 0 *0
3 pH Ổn định tối ưu và nhiệt độ tối ưu pH: 6.5 -7.5; 30*c pH: 4,5
8« Oxidoreductase
Or Gluco oxidase (EC.1.1,3.4)
Enzym này thường được sản xuất từ Aspergillus niger, A. oryzae
và Peniciỉlium notatum. Chúng tham gia oxy hóa glucose thành acid
gluconic khi có m ặt của oxy theo phương trình sau:
Glucose + 02 + H20 ------ ô - gluconolactone + HjOfe
l+HjO
gluconic add
Dưới tác dụng của catalase H2O2 sẽ bị phân hủy thành cạy và nước.
Glucose oxidase hoạt động trong khoảng pH 2,7 -8,5. Nếu nâng
nhiệt độ đến 80°c trong hai phút chúng sẽ bị biến tính. Enzym này
được áp dụng nhiều trong bảo quản nước quả, trong sản xuất
mayonnais.
ò- Upoxidase (Eai.13.lJ3)
Enzym này còn được gọi là lipoxygenase. Enzym này 06 thể thu nhận
từ bột đậu. Chúng tham gia oxy hóa acid béo. pH hoạt động từ 6,5-9,0.
7.1^ ứng dụng enzym trong công nghiệp thực phẩm
- 1- Úng dụng enzym trong chế biến bội và sàn xuất bánh kẹo
Các nguyên liệu chứa tinh bột không chỉ là nguăn thực phẩm
trực tiếp quan trọng mà còn là nguồn nguyên liệu r ấ t quan trọng để
tạo ra rấ t nhiều ỉoạỉ thực phẩm khác nhau.
414 Chương 7
Trong công nghiệp sản xuất bột và các sản phẩm từ nguyên liệu
chứa tinh bột, ở các nước châu Âu và châu Mỹ, người ta thường sử
dụng một số chế phẩm enzym thương mại theo bảng 7.13.
Bảng 7.13 Một số chế phẩm enzym amylase thương mại
Stt Chế phẩm enzym Tén thương mại , Hãng sàn xuất
1 a-amylase vi khuẩn Tenase Miles ỉab

Optiamyl Miles Kalỉ-chemie
BAN Novo-nordisk
Rapidase Gist-brocades
2 a-amylase vi khuẩn Termamyl Novo-nordisk

chịu nhiệt Taka-them II Miles lab
Taka-lite Miles lab
Opti-therm Miles Kali-chemic
Maxamy! Gist-brocades
3 Amyioglucosidase Diazym Miles lab
Optidex Miles Kall-chemic
AMG Novo-nordisk
Spezym Fiun Biochemical
Amygase Gist brocades
4 p amylase Dextrozym (chứa AMG) Novo-nordisk
Promozym Novo-nordisk
5 Amylase nấm sợi Biozym Amano
MKC. Fugai amylase Novo-nordisk
Fungamyl clarase Miles lab
Ở các nước châu Âu và châu Mỹ, công nghiệp sản xuất bột bắp
đã phát triển từ rấ t lâu. Ngay ở Mỹ, nước có lịch sử không lâu như các
nước khác, nhưng công nghiệp sản xuất bột bắp cũng đã phát triển
rất mạnh ở th ế kỷ 19. Khoảng 50% bột bắp trong tổng số 20x l 06 tấn
bột bắp được sản xuất hàng năm dùng để sản xuất m ật tinh bột. số
còn lại dùng cho chăn nuôi và làm các loại bánh.
Or ứng dụng emym trong sản xuất «ro và các sàn phẩm chứa đường
Hiện nay, các nước châu Âu và châu Mỹ sản xuất siro đường
fructose từ bột bắp (ngô) bằng phương pháp enzym phát triển rất mạnh.
Theo phương pháp này, phôi bắp được xử lý bằng S0 2 và vi
khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra khỏi khối bột bằng ly tâm.
Enzym chỉ được sử dụng sau khi bột đã được hòa vào nước.
Chế phẩm enzym được sử dụng bao gồm cellulase, glucanase,

protease, pectinase. Công nghệ sản xuất siro fructose được trình bày
như sau:
Phân bắp (ngõ), S02 Dáu, gluten và các thành phán khác
Hình 7.1 Quá trình chuyển hóa tinh bột bắp (ngô) thành siro fructose
Theo công nghệ trên, dung dịch tinh bột bắp được điều chỉnh
pH :6 và được hồ hóa ở nhiệt độ cao và được thực hiện theo phương
pháp liên tục. Ở giai đoạn gia nhiệt này, người ta cho một lượng nhỏ a-
amylase để dịch tinh bột có độ nhớt thấp, tránh hiện tượng cháy khét.
Tiếp theo, người ta cho lượng enzym còn lại vào. Đây là giai
đoạn đường hóa rất mạnh để dạt được giá trị DE (dextrose equi
valents) 15-20. Trong công nghệ đường hóa liên tục, thời gian để đạt
được DE 15-20 phải mất hai giờ.
Ngoài tinh bột bắp, người ta còn sử dụng tinh bột khoai tây,
tinh bột mì, tinh bột sắn (khoai mì). Tùy theo nguồn nguyên liệu tinh
bột mà người ta áp dụng kỹ thuật khác nhau cho phù hợp.
Enzym được sử dụng trong công nghệ sản suất siro fructose phải
là những enzym chịu nhiệt. Những ẹnzym này thường được thu nhận
từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus. Ngoài
ra, người ta còn sử dụng a-amylase từ nhiều vsv khác nhau. Đặc tính
của enzym a-amylase từ các nguồn enzym khác nhau được trình bày
trong bảng 7.14.
416 Chương 7
Bảng 7,14 Đặc tính ernym từ các nguồn v s v khác nhau
Khoảng Chất
ỉ *
tel
Khoảng
s tt Enzym Nguổn enzym nhiệt độ hoạt Chức nỉng
pH
ỉ
(°C) hóa
1 a-amylase Aspergillus nìger 4 -6 5 0 -7 0 4.5 -6,5 Thủy phân hạn

nấm sợi A. oryzae chế tình bột
A. awamori
2 a-amylase Bacillus subtiiis 6 -7 4 0 -8 0 6 -7 ,5 Ca2* Thủy phân hạn
vi khuẩn B. amyio liquefadens chế linh bột
ưa ấm
3 a- amylase B. licheniform is 5 ,5 -6 ,5 9 0-12 0 5.8. 110 Ca2* Thủy phản tinh bột
vi khuẩn 6, 115 ở nhiệt độ cao
chịu nhiệt B. stearotherm ophflus 4,5 - 6.5
4 p-amylase B. polymyxa 4-7 5 5 -7 5 5 .60 Tạo ra siro có DE
thấp
5 Pullulanase Bacillus sp 3 .5 -4 .5 5 5 -6 5 4 .6 0 Ca2* Phân cắt mạch
nhánh
6 Amylo A. niger 3 -4 .5 5 5 -6 5 4 .6 0 Đưởng hóa, phân
giuco- cắt Rồn kết 1.4
sidase gỉucoside
Đặc điểm quan trọng nhất của enzym amylase là c h ủ n g hoạt

động ở pH gần trung tính (pH 6). Đặc điểm này giứp ta thực biện các
quá trình đường hóa rấ t dễ dàng. Đặc điểm kỹ thuật của từng công
đoạn sản xuất siro fructose được trình bày trong bảng 7.15.
B ảng 7.15 Điều kiện chuyển tinh bột thành đường trong công nghệ
sản xuất siro fructose
Hàmlượng
Hàm lượng Nhiệt dộ
s tt Các cống đoạn QhisỐDE pH Ca**. Mg'*.
enzym (%) CC)
mg/l mg/l
1 Chuyển hỏa tinh bột
-Dịch hóa lần 1 a-amylase 2 -5 105 -1 1 5 5 ,5 -6 .5 5 0 -1 0 0
(0,01 - 0,02)
-Dịch hóa lẩn 2 a-amylase 1 5 -2 0 9 0 - 9 5 5,5 - 6.5 5 0 -1 0 0
<0.1-0,2)
2 Đường hóa Amyluco-siđase 9 8 *9 9 5 5 -6 5 4 - 4 ,5 5 0 -1 0 0
(0,1)
3 Isomer hóa Glucose - 41% 5 5 -6 0 7 -8 2 2 5-10 0
isomerase fructose
4 Làm giàu fructose 55 - 95%
fructose
ứ n g dụ n g enzym 417.
Trong đó, hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa đóng vai trò rất
quan trọng. Các giai đoạn này thường quyết định các giai đoạn sau và
quyết định đến chất lượng sản phẩm.
DE
Hình 7,2 Quá trình dịch hóa và đường hóa

Trong công nghệ sản xuất siro fructose, nhiều nước trên thế giới
có sử dụng enzym cô" định amyloglucosidase và pullulanase. Phương
pháp này thường thực hiện ở nhiệt độ 60°c và hàm lượng chất khô
trong dịch khoảng 30-35%. Các đặc tính cơ bản của công nghệ sản
xuất siro fructose bằng enzym cô" định được trình bày trong bảng 7.16.
Bảng 7,16 Hiệu suất chuyền hóa tinh bột bằng enzym cố định
trong sản xuất siro fructose
glucose maltose maltotriose maltotetraose

Stt Enzym cố định
(%) (%) (%) (%)
1 p-amylase 1 51 14 34
2 p-amylase-pullulanase 60 8 32
3 p-amylase-pullulanase-a-amylase 2 69 18 11
Ngoài công nghệ sản xuất siro fructose từ nguyên liệu ban đầu là
bột ngô ra, người ta còn tiến hành quá trình isomer hóa glucose để
sản xuất siro fructose. Quá trình isomer hóa glucose để sản xuất siro
fructose. Quá trình isomer hóa được tiến hành như sau:
418 Chương 7
H' c ^ _ CH2
lÔ H
C H -O H c 1
glucoisomerase I
O H -C H o , -C H I
I HO I Ộ
CH CH-OH I
I I
CH----- CH----------- 1
r I
CH2-O H CH2OH
glucose D - fructose
và quá trình công nghệ sản xuất siro fructose như sau:
Siro D-glucose vói DE 95-98
(40-45% DS)
Điều chĩnh pH
Thanh trùng bằng nhiệt hay lọc
Isom erase Isomer hóa

. ị
Xử lý bằng than hoạt tính
Trao dổi ion (catỉon/anion)
Điều chinh pH
Cô đặc (DS 70-72%)
Làm nguội đến 35°c
Isogencose
(chứa 42% fructose)
b’ ứng dụng enzym trong công nghệ sản xuất bánh mì

Các loại hạt ngũ cốc như lúa mì, lúa nước, bắp (ngô), khoai mì
(sắn) như là những nguồn nguyên liệu chính để làm bánh. Trong đó,
chỉ có bột từ lúa mì mới là nguyên liệu để sản xuất bánh mì. Bánh mì
như là một loại lương thực chính của các nước châu Mỹ và châu Âu.
Trong vài thập niên gần đây, bánh mì được coi như một khẩu phần
lương thực của Việt Nam.
Trong sản xuất bánh mì, enzym được xem như một chất phụ gia
cho vào quá trình làm bánh để làm tàng chất lượng bánh mì.
Viện sĩ A.N. Bakh đã nói “Trong điều kiện công nghiệp sản xuât|
bánh mì đã được tự động hóa thì quá trình hóa sinh xảy ra trong khi,
chuẩn bị bột nhào, ổn định bột nhào và nướng bánh có ý nghĩa rất
lớn và bây giờ có thể nói chắc rằng, nếu không nắrr dược các kiến
thức đó sẽ không thể tổ chức sản xuất bánh mì tốt dược”.
Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng enzym nhằm giải
quyết một số vấn đề sau:
- Làm táng nhanh thể tích bánh
- Làm màu sắc của bánh đẹp hơn
- Làm tăng mùi thơm cho bánh.
Sự tác động tương hỗ giữa khả nãng chuyển hóa của enzym cho
vào trong quá trình chế biến và sự hoạt động của nấm men sẽ làm
tăng nhanh chất lượng bánh và đảm bảo được những mục đích trên.
Trong sản xuất bánh mĩ, người ta sử dụng những loại enzym sau.
Enzym protease. Enzym protease được sử dụng trong sản xuất
bánh mì nhằm làm giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, làm
táng hệ số tiêu hóa của protein. Protease được sử dụng trong sản xuất
bánh mì là những protease trung tính.
Enzym p-amylase, a-amyỉase. Trong sản xuất bánh mi, người ta sử
dụng cả a-amylase và cả p-amylase. Các loại enzym này tham gia thủy
phân tinh bột để tạo thành dường- Nhờ đó, nấm men Saccharomyces
cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, COa, làm tãng thể
tích của bánh và tạo ra màu sắc, hương vị tết cho bánh.
420 Chương 7
Nguồn enzym amylase thường sử dụng là từ malt. Tuy nhiên

trong những năm gần đây, nguồn nguyên liệu malt dần dần được thay
th ế bằng nguồn nguyên liệu từ nấm sợi. Các chế phẩm enzym từ nấm
sợi có ưu điểm là trong chế phẩm này không chỉ chứa amylase mà còn
chứa protease và một sô" enzym khác rất có lợi cho quá trình lên men.
Trong khi đó, m alt chủ yếu chứa amylase còn protase và những enzym
khác không đáng kể. Chế phẩm enzym từ nấm sợi chủ yếu thu nhận
từ Aspergillus oryzae. Enzym amylase từ nấm sợi có pH hoạt động tối
ưu là 4,5-5,5.
Ngoài ra, người ta còn sử dựng enzym lipoxygenase từ đậu nành
để tăng khả năng làm trắng bột, phospholỉpase từ nguồn động vật,
hemicellulase để làm tăng chất ỉượng bột.
Tùy theo hoạt tính enzym và điều kiện xử lý bột, người ta
thường cho lượng enzym khác nhau. Thông thường lượng enzym cho
vào bột để làm bánh mì, bánh nổ là hai gam/100kg bột, bánh biscuit
là lỗgam/iookg bột. Tiêu chuẩn enzym đưa vào xử lý các loại bột để
làm bánh như sau:
- Khả năng dextrin hóa: 2000ul/g
- Khả năng dường hóa: 150ul/g
- Khả năng phân giải protein: 7uI/g.
Trong quá trình sử dụng chế phẩm enzym, người ta cho sulfat
amon vào bột như một chất đệm cho enzym hoạt động của amylase.
Trong trường hợp muốn protease hoạt động mạnh, người ta lại sử
dụng chết đệm là ammonium phosphate. N gười ta thường tạo chất
đệm cho amylase bằng cách trộn lượng enzym amylase và tinh bột
theo tỷ lệ 1:1. Hỗn hợp này có tác dụng làm ổn định hoạt tính enzym.
Theo cách này hoạt tính enzym không thay đổi trong một năm bảo
quản. Hỗn hợp enzym và ammonium sulfate này khi cho vào bột để
làm bánh, chất lượng bánh sẽ tăng lên rất nhiều (tăng thể tích, độ
xốp, tăng khả năng giữ hình bánh, tăng mức ổn định cấu trúc ruột
bánh và làm giảm quá trình làm khô của bánh). Ngoài ra, khi sử dụng
chê phẩm enzym sẽ làm giảm tiêu hao nấm men lỏng đến 20%.
Các kết quả nghiên cứu dộng học của các phản ứng xảy ra trong
sản xuất bánh mì cho thấy rằng, lượng đường có sẵn trong bột mì
không đủ cho sự chuyển hóa hóa học cũng như các chuyển hóa sinh
học để đảm bảo chất lượng của bánh mì.
Mặt khác, chất lượng của bánh mì không chỉ phụ thuộc vào
lượng C0 2 tạo ra nhiều hay ít, mà phụ thuộc vào động thái của quá
trình tạo ra nó. Nếu lượng khí CO2 tạo ra chỉ từ lượng đường có sẵn
trong bột mì thì lượng C0 2 này sẽ đạt cực đại ở giờ đầu tiên và giờ
thứ hai của quá trình ỉên men, sau đó lượng khí sẽ giảm, bánh mì sẽ
không đảm bảo chất lượng. Trong công nghệ sản xuất bánh mì, ỉượng
khí C0 2 phải được tạo ra lịên tục từ giờ đầu tiên đến giờ cuối cùng của
quá trình sản xuất. Đặc biệt là quá trình tạo ra CO2 phải được ổn định
10-15 phút dầu khi đưa bánh vào lò nướng.
Khi trong bột có P-amylase hoạt động thì tạo thành CO2 trong
quá trình chuẩn bi bột nhào xảy ra theo chiều hướng[ tă n g v à dạt cực
đại ở giờ thứ tư của quá trình lên men. Quậ trình này rấ t thuận lợi và
hoàn toàn phù hợp với những yêu cầu kỹHhuật của sản xuất bánh mi.
Như vậy, việc duy trì sự tạo thành lượng khí liên tục như vậy là do
hoạt động enzym amylase ta đưa vào bột trong quá trình nhào bột.
Điều này hoàn toàn khác với trường hợp là cho đường vào bột
nhào. Nếu cho đường vào bột nhào thì quá trình lên men sẽ xảy ra rất
mãnh liệt ở những giai đoạn đầu của quá trình lên men. Sau đó, lượng
khí sẽ giảm dần. Sự lên men mạnh ở giai đoạn dầu sẽ làm giảm thay
đổi cấu trúc vật lý của khối bột và sẽ tạo ra màu, mùi không tốt cho
sản phẩm, ở đây cũng cần được làm rõ hơn ảnh hưởng của từng loại
đường được tạo ra trong hoạt động của enzym đối với chất lượng bánh.
Trong quá trình chuyển hóa tinh bột có trong bột mì, một loạt các loại
đường được tạo thành như "glucose, fructose và maltose. Trong đó,
maltose có ý nghĩa quan trọng nhất đối với chất lượng bánh mì.
Ý nghĩa quan trọng của việc sử dụng chế phẩm enzym trong sản
xuất bánh mì là khi ta sử dụng enzym, nhờ hoạt động của nó mà
lượng đường được tạo thành từ từ, không tập trung quá nhiều ỏ giai
đoạn đầu hoặc ở giai đoạn cuối của quá trình nhào bột. Chính vi thế,
422 Chương 7
enzym như một chất điều hòa rất có hiệu quả cho quá trình lên men,
tạo C0 2 trong suôt quá trình kỹ thuật. Như vậy, ở một góc độ nào đó
ta sử dụng enzym trong sản xuất bánh mì như một yếu tô" điều khiển
kỹ thuật cho quá trình sản xuất này.
Các enzym thủy phân protein (enzym protease) được ứng dụng
như một tác nhân làm giảm độ nhớt trong bột nhào. Nhờ đó bột nhào
sẽ có đủ điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển của nấm men và
quá trình tạo ra CO2 vừa ổn định vừa cao, đảm bảo cho việc tạo thành
các phản ứng melanoidin trên vỏ bánh, khi nướng bánh sẽ đẹp hơn
mẫu bánh không có protease. Tuy nhiên cũng cần luu ý rằng, nếu ta
sử dụng protease có hoạt tính quá mạnh, cấu trúc gluten sẽ bị phá hủy
và khi đó khả năng giữ CO2 sẽ giảm cấu trúc bánh sẽ rấ t dễ bị thay
đổi nhau, bánh có nở nhưng sẽ nhanh chóng teo lại khi nhiệt độ bánh
trở về nhiệt độ thường của phòng.
Trong sản xuất bánh mì, người ta thường sử dụng protease acid
của nấm sợi. Cũng là chế phẩm của protease nấm sợi, protease của
nấm sợi từ phương pháp nuôi cấy bề m ặt có ưu điểm hơn pro tease của
nâm sợi nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm).
Các chế phẩm protease nấm sợi được bán rộng rãi trên th ế giới
gồm có Amano “A” cỏa hãng AMANO, Fungal protease của hãng Miles
lab. Tính chất của một so protease acid từ nguồn nấm sợi ta có thể
tham khảo ở bảng 7.10 “Tính chất proteinase của nấm sợi”.
Chất lượng bánh mì được quyết định chủ yếu do hương và vị bánh.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, nguyên nhân của sự tạo màu của vỏ bánh và
chất thơm của bánh là do các phân ứng tương hẫ oxy hóa-khử giữa đường
khử và các amino acid. Kết quả của các phản ứng tương hễ này là tạo ra
những phản ứng trung gian furfurol và oxy methyl furfurol.
Bột nhào và bánh mì chứa gác amino acid tự do. Lượng amino
acỉd này giảm nhiều khỉ nướng bánh do quá trình tham gia vào phản
ứng melanoidin. Lượng amino acid này giảm rấ t m ạnh khi trong bột
có chứa nhiều đường khử, do đó phản ứng màu xảy ra rấ t mạnh.
ứ n g dụng enzym 423
Sự tạo thành oxy metil furfurol có thể do đường bị phân hủy bởi
nhiệt và cũng có thể do phản ứng Maiar. Chất oxy methyl furfurol chỉ
được tạo ra khi ở nhiệt độ cao và thấy chúng tích tụ nhiều ở vỏ bánh.
Trong ruột bánh, nhiệt độ chỉ dừng lại ở 93-95°C, nên lượng oxy
methyl furfurol không thấy hình thành.
Khi ta sử dụng chế phẩm enzym từ nếm sợi Aspergillus aryzae
hay Aspergillus awamori, lượng đường khử và các amino acid tự do
tăng lên. Đây là nguyên nhân chính dẫn tới sự tạo thành màu và mùi
trong sản xuất bánh mì.
Ở Nga, người ta sử dụng chế phẩm có tên thương mại là
AmiIorizin-P810X. Chế phẩm này được sản xuất từ nấm sợi
Aspergillus oryzae chủng 476-1. Chế phẩm enzym amilorizin-P810X
chứa cả các loại amylase và cả protease. Chế phẩm amilorizin-P810X
thường ở dạng cô đặc tinh khiết và cả dạng bột. Lượng sử dụng chế
phẩm amilorizin-P810X dạng cô đặc là 0,002%.
Ở Mỹ, hầu hết các xí nghiệp sản xuất bánh mì có sử dụng
enzym. Các chế phẩm enzym của Mỹ thường có dạng hạt. Hãng sản
xuất chế phẩm enzym dùng cho bánh mì lớn nhất ở Mỹ là hãng Rom
v à Khaac. Hãng này sản xuất chế phẩm enzym có tên thương mại là
GUMASE NR-150. Ngoài ra, người ta còn bán các chế phẩm VITASE và
VITOLA. Các chế phẩm này là phức hợp lipoxygenase của đậu nành,
còn chế phẩm Del Park.P/A là hỗn hợp enzym amylase và protease
được sử dụng rất phổ biến.
Ở Anh, người ta sử dụng các chế phẩm enzym amylase chủ yếu
từ nấm sợi Aspergillus oryzae bằng phương pháp nuôi cấy chìm. Các
enzym protease và amylase thường được tách riêng biệt. Khi sử dụng,
họ thường sử dụng liều lượng rất chính xác từng loại enzym.
ở Nhật, bánh mì không phải là lương thực chính nhưng những
cơ sở sản xuất bánh mì ứng dụng enzym rấ t có hiệu quả. Việc ứng
dụng enzym vào sản xuâ't bánh mì ở Nhật bắt đầu từ 1952. Điểm đặc
biệt là trong công nghệ sản xuất bánh mì, Nhật không chỉ là nước
châu Á đầu tiên sử dụng enzym mà cũng là nước sử dụng nhiều loại
424 Chương 7
enzym nhất, s ố loại các chế phẩm enzym được sử dụng tại Nhật lên
tới 50 loại. Các chế phẩm enzym sử dụng để sản xuất bánh mì tại
N hật thường là hỗn hợp amylase và protease.
c- ứng dụng enzym trong sản xuất bánh kẹo
Mục đích của việc sử dụng enzym vào sản xuất các loại bánh quy
là làm tăng mùi và vị của bánh. Khi chế biến bột thành các loại bánh
qui, các enzym protease và amylase của bột hoạt động làm táng hàm
lượng các amino acid tự do và làm tăng lượng đường khử. Đường khử
và amino acid có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng
oxy hóa-khử và kết quả tạo cho bánh quy có mùi, vị và màu hấp dẫn.
Tuy nhiên, nếu chỉ tận dụng lượng enzym có sẵn trong bột thì
phản ứng trên xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột
xấu để sản xuất bánh. Do đó, người ta thường cho thêm enzym
protease và enzym amylase vào chế biến bột trong quá trình sản xuất
bánh quy. Khi đó lượng đường khử và lượng amino acid tự do sẽ tăng
lên, phản ứng oxy hóa-khử sẽ được tăng cường.
Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đường, người ta
thường sử dụng các enzym thủy phân saccharose. Các sản phẩm của
quá trình sản xuất này gồm kẹo viên, bánh quy kem với nhân trái
cây, các loại kẹo mềm. Ở Nga, khi sản xuất các sản phẩm bánh kẹo từ
đường, người ta sử dụng chế phẩm invectin (tên thương mại của
enzym invertase).
2>ứng dụng enzym pectìnase sản xuất nước quả vả rượu vang
a- Các chế phẩm enzym
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là
một tiên bộ khoa học rấ t lớn. Các chế phẩm enzym được sử dụng
trong sản xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều
loại enzym và cũng có thể chỉ là một loại enzym riêng biệt. Việc sử
dụng hỗn hợp enzym hay từng loại enzym riêng biệt phụ thuộc vào
nguyên liệu và vào sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các
loại chế phẩm enzym như trình bày trên còn phụ thuộc vào công nghệ
sản xuất (các yếu tố kỹ thuật).
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng
một trong sáu nhóm enzym sau.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả đục. Mục
đích sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích
ly để thu được lượng sản phẩm lớn.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả trong,
không chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là
làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các chất protein,
pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục
nước quả.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng để ỉàm tàng khả năng đồng hóa
nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu
vang, nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng để ngăn cản quá trình oxy hóa
và làm cản trở sự phát triển của vsv hiếu khí phát triển trong nước
quả, trong rượu vang.
• Nhóm chế phẩm enzym dùng vào mục đích chông lại sự lại
đường trong sản xuất siro thành phẩm.
Việc sử dụng các chế phẩm enzym phải được xem xét cẩn thận
trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc
điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc
tự nhiên của sản phẩm. Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzym
phảỉ đảm bảo giữ đường màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những
màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển phản ứng enzym. Theo
màu sắc tự nhiên, các loại trái cây được chia làm hai loại:
Trái cây cổ màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam ,bưởi....
Trái cây cổ màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, m ận đỏ,
nho đỏ, mơ, mận đen, dâu....
Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một
loạt các enzym sau:
- Enzym endo-PMG để làm giảm độ nhớt của dịch quả
- Enzym PE làm tăng hiệu suất trích ly
- Enzym khác như cellulase, hemỉcellulase, protease không
bắt buộc.
426 Chương 7
Tuy nhiên, nếu cho thêm những enzym này vào sẽ làm tăng khả
năng trích ly vật chất hòa tan có trong tế bào quả.
Riêng enzym PTE, cần lưu ý là enzym này phân hủy protopectin,
thường không cố lợi cho việc thoát các chất có trong tế bào quả. Do đó
trong trường hợp này, người ta không sử dụng enzym PTE.
Sự có m ặt của enzym ascorbinatoxidiase thường gây ra sự phân
giải vitamin c.
Các enzym tham gia quá trình oxy hóa như poly phenoloxidase,
peroxidase, catalase thường làm biến màu nước quả và làm giảm giá
trị cảm quan khác. Do đó, trong chế biến nước quả không nên dùng
những loại enzym này.
Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần luu ý phải bảo tồn chất
màu antocian. Chính vì th ế không được dùng những loạỉ enzym có
khả năng phân giải antocỉan.
Ascorbic acid là một trong những chỉ tiêu quan trọng cỏa nước
quả, do đó trong khi chế biến nước quả tuyệt đối không được sử dụng
enzym ascorbicnatoxidase.
Trong nhiều trường hợp, enzym protease đóng vai trò rất quan
trọng trong quá trình làm trong nước quả. Chính vì th ế khi cần làm
trong nước quả, người ta thường kết hợp protease acid với enzym phân
hủy pectin.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế
phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemỉcellulase, cellulase.
Trong đó, enzym pectintrancelimitase đóng vai trò quan trọng nhất.
Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt
enzym polygalacturonase, đặc biệt là không được chứa enzym
endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt
của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả.
Việc ứng dụng enzym vào chế biến nước quả và trong sản xuất
rượu vang bắt đầu từ năm 1930. Khi đó, Z,J.Kertesz và A. Meilliz được
xem như những người đầu tiên đưa ra ý tưởng sử dụng enzym trong
chế biến rau quả. Từ đó đến nay, trên th ế giới cổ rấ t nhỉều loại chế
phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả.
Các chế phẩm đó được liệt kê trong bảng 7.17.
Bảng 7,17 Khả năng hoạt động của một số chế phẩm enzym
sử dụng trong chế biến rau quả
Hoạt độ phân giải ul/g Khả nâng phân hủy (%)

stt Tên chế phẩm Cellulose Hemi-
Pectin Protỉt Protopectin Cellulose
c, c, celluiose
1 Pectavamorin P10X-22 24,6 12,8 0,233 3,59 23 21 35
2 Pectavamorin P10X-16 22,6 6,12 0,213 1.14 29 90 61
3 Pectnigrin OP.IOX 42,8 5,09 0 0,34 35 99 80
4 Pectnigrin G.10X 38,6 0 0,01 0,34 69 68 66
5 Pectnigrin P10X 37,9 1 C,26 0,04 0,32
6 Pectnigrin P10X không chất độn 53,2 8,0 0,09 0,42
7 Pectnigrin P10X có bentonỉt 19,6 4,13 0,05 0,16
8 Rapidase c (Pháp) 53,1 9.79 0,14 0 ,1 2 98 100 91
9 Pectolitic (Anh) 53,1 1,6 0 0,1
10 Pectỉpol có chất độn mạt cưa 19,5 0,8 0 0,1
11 Bistrin 16,5 0 0,03 0,17
12 Celluzin (Nagaze) 100 98 59
13 Celluzin (Daivakasei) 98 98 86
Ngoài những chế phẩm enzym trên, hiện nay trên thế giới có
rất nhiều chế phẩm pectinase có hoạt tính rất cao như: rohapect (RM),
rohament (RM), pectimex (NO), ultrazym (NO), biopectinase (BN),
panzym (BOI), pectolase (GT), klerzym (GB), spark (SOE), sumizym
(SN), pectinol (GR).
b- Cơ ch ế tác động của enzym pectinase
Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym
nhằm hai mục đích cơ bản.
- Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu
nước quả.
- Làm trong và ổn định chất lượng nước.
428 Chương 7
Phá vỡ thành tể bào. Tê bào thực yật được câu tạo bằng vỏ tế
bào (thành tế bào), vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rấ t hữu hiệu
và tạo hình cho tể bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các
chết pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ
sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất có trong tế bào thoát
khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn
chứa các enzym trong nhóm ceỉỉulase. Các loại enzym này sẽ ỉàm phá
*
vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn.
Làm trong nước quà. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào
thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng
đáng kể và pectin thường gây hiên tượng độ nhớt cao và gây đục nước
quả. Hàm ỉượng pectin ở một số loại quả được trình bày ở bảng 7.18.
Bảng 7.18 Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả
stt Nguổn pectin Pectin Chất ester hóa stt Nguổn pectin Pectin Chất ester hóa
(%) (%) (%) (%)
1 Nho 0.2-1,0 1 0 -6 5 6 Vò chanh 32,0 5 0 -6 5

2 Dịch nho 0,01 - 0,09 - 7 Thịt chanh 25,0 -
Vò cam 2 0 ,0
3 Táo 0.5-1.6 70-00 8 Vỏ lụa 29.0

Dịch quà 16.0
4 Dịch táo 0 ,2 - 9 Củ cải đường 30,0
Khốỉ nghiền
5 1 ,6 -
nho den
Gác chất protein cổ trong bào tương, màng tế bào và gian bào.
Pectin chứa polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lượng
polygalacturonic acid chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách
thành haỉ phần:
- Phần trung tính-phức chất galactanoaraban
- Phần acid-acid pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào
và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin.
Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá cao và một
lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin

ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metocil
hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt.
Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế
bào khó liên kết với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin
thường có mối liên kết hydro và liên kết nguyên tử yếu hơn so với
cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại enzym. Các
enzym đó được tóm tắ t trong bảng 7.19.
Bảng 7.19 Các loại enzym pectinase
stt Enzym Enzym Phản ứng xúc tác

(tên gọi theo hệ thống) (tồn thường gọi)
Pectin-pectinhydrolase Pectinesterase Pectin + H20 = n metanol + pectic acid

1
(3.1.1.11)
Poly-a-1,4.galacturonỉd- Endopoly Thủy phftn liên kết a-1,4-D-galacturanỉc

2 glycano hydrolase- galacturonase trong galacturonid không theo một trật tự
PG (3.2.1.15) (Endo-PG) nào
Poly-a-1,4-D galac- Exo-poly Thủy phân lỉên kết a-1,4-D-galacturonid

3 turonidgalacturon- galacturonase trong pectat, Uong galacturonit vđi sự đứt
hydrolase (3.2.1.40) (exo-PG) mạch của acid 9 alacturonic
Poly-a-1,4-D galactu-ronid Endopoỉymetil - Thủy phân liên kết a - 1 ,4-D-galacturonid

metilester- galacturonase trong pectin không ttieo một ừật tự nhất
4
glycanohydrolase (Endo-PMG) định
(3.2.1.41)
Poly - a - 1,4 D-galactu - Exo-pectatliase Thùy phân liên kết a-1,4-D galacturonit ừohg
ronid dìgalacturonoliase (exo-PKTE) pectat vởỉ sự tạo thành A-4,5 acid
5
(4.2.99.7) degalacturonic khổng theo một trật tự nhất
định
Poly-a-1,4 D-galacturo-nỉd Endopectatìiase Thủy phân liên kết a - 1 ,4-D-galacturonid

glicanoliase (PETE) trong pectat, ừong galacturonid với sự tạo
6
(4.2.2.1) ttiành nối đôi không theo một trật tự nhất
định
Poly-ữ-1,4 D-galactu*ronid Endopectinliase Thủy phân liên kết a-1,4-D galacturonit

7 mety lester-glycanoliase (Endo-PTE) trong pectin với sự tạo thành nối đôi khỏng
(4.2.99.8) theo một trật tự nhất định
430 Chương 7
c- Hiệu quả của việc sử dụng enzym pectinase

N hững bất lợi kh i sử dụng enzym
Nước quả được sử dụng enzym có n h iều ưu điểm , tuy n h iê n việc
sử dụng enzym cùng có n h ữ n g nhược điểm n h ư xảy ra n h ữ n g b iến đổi
b ấ t lợ i về v s v và v s v .
N ếu xử lý tro n g th ờ i gian n g ắn , quá tr ìn h oxy h ó a và sự nhiễm
v sv không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu xử lý enzym trong thời gian
dài sẽ xảy ra quá trình oxy hóa và sự nhiễm vsv.
Nfnfời ta n g ă n ngừa quá trìn h oxy h ó a tro n g nước quả b ằn g một
tro n g ba cách sau:
- Cho ascorbic acid
- Cho anhydric sulfur
- Cho enzym glucose oxidase.
^ rư ớ c k h i dùng n h ữ n g c h ấ t chống oxy h ó a trê n , người ta thường
p h ải đun nó n g dịch quả. K hi đun n óng dịch quả, các enzym oxy hóa có
tro n g nước quả sẽ bị ức chế. Theo đó, nước quả được ly tâ m để làm
sạch cơ học, sau đó nước quả được đun n óng tới 8 0 °c và sau đó hạ
n h iệ t đ ến n h iệ t độ tố i ưu của h o ạ t động của enzym . Người ta thường
cho lượng ascorbic acid tớ i 5m g/100 gam nước quả đ ể h ạ n ch ế quá
trìn h oxy hóa.Y
Đế hạn chế sự phát triền của vsv trong trường hợp sử dụng enzym
để xử lý nước quả, người ta thường áp dụng những biện pháp sau.
S ử dụng sorbic acid , ascorbic acid, benzoate natri. Sorbic acid
thường được sử dụng trong Iiước quả với liều lượng ỉà 0,03%. Acid này
h o ạ t động ở pH r ấ t rộ n g (pH 3,9-9,2). Sorbic acid ức c h ế sự p h á t triể n
của n ấ m m en và n ấ m sợi, k h ô n g làm th a y đổi vị v à m ùi của sản
p h ẩm . B enzoate n a tri thư ờng được sử dụng tro n g nước quả với liều
lượng là 0,15%.
Sử dụng anhydric sulfur. Người ta thường sử dụng anhydric
su n fu rơ đế bảo q u ản nước quả b á n th à n h p h ẩm . C h ấ t n à y vừa có khả
n ă n g tiêu diệt v sv , vừa có khả năng chống oxy hóa. Khi cho chất
a n h y d ric sunfurơ vào d ịch quả, ch ú n g dễ d à n g bị oxy hóa. K hi đó
lượng oxy có trong dịch quả ít dần và đến mức triệ t tiêu, gây ra
trạn g thái thê hiệu oxy hóa-khử trong dịch quả thay đổi và v sv sẽ
bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Tuy nhỉên cần phải lưu ý rằng, nếu lượng
anhydric sulfur quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế hoạt động của enzym.
Các thí nghiệm cho thấy, nếu hàm lượng anhydric sulfur 0, 1 % làm
giảm hoạt tính chế phẩm enzym, nếu hàm lượng 0,5% thì enzym
hoàn toàn bị ức chế.
Xử lý nhiệt. Người ta có thể đun nóng dịch quả để bảo quản
nước quả. Tuy nhiên, việc đun nóng dịch quả không thể quá cao vì
chính nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan, thành phần hóa
học và hoạt tính enzym.
Đa số enzym phân giải pectin bị mất hoạt tính ở 70°c và chúng
hoạt động mạnh ở 45-50°C. Tuy nhiên ở nước quả lên men, người ta
sử dụng enzym để xử lý nước quả ngay ở nhiệt độ thường (trùng với
nhiệt độ lên men).
Hiệu quả của việc sử dụng enzym
Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước
quả và rượu vang cho thấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất
nước quả và chất lượng rượu vang rất cao.
Khi tiến hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và sản
xuất rượu vang, người ta đặc biệt quan tâm đến hai yếu tố có tính
chất quyết định đến hiệu quả enzym.
- Nguyên liệu
- Khả năng xay, nghiền và làm nhỏ nguyên liệu.
Nguyên liệu. Không phải tấ t cả các loại quả đều có khả năng
cho hiệu suất cao khi xử lý enzym. Khi sử dụng enzym trong chế biến
nước quả và chế biến rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật
cho phù hợp. Khái niệm này hoàn toàn khác khái niệm độ chín kỹ
thuật khi trong công nghệ người ta không sử dụng enzym. Độ chín kỹ
thuật để sản xuất nước quả là giai đoạn chín của quả, đảm bảo tách
dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa các chất có giá trị dinh dưỡng
cao và hương vị thích hợp.
Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất
dịch quả cao không trùng hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh
dưỡng. Ở nhiều loại quả, khả năng thoát dịch quả không trùng với
mức độ chín. Nhiều khi quả th ật chín, khả năng tích tụ chất dinh
432 Chương 7
dưỡng cao nhưng lại không thuận lợi trong việc tách nước quả. Chính
vì thế, từng loại quả, người ta phải tiến hành phân loại và xác định
độ chín kỹ thuật riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzym và
thu hồi dịch quả.
Cồng việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải
làm trước khi sử dụng enzym là quả phải được làm sạch bằng cách
rửa nhiều lần để loại bỏ những tạp chất, v s v . Sau dó là các quá trình
kỹ thuật như xé nhỏ, nghiền,... để tăng khả năng tác động của enzym
và tăng hiệu suất thu nhận dịch quả.
Khả năng làm nhỏ nguyên liệu. Làm nhỏ nguyên liệu là khâu
kỹ thuật rấ t quan trọng, nó quyết định đến hiệu quả tác động của
enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng dịch quả.
Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả,
người ta chọn những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền,
cắt, chà hay xé nhỏ.
Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số
tế bào sẽ bị phá hủy, m ất tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương
pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa
công nghệ. Những đặc điểm kỹ thuật sử dụng enzym cho từng loại quả
và cho từng loại sản phẩm từ quả được trình bày chi tiết như sau:
- Sử dụng enzym để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực
tiếp từ quả táo và quả vả.
Ngày nay, nước quả trong hoặc nước quả đục được sản xuất ở
nhiều nước trên th ế giới. Tùy theo hàm lượng đường và acid có trong
quả, người ta chế biến nước quả có cho thêm đường hoặc acid hay
không. Đối với nước quả có hàm lượng đường và acid thấp, người ta
thường phải bổ sung đường hoặc acid để điều chỉnh chất lượng cuối
cùng của sản phẩm. Hàm lượng pectin cao trong dịch quả thường
không có lợi vì khi đó độ nhớt của sản phẩm rấ t cao. Việc thủy phân
pectin có trong dịch quả còn làm cho những sản phẩm dịch quả trong
không bị đục. Tuy nhiên, việc xử lý pectỉn bằng các enzym pectinase
không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần phải giữ một
lượng pectin n h ất định trong sản phẩm nước quả. Chính lượng pectin
này sẽ giúp cho chất lượng nước quả tốt hơn.
Trong sản xuất nước quả táo và nước quả vả, người ta sử dụng
chế phẩm pectinase cho hiệu quả rất cao. Khi xử lý nước quả ở 50°c
trong 2 giờ, hiệu suất tách nước quả tăng được 20%, ở 37-40°C sau 2-4
giờ xử lý, hiệu suất tách nước quả tăng 20-25%. Các nghiên cứu và
thực tế sản xuất đều cho thấy hiệu quả xử lý nước táo rất cao. Chính
vì thế, việc ứng dụng enzym, pectinase được áp dụng ở tấ t cả các nhà
máy sản xuất nước táo trên thế giới. Trong khi xử lý nước quả bằng
enzym pectinase, người ta thường cho thêm ascobic acid vào để chống
quá trình oxy hóa của nước táo.
Bảng 7.20 Hiệu quả xử lý nước táo và nước vã bàng chế phẩm pcctinase
I
stt Loại nước quả Hiệu Hàm Độ Đildng Pectin Chát Điếm
suất lượng acid (%) (%) chát đánh
nước chất chuẩn (%) giá
quà khữ (%) cểm
(%) <%) ' 'quan
1 NƯỚC quả từ táo

a- Không cho chế phẩm enzym 71,2 10,2 0,53 6.7 0,33 0.04 4,5
b- Có cho chế phẩm enzym 78,8 11 5 062 8,0 0 15 0,02 4,8
2 Nước quả vả
a- Không cho chế phẩm enzym 49,2 8,5 0,91 5,62 0,26 C.09 3.8
72,4 10,2 1.16 7,4 012 0,16 4,3
b- Có cho chố phẩm enzym
- Sản xuất nước quả uống ngay tờ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử.
Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả
dục từ các loại trái cây trên. Trong quá trình sản xuất, người ta cho
thềm đường và điều chỉnh lại lượng acid cho phù hợp.
Các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin. Do đó việc sử
dụng các chế phẩm enzym pectinase để loại bỏ khả năng gây đục cho
nước qưả trong cũng như ổn định và nâng cao chât lượng dịch quả là
điều cần thiết.
Người ta rửa sạch các loại quả trên bằng nước của vòi hoa sen.
Sau đó, các loại quả trên được đem chà thành dạng purê. Quả nghiền
được đun nóng ồ nhiệt độ 40-50°C được cho vào máy trộn. Tại dây
nước quả dược phối trộn với tỷ lệ một phần nước quả và 10 phần nước
enzym có lượng enzym 0,03%. Riêng dối với nước dâu tây, người ta cho
434 Chương 7
thêm vào 0,03% ascorbic acid để làm chất chống oxy hóa. Hỗn hợp
này được giữ ở nhiệt độ 40°c. Thời gian lưu ở nhiệt độ 40°c là 4-8 giờ.
Nước quả sau đó được cho qua máy ép và được đun nóng đến 45°c.
Tiếp đó, người ta đem nước quả ly tâm và cuối cùng là lọc qua máy ép
lọc khung bản. Hiệu suất thu nhận nước quả theo phương pháp này
được trình bày trong bảng 7.21.
Bảng 7.21 Hiệu quả việc xử lý nước quà dâu tây, anh đào bằng enzym
Độ
Hiệu suất Chất khô Đường Pectin Chất cháỉ Điểm
stt Loại nước quả acid
(%) <%) (%) (%) (%) cảm quan
(%)
1 Nước quả dâu tây
a- Không dùng enzym 71,2 1 0 ,2 0,53 6,7 0,33 0,04 4.5
b- Dùng enzym 78,8 115 0,62 8 ,0 0,15 0 ,0 2 4.8
2 Nước quả mâm sôi

a- Không dùng enzym 49,2 8,5 0,91 5,62 0,26 0.09 3,8
b- Dùng enzym 724 1 0 ,2 1,16 7,4 0 ,1 2 0,16 4,3
- Sản xuất nước quả từ nho

Nước uống từ trái nho là loại nước uông trong chứ không thụộc
loại nước uống đục. L oại nước uống từ nho d ạn g tro n g th ư ờ n g được sản
xuất nhiều ở hầu hết các nước châu Âu và châu Mỹ. Tuy nhiên hiện
nay, người ta cũng sản xuất nước uống từ nho dạng đục (chủ yếu từ
nho có màu đỏ). Trong đó, Ý là nước sản xuất nước uống dạng đục
nhiều nhất, sau đó là Pháp, Rumani. Nho là loại quả cho nhiều dịch
và chứa nhiều đường. Tuy nhiên, nước nho thường chứa nhiều thịt
quả. Trong thịt quả có nhiều pectin, dễ gây đục hoặc nếu thu nhận
dịch quả trong thường không cho hiệu suất cao. Chính vì thế người ta
phải xử lý nước nho bằng chế phẩm pectinase. Lượng enzym pectinase
được sử dụng trong trường hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lượng
nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đẫ làm nát, người ta xử lý
p e c tin a se với liều lượng 0,2% so với khối lượng nho. Thời gian xử lý
bằng enzym là 3 giờ ở nhiệt độ 45°c. Bằng phương pháp xử lý này
người ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3%
đôi với nho trắng và từ 66-82,2% đôi với nho đỏ.
ứ n g dụ n g enzým 435
Đối với nho trắng nghiền kỹ, khi xử lý enzym pectỉnase trong
thời gian 2,5-3 giờ ở nhiệt độ 40-45°C, hiệu suất tăng 14-18%. Nếu
tiếp tục xử lý nước quả sau giai đoạn xử lý trên thêm 4-5 giờ ỏ nhiệt
độ 40-45°C, nước táo sẽ hoàn toàn trong. Ở giai đoạn làm trong dịch
quả này, người ta đun nóng dịch quả ồ giai đoạn 1 lên 90°c, sau đó
người ta hạ nhiệt xuống 50°c và khi đó mới sử dụng enzym để làm
trong nước quả. Trong khi ở những mẫu dịch không xử lý bằng enzym,
quá trình làm trong nước nho phải kéo dài 2-4 tháng. Hiệu suất thu
dịch không sử dụng enzym chỉ đạt trung bình 65%.
Quá trình sản xuất nước nho trắng có xử lý enzym pectinase
được thực hiện như sau:
Nho được rửa sạch, tách cuống, loại hạt bằng máy xé và chứa
chúng vào các thùng trong thời gian 6-8 giờ hoặc các thùng lên men
liên tục trong thời gian 3-4 giờ. Trong thời gian lưu trữ này, người ta
cho 0,02% chế phẩm pectinase và 0,01 anhydride sulfur hoặc 0,03%
ascorbic acid, sau đó người ta ép để thu nhận dịch nho. Dịch nho
được làm nóng đến 80°c, sau đó là nguội nhanh xuông 40°c. Nước
nho ở 40°c được cho thêm 0,01 % enzym pectinase. Tiến hành quá
trình thủy phân cho độ nhớt giảm tới độ nhớt của nước nho trong
suốt. Thời gian thủy phân này kéo dài khoảng 6-8 giờ. Kết thúc quá
trình thủy phân, người ta lại đun nóng dịch quả lần thứ hai đến*
80°c, làm nguội đến 20°c và lọc nước qụả qua máy lọc ép, tiến hành
rót chai và đem thanh trùng.
Quy trình sản xuất nước nho đỏ cồ sử dụng enzym pectinase
như sau:
Nho đã rửa sạch, tách cuống, xé nhỏ và đun nóng đến 85-90°C
trong máy gia nhiệt và ngay lập tức làm nguội đên nhiệt độ 45-50°C.
Giữ dịch nho ồ nhiệt độ này trong thời gian 4-6 giờ trong thùng kín
hoặc 3-4 giờ trong những thiết bị lên men liên tục. Người ta thường
cho enzym pectinase vào giai đoạn này với liều lượng 0,03%. Sau thời
gian thủy phân bằng enzym như trên, người ta tiến hành lọc ép. Dịch
lọc được cho thêm 0,03% enzym pectinase để làm trong dịch quả. Quá
trình làm trong dịch quả được thực hiện trong thời gian 6-8 giờ. Sau
đó nước quả được lọc, rót chai và đem thanh trùng.
436 Chương 7
Bảng 7*22 Hiệu suất và chất lượng nước nho sản xuất theo
phương pháp xử lý pectinasé
Chết khỏ Hiệu suất Độ acid Đường Chít chát Cặn Điểm cảm
stt NƯỚC nho
(%) (%) (%) (%) (%) (%) quan
1 Mẫu dối chửng 17,5 65,0 0,54 15,1 0,125 3,0 4,2
2 Mấu xử lý bằng chế 19,0 70,1 0 ,6 8 16,85 0,135 cỏ một a 4.5
phẩm pectỉnase cá-pectat
- Sản xuất nước mận

Người ta thường sản xuất nước quả pha đường từ mận. Mận là
loại quả cho hiệu suất thu nhận nước ép rấ t thấp. Để thu nhận nước
quả từ mận, người ta phải áp dụngphương pháp nhiệt và enzym. Quá
trình công nghệ được thực hiện như sau:
Mận được rửa sạch, đun nóng với nước. Nước được cho vào
khoảng 15-20% so với khối lượng mận. Nhiệt độ dược giữ ỏ 85-90°C
trong thời gian 5-20 phút tùy thuộc vào độ chín của mận. Sau đó cho
khối quả qua hệ thấng ép và xử lý enzym pectinase ở nhiệt độ 40-
45°c trong thời gian 3-6 giờ. Dịch quả dược thu nhộn bằng máy lọc ép
lần nữa, đóng chai và đem thanhítrùng.
Phương pháp xử lý nhiệt và enzym kết hợp đã cho ta hiệu suất
đạt tới 78,9% so với hiệu suất 58,2% khi không xử lý enzym.
3- ứng dụng enzym proteose đề làm trong và ổn định chất lượng
nước quả và rượu vang
Một trong những nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc làm
trong nước quả và gây đục nước quả là protein. Hỉện nay người ta sử
dụng các phương pháp sau để phá hủy protein và loại protein:
- Xử lý nhiệt
- Xử lý bằng chất keo tụ
- Xử lý bằng chất hấp phụ
- Xử lý bằng enzym.
Phương pháp xử lý nhiệt, chất keo tụ, chất hấp phụ thường làm
giảm chất lượng sản phẩm. Phương pháp ưu điểm nhất là sử dụng enzym
protease. Các loại nước quả thường có độ pH thấp, do đố ta không thể sử
dụng protease trung tính và protease kiềm mà phải sử Himg protease
acid. Hiện nay, người ta đã sản xuất ra nhiều chế phẩm protease acid.
Các chế phẩm protease acid được sử dụng để xử lý nước quả thường hoạt
động mạnh ở pH 2,5-3,5. Các protease acid thường được sản xuất từ Asp.
ergillus oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus, Asp. saitoL
Trong sản xuất nước quả hay rượu vang, người ta thường làm
trong nước quả bằng enzym protease với liều lượng 0,1-0,3%. Thực tế cho
thấy các chất bảo quản nước quả, rượu vang như sorbic acid 0,05-0,06%,
benzoate natri 0,06-0,07%, anhỉdrỉc suníurơ 0,05-0,1% không ảnh
hưỏng đến hoạt tính protease acid trong xử lý nước quả. Trong sản
xuất rượu vang, khi hàm lượng cồn đạt 8% cũng hoàn toàn không ảnh
hưỏng đến hoạt tính protease acid.
4- Khừ vị đắng của nước quả bằng chế phẩm enzym
Nước quả được sản xuất từ quả có múi như chanh, cam, bưởi thường
có vị đắng. Vì đắng có trong các loại nước quả này là do glucositnaringin
(7-ramnocido-P-glucosido-4,5,7 trihydroxiflavon). Trong đó ramnose nối
với glucose bằng liên kết glucoside.
Khi enzym naringinase thủy phân narỉngin sẽ tạo thành hỗn
hợp ranỉnose và prinin. Hỗn hợp này tiếp tục bị thủy phân tạo thành
prinin và naringinin, hoàn toàn không còn vị đắng.
Ở Nhật Bản, người ta sản xuất chế phẩm naringinase từ nấm sợi
Aspergillus niger. Chế phẩm có chứa hai loại enzym là ramnosidase và
-p-glucosidase. Ở Mỹ, người ta sản xuất chế phẩm pectinol 10-M và
pectino-100-D. Các loại enzym hoạt động mạnh ồ pH 4. Người ta
thường sử dụng chế phẩm tinh khỉết với liều lượng 0,025% trong thời
gian 1 giờ, pH 4 ở nhiệt độ thường hoặc 0,01% trong thời gian 4 giờ.
Nếu tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 40°c trong 4 giờ, quá trình thủy
phân sẽ nhanh hơn.
5- ứng dụng enzym khác trong sản xuất rượu vang
Nhiều công trình nghiên cứu và thực tế cho thấy enzym được sử
dụng trong sản xuất rượu vang có những tác động rấ t tốt như:
- Enzym làm tăng quá trình trích ly dịch quả
438 Chương 7
- Enzym làm trong dịch lên men

- Enzym làm tăng quá trình tạo hương
- Enzym làm giảm giá rượu vang
- Enzym làm tăng chất lượng rượu vang.
Quá trình sản xuất rượu vang và phương pháp sử dụng enzym
trong các công đoạn sản xuất rượu vang được trình bày trong hình 7.3.
Nho
Nghiển hoặc * ------Pectỉnase

làm nát --------- p-glucanase
Lọc ép
Pectinase --------- ► Lôn men phụ « Pecteỉnase
Rượu vang
Hình 7.3 Công nghệ sản xuất rượu vang có sử dụng enzym
Trong dịch nho chứa các chất trùng hợp. Hàm lượng các chít
trùng hợp phụ thuộc vào giống nho, vào khí hậu và đất trồng nho.
Hàm lượng các chất trùng hợp thường dao động trong một khoảng rất
rộng, trung bình khoảng từ 700-1400mg/L Trong đó pectin chiếm
khoảng 90-500mg/l. Tổng lượng pectỉn và protein chiếm khoảng 54%
SO với tổng số chất trùng hợp. Ngoài pectin và protein, trong các chất
trùng hợp còn có các polyphenol, các polysaccharide, và một số hợp
chất cao phân tử khác.
a- Protein trong dịch nho
Protein trong dịch nho bao gồm albumin, glutelin còn globutin
khống đồng nhất. Khi tiến hành điện di trong genase protein nho cho
4-5 phần chiết anode, trong gel polyacrylamide, protein chia ra 7-16
vùng. Điểm đẳng điện của protein trái nho là 3,0-3,6 . Protein của dịch
nho có khối lượng phân tử tương đối nhỏ (khoảng 1800-23000).
6- Polysaccharide
Polysaccharide của dịcỊỉ nho chiếm khoảng 3,21 -4 ,10 %. Trong đó
ỉượng pectin và cellulose gần bằng nhau, hemicellulose có hàm lượng ít
hơn. Trong pectin, protopectin chiếm lượng nhiều nhất. Các chết khác
gồm có lignin, các chất phenol và tro.
Trong polysaccharide, pectin có ý nghĩa rấ t lớn đối với chết
ỉượng rượu vang. Nhiều nghiên cứu cho thấyỊrằng, pectin có tác dụng
làm dịu rượu vang, tạo ra vi bơ cùng với glycerol và dextran. Ngược lại
cũng cố nhiều nghiên cứu cho rằng sự hiện diện các chất cao phân tử,
trong đó có chất pectin làm hạn chế vị của rượu vang. Tuy nhiên, các
nhà khoa học đều thông nhất, vị rượu vang được quyết định bởi đường
và các quá trình oxy hóa, hàm lượng pectin cao trong rượu vang làm
đục rượu vang. Do đó việc sử dụng enzym pectinase để thủy phân
pectin cổ trong rượu vang là điều rất cần thiết, hoàn toàn không làm
giảm hương vị của rượu vang.
€• Sử dụng chế phẩm enxym trong sản xuất rượu vang
Trong sản xuất rượu vang, ngưòi ta thường sử dụng chế phẩm
enzym hỗn hợp. Các enzym này cùng lúc tham gia phân giải pectin,
protein, cellulose, hemicellulose^à nhiều chất khác, ở một số nước lại
sử dụng phức hợp của một nhóm enzym cổ cùng bản chất.
Nhỏm enzym phân giải pectin
Nhóm enzym thường hoạt động mạnh ở pH acid (pH 5) và nhiệt
độ trong khoảng 30-40°C. Người ta thường sử dụng enzym phân giải
pectin với liều lượng 0, 1 %.
440 Chươtag 7
Nhóm các ernym phân giải protein

Các chế phẩm protease từ Aspergillus oryzae, Asp. flavusi casein
Ở pH 7,7. Ngược lại protease từ Aspergillus awamori lại hoạt động ở
pH acid. Tác động của protein dịch nho gần giếng như albumin và Ỵ
globulin. Các protease của Aspergillus niger cũng giống như protease
Aspergillus awamori. Chúng hoạt động cả trong môi trường acid mạnh
(pH 1 ,8-2,0) và hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40°c. Các chế phẩm
enzym protease acid thường được dùng để xử lý dịch nho.
Nhổm em ym phân giải hemicelluỉose và cellulose
Khi cho các chế phẩm enzym phân giải pectin vào dịch nho
nghiền, trong dịch nho sẽ tâng hàm lượng các chất phenol tinh dầu}
các hợp chất chứa nitơ và cả chất khô trong dịch nho. Trong xử lý
nước nho, người ta sử dụng cả phức hợp ceỉluỉase. Các chế phẩm
ceỉluỉase sử dụng trong sản xuất rượu vang hoàn toàn không phải là
các chế phẩm tinh khiết mà là phức hợp enzym, bao gồm nhiều
enzym khác như pectinase, protease....
Những yêu cầu cơ bản của chế phẩm enzym sử dụng trong sản
xuất rượu vang như sau:
- Các chế phẩm enzym không được làm ảnh hưởng xấu tới vị,
màu và hương rượu vang.
- Khi cho chế phẩm enzym vào dịch nho hay khối nho nghiền,
chế phẩm enzym phải làm tăng khả năng trích ly dịch nho, làm trong
dịch nho.
- Khi cho chế phẩm enzym vào khối nho nghiền, chế phẩm
enzym phải tăng khả năng lọc và* lắng trong. Trong nhiều thí nghiệm,
khi người ta cho chế phểm enzym để xử lý khếi dịch nho, chế phẩm
enzym làm tăng tốc độ lọc lên 3-4 lần.
Người ta thường xử lý enzym trong 6-8 giờ ở nhiệt độ 18-20°c
hoặc 2-4 giờ ở nhiệt độ 35-40°C. Để làm tăng khả năng làm lắng,
người ta có sử dụng các chất tạo keo.
- Chế phẩm enzym sử dụng trong xử lý dịch nho hoặc khối nho
nghiền làm tăng mức ổn định của rượu vang, chống lại các nguyên nhân
gây đục do protein, polysaccharide hay do nhữĩỉg nguyên nhân khác.
- Các chế phẩm enzym oxy hóa như Ascorbinatoxydase, O-

diphenoloxydase, peroxydase có khả năng chống lại sự m ất màu đỏ
của rượu vang đỏ và vang trắng chuyển màu. Liều ỉượng các enzym
này không được cao.
- Khi sử dụng các chế phẩm enzym để xử ỉý dịch nho và khối
nho nghiền phải đảm bảo được tính kinh tế. Khỉ sử dụng các chế
phẩm enzym để xử ỉý dịch nho, thành phần hóa học của đung dịch
nho bị biến đổi rấ t nhiều, đặc biệt là các hợp chất phenol. Các chất
phenol thường tăng ỉên rấ t nhỉều, từ đó làm thay đổi rấ t mạnh tính
chất hóa học và tính chất cảm quan của rượu nho. Nhỉều nghiên cứu
cho thấy rằng, vỉệc xử ỉý dịch nho bằng chế phẩm enzym làm tăng giá
trị sinh học của dịch nho.
Trong đó emtoxian cố một giá trị sinh học nhất định trong sinh
lý người. Ngoài ra, việc xử lý dịch nho làm tâng nhanh quá trình tạo
hương, rút ngắn quá trình sản xuất nho.
Nếu trong khỉ nghiền dịch nho, ta sử dụng chế phẩm enzym,
hàm lượng các hợp chất chứa phenol táng lên rấ t nhiều (có khi táng
đến 50-80%) thi trong quá trình lên men, lượng các chất phenol và
antoxian lại giảm rấ t mạnh. Điều đố giải Ếhích tại sao trong quá trình
tàng trữ, tổng lượng phenol và chất màu giảm. Hiện tượng này xảy ra
rất mạnh trong những năm đầu tiên khi tàng trữ. Sau 2, 3 năm tiếp
theo, quá trình chuyển hóa này xảy ra chậm hơn.
Các enzym oxy hóa có tác động rất mạnh đến chất lượng rượu
nho. Các enzym oxy hóa sẽ tâng hoạt tính khỉ đun nóng dịch nho, khi
cho các chế phẩm enzym vào địch nho. Các enzym oxy hóa thường có
sẵn trong dịch nho, tác động vào antoxian, kích thích nhanh các quá
trình tạo màu của dịch nho như màu vàng, màu, gạch đỏ và một số
màu khác.
Đối với rượu vang trắng, các enzym oxy hóa thường làm sẫm
màu. Các enzym polyphenoloxidase thường có khoảng hoạt động rộng.
Chúng oxy hóa mạnh nhất chất odiphenol và ít tác động đến p-
diphenol. Các polyphenoloxidase thường chứa trong vỏ và cả trong thịt
quả. Ở trong th ịt quả, polyphenoloxidase thưởng chứa nhiều hơn trong
vỏ quả ở giai đoạn bắt đầu chín của quả. Khi quả chín thì ngược lại,
442 Chương 7
các polyphenoloxidase ở vỏ quả lại hoạt động mạnh hơn trong th ịt quả
đến 2-3 lần. v
6- ứng dụng ehzym trong công nghệ sản xuất bia
Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzym
amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột cổ trong mầm
đại mạch. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các enzym khác có trong
mầm dại mạch để thủy phân và chuyển hóa các chất không tan sang
trạng thái tan như chuyển protein, cellulose,... sang amino acid và
glucose. Các quá trình công nghệ này đã được thực hiện hàng ngàn
năm nay ở nhiều nước trên thế giới- So với các loại enzym amylase từ
các nguồn khác, amỵỉase từ thóc đại mạch đã nảy mầm được sử dụng
với số lượng nhiều nhất hiện nay.
Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp
enzym amylase và nhiều enzym khác. Nhờ sự tổng hợp ra những
enzym này mà hạt tiến hành quá trình tự thủy phân tinh bột, protein
và các hợp chất khác để cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho hạt
nảy mầm. Đây là quá trình sinh lý bình thường của quá trình nảy
mầm của hạt. Quá trình nảy mầm là quá trình trao đổi chất và là quá
trình sinh lý h ạt chuyển từ trạng thái năng ỉượng dự trữ sang trạng
thái năng lượng phát triển.
Lợi dụng quy luật sinh lý bình thường này của hạt, loài người đã
biết can thiệp rấ t khoa học để quá trình trên được tiến hành nhanh
hơn, mạnh hơn và biết ngưng ở một giai đoạn nhất định, phục vụ cho
mục đích của mình trong việc tạo ra sản phẩm là bia chứ không phải
là cây lúa đại mạch như trong sản xuất nông nghiệp.
Tuy nhiên, xét về m ặt kỹ thuật thấy có một số thiếu sót cơ bản.
Thứ nhất: Trong kỹ thuật nảy mầm, các chất khô cổ trong hạt
sẽ bị tiêu hao. Lượng chất khô bị tiêu hao trong quá trình này khoảng
12 % so với tổng lượng chất khô có trong hạt. Sự tiêu hao này là điều
khó trán h khỏi trong bất kỳ quá trình nảy mầm nào của hạt. Nếu so
với tổng lượng thóc đại mạch được sử dụng để sản xuất bia của những
nhà máy bia trên tế giới thì lượng chất khô bị tiêu hao trong quá
trình nảy mầm sẽ rất lớn.
Thứ hai: Quá trình nảy mầm của hạt là quá trình đòi hỏi thời
gian cho sinh tổng hợp các loại enzym và quá trình chuyển hóa vật
chất. Quá trình này thường kéo dài khoảng 10-11 ngày. Thời gian chi
phí cho giai đoạn này không nhỏ nếu như dem so sánh với toàn bộ
quy trình sản xuất bia.
Thứ ba: Do phải sản xuất malt nên cần phải có một phần xưởng
sản xuất m aỉt trong nhà máy bia. Do đó, đòi hỏi không ch! m ặt bằng
sản xuất, máy móc, thiết bị cho sản xuất mà còn đòi hỏi lao động.
Tiêu hao lao động cho sản xuất malt thường chiếm khoảng 1/3 tổng
tiêu hao ỉao động chung của nhà máy bia.
Chính vì th ế trong thời gian từ những năm 60 của th ế kỷ trước
đến nay, người ta đã tìm những nguồn enzym khác thay thế cho malt
nhằm làm giảm bớt những nhược điểm đã trình bày trên.
Những enzym được sử dụng trong sản xuất bia thay thế malt
phải đảm bảo những yêu cầu sau:
• Enzym thay th ế malt cần phải phù hợp với enzym của malt về
đặc tính tác dụng và phải có hoạt tính mạnh hơn enzym cố trong
malt. Các enzym có trong malt bao gồm:
• Các enzym phân giải tỉnh bột thành đường. Đây là nhóm
enzym quan trọng nhất, đóng vai trò quyết định chất lượng bia qua
quá trình đường hóa, quá trình lên men.
- Các enzym protease tham gia thủy phân protein
- Các enzym tham gia thủỵ phân cellulose, hemi-cellulose.
• Enzym thay th ế malt phải đảm bảo cho việc lọc, lên men dịch
đường, làm trong bia, cũng như phải tạo ra những đặc tính bia phù
hợp như tạo bọt, độ trong và tính chất ổn định trong bảo quản.
Sử dụng enzym từ v sv là hướng nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều
nước. Hướng nghỉên cứu và ứng dụng này đã đạt dược rấ t nhiều kết
quả. Sau một thời gian dài, các ứng dụng này cho thấy những ưu điểm
quan trọng sau:
- Thay th ế được 30-50% m alt trong sản xuất bia. Khả năng
thay th ế m alt bằng chế phẩm enzym từ v sv có ý nghĩa rấ t lớn
không chỉ m ặt kỹ thuật mà còn có ý nghĩa rấ t lớn về kinh tế, đặc
444 Chương 7
biệt là đối với các nước không sản xuất được thóc đại mạch, giảm
ngoại tệ để nhập malt.
- Hạ giá th ành sản phẩm bia.
- Giảm đáng kể vốn đầu tư xây dựng.
Or Enzym vsv
trong sản xuất bia
Khi tiến hành đường hóa để tạo thành nước mu trong sản xuất
bia bằng enzym amylase của malt, người ta được nước mu có thành
phần đường như bảng 7.23.
Bảng 7J23 Thành phần các loại đường có trong nước mu
stt Các k * i đudng Thành phỉn (%) Stt Cic loại đường Thành phấn (%)
1 Glucose 5 -1 0 % 3 Maltotriose 15%

2 Maltose SO-55% 4 Dextrin 25%
Số lượng các loại đường trong bảng 7.23 cho thấy đưởng ỉên men
trực tiếp (glucose) thường chỉếm số lượng không nhiều. Nếu không
thêm các ỉoại enzym từ bên ngoài vào, rất khó nâng cao được mức độ
ỉên men. Do đó trong sản xuất bia, người ta thường cho enzym có
nguồn gốc từ v s v và từ nguồn thực vật.
Các loại enzym khỉ cho thêm vào trong sản xuất bia thường
nhằm vào những mục đích sau:
- Nâng cao chất lượng dịch đường hóa
- Nâng cao khả nâng lên men bia
- Nâng cao chất lượng và ổn định chất lượng bia
- Giảm giá thành sản phẩm khỉ tiến hành thay maỉt bằng
những nguyên liệu phỉ malt.
Những uu điểm của enzym từ nguồn v sv được sử dụng trong sản
xuất bia như sau:
• Các chế phẩm enzym từ v s v thường có hoạt tính xúc tác rất
mạnh và chứa khá đầy đủ các loại enzym cần thiết cho sự chuyển hóa
tỉnh bột th àn h các loại đường, đặc biệt là tạo ra được ỉoạỉ đường có
khả năng lên men với số lượng lớn.
• Các chế phẩm enzym từ vsv thường có khả năng hoạt động à
nhiệt độ rấ t cao. Điều này rất thuận lợi cho việc vận hành quá trình
dịch hóa và đường hóa.
Bảng 7.24 Một số đặc điểm của chế phẩm enzym từ v s v sứ dạng
trong sản xuất bứt
L09I chế phẩm
Termamyl
stt BAN-2401 Fugamyl 800 L A IIG 3 0 0 L Promazym 200 L
120 L
Đặc
1 Loại enzym a-amylase a-amylase p-amyiase Amytogluoosẽ Polulanse
a-amylase dase
2 Mối liên kết bị a-1,4 a-1,4 a-1,4 a-1,4 a -1 .6
tác động a -1 .6
3 Sản phẩm của dextrin dextrin maltose glucose dextrin
phản ứng mạch thẳng
4 Nhiệt độ tốí ưu 70°c 90°c 55°c 65°c 6Ơ°C

5 pH tối ưu 6 6 5 4 5
b- ứng dụng enzym trong sản xuất bia

Ngày nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng enzym từ nguồn v sv
để sản xuất bia cổ thay th ế 30-40% nguyên liệu không phải từ malt và
để nâng cao và ổn đình chất lượng bia.
Công nghệ sản xuất bia là dạng công nghệ rấ t phức tạp, qua
nhiều công đoạn sản xuất khác nhau. Việc ứng dụng enzym từ nguồn
v sv vào sản xuất bia không phải là nhằm mục đích thay th ế hoàn
toàn enzym có trong malt mà chỉ ứng dụng vào từng công đoạn nhất
định để hoàn thiện hơn quá trình sản xuất. Các nước trên th ế giới
thường ứng dụng enzym trong các công đọạn sản xuất bia như sau:
- Dịch hổa
- Đường hóa
- Giai đoạn lên men
- Giai đoạn làm trong bia và ổn định chất ỈUỢng bia.
Sử dụng enzym trong quả trình dịch hỏcL Dịch hóa là quá trình
thủy phân sơ bộ tinh bột và protein trong khối bột ỏ nhiệt độ cao. Ở
giai đoạn này, người ta thường sử dụng enzym amylase và protease
của vỉ khuẩn. Các loại enzym thu nhận từ vi khuẩn thường có hoạt
tính cao và có khả nâng chịu nhiệt độ cao rấ t tốt. N hiệt độ cao thường
làm biến tính enzym có trong malt. Do đó việc bố sung enzym có khả
năng chịu nhiệt từ ngiiổn vỉ khuần ỉà điều hết sức cần thiết.
446 Chương 7
Khi ta cho nguyên liệu thay thế malt (bột bắp hay bột gạo) vào
trong hỗn hợp, các loại nguyên liệu này không được thủy phân, dễ
dàng tạo ra dộ nhớt cao, ảnh hưởng nhiều đến quá trình đường hóa và
lên men sau này. Nếu ta cho thêm enzym chịu nhiệt từ nguồn vi sinh,
độ nhớt các nguyên liệu trên sẽ giảm, sẽ làm tâng quá trình đường
hóa và lên men sau này.
Các thí nghiệm dùng 10% malt trong dịch hóa bột bắp và sử
dụng enzym từ vi khuẩn cho thấy độ nhớt trong dung dịch bột khi sử
dụng enzym từ vi khuẩn giảm nhiều hơn dùng malt.
Hiện tượng độ nhớt giảm cũng thấy ở bột gạo khi dịch hóa có sử
dụng enzym từ vi khuẩn.
Phút Phút
Hình 7A Khả năng làm giảm độ nhớt của dung dich bột gạo khi cho enzym
vi khuẩn vào trong quá trình dịch hóa
c- Sử dụng enzym trong quá trình đường hóa

Đường hóa là công đoạn sản xuất bia rấ t quan trọng, trong đố
lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất
lượng bia sau này. Chính vì thế, nhiều nhà máy bia trên th ế giới đã
cho thêm enzym với số lượng lớn trong giai đoạn này. Các enzym cho
vào trong giai đoạn này là những enzym vi khuẩn chịu nhiệt.
Bảng 7.25 Sự tạo thành các loại đường khi cho thêm
enzytn vi khuẩn trong quá trình đường hóa
Enzym - AMG 300L FUNGAMYL 800L PROMOZYME 200L
Liểu dùng, Kg/T 0 2 10 2 20 2 10
Glucose: DP1 5 29 82 5 11 7 6
Maltose: DP2 56 45 5 58 55 59 63
Maltotriose: DP3 14 6 2 14 11 14 16
Dextrin: DP4 25 24 11 23 23 20 15
100°c : 15’
Hình 7.5 Giản đồ nấu bia có nguyên liệu phụ khỉ cho enzym
100°C:20'
Hình 7.6 Giản đồ nấu bia hai lần có cho enzym
d- Ổn định khả nâng lên men

Trong nước mu, sau khi đường hóa có chứa 90% là các chất
carbohydrat, trong sô" này có đến 75% đường có khả năng lên men.
Phần còn lại 25% là các loại dextrin mạch thẳng và mạch nhánh.
448 Chvơng 7
Trong rấ t nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành không đạt
được mức độ trên do nhỉều nguyên nhân. Trong đó nguyên nhân chính
là chất lượng m alt kém. Có ba cách để làm tăng ỉượng đường trong
nước mu:
- Kéo dài thời gian đường hóa
- Sử dụng thêm đường
- Sử dụng enzym để đường hóa hết lượng tinh bột.
Trước đây người ta thường áp dụng hai cách trên. Sau này, việc
sử dụng enzym thường được sử dụng hơn. Người ta thường sử dụng các
ỉoại chế phẩm enzym sau:
B ảng 1J2S Các loại emym thủy phân tinh bột sử dụng trong sản xuất bia
Loại eflzym và Điểu kiện sử dụng Kiểu tác động và •

vi sinh sán xuất pH sản phẩm tạo ra
°c
Amylase vi khuẩn
a) B. subtítis 6.5 85 Endo, nối a-1,4
6.5 105/95 Dextrin

b) B. lichentíornĩís
a- Am ylase nấm mốc Endo, nối a-1,4

Aspergữus Orizae 5,0 55 mattoz
Amyfgfuco&dase 4,3 60 Exo, nối a-1,4; a- 1 , 6

Asperọăkis N iger Glucoz
Pvữuinase 4.3 60 Endo, nổi a - 1 , 6

Loài Baetitus Dextrin
Glucose isomerase 8.0 60 Endo, nối a- 1 ,4

B. Coagkjcanz Glucoz + Fructoz
Khi thêm các chế phẩm enzym vào trong dịch đưởng hóa sẽ làm
tâng độ lên men biểu kiến của dịch đường hóa.
Nước nha
% 50% malt __ _ ____________ __
20 40 60 80 100
Hình 7.7 Khả năng tăng độ lên men biểu kiến khi cho enzym vào
Khi sử dụng enzym, chúng ta có khả năng sản xuất bia không có
các dextrin dư thừa và do đó chứa ít calori hơn (ít năng lượng hơn)
loại bia thông thường. Mức giảm này có thể đạt tới 25%.
Các enzym sau khi tham gia vào các quá trình đường hóa sẽ còn
sót lại và lẫn vào dịch lên men. về nguyên tắc, hoạt tính còn sót lại
này không ảnh hưởng gì đến chất lượng bia, mà ngược lại chất lượng
bia sau này thường tốt hơn.
Ở Nga, người ta đã sử dụng enzym rất có hiệu quả trong sản
xuất bia. Các chế phẩm enzym được sử dụng nhiều trong sản xuất bia
là Cytorozemin.Px, Amylorizin, Pxi. Bằng cách sử dụng những chế-
phẩm enzym này, các nhà máy bia ở nước Nga có thể tiết kiệm được
50% lượng malt cần thiết trong sản xuất bia. Mặt khác, chất lượng
dịch đường hóa được tăng lên, các chất thấi bỏ theo bã sẽ ít đỉ.
Nước nha tử 100% malt Trong lượng Nước nha từ Trọng lượng
c riông c 50% malt + 50% lúa m ạch r'^ n9
0
Tỷ trong nquyôn thủy: 9,65 B Tỳ trọng nguyôn thủy: 9,43°B
Lền men 5 ngày ở 25°c
E
90 1,000-
s
80 ----- 1------- 1------- «------- *--------■— 0,990J 80 ------1--------1--------1-------- 1-------- 1— 0,990
Fungamyl 800Ư100L nước nha Fungamyl 800Ư100L nước nha
Hình 7.8 Gia tăng độ lên Hình 7.9 Gia tăng độ lên
men của nước nha men của nước nha
450 Chương 7
Hiệu quả đường hóa khi sử dụng các chế phẩm enzym sẽ thấy
ngay sau 20-35 phút. Việc tăng thêm lượng enzym vào không chỉ làm
tăng lượng đường hay mức độ trích ly những chất hòa tan mà còn
tăng khả năng lọc và lên men sau này.
Bảng 7.27 Khả năng trích ỉy các chất khi cho enzym vào
Nguyẽn liệu SỐ lượng Chế phẩm enzym Khà năng Chất trích ly còn
mỏ nấu trích ly (%) iọl trong bã (%)
100 % malt 16 - 96,9 2,14

40-45% nguyên 70 Amylorizin Px 98,0 1.97
liệu thay thế 31 Xitocrom Px 969 1,93
33 Amylosubtilin G 10x 97,0 237
e- Sử dụng enzym để làm bền vững chốt lượng bia và làm trong bia
Độ bền của bia khi bảo quản là một trong những chỉ tiêu rất
quan trọng trong sản xuất bia.
Để làm ổn định chất lượng bia, người ta thường sử dụng các chế
phẩm protease. Nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficin, chế phẩm
protease nấm sợi và papain đều có tác dụng rấ t tốt trong quá trình ổn
định chất lượng bia. Trong đó papain được ứng dụng nhiều hơn cả.
Khi tiến hành lên men phụ, người ta thường cho papain vào. Kết quả
của những tác động của papain, dịch bia trở nên trong hơn và quá
trình bảo quản bia, chất lượng bia không thay đổi.
7- ứng dụng enzym trong sản xuất cồn
Cồn được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men. Người ta
lên men cồn từ nguyên liệu chứa đường (như m ật rỉ) hoặc từ nguyên
liệu chứa hydro carbon. Trong nội dung phần này chúng tôi chĩ trình
bày sản xuất cồn từ hydro carbon. Đây là quá trình sản xuất cổ ứng
dụng enzym.
Ngày nay cồn được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống, trong
công nghiệp. Trước đây, sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột,
người ta thưởng đùng m alt giống như trong sản xuất bia. Sau khi các
nhà khoa học N hật đưa ra phương pháp sản xuất amylase từ nấm sợi,
người ta thay th ế amylase của malt bằng amylase nấm sợi. Amylase
nấm sợi đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất cồn từ nguồn nguyên
liệu tinh bột amylase của Aspergillus oryzae. Sau này nhiều amylase
từ các loài v sv khác nhau được sản xuất và được áp dụng rấ t rộng rãi.
Công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột qua những
công đoạn cơ bản sau:
- Xử lý nguyên liệu bao gồm nghiền nhỏ nguyền liệu, dịch hóa
nguyên liệu. Có thể xử lý nguyên liệu bằng acid hoặc kiềm.
- Chuyển hóa tinh bột bằng a-amylase để tạo thành dextrin.
- Chuyển hóa dextrin bằng p-amylase hay amylogỉucosỉdase để
tạo ra đường cố khả năng lên men.
- Lên men dịch đường bằng nấm men Saccharomices cerevisiae.
- Chưng cất thu nhộn cồn.
- Tinh chế cồn để thu nhận cồn có chất lượng cao.
Trong các quá trình công nghệ trên, enzym được ứng dụnậ ở
công đoạn đường hóa (chuyển hóa tinh bột thành đường).
a- Chuyển hóa tinh bột
Quá trình thủy phân tinh bột được thực hiện theo sơ đồ sau:
Nguyên liệu chứa tinh bột
Nấu chín ở nhiệt độ cao
Amyloglucosídase Amylase
Làm nguội
hoạt động ô 55°c hoạt động ở 55°c
Đường hóa
Quá trình đuờng hóa đóng vai trò quyết định đến khả năng lên
men và hiệu suất cồn thu được. Các chế phẩm sử dụng trong công
nghệ sản xuất cồn bao gồm những chế phẩm thô được thu nhận từ
phương pháp nuôi bề mặt, nuôi chìm hoặc các chế phẩm đậm đặc,
tính khiết. Tuy nhiên, các nhà máy sản xuất cồn hỉện nay thường sử
dụng chế phẩm thô do tính chất kinh tế. Sau khi tiến hành đường
hóa, phần thô còn lại của chế phẩm enzym tồn tại trong bã rượu.
Toàn bộ phần này được sử dụng để sản xuất thực phẩm gia súc.
452 Chương 7
Vì sử dụng các loại chế phẩm enzym ở dạng thô nên trong chế
phẩm không chỉ chứa các thành phần không phải enzym mà còn chứa
trong đó nhiều loại enzym khác nhau. Phức hợp enzym này vừa có lợi
và cũng vừa có hại. Có lợi vì sản phẩm được tạo ra do phức hợp
enzym, dó là môi trường rấ t thuận lợi cho nếm men phát triển trong
giai đoạn dầu của quá trình lên men. Nhưng điều không có lợi ồ chỗ,
có thể có những phản ứng không mong muốn giữa các sản phẩm đó,
tạo ra những sản phẩm xấu trong dịch lên men và trong sản phẩm.
Chính vì thế, diều cần phải làm trước khi đưa chế phẩm enzym vào
quá trình đường hóa là phải xác định hoạt tính enzym của từng loại
enzym, từ đó điều chỉnh hoạt động của chúng. Việc điều chỉnh hoạt
động và quá trình tạo ra enzym là cả một nghệ thuật dựa trên dặc
điểm sinh lý và cơ chế sinh tổng hợp enzym của v s v . Từ đó, ta có thể
phân chia các chế phẩm enzym thành ba nhóm sau:
Nhóm 1: Bao gồm các enzym có khả năng thực hiện các phản
ứng sinh hóa cần thiết và nó quyết định đến hiệu quả sản xuất cồn.
Nhóm 2: Bao gồm các enzym tham gia những biến đổi cơ bản cơ
chất để tăng cường quá trình chuyển hóa cơ bản.
Nhóm 3: Bao gồm những enzym tham gia các phản ứng, tạo ra
những sản phẩm không mong muốn, làm cản trở quá trình lên men
hoặc tạo ra những sản phẩm lẫn vào cồn, gây khó khăn cho quá trình
tinh luyện.
B ảng 7.28 Tính chất của các nhóm enzym
Giai đoạn đường hóa

Nhóm
Giai đoạn dịch hóa
enzym Đ ư ờ n g h ó a dịch Đường hỏa dịch
đường hóa nấm men đường hóa cơ bàn
Nhỏm 1 a-amylase ỡlucosidase, a-amylase, Glucoamylase, a-amylase,
proteinase, oligo-1 ,6 - oligo-1,6-glucosidase
glucosidase
Nhóm 2 Hemicellulase, cellulase Hemicellulase, cellutase, Hemicellulase, cellulase,
pupulanase, phosphatase, pupulanase, phosphatase,
p-amylase a-amylase
Nhóm 3 Glucoamylase, pro tease, Transglucosidase Transglucosỉdase
p-amylase, phosphatase,
transglucosidase
Sử dụng enzym trong sản xuất cồn biểu diễn rõ nhất của hướng
ứng dụng enzym trong công nghệ thực phẩm. Theo đó, enzym được sử
dụng theo hai hướng:
Hướng thứ nhất: Enzym được tổng hợp cùng với sự phát triển và
sinh sản của tế bào vs v . Sản xuất cồn theo phương pháp amylo, người
ta sử dụng enzym theo hướng này.
Trong công nghệ sản xuất cồn theo phương pháp amylo, người ta
cho nấm sợi Rhizopus spp. hoặc Mucor spp. phát triển hẳn trong dung
dịch cơ chất. Trong quá trình phát triển, các loài nấm sợi này sinh
tổng hợp ra enzym và các loại enzym này tham gia thủy phân tinh
bột, protein và cả cellulose. Quá trình phát triển, sinh sản của nấm
sợi song song với sự thủy phân tinh bột. Phương pháp này rất có hiệu
quả khi ta sử dụng nguồn tinh bột có độ nhớt cao trong môi trường
nước. Quá trình trên cũng song song xảy ra cùng với sự tăng trưởng
của nấm men, sinh sản của nấm men và quá trình rượu hóa.
Hướng thứ hai: Chế phẩm enzym sẽ được sản xuất riêng và
người ta sử dụng chế phẩm enzym (chứ khôộg phải chế phẩm VSV) để
thủy phân tinh bột. Phương pháp ứng đụng enzym này dược triển
khai nhiều trong sản xuất cồn theo phương pháp mycomant. Chế
phẩm enzym có thể là các chế phẩm thô, hoặc cũng có thể là các chế
phẩm đậm đặc. Theo phương pháp mycomant, công đoạn dường hóa
hoàn toàn tách hẳn công đoạn lên men. Người ta tiến hành quá trình
đường hóa nhờ chế phầm enzym, sau đố mới tiến hành quá trình rượu
hóa. Phương pháp ứng dụng enzym theo hướng này có rất nhiều ưu
điểm. Ưu điểm lớn nhất là ta hoàn toàn kiểm soát được quá trình
dường hóa.
Ngày nay ở nhiều nhà máy sản xuất cồn, người ta tiến hành quá
trình đường hóa theo phương pháp liên tục và còn sử dụng phương
pháp cố định enzym. Hai phương pháp này nằm trong hướng sử dụng
enzym thứ hai có kiểm soát rấĩ chặt chẽ.
6- Vai trò các loại enzym cổ trong chế phẩm enzym được ứng
dụng trong sàn xuất cồn
Các chế phẩm enzym được sản xuất cồn từ v sv thường chứa
nhiều loại enzym khác nhau. Các enzym này thường thực hiện những
phản ứng riêng.
454 Chương 7
Vai trò của a-amyỉase. Các loại a-amylase được thu nhận từ các
nguồn khác nhau thường có tính chất giống nhau, nhimg giữa chúng
cũng tồn tại những đặc tính riêng.
- a-amylase bị kìm hãm bởi kim loại nặng. Calcium có vị trí và
vai trò rấ t quan trọng trong cấu trúc của a-amylase. Chúng bảo vệ
enzym khỏi những tác động xấu của điều kiện môi trường. Chúng đảm
bảo tính Ổn định của hoạt động enzym, chống lại sự phá hủy bởi các
enzym protease.
- Khối lượng a-amylase vào khoảng 50.000. Riêng dối với a-
amylase của Bacillus sterothermophiỉus có khôi lượng chỉ khoảng
15.600. a-amylase của vỉ khuẩn thường hoạt động mạnh ở pH kiềm
yếu và pH trung tính, và hoạt động mạnh ở pH 5,5-7,9. a-amyiase của
nấm sợi thường hoạt động mạnh ở pH acid yếu.
- a-amylase của vi khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn của nấm sợi.
Các a-amylase của vi khuẩn có thể hoạt động ở nhiệt độ 85°C-95°C.
Trong khi đó, a-amylase của nấm sợi chỉ có thể hoạt động ồ 65°c.
- Khi thủy phân tinh bột, a-amylase tác động vào liên kết a-1,4
gỉucoside và sản phẩm tạo ra là là mantose và dextrin mà mạch của
chúng gần bằng c 6. Các dextrin sau đố sẽ phân hủy chủ yếu theo:
Qg * Cs + Ci
C7 » Cl + Cg hay C5 + C2
Cô ► C2 + Cg hay C3 + C5
a-amylase của vi khuẩn thủy phân tinh bột tạo ra lượng glucose
và maltose theo tỷ lệ 1:5,45. a-amylase của nấm sợi thủy phân tinh
bột tạo ra lượng glucose và maltose theo tỷ lệ 1 :3,79 . a-amylase của vi
khuẩn và của nấm sợi hoàn toàn không có khả năng phân giải a- 1,6
gỉucoside của cơ chất. Trong khi dịch hóa, pH của dung dịch bột
thường trùng hợp với hoạt động tối ưu của a-amylase, pH này cũng là
pH hoạt động tối ưu khi tiến hành đường hóa. Chính vì thế, nếu trong
trường hợp sử dụng các loại bột có pH không trùng với pH hoạt động
tôi ưu của a-amylase thì phải điều hòa pH cho thích hợp.
Bảng 7.29 pH tối ưu của a-amylase từ các nguồn khác nhau
Nguổn a-amylase pH tốí ưu
t' '
^r
ư>
Cữ
Nấm sợi
1
Vỉ khuẩn 6.0 - 7,0
Malt 5,3 - 5,5
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, a-amylase của vi khuẩn chỉ
hoạt động rất mạnh trong giai đoạn đầu của quá trình đường hóa.
Nguyên nhân vì có sự thay đổi pH trong thời gian đường hóa, nhutig
nguyên nhân quan trọng là giới hạn hoạt động của a-amylase tới
đường không vượt quá 70*80%.
(%) glucid lên 80- 6 1-0,5ul/g

men so với lượng 2- 5ul/g
glucid đưa vào 60- 3- 25ul/g
3 4- 0,5ul/g
40 •
2 5- 150ul/g
1 6- 500ul/g
20
H----- 1-- I --------------

0 12 24 36 48 60 Thời gian (giờ)
Hỉnh 7.10 Khả năng đường hỏa của a-amyỉase

Theo giới hạn thủy phân tinh bột bằng a-amylase của Bacillus
subtilis là dextrin có năm gốc glucose, một liên kết a- 1,6 và ba liên
kết a-1,4. Theo tính toán, người ta cho thấy rằng, giới hạn thủy phân
tinh bột đến glucose và mantose là 70-75%.
Khi tiến hành thủy phân tinh bột bằng a-amylase của nấm
sợi đến dextrin giới hạn có bốn nguyên tử gluxit và một liên kết a-
1,6. Trong trường hợp này, giới hạn đường hóa đến glucose và
maltose dạt 84-87% tinh bột ban đầu đường hóa. Như vậy lượng cơ
chất ban đầu không phải với số lượng càng lớn, khả năng thủy
phân của a-amylase càng cao.
Như vậy, vai trò cơ bản của a-amylase trong sản xuất rượu là
làm dịch hóa nhanh ò giai đoạn nấu và cả ở giai đoạn đầu của sự
đường hóa, dextrin hóa và tích tụ đường.
456 Chương 7
Vai trò của glucoamylase. Glucoamylase thủy phân liên kết a-1,4
trong các polysaccharide, chúng liên tiếp phân cắt các gốc glucose
không khử trong mạch polysaccharide. Ngoài ra glucoamylase còn có
khả năng phân cắt liên kết a- 1,6 glucoside.
Glucoamylase thường hoạt động mạnh trong môi trường acid (pH
hoạt động tối ưu là 3,5-5,5). Ngoài ra các glucoamylase còn có thể hoạt
động ở môi trường trung tính (pH 6,0-7,5). Các glucoamylase của nấm
men thường là những glucoamylase trung tính.
Phần lớn các glucoamylase hoạt động ở pH không cao. Nhiệt độ
tối ưu vào khoảng 55-60°C. Sản phẩm cuối cùng của hoạt động của
glucoamylase là glucose, glucose được xác định là đường lên men. Do đó,
việc sử dụng glucoamylase trong sản xuất cồn có triển vọng rất lớn.
Vai trò của puluỉanase. Pululanase là enzym tham gia thủy phân
liên kết a-1,6 glucoside trong các poly và oligosaccharide. Pululanase
dược tổng hợp bởi Aerobacter aerogenes.
Pululanase có khối lượng phân tử 145.000, hoạt động mạnh ở pH
4,7-5,0 và nhiệt độ hoạt động tối uu là 47,5°c.
Pululanase phân cắt liên kết a-1,6 trong trường hợp các liên kết
này bị bao quanh tấ t cả các phía bằng liên kết a-1,4 glucoside.
Dextrin có phân tử thấp, rết dễ bị pululanase phân hủy tạo
thành từ hai gốc maltose, nối với nhau bằng liên kết a- 1,6 glucoside.
Nếu có sự kết hợp với a-amylase và puluỉanase, dextrin sẽ bị phân
hủy hoàn toàn.
Vai trò của hệ enzym cellulose. Các enzym thuộc nhóm cellulase
(cellulase, hemicellulase, xylanase...) tham gia phân hủy các
polysaccharide không phải là glucỉd. Các chất này bao gồm cellulose,
hemicellulose, lignin, pectin.... Các chất này có m ặt trong thành tế
bào của tế bào thực vật, nằm ở gian bào và ở một số thành phần khác
của tế bào. Việc phá vỡ các thành phần này sẽ làm tâng khả năng
chuyển hóa vật chất có trong tế bào.
Các loài nấm sợi như Aspergillus spp. thường cùng một lúc có
thể tổng hợp cả protease, amylase và cellulase. Trong các chế phẩm
enzym thô từ v sv thường chứa các loại enzym trên. Vì th ế việc sử
dụng chế phẩm enzym hỗn hợp này có ý nghĩa rất lớn trong công
nghệ sản xuất cồn. Tuy nhiên, không phải tấ t cả các loài v sv đều có
khả năng sinh tổng hợp dều đều và tất cả các loại enzym phân hủy
cellulose, hemỉcelỉulose và lignin. Mặt khác, các loại enzym này đều là
những enzym cảm ứng, việc tổng hợp ra chúng hoàn toàn phụ thuộc
vào các chất chúng tham gia phân hủy có trong môi trường. Ngày nay,
người ta thường sản xuất cellulase, hemicellulase từ Aspergillus niger,
Trichoderma roseum, Trichoderma viride (Trichoderma reeseii) và chế
phẩm chịu nhiệt từ Aspergillus terreus.
Các thí nghiệm khi cho các chế phẩm enzym trên vào trong quá
trình đường hóa thấy rằng, hàm lượng galactose, arabinose, cylose,
glucose tăng ỉên rỗ rệt. Khi tiến hành lên men, dung dịch được đường
hóa bởi amylase và các enzym Céllulase hiệu suất cồn tăng 15%.
Việc bổ sung hệ enzym cellulase được coi như biện pháp tăng cường
khả năng đường hóa và làm táng hiệu suất thu nhận cồn sau lên men.
Vai trò của enzym protease. Cũng như những enzym kể trên,
protease luôn luôn trong tổng hợp bởi các nấm sợi Aspergillus spp. Các
protease của nấm sợi thường hoạt động ở trong môi trường acid (pH
5,0-5,5). Khi xử lý nguyên liệu bằng chế phẩm protease, trong dung dịch
đường hóa tích tụ nhiều amino acid. Amino acid là thành phần rất cần
thiết cho sự phát triển của nấm men trong quá trình lên men.
c- Những yêu cầu đối với chế phẩm enzym
Tùy theo từng công đoạn trong sản xuất cồn, người ta đưa ra
những yêu cầu về chế phẩm enzym khác nhau.
Giai đoạn xử lý nhiệt ẩm nguyên liệu. Đây là giai đoạn dịch hóa
và dextrin hóa nguyên liệu tinh bột ở nhiệt độ 60-95°C. ở giai đoạn
này không đòi hỏi sự tích tụ nhiều đường và amino acid nên các
enzym a-amylase phải hoạt động mạnh. Nếu quá trình phân giải ở
giai đoạn này tạo nhiều glucose và amino acid, rất có thể chúng sẽ tạo
ra phản ứng melanoidin, hình thành màu sẫm hoặc cũng có thể sẽ bị
caramen hóa khi ở nhiệt độ cao. Ở giai đoạn này, các enzym phải
hoạt động gần với pH tự nhiên của nguyên liệu. pH của nguyên liệu
458 Chương 7
thường khoảng 5 ,4-6,2. Như vậy, trong giai đoạn này chỉ nên tạo điều
kiện tối ưu cho a-amylase hoạt động.
Việc ứng dụng a-amylase ở giai đoạn này khi nguyên liệu được
nghiền mịn và theo sơ dồ liên tục đem lại hiệu quả rấ t cao cho toàn
bộ công nghệ.*
Trong quá trình dịch hóa, người ta thường sử dụng a-amylase
của vi khuẩn. Enzym a-amylase của vi khuẩn là những enzym chịu
nhiệt, nhờ đó thúc đẩy việc sử dụng triệt để nhiệt hơi mà còn hướng
quá trình theo chiều tích tụ nhiều dextrin cao phân tử hơn và ít đường
lên men hơn.
Gia nhiệt nhanh hỗn hợp không dịch hóa bằng a-amylase cho
ỉượng gluxit tan trong rượu ít hơn so với có dịch hóa. Nếu nấu sơ bộ
mà gia nhiệt nhanh rồi duy trì lâu ở 90-95°C và không dịch hóa thì
hoàn toàn không thể thực hiện được trong điều kiện sản xuất. Do đó,
trong thực tế bắt buộc phải kết hợp chế độ gia nhiệt nhanh và dịch
hóa bằng a-amylase của vi khuẩn.
Người ta tiến hành quá trình xử lý nhiệt ẩm với quá trình dịch
hóa theo chế dộ sau.
- Mức dộ nghiền nguyên liệu: Bột sau khi nghiền 100% qua rây
có lỗ 0 = lmm.
♦ Trộn nguyên liệu đã qua nghiền với nước và chế phẩm a-
amylase ở 30-40°C có hoạt tính 0,8-1,0 ul/gam tinh bột.
- Đun nhiều lần hỗn hợp đến 90-95°C và duy tri nhiệt độ này
trong 20-25 phút, có khuấy đảo liên tục để phản ứng enzym xảy ra
mạnh và để trán h hiện tượng caramen xung quanh thiết bị. Người ta
duy trì nhiệt dộ nhờ hệ thống khuấy liên tục, cung cấp hơi nóng liên
tục và điều chỉnh nhờ bộ diều chỉnh nhiệt.
Giai đoạn đường hóa nguyên liệu. Điều kiện căn bản của giai
đoạn này là trong chế phẩm phải có dầy đủ cả enzym glucoamylase và
a-amylase để đảm bảo cho việc phân hủy cơ chất tạo thành lượng
đường có thể lên men đạt được cao nhất. Ngoài ra, trong giai doạn
đường hóa còn cần cả enzym protease và cellulase để tăng hiệu suất
đường hóa và tạo điều kiện tốt cho quá trình lên men sau này.
Nhiệt dộ tối ưu cho tấ t cả các enzym này là 55-62°C. Mặt khác,

các enzym này phải được tồn tại cả trong quá trình lên men.
pH tối lAi cho tấ t cả các enzym này thường là pH tự nhiên của
dịch đường hóa (pH 4,0-5,6).
Như vậy, khi ứng dụng các chế phẩm enzym vào trong đường
hóa tinh bột trong sản xuất rượu cổ những đặc điểm sau đây.
- Sản phẩm cuấi cùng của quá trình đường hóa phải là glucose.
Đây là loại dường có khả năng lên men mạnh nhất.
- Quá trìn h thủy phân cơ chất để tạo thành glucose tiếp tục xảy
ra trong quá trình lên men. Tuy nhiên, tốc độ lên men phụ thuộc rất
nhiều vào ỉương đường tạo thành trong quá trình đường hóa. Do đó,
quá trinh chuyển hóa cơ chất trong giai đoạn đường hóa phải là quá
trình chuyển hóa chính.
Đến thiết bị nấu 80 bộ

dể dịch hóa
Từ xưdng nuôi cấy chìm

Giống vi khuẩn
Giống nấm mốc
16' 12
1* thiết bi duy trì - tách h d ; 2- phòng tách chân không; 3- thủng chửa a-amylaza;
4 ' miết bị dường hóa; 5- thùng chứa gkicoamylaza; 6- bình ngưng tụ áp suất khí quyển;
7- bơm ch&n không; 8.9- ttriết bi đo lường; 10- bộ phân phối; 11- phễu nhận; 12- bơm s ả n
phẩm; 13- thiết bỉ bao đổi nhiột; 14- thùng lên men; 15- ống dẫn tác nhân dịch hóa;
16-thủng chửa ntídc: 1 7 -ống dẫn sản phẩm
Hình 7*11 Sơ đồ thiết bị công nghệ ứng dụng emym vsv để đường hóa
460 Chương 7
d- ứng dụngxenzym trong lên men cồn liên tục

Một trống những nhược điểm quan trọng nhất là khả năng
nhiễm trùng rấ t cao khi tiến hành quá trình lên men liên tục. Nguyên
nhân của sự nhiễm trùng là sự đường hóa dextrin đến đường có khả
năng lên men thường xảy ra đồng thời với quá trình lên men. Quá
trình đường hóa trong lúc lên men thường kéo dài quá trinh lên men
và hạn chế quá trình khử trùng vì các chất này cổ ảnh hưởng xấu đến
hoạt lực của enzym amylase.
Để giải quyết khó khăn nhiễm trùng trong lên men liên tục,
người ta tiến hành những biện pháp sau:
- Acid hóa môi trường. Biện pháp này nhằm hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn, vì đại đa số vi khuẩn phát triển ở pH trung tính
hoặc acid yếu. Ta có thể dùng acid vô cơ để acid hổa môi trường (dung
dịch lên men). Tuy nhiên, việc acid hóa phải đảm bảo pH nằm trong
khoảng pH tối ưu của enzym và pH tối ưu hoạt động lên men của nấm
men Saccharomyces cerevisiae.
- Sử dụng chế phẩm enzym đậm dặc để đường hóa, thay cho chế
phẩm enzym thô. Chế phẩm enzym thô thường chứa vi khuẩn lạ.
- Sử dụng lượng nấm men nhiều, pha loãng dung dịch đường hóa
và lên men. Khi đó tế bào nấm men sẽ sử dụng mạnh các chất dinh
dưỡng, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Các sản phẩm này sẽ ức
chế hoạt động của vi khuẩn. Tuy nhiên, việc tăng số ỉượng nấm men
và mức độ pha loãng dung dịch cơ chất có một giới hạn nhất định,
không ảnh hưởng đến hiệu suất tạo ra cồn.
- Sử dụng một sấ chấỉ diệt khuẩn. Những chất này một m ặt tiêu
diệt hoặc ức chế được vi khuẩn, m ầt khác không gây ảnh hưởng xấu
cho hoạt động của nấm men.
Trong lên men liên tục, người ta thường cho nấm men vào chỉ
một lần ở thùng lên men đầu tiên. Sau đó cho dòng chảy từ thùng lên
men này sang thùng lên men khác với tốc độ 0,15-0,16 1/giây. Khi đó
sô lượng nấm men ồ thùng thứ nhất vào khoảng 45 triệu tế bào/mỉ-
Quá trìn h lên men sẽ kết thúc ở thùng thứ 7 hoặc thùng thứ 8. Toàn
bộ quá trình kéo dài khoảng 56-60 giờ.
8
1- c h ấ t khử
4
2- số lượng tế bào nấm men
3- pH
4'hàm lượng rượu
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sổ thủng lên men
H ỉnh 7.12 Chỉ tiêu công nghệ lên men theo các thùng ở chế độ đã xác lập
Động học quá trình thủy phân tinh bột và quá trình lên men
trong quá trình lên men liên tục được biểu diễn bằng phương trình
toán học trong mối tương quan lẫn nhau như sau:
^ = DSa + DZ„ ự - e a ) - DS - ^ = ỡ
dt a
trong đó: s , So - lượng đường môi trường bị lên men bởi nấm men lúc
đầu và khi ra khỏi quá trình lên men, gỊl
t - thời gian lưu giữ môi trường trong thùng lên men, (giờ)
D - tốc độ pha loãng, hr1; a - hiệu suất sinh khối cố định
Z0 - lượng tinh bột và dextrin của môi trường ban đầu, gỊl (tính
ra glucose); M - tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men, hr1
e - cơ số' logarit tự nhiên; X - số lượng sinh khối nấm men, gỉỉ
c - hằng số tốc độ thủy phân tinh bột, hr1.
Lập ra các phương trình toán học trong lên men liên tục và sự
tạo ra cồn trong hệ thông nhiều thùng lên men có liên quan đến quá
trình đường hóa như sau.
4 ệ = D(Sa -S „ ) + DZA1 - e)~,<Ci +°2+" +Cb* - ^ m a x = 0
dt a
p = 0,622[(Sữ - S J + Z 0( l - e ) - Hci+c2+ -+c*)]
trong đó: p - là hàm lượng cồn, m in
Ch C2, công nghiệp - là hằng số trung bình tốc độ thủy phân
tinh bột trong các thùng lên men tương ứng.
462 Chương 7
e- Hiệu quả kinh tế của ứng dụng enzym

Để làm sáng tỏ hiệu quả kinh tế của việc úng dụng enzym trong
sản xuất cồn, người ta thường tách từng công đoạn trong toàn bộ công
nghệ sản xuất cồn riẽng.
Hiệu quả của ứng dụng enzym trong dịch hỏa
Trong quá trình dịch hóa cố sử dụng enzym amylase từ vi khuẩn
đã đem lại những hiệu quả kỉnh tế quan trọng như sau.
- Giảm chi phí nhiên liệu. Khi tiến hành dịch hóa có sử dụng
chế phẩm amylase của vi khuẩn, tiêu hao hơi cho việc gia nhiệt giảm
500-520 kg/tấn nguyên liệu. Nếu quá trình dịch hóa được thực hiện
trong hệ thấng liên tục, tiêu hao hơi cho quá trình gia nhiệt giảm 250-
260 kg/tấn nguyên liệu.
Sở dĩ có sự giảm năng ỉượng khi nấu nguyên liệu là do khi sử
dụng enzym amylase của vi khuẩn chịu nhiệt, nhiệt độ nấu giảm từ
130-140°c xuống còn 131-133°c và táng nhiệt độ nấu sơ bộ từ 60-65°C
lên 90-95°C.
- Tiết kiệm do tăng hỉệu suất cồn 0,4 daỉ/tấn nguyên liệu vì
giảm tổn th ất chất lên men khỉ dịch hóa.
Hiệu quả kinh tế trong quá trình đường hổa
- Không cần sử dụng malt, do đó làm giảm giá thành sản phẩm
cuối cùng.
“ Hiệu suât cồn thu được cao hơn khí đường hóa hftng malt
khoảng 0,5-1,5%.
- Rút ngắn thời gian lên men từ 72 giở xuống còn 48 giờ mà vẫn
đảm bảo chất lượng cẩn.
8-ứng dụng em ym trong e h ế b iín th ịt
Thịt gia súc, gia cẩm bao gồm: mô cơ; mố liên k ế t (mô liên kết
xốp, mô liên kết đặc, mô sụn và mô xương); mô thần kinh; máu.
Thịt là ỉoại thực phẩm giàu dinh dưỡng. Thành phần của thịt
bao gồm nước, protein, lipit, gluxit và khoáng. Trong đó giá trị dinh
dưỡng quan trọng nhất là protein. Protein chiếm khoảng 18,5-22%
trong mồ cơ, 21-35% trong mồ liên kết, 16,4-18,5% trong máu. Protein
trong thịt gia súc bao gồm hai nhóm:
Nhóm protein hoàn thiện. Protein hoàn thiện là protein chứa
dầy đủ các am ino acid và có tỷ lệ các am ino acid cân đối. Các loại
protein hoàn thiện có trong thịt bao gồm myoglobin, myozin, actin,
actomyozin, myoalbumỉn.
- Myoglobin chiếm khoảng l c/c lượng protein của sợi cơ, bao gồm
globin và phần không phải protein là heme, trong thành phần heme
có sắt. Myoglobin là protein có màu sẫm, myoglobin là màu thịt và
chiếm khoảng 90% tổng lượng sắc tố của thịt bò.
- Myozin chiếm khoảng 40-45% khối lượng của mô cơ và là
thành phần cơ bản của mô cơ. Myozin là phức của hai protein tương tự
nhau: H-meromyozin và L-meromyozin.
H-meromyozin có hoạt tính enzym. Chúng tham gia vào quá
trình phân giải ATP thành ADR, H3PO4 và năng lượng tham gia quá
trình co cơ. Myozin có khả năng liên kết với actin, ion calcium đề
làm tăng hoạt động của enzym. Trong khi đó ion Mg lại ức chê
hoạt động của enzym.
- Actomyozin chứa khoảng 3,7%, được tạo thành do liên kết
F-actin vào myozin. Chúng có độ nhớt cao, bị co rút mạnh.
- Actin chiếm 12-15% protein chung. Chúng tồn tại ở hai dạng:
G-actin hình cầu và F-actin hình sợi, cả hai dạng này chuyến hóa lẫn
nhau. Chúng đóng vai trò giông như myozin, sinh năng lượng và tham
gia quá trình co cơ. *
- Myoabbium chiếm khoảng 1-2% lượng protein chung- Chúng có
tính chất albumin điển hình. Ngoài ra, trong thịt còn có globulin X,
myozen. Mổi loại chiếm khoảng 20% tổng lượng protein chung.
464 Chương 7
Các loại protein không hoàn thiện

- Colagen có trong xương, trong da, trong gân, trong sụn, trong hệ
thống tim mạch. Chúng không tan trong nước, ít thay đổi khi chín thịt.
Trong trạng thái tự nhiên, colagen chỉ bị thủy phân bởi pepsin
và colagenase. Nếu gia nhiệt, colagen bị một loạt các enzym khác
động như trypsin, chymotrypsin và carboxypeptidase. Sự thủy phân
colagen xảy ra thường rấ t chậm.
- Elastin có màu vàng, có nhiều trong thành dộng mạch, trong
các dây chằng đốt sống của dộng vật có xương sống. Chúng có cấu trúc
sợi, chúng bền acid, base. Chúng bị thủy phân một phần bởi papain.
a- Một 80 tính chất của thịt sau khi giết mổ
Sau khi giết mổ xảy ra hàng loạt quá trình hóa học và vật lý
trong th ịt được gọi chung là quá trình chín của thịt. Nhiều yếu tố ảnh
hưởng tới quá trình chín của thịt.
Ảnh hường nhiệt Nhiệt độ có ảnh hưởng rấ t khác nhau tới từng
bộ phận thịt của cơ thể gia súc sau khi giết mổ. Ở một số bộ phận của
cơ thể mềm ra, một số khác lại cứng lại. Sự biến đổi này phụ thuộc
rất nhiều ở thành phần calogen và các sợi thịt đàn hồi có trong thịt.
Mức độ hydrat hóa của protein mô cơ và pH . Thịt thường có độ
rắn cao nhất ở pH 5,0-5,5. pH này cũng là điểm đẳng điện của tuyệt
đại đa số protein có trong thịt. Nếu thay đổi pH Ea khỏi miền pH trên
đều làm tăng mức độ mềm của thịt.
Các muối trung tính. Khi cho thêm các muôi clorua natrium,
clorua kalium, clorua calcium và clorua magiesium thường tăng khả
năng giữ ẩm của thịt. Ngoài ra, các ion NƠ2 và NO 3 cũng có tác
dụng tương tự. Các muối phosphate thường làm tăng độ mềm của thịt.
6- Các phương pháp làm tăng độ mềm của thịt
Có nhiều phương pháp làm tăng độ mềm của thịt. Các phương
pháp đó như sau:
- Để tăng độ mềm của thịt, người ta thường để thịt trong điều

kiện vệ sinh trong thời gian 4-5 giờ ở 37°c.
- Ở Mỹ, người ta làm tăng độ mềm của thịt bằng cách dùng
dòng điện kích thích mô trước khi lột da và sau đó làm lạnh thịt
trong nhiệt độ thường. Khi đó pH trong thịt giảm về miền acid. Kế
tiếp đưa th ịt bảo quản trong nhiệt độ 0,6-l,6°C khoảng 2 ngày, thịt sẽ
đạt được độ mềm mong muấn.
- Người ta đưa vào thịt các loại muối calcium, magiesium,
polyphosphate.
- Người ta cũng làm mềm thịt bằng cách chiếu tia tử ngoạỉ vào
bề m ặt thịt.
- Phương pháp làm mềm thịt có hiệu quả nhất và nhanh nhất là
dùng enzym để ướp thịt. Ngoài khả năng làm mềm thịt, cảc chế phẩm
enzym còn làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan của thịt.
c- Phương pháp làm mềm thịt bằng chế phẩm enzym
ứ ng dụng các chế phẩm enzym để làm mềm thịt được thực hiện
bắt đầu vào năm 1940. Lúc đầu, người ta sử dụng enzym của đường
tiêu hóa và ở trong thịt để làm mềm thịt. Sau đó, người ta đã sử dụng
enzym papain, proiỊielin và íìcin để làm mềm thịt.
Yêu cẩu chế phẩm enzym sử dụng trong làm mềm thịt
Các chế phẩm enzym được sử dụng làm mềm thịt phải đảm bảo
những yêu cầu sau:
- Có khả năng làm giảm độ bền vững của mô liên kết khi gia nhiệt.
- Có khả năng chịu nhiệt
- Không độc đối với người tiêu dùng.
Các phương pháp làm mềm thịt bằng ernym
Các chế phẩm enzym có thể chứa một loại enzym, cũng có thể là
hỗn hợp nhiều loại enzym khác nhau. Người ta xử lý th ịt bằng enzym
theo một trong những cách sau:
466 Chương 7
- Ngâm th ịt vào chế phẩm enzym trong nhiệt độ ổn định và pH

ổn định, trong khoảng thời gian nhất định đối với từng loại thịt.
Phương pháp này được ứng dụng nhiều trên th ế giới.
- Trộn bột với enzym, sau đó trộn bột có enzym này với thịt.
Phương pháp này chỉ phù hợp với một số cách chế biến th ịt nhất định.
- Tiêm dung dịch chế phẩm enzym vào hệ tuần hoàn của động vật
trước khi giết mổ động vật. Phương pháp được thực hiện lần dầu tiên
vào năm 1960 và dược phát triển nhỉều trong những năm gần đây.
- Tiêm dung dịch enzym vào khối thịt sau khi giết mổ.
Ngoài các chế phẩm enzym từ nguồn thực vật, người ta còn sử
dụng enzym có nguồn gốc vi khuẩn để làm mềm xương động vật. Ưu
điểm của chế phẩm enzym từ nguồn vi khuẩn là chúng có khả năng
chịu nhiệt, do đó khi nấu hoạt động của enzym vẫn còn.
9-ứng dụng enzyrn trong chế biến sữa
Sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa là những sản phẩm thực
phẩm quan trọng ở các nước châu Âu và châu Mỹ. Ngày nay, sữa và các
sản phẩm từ sữa rất phổ biến ở các nước châu Á và cả ỏ Việt Nam.
Chế biến các sản phẩm từ sữa không thể không sử dụng các chế
phẩm enzym. Có thể nói, các sản phẩm enzym đóng vai trò quyết
định để tạo ra các sản phẩm từ sữa.
Trong sữa cũng có râ't nhiều loại enzym khác nhau như:
peroxidase, pro tease, phosphatase và xanthine oxidase, các enzym
này khá bền nhiệt. Ngoài ra, trong sữa còn chứa enzym của những
v sv có trong sữa. Trong đó hai nhóm enzym chiếm sô" lượng lớn là
lipase và proteinase.
a- Các chế phẩm enzym proteose sử dụng trong chế biến sữa
Trước đây, người ta chế biến sữa hoàn toàn sử dụng enzym từ
đường tiêu hóa của động vật non. Sau này, người ta sử dụng nhiều chế
phẩm enzym từ nguồn vsv và từ thực vật. Các chế phẩm enzym dược
sử dụng trong chế biến sữa thành các sản phẩm khác nhau được trình
bày trong bảng 7.30.
Bảng 7.30 Các chế phẩm enzym được ứng dụng trong chế biến sữa
stt Các chế phẩm enzym Nguổn enzym
1 Enzym Rennet
- Chymosin (Rennin, Rennet cửu) Cừu, dê
(EC.3.4.4.3)
- Pepsin (EC.3.4.4.1) Cừu, ngựa, gà
2 Rennet từ v s v Mucor miehei, Mucor pusillus, Endothia

parasitica, Bacillus subtilis.
Mucor racemosus, Bacillus cereus, Bacillus
mensentericus, Bacillus poiymyxa, Bacillus
licheniformis, Bacillus megaterium, Inpex lacteus,
Absidia racemosa, Rhizopus spp., Aspergillus
oryzae, Asp, Nidulans, Candida spp.
3 p-1,4 galactosidase
(EC.3.2.1.23)
- glucose isomerase Bacillus spp.
(EC.5.3.1.18)
- lysozyme Trứng gà, v s v
(EC.3.2.1.17)
- Peroxidase Sữa bò
(EC.1.11.1.7)
- Catalase Gan bò
(EC.1.11.1.6)
- Superoxidase dismutase Sữa bò
(EC.1.8.3.2)
- P h o s p h a te a cid Khoai tây
(EC.3.1.3.2)
- Phosphatase kiểm lipase Cừu
(EC.3.1.1.3) Pancrease, Sừeptococcus spp., Penicillium spp.,
• glucose oxidase Aspergillus spp.
(EC-1.1.3.4) Aspergillus spp.
4 Các protease khác

- Papain (EC.3.4.22.2) Quả đu đủ
- Ficin (EC.3.4.22.3) Quả sung
- T ry p sin (E C .3 .4 .4 .4 ) Bò,ngựa
- Chymotrypsỉn (EC.3.4.4.5) Bò ngựa
Protease từ động vật Protease từ động vật được khai thác và

ứng dụng từ rất lâu, khi loài người biết chế biến sữa thành phomai.
Các loại enzym được khai thác và ứng dụng trong công nghiệp chế
biến sữa được trình bày trong bảng 7.31.
468 Chương 7
Bảng 7.31 Các loại protease từ động vật
s tt Loại Proenzym Khoảng pH Chết

protease (tiền enzym) hoạt động hoạt hóa
1 Pepsin Pepsinogen 1,5 -4 ,0 H+, protease
2 Chymosin Prochymosỉn 5 -6 ca2*
3 Trypsỉn T rypsinogen 6 ,5 - 9 ca2*, endorokinase

4 Chymotrypsỉn Chyanotrypsinogen 7 - 8 ,5 ca2+
5 Carboxypeptidase Procarboxypeptidase 7,4 (6 - 8,5) Trypsin

6 Aminopeptidase - 7,5 - 9,0 (6,5 - 8) -
Một số tính chất quan trọng của từng loại protease động vật
được tóm tắ t trong những bảng sau.
Bảng 7.32 Tính chất của protease động vật
Loại Trọng lượng Điểm Hoạt tỉnh Độ bển ứng dụng
enzym phân từ đẳng điện
Pepsin 35.000 dalton pH, 1,0 Khả năng phân giảỉ Trong glycerol Được sản
(EC.3.4 23.1) chứa 321 nhiểu loại protein mất hoạt tính xuất nhiểu ở
amino acid trong pH kiềm hãng Anex R-
Werner Đửc
.ỉ và Orthana
Đan Mạch
Chymosin 31.000 Trong 10 phút có thể
(EC.3.4.23.4) tàm đống tụ sữa với
SỐ lượng gấp 72 triệu
lân khối lượng enzym.
Hoạt động mạnh ở
pH 3,8 và 40°c
Trypsin 24.000, “ Hoạỉ động mạnh ỏ Bển ô pH 3 —
(EC.3.4.21.4) chứa 233 pH 7 - 9

amỉno acỉd
Chymotrypsỉn 25.000 Hoạt động mạnh d Bổn ỉrong môí
(EC.3.4.21.1) pH 8 9, 40 - 45°c trường kiổm.
BỊ ức chế bởi
kim loại nặng
Carboxypeptidase 34.000, — Hoạt động mạnh d — ”
(EC.3.4.2.1) chứa 307 pH 7 - 8
amino acid
Aminopeptidase - - Hoạt dộng mạnh ỏ - -
(EC.3.4.1.2) pH 7,5 - 9,0
Protease vsv. Hiện nay rất nhiều loại protease v s v được nghiên
cứu và ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa. Tính chất một số
enzym v s v quan trọng ứng dụng trong chế biến sữa được trình bày
trong bảng 7.33.
Bảng 7.33 Tính chất protease vsv (có so sánh với trypsin)
Loộl Trọng iượng Chất pH Hoạt tính riéng/

stt enzym phẩn tử (dalton) kìm hãm hoạt động mg protein
1 Subulisin 26.000 DFP 8 ,5 -1 1 2.200
2 p rote as© kiềm từ B. subtilis 25.000 DFP 8,5-11 2.300
3 Protease trung tính (Tsuru I) 44.700 EDTA 6,5 - 7,5 13.600

4 Protease trung tính (Tsuru II) 34.000 EDTA 7,5 - 8,0 12.500
5 Protease kiốm của A. oryzae 35.000 DFP 7.5 - 9,5 3.500
6 Trypsin 24.000 DFP 7,0 - 9,0 1.700
Ghi chú: DFP: isofluorophate; EDTA: ethylenediamỉnetetra acetỉc acỉd.
Có rất nhiều chế phẩm protease từ v s v được sản xuất trên thế
giới. Các chế phẩm và các hãng sản xuất ra chúng được trình bày
trong bảng 7.34.
Bảng 7.34 Các hãng sản xuất và các chế phẩm protease vsv
s tt Nguđn enzym Hảng s in xuất v i tén chế phẩm
1 Carboxyl protease acid Sumizime R.P.(SN) Newlase (AM)

Rhizopus spp. Coiolase PS(RM), Veron PS(RM)
Aspergillus oryzae Sumizyme LP(SN), Sanzyme (SA)
Aspergillus niger Sumizyme FP(SN), protease (MJ)
Aspergillus saitoi Seishin
Pharm CO. Noda Japan (SP)
Mucor miehei
Rennilase (NO), Fromase (QB)
Mucor pusiilus
Marzyme (SOE), Morcurd (MSJ)
Noury Lab (MSJ)
Meito Rennet (MSJ), Nourylab (MSJ)
2 Metaloprotease Neutrace (NO), corolase N (RM)

S. amylotiquefaciens Veron p (RM). Bioprase, Rhozyme (GR),
B. thermoproteolyticus Orientase (uA), Thermoase (DA)
b- Các chế phẩm lipase. Lipase tham gia thủy phân triglyceride
theo từng bước sau:
470 Chương 7
o
II
H2C —o —c —R-I
R -C -0 -C H
II I
H .c -o -c -a
/ Ọ
II
H X-O -C -R ì H2C “ OH
V9
II
r 2- c - o - c h Ro-C -O -C o
I _ \\
H2C - O H h 2c - o - c - r 3
1,2. Dỉglyceride 2,3. digỉyceride
HO -C-R
Acid béo
o H2C - O H o
Ị 'I II
R2“ C - 0 - C HO -C-R3
HX-OH
2 - monoglyceride + acid béo
H2C —OH Ọ
y
OH-C H O -c-ạ
Bước 3 I
h2c - oh
glycerol Acid béo
Lip€tse động vật

Năm 1923, W illstatter và Memmen đã tách được lipase từ
pancrease lợn (heo). Từ đó đến nay loại enzym này được nghiên cứu
rấ t kỹ. Tính chất của lipase động vật bao gồm:
- Trọng lượng phân tử: 45.000-50.000 dalton
- Điểm đẳng điện pH 4,9-5,0
Các enzym lipase có tác dụng tạo mùi và cấu trúc cho sản phẩm
chế biến từ sữa.
Lipase từ vsv. Ngày nay người ta sản xuất lipase chủ yếu từ nấm
sợi và nấm men.
Lipase từ nấm sợi Aspergillus spp.
Năm 1963, Fukumoto đã tách được lipase từ nấm sợi. Đặc tính
của lipase của nấm sợi được trình bày ở bảng 7.35.
Bảng 7.35 Tính chất lipase của Aspergillus niger
stt Tính chất Lỉpase 1 Lipase II
1 Trọng lượng phãn tử 31.000 19.000

2 Pl 4,0 3,5
3 pH tối ưu 5-6 5-6
4 Cơ chát đặc hiệu s .Chuỗi acid béo dài Chuồi acid béo ngắn
5 Hg2+ Khổng ảnh hưỏng Làm bất hoạt
Trên th ế giới có ba chế phẩm ỉipase được thương mại hóa là

lipolact (AM), lipase AP (AM), lipozym (NO).
Lipase từ Mucor sp. Lipase từ Mucor, sp. hoạt động mạnh ở pH
7-8,2, nhiệt độ 40°c, trọng ỉượng phân tửjỉì.000 dalton.
Lipase từ Candida cyỉindrace
- Trọng lượng phân tử 120.000 dalton
- Điểm đẳng điện 4,2
- Hoạt động mạnh ồ pH 5-8,5, tốì uu ở pH 7-8
- Nhiệt độ hoạt động tối ưa là 45°c
- Chế phẩm thương mại: lipase AY. (AM) (SA)
Lipase từ Rhizopus sp
- Trọng lượng phân tử 43.000 daỉton
- pH tối ưu từ 5 ,0-7,0
- Nhiệt độ hoạt động tối ưu 30-45°C
- Chế phẩm thương m ạfrlipase D. (AM).
Lipase từ Psendomonas sp
- Trọng lượng phân tử 29000 daỉton
- pH tối uu 5,3
472 Chương 7
c- Phosphatase. Phosphattase được sản xuất nhiều trong sản

xuất casein. Enzym này phân giải phosphoprotein, làm giảm hàm
lượng phosphate có trong casein.
d- p-l,4-galactosidase. Enzym P-l,4-galactosidase tham gia thủy

phân lactose đến đường glucose và galactose. Người ta thu nhận p-1,4-
galactosidase từ v s v . Đặc tính các loại p-l,4-galactosidase từ các
nguồn v s v khác nhau được trình bày trong bảng 7.36.
Bảng 7.36 Tính chất một sổ enzym fi-l,4-galactosidase
stt vsv pH tối ưu Nhiột độ tối ưu
1 Aspergillus niger 3,0 - 4,0 55
2 Aspergillus oryzae 4.8 46
3 E. Coli 6,9 - 7,5 45
4 Saccharomyces flagilis 6,5 50
10- ứng dụng enzym trong thủy phân protein, chất béo, cellulose
và chuyển hỏa saccharose
a- ứng dụng enzym đề thủy phàn protein
Thực chất của quá trình thủy phân protein là chuyển nitơ hữu cơ
dạng không hòa tan (protein) sang nitơ hữu cơ hòa tan (peptide và
amino acid). Hỗn hợp các amino acid và peptide hòa tan này rất có ý
nghĩa trong sản xuất thực phẩm và thức ăn gia súc.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng enzym thủy
phân protein thường làm tăng tính chất chức năng của protein của
đậu nành.
Trong quá trình thủy phân, protein cổ thể xuất hiện vị dắng.
Nếu có vị đắng, ta có thể loại chúng bằng sự hấp thụ của than hoạt
tính. Các loại enzym được ứng dụng để thủy phân protein tạo ra hỗn
hợp nitơ hữu cơ hòa tan được trình bày trong bảng 7.37.
Bảng 7,37 Các loại enzym sử dụng trong thảy phân protein
Mứcđộ
stt Cđ chất Enzym ứng dụng
thúy phân (%)
1 Phế liệu thủy sản Papain 1 0- 15 Tách mỡ cá, làm thực

phẩm gia súc
2 Cá Proteinase pancreatic 10 Protein dậm đặc không
đắng, sử dụng nấu soup
3 Casein Proteinase pancreatic 2 -2 ,5 Sản phẩm thủy phân hòa
tan, peptide không đắng,
làm tâng mức bền bọt
4 Casein Proteinase pancreatin 37 Dung dịch huyển phù
dùng trong y
5 Gelatin Proteinase pancreatin đến 25 Sử dụng trong mỹ phẩm
6 Protein dịch lọc sữa Protease trung tính. Vi 2 -8 Tăng bột
khuẩn, proteinase pancreatin
b- ứng dụng enzym trong chế biến nước mắm

Nước mắm là sản phẩm lên men truyền thống của dân tộc Việt
Nam. Nước mắm là một dung dịch bao gồm nước, muối, amino acid,
peptide, các chất tạo mùi và màu. Hỗn hợp đó được tạo ra từ quá trình
lên men tự nhiên trong thời gian ít nhất là chín tháng. Nước mắm
được sản xuất từ quá trình lên men trên một năm là loại nước mắm
có chất lượng rấ t cao. Tuy nhiên, việc lên men tự nhiên thường kéo
dài, người ta muốn quá trình lên men nước mắm ngắn hơn. Để rút quá
trình lên men nước mắm, người ta cho bromelin vào cùng khối chượp.
Nhờ hoạt động của bromelin, protein cỏa cá được thủy phân nhanh
hơn. Vì nước mắm là sán phẩm không chĩ chứa amino acid, peptide
mà mùi có vị trí rấ t quan trọng làm nên chất lượng nước mắm. Do
đó, việc tăng nhanh quá trình thủy phân protein'của cá phải hài hòa
với quá trình tạo hương cho nước mắm. Việc rút ngắn thời gian lên
men phải đảm bảo hai chĩ số quan trọng đó. Khi sử dụng enzym
protease trong mục đích này, người ta sử dụng bromelin từ dứa.
Đromeỉin có ở nhiều thành phần của quả dứa, nhimg bromelin có
nhiều n hất ỏ đọt dứa. Người ta sử dụng đọt dứa như chế phẩm
bromelin thô và trộn chế phẩm thô này vào các lớp cá đă trộn muối.
Để trán h hiện tượng biến tính ồ bromelin, thay vì cho muối vào một
474 Chương 7
lần trong lên men, người ta cho muối vào nhiều lần. Theo cách này
ta có thể sản xuất nước mắm khoảng từ năm tháng đến bảy tháng
- thay vì chín tháng hay hơn một năm.
c- ứng dụng enzym để thủy phân chất béo
Người ta tiến hành thủy phân chất béo bằng enzym lipase từ
động vật và từ v sv . Quá trình thủy phân của lipase được ứng dụng
vào các lĩnh vực sau:
- Thủy phân lipit bằng lipase là phương pháp thay thế cho
phương pháp thủy phân cổ điển bằng hóa chất.
- Sử dụng enzym lipase bền môi trường kỉềm từ vsv được ứng
dụng trong sản xuất chất tẩy rửa. Trong chất tẩy rửa thông thường,
người ta cho enzym lipase để làm sạch vết bẩn lipid.
- Sử dụng enzym lipase trong quá trình làm chín phomaỉ.
d* ứng dụng enzym dể thủy phân cellulose
Hiện nay chưa có công nghệ thủy phân cellulose theo quy mô
công nghiệp. Nhưng trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu
dạng pilot sử dụng enzym hemicellulase, lignase, cellulase.
Trong tương lai sẽ xuất hiện các công nghệ được sản xuất theo
quy mô công nghiệp bằng các loại enzym trên.
Tuy nhiên, cũng đã có nhiều công trình ứng dụng hỗn hợp
enzym trên trong sự chuyển hóa các chất hữu cơ chứa lignocelluse để
làm sạch môi trường.
7.1.4 Sử dụng enzym tro n g chuyển hóa am ino acid và

h yd ro xyca rb o xylic acid
Ngày nay, việc sản xuất ra những amino acid tinh khiết để phục
vụ cho y học, thực phẩm đã thực hiện theo quy mô công nghiệp. Người
ta sản xuất các amino acid tinh khiết theo hai phương pháp:
- Phương pháp lên men
- Phương pháp xúc tác bỏi enzym.
Phương pháp enzym được thực hiện bởi enzym ngoại bào, enzym
cố định (enzym không hòa tan) và enzym có trong tế bào vsv.
2- Sản xuất L-amino acid từ dạng D-amino acid

Các amino acid thường tồn tại ở hai dạng đồng phân quang
học: dạng L-amino acid và dạng D-amino acid. Cơ thể người và động
vật cần dạng L-amino acid. Còn dạng D-amino acid không có ý nghĩa
nhiều hoặc không có ý nghĩa đối với người và độr vật. Khi thủy
phân protein bằng kiềm thường tạo ra đến 50% amino acid ở dạng
D-amino acid. Do đó, việc chuyển D-amino acid th à n h L-amino acid có
một ý nghĩa rấ t lớn.
Các D-isomer thường được racemic hóa trong bình phản ứng. Khi đó,
các amino acid dạng D sẽ được racemic hóa để chuyển thành dạng L-amino
acid. Người ta thường sản xuất L-methyonine, L-valin, L- phenylanin,
L-tryptophan và L-lysin được sản xuất theo phương pháp này.
a- Sản xuất L-amỉno acid từ N-acetyl-P, L-amino acid
Hai amino acid là L-methyonine và L-valin rất cần mức độ tinh
khiết tuyệt dối để sử dụng trong y học. Người ta dã tiến hành sản xuất
L-methionin và L-valin từ N-acetyl-D-L-amino acid nhờ enzym aminoacylase.
Enzym aminoacylase (EC.3.5.1.14) thường được sản xuất từ
Aspergillus oryzae. Enzym này hiện nay được sản xuất theo quy mô
công nghiệp. Người ta cũng đã sử dụng enzym này để sản xuất enzym
aminoacylase cố định dùng trong quá trình phản ứng liên tục. Toàn bộ
phản ứng chuyền hóa này theo cơ chế sau:
H
R COOH COOH
T H,0 X .
NHCOCH, - NH2 + CH 3COOH
Aminoacylase
H
COOH
Nhiệt
Racimỉc hóa NHCOCH3
trong dó: R = (CH3)2CH: valin; R a CH3S - CH2 - CH2: methyonine

6- Sàn xuất L-amino acid từ ester cùa D, L-amino acid
Người ta sản xuất L-amino acid từ ester của hỗn hợp D,L-amino
acid nhờ enzym esterase.
476 Chương 7
Enzym esterase (EC.3.1.1.43) được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus spp.

Quá trìn h chuyển hóa được thực hiện theo cơ chế sau:
_ H ___ _ H
R COOR’ r J^COOH r X COOR’
T esterase T T
Nh2 + H20 ----------------- ► NH2 + NH2
acid của D, L - R1—OH L - amỉno acid ester D - amỉno aciđ

amino acid
CHj
trong đó: R = ^ CH2,
R’ = CH3 NH
n
c- Sản xuất L-amino acid từ amide của ĐfL amino acid

Người ta sản xuất L-amino acid từ amide của D,L amino acid nhờ
quá trình thủy phân bởi enzym amidase.
Exizym amidase (EC.3.5.1.4) được sản xuất từ vi khuẩn Psendomonase
spp và Erwinia carotovora. Quá trình phản ứng xảy ra như sau:
_ H
R CONH2 R^KCOOH
T
nh 2
HaO
-------------- -
X2
nh + nh2
amidase
amỉde D, L amino acid L - amino acỉđ
H
R VL CONH
sau đó Ỷ
NHg
sẽ bị thủy phân tiếp để tạo thành
(amide D- amino acid)
H
COOH
" Ỷ + NHj
nh2
D- amỉno acid
trong đổ R:(CH3)2CH là valỉn; R: ^ CH2 là phenylalamin
R: C ì l CHllà tryptoplan
NH
d- Sản xuất -L-lysin từ D,L-a -amino-e 'caprolactam

Người ta thường sản xuất L-lysin theo cách này dể sử dụng trong
thức ăn gia súc. Để sản xuất L-lysin, người ta phải sử dụng đến hai
loại enzym. Phản ứng xảy ra như sau:
CH* HịO ^ ^ \U c O O H
NH ° ACt-. hydrolase rNHZH NH

t j
D,L. ACL L. lysin
t x -x í
ACL. racemase + ( CH,
NH 0
D. ACL
Enzym ACL-racemasẹ được sản xuất từ Achromobacterobae và
C.Lauretii, còn enzym ACL-hydrolase được sản xuất từ Cryptococcus UmretiL
e- Sản xu ất L-cysteine từ a cid D9L*2-amino-2-thỉazoline-4-
carboxylic
Người ta sản xuất L-cysteine từ acid D,L-2-amino- 2-thiazoline-4-
carboxylic bằng enzym đặc hiệu L-ATC-hydrolase, S-carbamoyl-L-
cysteine hydrolase. Các enzym này được sản xuất từ Pseudomonas
thiazolinophilum. Cơ chế của quá trình chuyển hóa trên như sau:
/H
COOH + C02
'2
HS
í NH5
NH2 + NH2
L.lysteiné
h 20 S.carbamoyl-L-esteine-hydrolase
ỵ^-C O O H
V
n
____ ✓COOH
1
_ .Hg - ------- ► S NHj
L.ATC hydrolase
h/
\ _ Q
~
D.L-ATC COOH
I____
s .N
nh2
A-ATC
478 Chương 7
f- Sản xuất L-amino acỉd và D-amino acid từ D,L hydantoin

Người t a s ả n xua't L-amino acid từ D,L h y d a n to in b ằ n g enzym
h y d a n to in a se . E n zy m n à y được s ả n x u ất từ vi k h u ẩ n Pseudomonas
striate v à Bacillus spp. N goài ra, người ta còn s ả n x u ấ t enzym n à y từ
Achromobacter liquifaciens v à Flavobacterium aminogenes. Cơ chế
chuyển h ó a n à y được tr ìn h b ày n h ư sau:
_ H H
FL KCOOH COOH
H
"rf°
HN NH
h 2o
hydantoinase
Ỳ
NH
h 2o
NH2 carbamoylase NH
ị + co2
o + NH
5-Substituted L - amino acid
L-Hydddantion
ti H
COOH
h 2o
5-Substituted "Ỷ
D-Hydantlon hydantionase HN
Ỵ n Hí
0
g- Sản xuất L-amino acid từ acid DyL-a hydroxycarboxylic

E nzym th a m g ia chuyển h ó a acid D,L.a hydroxycarboxylic th à n h
L-am ino acid p h ụ thuộc vào cofactor. P h ả n ứng n à y được thự c h iện
liê n tụ c qua m à n g p h ả n ứng. E nzym thực h iệ n p h ả n ứ ng n à y là L-
la c ta te d eh y d ro g en ase, được s ả n x u ấ t từ Lactobacillus spp v à có m ặ t
của NAD. K hi đó, acid L-lactic sẽ chuyển th à n h p y ru v ate v à pyruvate
tiế p tục được khử nhờ a la n in e d ehydrogenase. E n zy m alan in e
d eh y d ro g en ase được s ả n x u ấ t từ Bacillus cereus. N hờ h o ạ t động của
enzym n ày , p y ru v ate sẽ chuyển th à n h ala n in . T o àn bộ quá trìn h
chuyển h ó a th e o phương tr ìn h sau:
R ^C O O H EJE, R ^C O O H R ^C O O H
OH NAD NADH
R Ei /E 2/E 3 Sản phẩm
ch3 L-lactate DH (Ei) L-Alanỉn

D-lactate DH (E2)
L-Alanine DH (E3)
(CH3)2CH - c h 2 L-hydroxyisocaproate DH (Ei) L-Leusine
(CH3)2CH D-hydroxyisocaproate DH (Ei) L-Valin
c h 3- s - c h 2- c h 2 L-Lencine DH (E3) L-Methyonine
C8H5CH2 L-lactate DH (Ei) L-Methyonine
D-lactate DH (E2)
L-phenylaíaníne DH (E3)
Ghi chứ: DH-dehydrogenase

2- Sản xuất L-amino acid từ a, phợp chất không bão hòa
Enzym tham gia xúc tác gắn thêm NH3 vào fumaric acid để tạo
ra aspartic acid. Ngày nay người ta sản xuất aspartic acid theo quy mô
công nghiệp theo phương pháp này. Đây là amino acid là thành phần
của aspartam (ester methyl của L-aspartyl-L-phenilalanine). Enzym
tham gia các chuyển hóa này là L-aspartate amonia-lyase (EC.4.3.1.1).
Enzym này được sản xuất từ vi khuẩn E.coli. Quá trình chuyển hóa
này được trình bày như sau:
r / ^C O O H NH3 r COOH ^
E nh2
R Enzym Sản phẩm
HOOC a s p a rta te L- aspartic acid
L- phenỉlatanine L- phenilalanine
o a m in o n ia ly a s e
3- Sản xuất L-amino acid từ acid a-oxo

Người ta sản xuất L-amino acid từ acid a-oxo nhờ enzym formate
dehydrogennase với sự có m ặt của NAD. Enzym formate
dehydrogenase được sản xuất từ Candida boidinỉL Theo phương pháp
480 Chtfdiig 7
này, người ta sản xuất L-alanin từ pyruvate. Sản xuất L-aỉanin từ

pyruvate nhờ enzym L-alanine dehydrogenase của Bacillus cereus.
L-phenyllalanine dehydrogenase từ Brevibacterùun spp. hay Rhodococcus spp.
được sử dụng để tổng hợp L-phenilalanine từ phenyl pyruvate và amonỉac.
Toàn bộ các quá trình này được trình bày như sau:
R\ / COOH H
enzym COOH
II + NH< + HzO
o NADH T NH-
Formate DH
R Enzym S in phẩm
ch3 L-alanine DH L-aỉanine

(CH3)2CH - c h 2 L-leusine DH L-leusine
(CH3)2CH L-leusine DH L-vanine
(CH3)3C L-leucine DH L-tert-leusine
c 8h 5 - c h 2 L-phenylalanin DH L-phenylalanine
Trong công nghiệp, người ta cũng sử dụng tế bào cế định để sản

xuất L-amino acid nhờ enzym có trong tế bào. Các vsv thường được sử
dụng trong mục đích này là E.coli và Pseudomonas psendocalcaligenes.
Các phản ứng theo sơ đồ sau:
i^COOH
HOOCXỴ
NH2 O ' °
L-aspartic acid Phenylpyruvie acid COOH
Transaminase co 3
pyridoxel 5-phosphate
0
COOH
oxalo acetic acid

ơi COOH
L-phenylalanine
4- Sản xuất L-alanin từ acid arpartic

Dưới tác dụng cửa L-aspartate 4-carboxylyase (aspartate
^-decarboxylase, EC.4.1.1.12), a s p a rtic a c id c h u y ể n th à n h L -a la n in e .
H
/ k | / cCOOH
oc Aspartale-p- CH3 COOH
H O O C ^Ỵ
NH2 decarboxylase
pyridoxal“5’-phosphate
Aspartic acid L. alanine
Người ta sản xuất L-alanin theo quy mô công nghiệp từ năm 1965.
ố- Sản xu ấ t L-cysteine từ ậ-chloro L-alanine
Trong công nghiệp, người ta sản xuất L-cysteine từ p-chloro L-

alanine nhờ enzym cysteine desul flydrase, EC .4.4.1.1. Enzym này có
trong vi khuẩn Enterobacter cloaceac:
NH2 INr<2 HCI

Aspartic acid L.alanine
Ngoài Enterobacter cloaceac ra, người ta còn thấy Preudomonas

putida cũng có khả năng sinh tổng hợp enzym cysteine desul flydrase.
6- Sản xuất L-serine từ glycine và formaldehyde hay methanol
Enzym serine hydroxymethyltransferase (SHMT) (EC.2.1.2.1)

tham gia quá trình chuyển hóa glycine thành L-serine. Enzym này
được tổng hợp bởi Klebsiella aerogenes:
7- Sản xuất L-threonừie từ glycine và acetaldehyde hay ethanol
Phản ứng tạo ra L-threonine từ glycine được xúc tác bởi L-theonine
acetaldehylase (L-threonine aldolase) (EC.4.1.2.5). Enzym Iiay có trong
tế bào của vi khuẩn Pseudomonas spp.
482 Chương 7
8- Sản xu ấ t L-tryptophan từ indole và pyruvate hay serine

Hai enzym tham gỉa quá trình chuyển hóa này là tryptophan-
synthase (EC.4.2.1.20) và tryptophanase (EC.4.1.99.1). Cốc enzym này
dược tổng hợp bởi E.coỉỉ, Pseudomonas và Methỵlomonas.
Cơ chế chuyển hóa được trình bày như sau:
H
Tryptophan -
NH* sy n th a se H
L-serine
NH
COOH
V ' ỉndote
II + nh3
o Tryptophanase
Pỉruvíc acid
9- Sản xuất L.tyroõine từ phenol, pyruvate và amotUac

I •
Sịnh tổng hợp L-tyrosine được xúc tác bởi enzym L-tyrosine
phenollyase (p-tyrosinase, EC.4.1.99.2).
H
COOH
NH2
L.tyrosỉne
7.2 ỨNG DỤNG ENZYM TRONG PHÂN TÍCH VÀ TRONG Y HỌC
Enzym được sử dụng như một ỉoại hóa chất để:

a- Xác định nồng độ cơ chất
b- Xác định hoạt tính xúc tác của enzym có một trong mẫu sinh vật.
c- Sử dụng như một tác nhân thực hiện các phản ứng miễn dịch.
Các loại enzym được sử dụng trong phân tích thực phẩm và
trong y học được tổm tắ t trong bảng 7.38.
B ả n g 7.38 Các enzym sử dụng trong phân tich thực phẩm

và trong chuẩn đoán bệnh
Trọng lượng Điếm

Enzym Nguỉn Kmmol/I PHttfilJU Cơ chất
phin từxio* dềng
dalỉon đtện
(1) (2) (3) (4) (5) (6) í7)

Acety-CoA Nám men 151 2.8* 1CT4(acetate) 7,6 acetjjf
Synthetase
(EC.6.2.1.1)
Adenylate Kinase Cơ động vật 21 5x104(AMP) 7,5 6,1 AMP J

(myokinasa)
SxlOÂTP)
(EC.2.7.4.3)
Alcohol Nấm men 141 1,3x10* {ethanol) 9.0 5,4-5,8 ethanol

dehydrogenase 7,8x1 a 4 ahcohot
(EC.1.1.1.1) (acetaldehyde) • ahdehyde
7,4x10* (NAD)
1,08x10 s (NADH)
Aldehyde Nấm men 207 9x1 ừ* 9,3 Acetaktehyde,

dehydrogenase acetaklehyd* ethanol
(EC.1-i.1-6' 1,3x1c4 (NAD)
D-amino acid Thận heo 100 I.SxKT3 8,5 Penicillin

oxidase {EC. 1.4.3.3) 38-39 (D-alanine) hormone
1,8x10'4 (oxygen)
Amytoglucosidasa Asp. 97 2,2x10*7 5.0 4.2 Tỉnh bộỉ

(glucomylase) (amylopectin) glycogen
niger
(EC.3.2.1.3)
Ascobate okydase Cucurbềasp 140 2,4x1 ữ4 5.6-7,0 5,0*5,5 ascorbate

(EC. 1.10.3.3) (L-ascortoate)
Batroxobin (Serine Bothropsatrox 32-43 1,6-2,9x10'4 7,4-8,2 6.6 Fibrinogen

proteinase, Reptitase) (Phe.Val, Arg, p
(EC.3.4.21.29) nitroanilide)
Cataỉase Gan bò 232 — 6,8-7.0 5,4-5,8 Uric acid

(EC.1.11.1.6) cholesterol
Cholesterol Pseudomonas 129 7x10r® 7,3*7,6 4,5 cholesterol ester

esterase aurmcens (choỉesteroi oleaỉs)
(EC.3.1.1.13)
Cholesterol oxydase NocanẾaerythr 59 1x10* 7,5 4,85 Cholesterol

opoẵs (cholesterol)
(EC. 1.1.3.6)
Choline KinaM Nám man 6,7-6,8 1.5x10** 8,0-9,5 6 Phosphatidy-

(EC .2.7.1.32) (choline) choline
484 Chương 7
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Cholin oxidase Arthrobacter 84 hay 71 1,2x10'3 (cholin) 7,5 4,5 Phospholipids
(EC.1.1.3.17) gtobiformts 8.7x10-* (betain
aldehyde)
Citrate lyase Aerobacter 575 (73,8) 2,1 xio*4 8,0-9,0 8,0 citrate
(EC.4.1.2.6) aerogenes (citrate)
Citrate synthase Tim lợn 100 2.5x10‘4 (citrate) 8.0 5,05 acetate
(EC.4.1.3.7) 2,8 x10 5 (CoA)
Creatinase Pseudomonas 94 1x102 (creatine) 8.0 4,8 creatine,
(Creatinine sp creatinine
amldinohydrolase)
(EC.3.5.3.3)
Croatininase Pseudomonas 175 3x10* (Creatinine) 7.8 4.7 Creatinine
(creatinine sp 6x10*2 (creatine)
amidohydrolase)
(EC.3.5.3-10)
Creatinine (Corynebacteri 200 6x10*3 (creatine) 7.5-9,0 4.2 Creatine

deiminase umlilium)
(EC.3.5.4.21)
Dihydrolipoamide Tỉm lợn 114 5x1 O'3(lipoamide) 4,8 S.9-7,2 NADH
dehydrogenase 2x10'3 (lỉpoate)
(diaphorase) 2x10*4(NAD)
(EC. 1.8.1.4) 2,7x10'4
(Ferricyanide)
Estenase Gan lợn 168 5x10* 8,6-8,8 5,0 Triglyceride
(carboxylesterase) (ethyl- n butyrate)
(EC.3.1.1.1) 4,4x104 (phenyl
n-butyrate)
Factor xa Huyết tương 47,2 5x10 4 8,3 Prothrombin
(Thrombo Kinase) bò
(xao)
(EC.3.4.21.6) 44,2 (xa ự>)
Formaldehyde Pseudomonas 150 6,7x10 s 7,8 5,25 Formaldehyde
dehydrogennase sp (formaldehyde)
(EC.1.2.1.46)
1,2x104 (NAD)
Formate Candida 74 1,3x1 O'2 (lormate) 7,5 + 8,5 formate, oxalate
dehydrogenase bokUnini 9x10 5
{EC.1.2.1.2) (NAD*)
(J - Fructosidase Nấm men 270 9,1x10* 3.4-4,0 4.02; đường kính
(EC.3.2.1.26) (đưdng kỉnh) 4,25
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

p-D-galactose Pseudomonas 64 7x10 4 9,1-9,5 5,13 galactose,
dehydrogenase fluorescens (D-galactose) raffinose
2,4x10 4 (NAD*)
2,3*10 3 {NADP )
u-galactosidase E.coti 329 2x102 (galactose) 6.0-7,0 5,1 rafinose
(EC.3 2.1.22)
p-galactosidase E.coli 465 3.85x10 3 8.0 4.61 lactose
(EC.3.2.1.23) (lactose)
9,5x10
glucono Kinase Ecoli 67 7x10 5 8,0 D * gluconate
(EC.2.7.1.12) (D-gluconate)
5x104
(ATP)
glucose Bacillus 118 4.75*10* 8.0 glucose
dehydrogenase megatherum (glucose)
(EC.2.7.1.12) 4,5x10 3 (NAD*)
glucose oxidase Asp niger 160 3.3x1 O'2 5,5-6.5 4,2 glucose
(EC.1.1.3.4) (glucose)
glucose*6- Lenconostoc 103,7 6,4*10 5 (glucose-6- 7.8 4,6 glucose-6
phosphate mensenteroide phosphate) phosphate
dehydrogenase 5 I.ISxIO"4 (NAD*) A T P , đường
(EC. 1 1.1.49) 4
glucose-6- Nấm men 120 0,7’ 1.5>dp*3 7.6 5,0-5,4 fructose

phosphate (glucose*6-
isomerase phosphate)
(EC.5 3.1.9)
a-glucosidase Nấm men 68 1,8-2,8^10“ 7,5-8,0 5,6-5.9 a-amylase
(maltase)
(EC.3.2.1.20)
JỈ-glucosidase Amylodalacdul 135 6x10 3 4,4-6,0 7.3 ct-amylase
(EC.3.2.1.21) ces amygdalin
glutamate Gan bò 332 1,8x10 3 8,5-9,0 1.5 glutamate. ?-

gehydrogenase (L - glutamate) oxoglutarate
(EC. 1.4.1.3) 7x104 ammama
(2 -oxoglutarate)
3.2x1 O'3
(amonia)
7,0x10 4(NAD*)
4.7x105
>
(NADP*)
2,5x10 s
2200 (NADH)
2,4x10*
(NADPH)
glutamic-oxaloacetic Tim heo 94 8,9*10 3 8,0-8,5 5.0 malate

transminase (L-glutamate)
(EC.2.6.1.1)
486 Chương 7
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Glutamic pyruvic Tim heo 115 2.5 • 10 ? 8.0*8,5 lactate
transaminase (L-glutamate)
{alaninế*aminotr - 3 10 4
ansferase) (l-alanine)
{EC.2.6.1.2) 4 10 4
(2-oxoglutarate)
Glycerol Enterobacter 340 1.4 -10-2 (glycerol) 9.0 glycerol,
dehydrogenase aerogenes 1.3-10-3 triglyceride 1
Ị (EC.1 1.1.6) (dehydroxeyacetone) !

i
1.5-10-4
(NAD+)
1,4-10-5 (NADH)
Glycerol kinase Bacillus 230 4,4«Ì0 '5 10.0-10,5 glycerol.
stenrothermop (glycerol) triglyceride
(EC.2.7.1.30)
hillus 6 10s
(ATP)
Glycerol 3- Cơ thỏ 78 1,1' 104 glycerol 3- 7.8-8.6 6.45 ylycerol.
I phosphate phosphate triglyceride i
Ỉ dehydrogenase 3.8.'10“* (NAD") lipase 1
(EC 1 1 1.8) Í
Glycerol 3- Aerococcus 75 3.2-10 3 7,5-8.5 4.2 Trigiycende
phosphate viridans {L-glycerol glycerol
oxidase I
3-phosphate) ị
{EC. 1.1.3.21)
— Ị
Hexokinase Nấm men 104 1.0-10'4 8.0-9.0 4.7 Triglyceride 1
(EC 2 7.1.1) (D-glucose)
7.0 1 0 J 1
(D - Iructose) glucose.fructose 1
2,0* 104 (ATP) manose.AT Ị
I 8.0-9.0 4.7
5 .0 -10 s
Creatine kinase
(D-manose)
3-Hydroxybutyrate Phodopseudo 85 4.1 , 10'4 6,2-6,9 3-
dehydrogenase monas (D-3- hydroxybutyrate
(EC.1.1.1.30) spheroides hydroxybutyrate)
8.0 -10 5 (NAD)
Isocitrate Tim lộn 60 2.6 10‘6 (isocitrate) 7.0-7.5 7.4 isocitrate
dehydrogenase 9.2'10 6 (NADPH)
(EC. 1.1.1.42) 1,3 10 4
(2 - oroglutarate)
I 1 107(NADP*)
j-----------------------------
D. lactate Lactobacillus 68 hay 80 7 10 2 7.0 D. lactate,
dehydrogenase teichmanii (D-lactate) glutamic,
(EC.1.1.1.28) 1.2 103 oxaloacetic và
(pyruvate) glutamic,
7.1 105 pyruvic
(NADH) transaminase 1
L. lactate Tim lợn 140 1.5 10 4 (pyruvate) 7.0 L-lactate Í
dehydrogenase 3.3 10J pyruvate, citrate 1
(EC.1.1.1.27) {L lactate) ADP
1.1 -105{NADH) 1
6,7 10 5 (NAD*) _ l
L.
Ung d ụ n g enzym 487
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Lipase Pseudomonas 32 9x10-* 7,0-8,0 4,3 Triglyceride
(triacytgỉycerotacyl sp (tributyrin)
hydrolase)
(EC.3.1.1.3)
Luciferase Photo 80 4-8x10 7 6,8 NADH
Vi khuẩn bacterium (FMNHa)
(Alkanal fischen
monooxygenase)
{EC.1.14.14.3)
LucHerase Phơtìmus 100 5x10* 7,5 - 7 8 6,2 *6,3 ATP
Firefly pyraỉis (ATP)
(EC.1.13.12.7)
Malate Tim lợn 67 4x10"* 7,4-7,5 6,1 *6.4 malate,
dehydrogenase (Lmalato) oxaloacetate,
(EC. 1.1.1.37) 3,3x10** acetate, citrate
(oxaioacetate)
Mannose Nám men 45 0,8-1,35x10a 7,0-7,2 mannose
6 - phosphate (manose
'
(EC.5.3.1.8) 6 - phosphate)
NADH - peroxidase Streptococcus 120 1,7x10* 6,0 Ha0 2
(EC.1.11.1.1) faccatis ÍNADH)
2,8x10*
(HiOa)
Nitrate reduce Aspergillus sp 200 3,2x10 4 7.5 - nitrate
(EC. 1.6.6.2) (nitrate)
Peroxidase Cù c&i ngựa 40 - 60-70 - H*02
(EC.1.11.1.7)
Phosphatase kiềm Ruột cửu 140 - 9.8 5,7 HaOa
(ẼC.3.1.3.1)
6 • phospho Ním men 100 1,6x1 o 4 8,0 gluconate
gluconate [6-phosphoghjconate)
dehydrogenase
(EC. 1.1.1.44)
Phospholipase BacUkJs 23 2x104 8.0 7.0 Phosphatidyl*
(EC.3.1.4.3) OSreus (phosphate-idyl chonine
chonine)
Phosphoiipas® 0 Stroptotnyces 5,7 1,43x1c*3 8,0 5.1 Triglyceride,
(EC.3.1.4.4) chromofuscus (phoaphati choline,
dytcholine) phospholipid
5,6x1 o 2
(sphingomyelin)
Plasmin Plasma của 8,7-9,1 1,7*10 4 74 6,1-8,4 a2 * amtiplasmin
(EC.3.4.21.7) nguời vàcùa k*n
Pyruvate oxidase Pootococcus 150 1.7x10 3 6.5-7,5 4.0 Pyruvate. ADP.
(EC.1.2.3.3) sp (pyruvate) Glutamic*
5x10’4 oxaloaxetic và
(phosphate) glutamic-pyruvic
transaminase
488 Chương 7
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

pyruvate kinase Cơ thò 237 7,0x1 O'5 7.0-7,8 5,98 ADP, IDP,
(EC.2.7.1.40) (phosphoenol Creatine kinase,
pyruvate) Phosphoenol-
1,0x10 3 pyruvate
(pyruvate)
3.0x1 o 4
(ADP)
8,6x1 O’4
(ATP)
Sarcosine oxidase Pseudomonas 174 4x1 O'3 8,0 Sarcosine,
(EC.1.5.3.1) sp (sarcosine) creatine
1,2x10**
(N-methylalanine)
1,3x10 4
oxygen
Sorbitol Gan CỬU 115 0,7-1,1 X 10*3 7,9-8,1 Sorbitol, xylỉỉol

Dehydrogenase (sorbitol)
(L-iditol 1,8x1 O'4
dehydrogenase) (xylitol)
(EC.1.1.1.14)
Succinyl-CoA Tim lợn 75 4-8x1 o*4 8,3 5,8-6,4 Succine
synthetase (Succinate)
(succinate * CoA- 5-10x10-«
ligase GDP-forming) (GTP)
(EC.6.2.1.4) 5-20x1 o*6
(CoA)
Sulfite oxidase Gan gà 110 2,5x1 o*3 8,5 - sulftte
(EC.1.8.3.1) (sulfite)
Thrombin Plasma bồ 39 (a) 1,3x1<r3 9,0 5,3-5.75 antithrombin III,
(EC.3.4.21.5) 28 (P) Arg. nitroamlid Fibrinogen,
5,9x10® heparin,
gly-pro- coagulation
Arg.nrtroaniltd status
Trypsin Tụy bò 23,3 9,4x10* 8,0 10,5- di-proteinase
(EC.3.4.21.4) (Arg-P-niczoamid) 10,8 ức chế
4,3x1 O'* Otrmacro -
(arg-ethyl ester) globulin
Urate oxidase Arihrobacter 170 6,6x10-* 9,0 urate
(urtcase) protophormiac (urate)
(EC. 1.7.3.3)
Urease Đậu Jack 480 1,05x1 O'2 7,0 5,0-5,1 urea
(EC.3.5.1.5) (urea)
Xanthine Sữa bò 283 1,7x10* B.5-9,0 6,2 xanthine, hypo
oxidase (xanthine) xanthine
(EC.1.1.3.22) 2,4x10-® phosphate
(oxygen)
Bảng số 7.39 Các enzym sử dụng trong chữa bệnh

Lo«l Trọng iượng Diing đế
MS SỐEC NgmCn
enzym? phàn tử chữa các bệnh
a-amylase 3.2.1.1 Tụy lợn - Bệnh kém tiôu hóa
p-amylase 3.2.1.2 - - Bộnh kém tidu hóa
Arkistrodon 3.4.21.28 Nọc rắn 35,4 Bệnh tắc nghdn
rhodostoma serine động mạch biôn
protease
Asparaginase 3.5.1.1 E.coiì 141 Bệnh bạch câu
Batroxobin (Bathrops atrox 3.4.21.28 Nọc rắn - -
serine protease)
Bromelin 3.4.22.5 Chội dứa 28 Bệnh khỏ tiôu hóa
Celiulase 3.2.1.4 Trichoơermaviride 57 + 52 + 76 Bộnh khó ỉiôu hóa
Chymopapain 3.4.22.6 Mủ đu đù 35 Chữa bénh ngoải da
Chymoỉrypsin 3.4.45 Tụy bỏ 25 BẬnh khó tiéu hóa
Collagenase 3.4.24.3 Clostridium 72-81 Chữa bệnh chảy máu
Nstolythum
Deoxyribonuclease 3.1.21.1 Streptococcus sp - Chữa vết thương
Factor VII 3.4.21.21 Plasma ngưđi 50 Bộnh chảy máu
(Proconvertin)
Factor IX 3.4.21.27 Plasma ngưdi 55,4 Bệnh chảy máu
(Chris mas factor)
factor xa 3.4.21.6 Plasma ngưởi hay bỏ 47.2 {xa a) Bénh rối loạn đông tụ
44.2 (xap)
factor XIII - Plasma ngudỉ 340 Bệnh mủ lỏa
(fibrin • stabilizing factor)
Hyaluronidase 3.2.1.35 - 61 Chất phát tán
Kalti Krein (kininogenase) 3.4 21.8 tụy lợn 27,1 Bệnh tắc nghdn mạch máu
Lipase 3.1.1.3 Rháopusarhũus 43 Bệnh kém tiồu hóa
Lysozyme (muramidase) 3-2.1.17 Lòng trắng trúng 14,3 Bệnh nhiềm trùng
Pancreatin - Tụy lợn - Bệnh kém tỉéu hóa
Papain 3.4.22.2 Mử đu đủ 23 Bộnh kém tidu hóa
Pepsin 3.4.4.1 Bao ỉìr lợn 35 Bệnh kém tiồu hóa
Plasmin (fibrinolysin) 3.4.21.7 Plasma 87-91 Bệnh hóa xơ
Plasminogen activator 3.4.21.99 Tế bào melanoma 67 Bệnh hóa xơ
Robinuciease 3.1.27.5 Tụy bỏ 13.7 Chữa vết thương
Subtisin 3.4.21.14 Bacillus sp. 27,6 Lảm sạch vết thương
Superoxide dismutase 1.16.1.1 Erythrocyt bò 32,5 chống lảo hỏa tế bảo
Thombin (fibrinogenase) 3.4.21.5 plama người 39 (a) Bệnh chảy máu
28 (P)
Trypsin 3.4.4.4 Tụy bò 23,3 Bộnh kốm tiồu hóa
Urokinase/urokinase 3.4.21.31 Nuởc tiều người, 49,54 Bộnh hóa xuơng
vi khuẩn biến đổi gen 31,0
490 Chương 7
7.2.1 ứng dụng enzym trong chữạ bệnh »

Enzym cũng như một sế chất dùng trong chữa bệnh cho người và
gia súc có những đặc tính không phù hợp chung như sau:
- Khối lượng phân tử 1ỚĨ1, khó qua màng tế bào
- Dễ dàng bị phân hủy trong đường tiêu hóa
- Dễ bị m ất hoạt tính sinh học do hoạt động ức chế của các chất
hiện diện trong hệ dịch và trong mô.
- Có thể biểu hiện như một kháng nguyên.
Tuy nhiên, enzym cố những đặc điểm riêng, được sử dụng như
một loạỉ thuấc chữa bệnh có hiệu quả. Hiện nay, enzym được sử dụng
chủ yếu chữa các bệnh sau:
• Enzym như chất cho thêm vào cơ thể để chữa bệnh kém tiêu
hóa đếi với những người.
• Enzym được sử dụng như chất làm sạch vết thương và làm
lành vết thương.
• Enzym được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch.
7.2.2 ứng dụng enzym trong chẩn đoán bệnh
2- ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp:
- Phương pháp xác định điểm cuối (end-poind methods)
- Phương pháp đo tốc độ phản ứng (measurement o f reaction rate).
Or Phương pháp xác định điềm cuối
Nguyên tắc của phương pháp như sau: Khỉ cho enzym tác động
vào cơ chất, cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tảng lên. Ta cố thể
xác định được những chĩ số này.
Đếỉ với nồng độ Cđ chất thấp hơn giá trị của hằng số (Km)
Michaelis, tốc độ phản ứng tuân theo phương trình sau:
V = es X vỉK m
Ở đây, thời gian cần cho kết thúc phản ứng phụ thuộc vào tốc độ
phản ứng và hằng số (Km) của enzym sử dụng.
Phương phẩp xác định glucose vói glucose-oxidase
Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hóa bởi glucose oxidase
(EC.1.1.3.4), tạo thành peroxide hydro theo phưcmg trình sau:
Glucose-oxidase 10 UI/mi
Glucose + O2 + HzO —ỉ — ► gluconate + H2Q2
Trong phản ứìig thứ hai peroxide hydro, dưới tác dụng của
enzym horse-radish peroxidase (EC.1.11.1.7) sẽ tạo màu theo phản
ứng sau:
H2Q2 + chromogen ■— ► màu + H2O
t
horse radish peroxidase
Trong phân tích này, 2>2’-azino-bỉs (3-ethyl 2,3-dihydrobenzothiazol

sulfonate (ABTS) được sử dụng như chromogen.
Phương pháp xác định urea
Urea bị thủy phân bởi urease (EC.3.5.1.5) ở 0,7 Ưl/ml. Và
amoniac được tạo thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase
(EC.1.4.1.3) có hoạt tính 6,2 Ul/ml tác động.
Urea + H20 -------► 2 NH3 + CQ2
2 -Cetoglutarate +2 NH4++ 2NADH -------► 2L-glulamate + 2 NAD+ + 2 H20
b- Phương pháp động học (kinetic methods)

Phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km
Phương pháp xác định glucose. Phản ứng xảy ra trong phương
pháp này như sau:
D-glucose + ATP ------► D-glucose-6 -phosphate + ADP
D-glucose-6 phosphate + NAD.P* ------► D-glucono-ỗ-lactone
6 phosphate + NADPH + H4
Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase

(EC.2.7.1.1). Sau đổ, glucose-6-phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động
của gỉucose-6-phosphate dehydrogenase (EC. 1.1.1.49). Sự tạo thành
NADPH sẽ được xác định bằng máy quang điện.
Xác định triglyceride. Chất béo được thủy phân bằng lipase
(EC.3.1.1.3) và carboxylesterase (EC.3.1.1.1). Glycerol sau đó sẽ được
phosphoryl hóa bởi glycerol kinase (EC.2.7.1.30) ADP được tạo thành
sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phospho enol pyruvate và
492 Chương 7
pyruvate kinase (EC.2.7.1.40). Cuối cùng, pyruvate được hydrogen hóa

bởi L-lactate dehydrogenase (EC. 1.1.1.27) và NADH sẽ giảm dần.
Triglycerỉde + 3 H20 ____ ► glycerol + 3 acid bẻo
glycerol + ATP ____ ^ glycerol 3 phosphate + ADP
ADP + phospho enol pyruvate -------- ATP + pyruvate
Pyruvate + NADH + H+ r L-lactate + NAD+
2- Xác định hoạt tính enzym

Xác định hoạt tính của alkaline phosphatase (EC.3.1.3.Ĩ)
4 - Nitro phenyl phosphate + HzO -------► phosphate + 4 - nitro phenolate
Ở pH tối ưu 9,8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ

tăng theo độ hấp thụ ở bước sóng 405nm.
Xác định hoạt tính của creatine kinase (EC.2.7.3.2)
Creatỉne phosphate + ADP ____ ► createne + ATP
ATP được tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzym
creatine kinase.
3- Thực hành miễn dịch
Enzym được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên-
kháng thể, tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng
máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác định phản ứng.
a- Enzym alkaline phosphtứase (EC.3.Ĩ.3.1)
Enzym này được ứng dụng trong phản ứng miễn dịch. Người ta
thường sử dụng enzym này với hoạt tính 2500UI/mg, ở nhiệt độ 37°c.
Để xác định hoạt tính alkaline phosphatase có thể sử dụng máy
huỳnh quang với 4-methylumbelliferyphosphate làm cơ chất.
6- P-gcdactosidase (EC.3.2.L23)
Ngựời ta thường sử dụng enzym này có hoạt tính riêng lớn hơn
250ƯI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl-P-D-galactosidase, ở 37°c.
H oạt tín h của P-galactosidase được đo bằng máy quang điện
với 4-methylumbelIiferyl-p-galactosidase. Ngoài ra ta có thể sử
dụ ng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-galactoside.
c- Horseral peroxidase (EC.1.11.1.7)

Enzym này chứa hai đến ba nhóm hoạt động aminE trong phân
tử và chứa 12-14,5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzym này
bằng máy quang điện. Cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-
azinobis [3~ethylbenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có
hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25°c.
Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là 3,3’; 5,5’-
tetramethyl benzidine.
7.2.3 ứ n g dụng enzym trong phân tích thực phẩm
Giữa thế kỷ 19, các nhà khoa học đã sử dụng enzym trong phân
tích. Tuy nhiên, sử dụng enzym trong phân tích thực phẩm mới áp
dụng khoảng 20-25 năm trước đây.
I- Xác định carbohydrate
Trong thực phẩm, carbohydrate chiếm khối lượng lớn và đóng
vai trò quan trọng trong dinh dưỡng. Các loại đường là những đối
tượng được phân tích thường xuyên.
Glucose. Glucose được xác định bằng phương pháp enzym
hexokinase. Phản ứng của quá trình đó xảy ra như sau:
D-glucose + ATP hex0kinase> ADP + glucose 6-phosphate
Glucose 6-phosphate dehydrogenase

Glucose-6-phosphate + NADP —-------------------- —-------------------- ►
D- gluconate-6-phosphate + NADPH + H+
Fructose. Enzym hexokinase cũng tác động lên fructose. Ta có

thể xác định fructose sau khi xác định glucose.
D-glucose + ATP -------------- ► ADP + Fructose 6 phosphate
^ ____u . Glucose phosphate is om erase . ____„ u ___ . .

Fructose-6-phosphate ----------- — — --------------► glucose-6-phosphate
494 Chương 7
Galactose. Galactose được xác định theo phản ứng sau:

A aaỉactose dehydrogenase _
D-galactonic acid + NADH + H _________ _________ ► D-galactose + NAD+
M annose. Xác định mannose tự do theo phương trình phản ứng sau:
hexokinase
D-mannose + ATP ---------------► ADP + mannose-6-phosphate
phosphomannose isomerase _
Mannose-6-phosphate ------------------------------- ► Fuctose-6-phosphate
Saccharose. Saccharose thường không có trong tế bào động vật.

Xác định saccharose theo phương trình sau:
_ p-FructoskJase _ _
Saccharose + H20 ----- --------- ► D-gtucose + D-fructose
Maítơềe. Xác định maltose theo phương trìnli phản ứng sau:
Maltose + H20 <*-ghicosidase ^ 2-D-glucose
L a cta se . Lactose thường có trong sữa. Xác định lactose theo

phương trình phản ứng sau:
Lactose + H20 ---------- ------- ► D-galactose + D-glucose
Rafinose. Raíinose có trong củ cải đường. Xác định rafinose theo

phương tr|nh phản ứng sau:
„ _ a-galactosidase _ _ . .___ . _____
Rafinose + H20 ■ ■ » D-galactose + saccharose
Tỉnh bột. Tinh bột cá nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài
v sv . Xác định tình bột theo phương trình phản itng sau:
_ amyloglucosidase _
Tính bột + (n -1) HaO ------I - -------------- ► n-D-glucose
2- Xác định a d d hữu cơ

Âcid hữu cơ và muối của chúng có nhiều trong nguyên liệu và
sản phẩm thực phẩm. Chúng đóng vai trừ rấ t quan trọng trong sinh
ỉý người, động vật9 thực vật và v sv . Chúng còn đuợc tạo ra do quá
trình ỉên men.
Acetic acid. Axetic acid thuộc nhóm acid bay hơi {volatile acids).
Người ta sử dụng enzym để xác định acetic acid. Phản ứng trong
phương pháp này được trình bày như sau:
Acetate + ATP + CoA acetyl-CoA sỵnthetas^ Acetyi-CoA +AMP + Pyrophosphate
Acetyl-Coa + Oxaloacelate + HaO citrate synlhetasg citrate + CoA
L-malate + NAD* kĩSSiSiláSteaSĩiSẼi oxaloacetate + NADH + H*
Phản ứng sau cùng được xem như phản ứng chỉ thị. Acetate có
nhiều trong vang.
Ascorbic acid. Giống như vitamin, ascorbic acid đóng vai trò
sinh học lớn trong sinh lý người và động vật. Chúng được sử dụng như
chất phụ gia thực phẩm. Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic
acid theo phương trình phản ứng sau:
L-ascorbic acid (XH2) + MTT —MS» dehydro ascorbic acid (X) + formazan" + H+
trong dó: PMS: 5-methylphenazinium sulfate;

MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Ascobate được oxy hóa tiếp:
L -ascorbỉc acid + 1/2 Ascorbate oxidase D ehydro ascorbic acid + H2 O
Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả, trong
rau, quả, trong sữa, trong sản phẩm thịt.
Dehydro ascorbic acid + dithiothreiỉol (chất khử) ►
L-ascobic acỉd + dithiothreitol (chất oxy hóa)
Aspartic acid. Aspartic acid có nhiều trong nước táo và được xác
định theo phản ứng sau:
L-Aspartate + a-oxoglutàrate G0T-» Oxaloacetaỉe + L-glutamate
Oxaloacetate + NADH + H+ LMPH- L-malate + NAD+
Citric acid. Citric acid đóng vai trò rất cơ bản trong trao đổi
chất ở sinh vật. Chúng có nhiều trong trái cây, trong sữa. Xác định
citric acid theơ phương trình sau:
496 Chương 7
. citrate (pro-35) lyase _ ___ . .

Citrate ---------— —-—► Oxaloacetate + acetate
Formic acid. Formic acid là sản phẩm trao dổi chất của vi
khuẩn và của nấm sợi. Acid này được xem như chất bảo quản nhỉều
thực phẩm. Tuy nhiên, việc sử dụng acid này trong bảo quản thực
phẩm phải tuân theo luật an toàn và vệ sinh thực phẩm. Người ta xác
định lượng formic acid theo phương trình sau:
Formate + NAD+ + H20 formate dehydrogenase HydKjgQjrcgrtjQpgfQ + NADH + H+
Gluconic acid. Người ta sử dụng enzym gluconate kinasè để xác

định gluconic acid. Phản ứng xảy ra như sau:
D-gluconate + ATP kinas» D-giuconate 6-phosphate + ADP
D-gluconate 6-phosphate + NADP+ 6‘ PGDH»
D-Rỉbulose-5-phosphate + NADPH + H+ + CO2
trong đó: 6. PGDH: 6-phosphogluconic acid hydrogenase

Glutamic €tcid. Người ta sử dụng enzym glutamate
dehydrogenase để xác định glutamic acid. Phản ứng xảy ra như sau:
L-glutamate + NAD* + H20 glutamate dehydrogenase a_0xog|utarate + NADH + NH /
3-hydroxybutyric acid. Trong trứng có nhiều 3-hydroxybutyric acid.

Người ta sử dụng enzym 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (3-HBDB).
Phản ứng xảy ra như sau:
D-3-hydroxybutyrate + NAD+ 3HSPI t Acetoacetate + NADH + H+
Isocitric acid. Người ta sử dụng enzym isocitrate dehydrogenase

để xác đinh isocitric acid. Phản ứng xảy ra như sau:
D-isocitrate + NADP* isocitrate dehydrogenase a.0xogịutarate + NADPH + C02 + H+
Lactic acid. Lactic acid được tạo ra nhiều trong quá trình lên
men. Người ta xác định lactic acid bằng lactate dehydrogenase. Phản
ứng xảy ra như sau:
L-lactate + NAD* L-lactate dehydrogenase t pyruvate + NADH +
D -lactate + NAD+ Ljactate dehydrogenase^ p yruvate + NADH + H*

Malic acid. Malic acid có nhiều trong nho, trong rau, quả khác.
Người ta xác địn h m alic acid b ằn g m a late deh y d ro g en ase và NADr.
P h á n ứng xảy ra n hư sau:
L-m alate + NAD* ^gjatedehydrogenase „ O xaloacetate + NADH + H*
Oxaloacetate + L-glutamate G0T» L-aspartate + ư-oxoglutarate
Oxalic acid. Oxalic acid đóng vai trò quan trọ n g tro n g h ế p th ụ
calcium ở cơ th ề người. Người ta sử dụng enzym oxalate
d ehydrogenase đế xác đ ịn h oxalic acid. P h ả n ứng xảy ra n h ư sau:
O x a la te o x a ta te d e h y d r o g e n a s e ^ fo rm a te + C o 2
ĩ
Pyruvic acid, pyruvic acid là một acid cơ bản trong chu t;ình
chuyên hóa ở mọi cơ thể. Người ta sử dụng enzym L-lactate
dehydrogenase. P h ả n ứng xảy ra n h ư sau:
x .,+ L-lactate dehydrogenase
Pyruvate + NADH + H -—-------------- ►L-lactate + NAD
Succinic acid. Succinicacid cũng là một acid quan trọng trong

chu trìn h tricarboxylic acid. Người ta xác định succinic acid bằng
enzym succinyl-coA -synthetase. P h ả n ứng xảy ra n h ư sau:
S u ccin ate - ITP ♦ CoA Succinyl-CoA-synthelasẹ. ,Dp + succiny,.CoA + p,
___ Pyruvate kinase __

IDP + PEP -------------- --------------- ► ITP + pyruvate
3- Xác định alcohol

a- Xác định ethanol
E th a n o l là s ả n p h ẩm lên m en đường bởi n ấ m m en. N goài nhữ ng
phương p h á p b ìn h thường, người ta còn dùng enzym để xác đ ịn h
e th an o l. P h ả n ứng x ảy ra n hư sau:
Ethanol + NAD+ADH- * Acetaỉdehyde + NADH + H+
Xác định glycerol. Glycerol phổ biến nhiều trong thiên nhiên và
có nhiều trong quá trình lên men. Người ta xác định glycerol bằng
enzym glycerol kinase và pyruvate kinase. Phản ứng xảy ra như sau:
Glycerol + ATP giycerQl kinas » glycerol 3-phosphate + ADP
An n o irrt pyruvate kinase _

ADP + PEP ------- ------- ► ATP + Pyruvate
498 Chương 7
Xác định alcohol đường, Người ta xác định sorbitol bằng enzym
sorbitol dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau:
D-Sorbitol ♦ NAD* sorbitol dehydrogenase D_fructose + NADH + H+
Tương tự, người ta cũng xác định xylitol bằng enzym sorbitol
dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau:
Xylitol + NAD* s o ^ ^ y d r o genase Xylulose + NADH + H+
4- Xác định các thành phẩn khác

Xác định cholesterol. Cholesterol ỉà một steroid cố ý nghĩa rất
lớn trong sinh lý người và động vật. Người ta xác định cholesterol
bằng enzym cholesterol oxidase và catalase. Phản úng xảy ra như sau:
Cholesterol + 0 2 chtfesterol oxtáase cholestenone + H2O2
HaQg + methanol catalas» formaldehyde + 2 H20
F o rm a ld e h y d e + N H *+ + 2 a c e ty la c e to n e ------ ► lu tid in e + 3 H 2 O
Xác định triglyceride. Người ta xác định triglyceride bằng

esterase và lipase. Phản ứng xảy ra như sau:
Triglyceride + 3H20 este.rase và l<pasi glycerol + 3 acid béo
Xác định acetcddehyde. Đây ỉà chất tạo mùi cho bia, yoourt và
các loại nước giải khát. Người ta xác định acetaỉdehyde bằng enzym
acetaldehyde dehydrogenase. Phản ứĩig xảy ra như sau:
Acetaldehyde + NAD+ + H20 ggaldehyde dehydrogenase acid ^ + NADH + H+
Xác định amoniac. Đây là chất chứa nitrogen đơn giản nhất.
Người ta sử dụng enzym glutamate dehydrogenase để xác định
amoniac. Phản ứng xảy ra như sau:
a-oxoglutarate+NADH+H++NH4 — dehyj ĩ p9enasị L-g|utamate+NAD++H20
X á c đ ịn h n itr a te . Lần đầu tiên sử dụng enzym để xác định

nitrate. Enzym được sử dụng để xác định nitrate là nitrate reductate.
Nitrate + NADPH + H+ —trate reductasg Nitrite + NADP+ + H20
Xác định sulfite. Xác định sulfite bằng enzym được bắt đầu từ
năm 1983. Enzym được ứng dụng để xác định sulfite là sulfite oxidase.
^ 2- ~ ^ sulfite oxidase „ 2. ,, _
SO3 + O2 + H2O ► SO4 + H2O2
,, _ . .4. NADH-peroxỉdase _ ____ .

H2O2 + N A D H + H --------------- — » 2 H aO + NAD*
Xác định creatin và creatinine. Hai chất này có trong cơ. Enzym
được sử dụng để xác định creatinine ỉà creatiminase, xác định creatine
là creatine kinase. Phản ứng xảy ra như sau:
Creatinine + H20 cre-*inin^ » creatine
Creatine + ATP creatine kipas» creatine phosphate + ADP
Xác định lecithin. Lecithin ịphosphotidylchoỉine) là một

phospholipide quan trọng. Người ta xác định lecithin bằng phản ứng
và những enzym sau:
Lecithin + H20 ph0S- h0ÍÍ-—e » 1,2 diglyceride + phosphorylcholine
_ .... ,. ~ alkaline phosphatase ... 0

Phosphorylcholine + H20 ---------- —-------- ► cholỉne + pị
Choline + ATP choline —nas-^» Phosphorylcholine + ADP
Xác định urea. Người ta sử dụng urasé để xác định urea. Phản
ứng xảy ra như ốau:
Urea + H20 2NH3 + COj
7.3 ỨNG DỰNG ENZYM TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN
7.3.1 E nzym c ắ t h ạ n c h ế (restrition endonuclease)

Các enzym cắt hạn chế là những enzym cắt phía trong phân tử
DNA thành nhữíig đoạn đặc hiệu. Lân đầu tiên vào năm 1950, các nhà
khoa học phát hiện ra một loại enzym có m ặt trong vi khuẩn có khả
năng ngăn cản sự phát triển của thực khuẩn thể. Các enzym này cắt
DNA của thực khuẩn thể làm chúng không phát triển được trong tế
500 Chương 7
bào chủ. Người ta tách tế bào này ra khỏi tế bào chủ và thực hiện
những phản ứng enzym trong ông nghiệm, các enzym này không chỉ
cắt DNA lạ mà cắt DNA của chính tế bào chủ.
Các enzym cắt giới hạn được đặt tên theo tên của vỉ khuẩn mà
ta dùng để thu nhận enzym cắt giới hạn. Ví dụ:
Eco RI: enzym cắt giới hạn của E.coỉi
Bam HI: enzym cắt hạn chế của Bacillus amylolique. Trong đó:
- Chữ đầu chỉ loại
- Hai chữ sau chỉ loài
- Chữ số lã mã ỉ, II, ... chỉ sự tách đầu tiên và thứ hai....
Enzym cắt hạn chế đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích
genome. Chúng có khả năng ghi nhận các trình tự (sequence) đặc bỉệt *
của nucleotide và tham gia cắt ở vị trí đặc biệt trong DNA. Đây là loại
enzym bắt buộc phải có trong những thao tác đầu tiên của tiến trình
tái tổ hợp DNA. Enzym này được miêu tả gồm hai phần:
- Phần đầu có tính giới hạn (restriction), viết tắ t là R
- Phần sau có tính cải biến (modification), viết tắ t là M.
Chính hệ thống R-M này giúp cho vi khuẩn có khả năng chống lại
sự xâm nhiễm của thực khuẩn thệ hoặc những nhân tố di truyền lạ khác.
Hệ thống R-M tồn tại rất đa dạng không chỉ ở các loài v sv khác
nhau mà ngay cả trong một loài vsv. Hiện nay, người ta đã tìm thấy
khoảng 2100 loại enzym cắt giới hạn. Trong đó, có 17 thuộc type I,
179 type III có tính đặc hiệu rất cap, 190 nhóm DNA modification
methyltransferase đang được nghiên cứu và ứng dụng.
Hệ thống R-M có hai tác động đặc hiệu:
• Restriction endonuclease (viết tắ t là R-ENase) tác động lên một
vị trí nhất định. Ngoài ra chúng có tác động phá hủy DNA lạ.
• Modification methylase của DNA (còn được gọi là methyl-
transferase, viết tắ t là M-Mtase) tác động vào chuỗi mã đồng nhất. Chứng
làm cải tiến và bảo vệ DNA của tế bào không bị R-Enase phá hủy.
1-Phân loại hệ thống R.M
Người ta chia R-M ra làm bốn dạng (bôn types) dựa trên hợp
phần của enzym, nhu cầu về cofactor, tính đối xứng của trình tự
nucleotide và đặc tính phân cắt. Các hoạt dộng của MTase đều cần đến
nhóm methyl cuả cơ chết cho.
ứ n g d ụ h g enzym 501
Bảng 7.40 Đặc tính của hệ thống R-M
Type H
stt Đặc tính Type 1 Type III Type IV
Prototype Type IIS
1 Cấu trúc hoạt Enzym đơn — — Enzym dơn —

động R-M
2 Cofactor mg++ Mg++ Mg++ mg+* mg++

ATP ATP
3 Vj trí xác Không đối Palỉdromỉc Khổng đối xứng Khỏng đốì Khổng đối xứng
định/phân xứng, khoảng cùng vị trí khoảng cách xứng 25-27bp 14bp đốn 3’
cắt cách đa dạng xác định 3’ đến 3'
4 methyl hóa Hai dây Hai dây Một MTase Chi một dây Hai dây
trôn mỗỉ dây
Or Type L R-M-enzym là một multienzym, cổ ba submit không đồng

nhất là R,M và s. Trong dó, subimit xác định tính đặc hiệu của R và M.
Type I cân Mg** và ATP như là cofactor, cắt DNA ở vị trí nhất định.
6- Type IL Hệ thống R-M gồm có hoạt động của cả hai R-ENase
và M-MTase. R-ENase là một dimer có hai subumit đồng nhất. M-MTase
là những enzym monomeric.
R-ENase của type II cồn Mg*+ như một cofactor. Cả hai R-ENase và
M-MTase của type n có khả năng nhận biết trình tự của nucleotide trong
DNA rất cao. Nhóm enzym này sẽ cắt DNA tại những vị trí nhận biết này.
c- Type HL Enzym này cổ hai subumit không dồng nhất. Trong
hoạt động chúng cần Mg++ vă ATP. Chứng nhận biết chuỗi mã ngắn,
không có tính chất palindromic Í5-3*) và chúng cắt DNA tại một vị trí
cố định. Chứng không thủy phận được ATP.
d- Type IV. Enzym này được xem như một ỉoại hình trung gian
giữa enzym type II và enzym type III. Eco 571 có R-ENase và M-MTase
khác nhau, nhưng R-ENase có chứa methylase bổ sung. Hoạt động của
enzym cùng methylase chưa đủ mạnh để bảo vệ DNA của tế bào chủ,
vì th ế chúng cân sự hỗ trợ của AdoMet.
502 Chương 7
Bảng 7A I Một sô' Restriction endonuclease

được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật gen
Trình tự (sequence)
stt Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzym
5’-*3\ 3*-+5*
1 Haemophilus aegyptins Hae III GG| c c
CClGG
2 Staphylococcus aureus 3A Sau 3A.I 1 GA TC
CT AGỈ
3 Bacillus am yloliquefaciens Bam HI GỊGATC c
c c ta g Ig
4 E .coli RYI3 Eco RI G | AATTC
CTTAAIG
5 Heamophitus influenzae Rd Hind 11 GTPyl PuAC
CTPuJ PyTG
Hind III AỊAGCTT
ttcgaIa
6 Providencia s iu a riii P s tI CTAGCAị G

g | acgtc
7 Serratia marcescens Sma I c c c l GGG

GGGỊCCC
8 Xanthomonas malvacearum Xma I c| CCQG G
G G G C cl c
9 M oraxella bovis Mbo II GAAGA Nel
CTTCT N7 1
2 - Xác đ ịnh vị tri cắt trong chuỗi DNA

Trong kỹ thuật di truyền, người ta thường dùng nhóm từ
recognition sequence, có nghĩa là chuỗi (trình tự, dây) mã xác định.
Các enzym cắt có tính chất đặc hiệu cao với trình tự nucleotit trong
DNA. Các enzym sè cắt đúng vị trí mà chúng tìm thấy.
Vị trí này được gọi là “target site*. Khi đó, DNA sè được cắt ra
từng đoạn ngắn hoặc dài khác nhau. Trong các type của énzym cắt
giới hạn, type được người ta chú ý nhiều nhất. Chúng có chuỗi mã xác
định theo kiểu tetra, penta và hexa nucleotit. Những trình tự như vậy
sẽ được viết từ trái sang phải theo hướng 5*-3r {palindromic). Ví dụ: 5’-
GAATTC-3’. Trình tự xác định thường có trục đối xứng theo vòng kín
{rotational), Ví dụ, trình tự mã xác định của EcoRI là:
5’-GAATTC-3’; 3’-CTTAAG-5’
Về m ặt lý thuyết, có 16 tetranucleotide đối xứng với 64

hexanucleotide. Trong đó, chỉ có 50% thực sự hoạt động tại các Target
site của nó.
Bảng 7,42 Trình tự xác định vị trí cắt của các restriction endonuclease
V
5’-end 3*<en<l Blunt end
Enzym Trình tự nucleotide Enzym Trình tự nucleotide Enzym Trinh tự nucleotide

0
T aqỉ T/CGA P s tl CTGCA/G Alul AG/CT
C la l AT/CGAT Scac ỉ GAGCT/C FnuD 11 CG/CG
M bol /GATC Sphl GCẦTG/C Dpn I GA/TC
Bgll A/GATCT Đ del GGCGC/đ Hae III GG/CC
BamHI G/GATCC Apa ỉ GGGCCỒ/C Pvu II CAG/CT
B ell T/GATCA Kpn ĩ GGTAC/C Sma 1 CCC/GGG
Hind III A/AGCTT N ael GCG/GGC
N co l C/CATG Hpa I GTT/AAC
X m al C/CCGG Nru I TCG/CGA
X hoỉ C/TCGAG B all TGG/CCA
EcoRI G/AATTC M stI TGC/GCA
S a il G/TCGAC Aha III TTT/AAA
T/CTAGA * EcoRV GAT/ATC

X ball
Enzym cắt giới hạn cắt^chuỗi DNA theo một số kiểu sau:
- Cắt theo kiểu blunt end (dạng thẳng hai đầu so với dây đôi).
- Cắt theo kiểu sticky end hay cohesive, đoạn cuối dây đôi so le
tại vị trí 5*.
- Cắt theo kiểu sticky end, tại vị trí 3’.
Các enzym tham gia phân cắt theo ba kiểu này được trình bày ở
bảng 7.42.
504 Chương 7
3- Tính chất đặc biệt của chuỗi mã xác định

■90
Sô" lượng enzym thuộc type II cần thiết để thực hiện phản ứng
phân cắt DNA phụ thuộc vào chiều dài của DNA, hợp phần các base có
trong DNA, tỷ lệ GC trong toàn bộ base của DNA.
Các loại enzym chứa chuỗi mã xác định thuộc dạng hecxa
nucleotide có đủ bôn loại base thường chứa nhiều hơn một vị trí xác
định (recognition site) trong phân tử DNA. Ví dụ: Sma I vị trí xác định
chỉ bao gồm c và G (CCC/GGG) hoặc Xma III (C/GGCCG). Hiện tượng
này sẽ khộng có trong phân tử nhỏ hem PBR 322 và SV40. Hiện tượng
này dược gọi là tính đặc hiệu của chuỗi mâ xác định.
Bảng 7A3 Tần suất của recognition site có tính chất hexanucleotỉde trong
plasmid PBR 322 và SV4Õ DNA
SỐ chuỗi mã xác định

s tt Eiuym Chuỗi mã xác đinh PBR 322 DNA s v 40 DNA
4364bp, 54% GC 5243bp, 40,8% GC
1 Bam HI GGATCC 1 1
2 EcoRI GAATTC 1 1
3 Hind III AAGCTT 1 6
4 Hpal GTTAAC 0 4
5 P s tl CTGCA 1 2
6 Pvu II CAGCT 0 0
7 Sac II CCGCG 0 0
8 Xma III CGGCCG 1 0
Bảng 7.44 Vị trí xác định có tinh chất tetranucleotide,

chứa CpG hoặc GpC dinucleotỉde ở nhiều DNA
Số vị trí
s tt Enzym Trinh tự nucleotide
PỌR 322 <Dx 174 SV40
1 Fnu DII CGCG 23 14 0

2 H hal GCGC 31 18 2
3 Hpa II CCGG 26 5 1
4 T aql TCGA 7 10 1
5 Hae III GGCC 22 10 19
Bảng trên cho ta thấy enzym FnuDII (CG/CG) cắt plasmid PBR
322 khoảng 23 lần. FnuDII không cắt SV40. Ở bảng trên cũng cho
thấy PBR 322 và SV40 đều bị cắt cùng một tần suất tương tự bởi Hae
III (GG/CC). Chuỗi mã xác định này không chứa CpG dinucleotide. Các
sinh vật Eukaryotic không chứa chuỗỉ mẫ dinucleotide.
4- Phương pháp phát hiện và tình sạch restriction endonuclease

DNA rất dễ quan sát dưới tia cực tím nhờ DNA có tính huỳnh
quang khi nhuộm với ethidỉum bromide. Tia sáng có bước sóng 254nm
có độ cảm cao nhất. Người ta cũng có thể phục hồi DNA trên gen trong
bước sóng của tia sáng 366nm. Sự chuyển động của các đoạn DNA trên
agarose và polyacrylamide gen tương ứng với logarithm trọng lượng
phân tử của DNA.
Để sử dụng enzym cắt giới hạn, người ta trộn lượng enzym cắt
giới hạn với DNA trong dung dịch đệm ở 37°c, Hoạt tính của enzym
được đo bằng đơn vị tương dương lượng enzym cần thiết để cắt một
microgam DNA trong một giờ ở 37°G.
7.3.2 C ác enzym nốỉ k ế t (ligase)
Các enzym nối kết được xem như là chất keo phân tử, dùng để
nối các đoạn DNA với nhau. Enzym nối kết được sử dụng nhiều nhất
là DNA ligase của T4. Enzym này được chiết tách từ E.coli bị nhiễm
phage T4. Enzym này hoạt động mạnh ồ 37°c.
Khi tiến hành các kỹ thuật gen, người ta lại thực hiện ở nhiệt
độ 4-15°C để ngăn chặn khả năng biến tính của enzym. Các phản ứng
nối kết xảy ra theo hai kiểu sau:
506 Chương 7
Or JVỐ» đẩu từ
DNA ligase
b N Ố Ỉd ẩ u cố kết
G A T c T I—
—I c c T A Q
7.3JS C ác enzym th a m gia sử a đổi
Các enzym tham gia sửa đẩi bao gồm những enzym sau:
i- Các nuclease
Các enzym nuclease thường làm đứt các liên kết phosphodiester.
Chúng được chia làm hai loại.
Bảng 7.45 Tinh chất quan trọng cửa DNA-polymerase

(Prokaryotic DNA-polymerase)
Trọng wợng
Sinh pH
Enzym phàn tử 109 Dặc hiệu Cơ chất
vật ttìư ư
Dalton
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
Eco/ZDNA- potym r—
DNA-polymerase ỉ E.coti 109 (Zn2+) 3’-5’ otymerase DNA-matrix 3*-OH 7-8 M g-

(Komberg enzym) ONAhay RNA
Primer,dNTP,
3’-5’ nuclease SSDNA
5'-3' exonudease dsONA.

DNMRNA hybrid
pyrophospbo-
rylase DNA matrix.
3*OH, DMA hay
RNA Primer
DNA-polymerase I E.coế 76 (Zn2+) 3'-5’ polymerase DNAmatríx, 3*- 7-8 Mg’*

(Klenow enzym) OH.DNAhay
RNAPrỉmer
3’-5' exonuclease 8S 0N A
dsDNA
DNA-polymerase I, E.coH 36 $'•3 exonulase dsDNA 7-8 Mg**

đoạn nhồ
DNA-polymerase II E.coti 120 3'-5' polymerase DNA matrix 7-8 Mg’*
ONA hay
RN APrim er
DNA-polymerase m E.coti 175 3’-5’ polymerase ss DNA matrix. 7.0 Mg**

3-OH RNAprimer
dNTP. ATP
508 Chương 7
(1 ) (2 ) (3) (4) (5) (6 ) (7)

Phage-coded DNA-pdymerase
T4 DNA polymerase E.coli, phage T4 114 3’-5’ polymenase DNA matrix 8-9 Mg2*
DNA hay
RNA-primer
T5 DNA polymerase E .coli, phage T5 96 3’-5’ olymerase DNA matrix, 8,5 MgJ*
3'-5’ exonuclease 3’-OH DNA
primer, dNTP
ss hay ds
DNA
T7 DNA polymerase 96 3'-5’ polymerase DNA matrix, Mg2*
>1
E.coli, phage T7
■>J
3'-OH DNA
00
primer, dNTP
ss hay ds
DNA
Virus-coded DNA-potymerase
Reverse Avian 160 3’-5' polymerase RNA hay 8 -8 , 5 Mg!*

transcriptase m yeloblastosis DNA Primer,
virus (AMV) dNTP
Reverse Moloney murine 80 3’-5’ polymerase RNA hay 8 -8 , 5 Mn2*

transcriptase lenkem ia virus Rnase H. DNA matrix
(Mo-MLV) DNA 3’-OH ONA
endonuclease hay RNA
Pyrophosphate primer,
exchange. dNTP, RNA
hay DNA
hybrid ds
DNA
HSV-1 DNA RC‘37 144- 3’-5’ polymerase DNA matrix, 8 -8 . 5 Mg**

polymerase HSV 1 150 3’-5' exonuclease 3’.OH DNA
pyrophosphate Primer
exchange ss DNA
Terminal transfease Thymus bắp chân, 62 3 ' -5 ' polymerase 3’-OH DNA 7 ,2 Mg!*
(bollum enzym) cơ bắp primer dNTP Co**
Vaccine virus DNA Tế bào Hela người 110 3'-5' polymerase DNA matrix 8 -9 Mg2*
polymerase 115 3-0H ONA
Primer,
dNTP,
88 DNA
ú n g dụ n g enzym 509
Bảng 7,46 Tính chất quan trọng của Eukaryote polymarase

Trọng IƯỢhg
pH
Enzym Sinh vật phôntử Đặc hiệu CƠ c h it Cofactor
tối Ưu
itfdal
Type a-DNA polymerase
DNA Drorophila 280

polymerase a melanogaster
DNA (RNA)
Tế bào mycoboma 190 3'-5’ polymerase 7,5-8,5 Mg2*
matrix,
Chuột pyrophosphorylase
3’-OH DNA
Thận mèo 155*250 Pyrophosphate
Primer,
Thymus co bắp chân 210-230 exchange
dNTP
Tế bào Hela người
320 (ai)
600 (a2)
Tế bồo KĐ người 220 (a3)
150-160
Type 0-DNA polymerase
DNA Thymus bắp chân 44 DNA hay 8.5-9.0

polymerase p Đào thaỉ gà 40 RNA
Tế bào KB người 43 matrix,
3’>5' polymerase
Tế bào hepatoma 3'-OH DNA
Novikoff 31 Primer,
dNTP
Type r-DNA polymerase
DNA Đào thai gà Ệ 180 RNA (DNA) 8,5-9 Mn2*

polymerase y Tế bào myeloma matrix,
Chuột 140 3’-5' polymerase 3'-OH DNA
Té bào Hela người 110 Ptrimer,
Lymphoblast người 120 dNTP
Poly (A) polymerase
Poly (A).
polymerase Thymus cơ bắp 60 Terminal rìboade- 3’-OH RNA 7,4 ATP, Mil2*
Poly (A). mylate transferase hay ATP,
polymerase TỐ bào Hela người 63-75 Terminal riboade- 3’-OH RNA 7,9 Mg2*
50-58 mylate transferase
510 Chương 7
Bảng 7.47 Eucaryote RNA polymerase

Trọng lượng
pH
Enzym Sinh vật phAn tử Đặc hiệu Cơ chất Cofactor
tối ưu
103 dal
RNA-polymerase I Nấm men 500-600
Mẩm hạt 400-500
Acanthamoela
casteũanM
RNA polymerase II Nám men 500-600
500-600 ss (d s),
Mẩm hột 3'-5'
D<NA 7-8 Mn2+
Acanthamoeỉa polymerase
500-600 matrix, NTP
casteHanii
RNA polymerase i n Nám men 500-600
Mẩm hạt 500-600
Acaníhamoeỉa
casteữanõ 500-600
Bàng 7,48 Enzym exonuclease

Trọng lượng pH
Enzym Sinh vật Đặc hi«u Cơ chất cofactor
phân tử 10* dal tối ưu
E.coli eaxonuclease
Exonuclease I E .coti 70-72 3’-5' exonuclease ss DNA 9,5 Mg’*
Exonudease i n E.coti 28 3’-5’ exonuclease ss DNA 7,6-8,5 Mg**
Exonudease IV E.coti - 3*-5' exonuclease ss DNA 8,0-9,5 Mg2*
Exonudease V E.coti 270 3’-5’ exonuclease ss DNA 9.0 ATP, Mg2*
Exonudease VII E.cotì 88 3’-5' exonuclease ss DNA 7,9 EDTA
Exonudease v m E .coti 140 3’-5’ exonuclease ss DNA 8,0-9,0 Mg2*
Bảng 7.49 DNA modifying enzym

Trọng lượng
pH
Enzym Sinh vặt . phântừ Đặc hiệu Cd chất Cofactor
tối ưu
1Ó*dal
Phosphatase kiểm Cơ bắp 140 Phosphatase 5'-P hay 3‘-P 7,5-9,5 Zn2*
DNA hay RNA
Phosphatase kiềm E.COỈÌ 80 Phosphatase 5’-P hay 3*-P 7,5-9,5 Zn2+
DNA hay RNA
Phosphodiesterase Crotaỉus — Phosphodiesterase 3 -OH DNA 5-7 Mg2*
durissus hay RNA NAO
DNA-iigase vi khuẩn
DNA ligase E.cotì 77 Potydeoxyribonucte 5‘“p “ DNA 7,5 8.oj Mg*+
otide synthase hay RNA ! NAD
Phage-coded DNA ligese

T4 DNA ligase E.coií 68 Polydeoxyribonucle 5'-P DNA hay 7,2-7,8 Mg'*
PhageT* otỉde synthase RNA 3'-OH ATP
DNA hay RNA
- Endo nuclease: Các enzym này phân cắt bên trong DNA
- Exo nuclease: Các enzym phân cắt lần lượt từ các đầu DNA.
2- Các polymerase
Các enzym này cố tác dụng sao chép các phân tử DNA và RNA.
Chúng tham gia tổng hợp nucleic acid bằng cách nối các nucleotide với
nhau theo nguyên tắc các base trên sợi mới bổ sung cho các base trên
sợi khuôn. Quá trình tổng hợp diễn ra theo chiều 5’-> 3’.
Trong đó, polymerase I còn có tác dụng xức tóc phản ứng thay
th ế sợi. Trong phản ứng này sẽ tạo ra sợi DNA mới.
Ngoàỉ ra, còn phải sử dụng đến enzym phiên mã ngược tạo ra
sợi DNA từ RNA. Đây là enzym polymerase phụ thuộc RNA, enzym này
chủ yếu được sử dụng dể sao chép các phân tử mRNA khi chuẩn bị c
DNA (DNA bổ trợ hay DNA bản sao) để tách dòng, mặc dù chúng cũng
tác dụng trên khuôn DNA.
3- Cức enzym sửa đổi các đấu của phận tử DNA
Thuộc nhóm này bao gồm phosphatase kiềm, polynucleotide
kinase và terminal transferase} các enzym này tác động vào đầu phân
tử DNA. Chúng được dùng để loại bỏ hoặc bổ sung các nhóm
phosphate. Enzym terminal transferase liên tục bổ sung các nucleotide
vào bất kỳ đầu 3’ nào đang tồn tại.
7.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CÙA ENZYM
7.4.1 ứ n g dụng enzym trong sản xuất chất tẩy rửa
Năm 1913, Otto Rohm là người đầu tiên sử dụng protease vào
sản xuất chất tẩy rửa. Ông đã cho công bố patent của mình với tựa đề
“Quá trình tẩy sạch”. Phương pháp áp dụng protease trong bột giặt
của ông được áp dụng cho đến ngày nay.
Năm 1919, 65 tấn pancrease của lợn đã dược sử dụng vào sản
xuất vào bột giặt “Bumus”. Sau đó, protease tiếp tục được hãng Novo
của Đan Mạch phát triển và hãng Bio-40 của Mỹ cũng đã sản xuất
một khối lượng lớn bột giặt có protease.
1-Chất tẩy rửa
Mục đích của tẩy rửa (hoặc giặt quần áo) là loại bỏ đất các loại
chất vô cơ, hữu cơ bám vào quần áo. Trong đó, có nhiều chất rấ t khó
làm sạch như protein, tamin, lipid, carbohydrate và những chất màu.
512 Cttương 7
Chất tẩy rửa bột bao gồm những chất kìem, sodium silicate,
sodium bicarbonate, sodium tripolyphosphate....
Ngày nay, phosphate được thay thế bằng các chất khác để tránh
ô nhiễm môi trường. Phần lớn các chất hữu cơ rấ t khó loại ra trong
quá trìn h giặt quần áo, trong đó có protein.
2- Protein và vấn đề tẩy sạch protein
Các chất carbonhydrate và lipid dễ dàng hòa tan trong môi ,
trường kiềm của bột giặt. Protein khó bị loại hơn các chất khác.
Chính vì thế, việc tìm ra chất nào đó, khi trộn vào trong bột giặt có
khả năng loại chúng ra khỏi quần áo là mục đích của những nghiên
cứu kéo dài rấ t nhiều nảm. Người ta đã thử enzym protease. Trong các
loại protease thì protease kiềm thích hợp hơn cả.
Các protease ứng dụng trong sản xuất bột giặt phải đáp ứng
những yêu cầu sau:
- Hiệu quả tẩy sạch cao.
- Có khả năng hoạt động trong môi trường có pH 9-11 và phải
chịu được nhiệt độ có khi đến 95°c.
- Có khả năng giữ được hoạt tính khỉ có m ặt của các chất tham
gia thành phân bột giặt.
- Có khả năng bảo quản và giữ được hiệu lực ít nhất là một năm.
Những yêu cầu trên chỉ có serine protease của vi khuẩn là đáp
ứng được. Lượng chế phẩm protease đưa vào thành phần của bột giặt
chỉ khoảng 0,5-1%.
B ảng 7.50 Thành phẩn bột giặt có enzym protease
s tt Thành phẩn SỐ IƯỢng (%) s tt Thinh phần Số lượng (%)
1 Anionic 1 0 -1 5 3 Na-T ripolyphosphate 20 - 45

Na-Carboxymethylen 0,5 -1,0
2 Các chát khổng phải anionic 2-3 4 Protease kiểm 0,5 -1,0
Na-sulfate á 100
Ngoài các cơ chất tẩy rửa dạng bột, thị trường các chất tẩy rửa
trên th ế giới có đến 25% thuộc dạng lỏng. Các chất tẩy rửa dạng lỏng
có ưu điểm là dễ khuếch tán các thành phần tẩy rửa nhưng có nhược
điểm là khó vận chuyển. Trong các chất tẩy rửa dạng lỏng, người ta
cũng cho enzym protase để tăng khả nâng phân giải các vết protein
có trong quần áo.
3- Các loại enzym khác được ứng dụng trong công nghệ sản
xuất các chất tẩy rửa
a■Amylase của vi khuẩn. Những enzym này không bền pH kiềm
và nhiệt độ cao trong một thời gian lâu, nên người ta thường bao
chúng lại trước khi phối trộn với các thành phần khác của chất tẩy
rửa để bảo quản được lâu và đảm bảo khả năng hoạt động của chúng.
Các enzym amylase của vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng phân giải các
vết bẩn do carbohydrate trong quần áo. Người ta thường sử dụng
enzym a-amylase của vi khuẩn. Enzym này thường chịu được nhiệt độ
cao (đến 90°C) và pH kiềm (pH9).
b- Enzym cellulose. Enzym cellulase được ứng dụng trong chất tẩy
rửa chủ yếu nhằm mục đích làm mềm vải cotton. Việc ứng dụng enzym
cellulase đặc biệt được phát triển ở Nhật và ở các nước châu Âu. Người
ta đã sử dụng enzym cellulase từ 23 chủng vi khuẩn và 125 chủng nấm
sợi. Trong đó, cellulase từ Humicoỉa insolens. Cellula từ Humicola
insolens cổ khả năng hoạt động ở pH 8,5-9,0 và nhiệt độ 50°c.
c- Lipase. Lipase sử dụng trong chất tẩy rửa để phân hủy các vết
bẩn lipid. Các lipase được ứng dụng trong chất tẩy rửa hoạt động ở
pH 9-10. Người ta sản suất ỉipase từ nấm sợi có tên thương mại
Liponase. Nấm sợi dùng để sản xuất lỉpase đã dược biến đổi gen này
có khả năng hoạt động ở pH < 12 và nhiệt độ 60°c.
7.4.2 ứ n g dụng enzym trong công nghỉệp d ệt
Trong công nghiệp dệt, người ta tiến hành xử lý vải bằng nhiều
loại bột khác nhau như bột khoai tây, bột gạo và một số chất khác
như gelatin, guar gum, poly-vinyl alcohol, methacrylate, trong đó tinh
bột được sử dụng nhiều nhất. Sau khi vải được hồ hóa để làm mịn vải,
người ta phải tiến hành quá trinh rũ hồ vải. Phương pháp làm s ạ c h
hồ tinh bột được sử dụng là enzym amylase.
Trước đây, người ta sử dụng enzym ot-amylase của malt hay
pancreatic amylase. Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừạ, đầu tiên
người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ sôi sau đó làm giảm nhiệt độ
xuống 50°c hay 60°c và cho enzym amylase vào.
514 Chương 7
Ngày nay, người ta sử dụng a-amylase của vi khuẩn thay

amylase malt và pancreatin. Enzym a-amylase của vi khuẩn chịu
nhiệt cao, chúng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 85-90°C. Có một số
enzym amylase của Bacillus subtilic có khả nảng hoạt động ở 105-
115°c. Một số nguồn amylase được sử dụng nhiều trong công nghệ dệt
dược trình bày trong bảng 7.51.
Bảng 7.51 Một số loại enzym amylase được sử dụng trong công nghiệp dệt
Khoảng pH Chất hoạt hóa,

s tt Loạienzym Nhỉột độ tối ưu
hoạt động chtft làm Ổn đinh
1 a-amylase của malt 4,5-5,5 55-65 Ca2+
2 Amylase pancreatỉn 6.7-7,5 . 45-50 NaCI. Ca2+
3 a-amylase nấm sợi 4,5-5,5 55-65 Ca2*
4 a-amylase vi khuẩn 5,5-7,5 75-85 NaCI, Ca2*
5 a-amylase vi khuẩn chịu nhỉột 5,0-7,0 90-105 NaCI, Ca2+
Tùy điều kiện sẵn có nguồn amylase, điều kiện sản xuất và điều
kiện kinh tế, ta chọn một trong những loại enzym trên cho rũ hồ vải.
Quá trình rũ hồ vải được thực hiệq qua bốn giai đoạn.
1- Giai đoạn làm Bạch vải (the pewash)
Giai đoạn này được thực hiện trong nước đun sôi. Ở giai đoạn
này, vải hấp thụ đến 90-100% nước và vải được rửa sạch các chất bẩn,
đồng thời làm các hạt tinh bột trương nở, giúp cho quá trình phân
giải tinh bột nhanh hơn.
2- Giai đoạn ngâm (soaking)
Trong giai đoạn này, người ta thường bổ sung một số chất để
điều chỉnh pH và làm ổn định điều kiện môi trường cho amylạse hoạt
động. Đối với a-amylase, người ta thường cho vào 300 gam NaCI, 50
gam*CaCI2 và khoảng 50 gam những chất không phải là các anionic
trong 100 lít nước ở nhiệt độ 65-70°C. Sau đó, người ta cho vào 100'
200 gram amylase với hoạt tính 3000SKB/g. Đối với enzym a-amylase
chịu nhiệt, người ta cho vào 100 lít nước ở nhiệt độ 70-80°C khoảng 30
gam CaCI2 và 400 gam NaCI, pH điều chinh khoảng 6-8.
3- Giai đoạn phân giải tỉnh bột

Quá trình phân giải tỉnh bột kéo dài từ 2 phút đến 16 giờ phụ
thuộc rất nhiều vào quá trình điều kiện cụ thể và hoạt tính của
enzym. Để xác định khả năng thủy phân tinh b ộ t trong quá trình rũ
hồ vải, người ta thường dùng dung dịch iodùie.
4- Giai đoạn rửa dung dịch (rinsing)
Sau khi tinh bột được phân giải, phần lớn sản phẩm thủy phân
ở trạng thái hòa tan, một phần cồn bám vào vải. Chính vì thế, người
ta phải tiến hành rửa sạch vải. Để rửa sạch vải, người ta thường thực
hiện ở nhiệt độ 95-100°C. Trong giai đoạn này, người ta thường chẹ
5-10 gam NaOH/llít nước để rửa, làm sạch vảỉ.
Một số mẫu thiết kế rũ hồ vải được minh họa như sau.
Mẫu sỉgger
Hình 7.13 Mẫu Sigger Hình 7.14 Mẫu Reel

Ngày nay, nhiều nhà máy thực hiện quá trình rũ hồ vải theo
phương pháp liên tục với enzym amylase chuẩn. Theo đó, người ta cho
vào dung dịch ngâm những chất sau: 300 gam NaCI; 200 gam CaCI2;
50 gam surfactant; 250-500 gam enzym amylase.
Trong nước rửa sạch vải người ta cho 20-30 gam NaOH. Toàn bộ
quá trình này được mô tả trong hình 7.15.
100°c : 15’
\
\
Nguyôn I \
gạo và b \
\ 76°c: 15'
Malt (+ Lúa mạch)

52 °c: 70’
Hình 7.15 Phương pháp rủ hồ vải liên tục

516 Chương 7
Các nhà máy dệt sử dụng amylase cũng thực hiện các giai đoạn như
hình 7.15. Tuy nhiên, có một số khác biệt về số lượng các chất vào trong
100 lít nước: 400 gam NaCI; 300 gam CaCI2; 50 gam surfactant; 50-300
gam chế p h ẩm enzym amylase chịu nhiệt với h o ạt tính 2600SKBu/gam.
Đối với các loại lụa tơ tằm, người ta lại áp dụng điều kiện như
sau: bicarbonate Natri 5,0g/l; surfactant không phải anionic 0,5-l,0g/l;
chê phẩm protease kiềm từ B.licheni formic lAu/g-rl,0-2,5 gam/lit.
7.4.3 ứ n g d ụ n g enzym lip ase tro n g c h ế b iế n d ầu , c h ấ t béo

Úng dụng enzym lipase đế thủy phân lipid không chỉ trong y học
mà còn phát triển mạnh trong công nghiệp thực phẩm và các ngành
khác (trong công nghiệp da, công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa....).
Enzym lipase thủy phân dầu, chất béo tạo ra acid béo và
glycerol. Trong kỹ thuật, người ta có thể tiến hành thủy phân dầu béo
ở nhiệt độ sôi rất cao và áp suất cao (25°c và 60ba).
Phương pháp này thường có giá thành cao và thực hiện trong
điều kiện kỹ thuật rất nghiêm ngặt. Sau đó, phương pháp thủy phân
dầu và chất béo bằng enzym lipase từ v sv được thay thế. Phương
pháp này có ưu điểm là chúng ta có thề thực hiện quá trình thủy phân
hoàn toàn trong điều kiện áp suất và nhiệt độ ôn hòa. Do đó, chi phí
về năng lượng cho quá trình rất thấp. Các quá trình thủy phân chất
béo và dầu bằng chế phẩm enzym lipase được phát triển rất rộng rãi
trên th ế giới, đặc biệt là ở Nhật. Hiện nay, có khoảng 34 công nghệ
đã được ứng dụng trên toàn thế giới. Các loại lipase được sản xuất chủ
yếu từ Candida cylindraceaL Toàn thế giới có khoảng 60 triệu tấn
dầu, chất béo đang được xử lý bằng phương pháp enzym. Người ta
thường tạo điều kiện thủy phân tôi ưu bằng tỷ lệ dầu (chất béo) và
chất đệm là 70:30, duy trì pH 5,6 và nhiệt độ thủy phân là 30°c với
lipase OF-360 từ nấm Candida cylindraceaL
Ngoài nấm Candida sp., người ta còn sản xuất lipase từ
Rhizopus sp., Aspergillus sp., Mucor sp. Quá trình thủy phân bỏi
enzym iipase xảy ra với hiệu suất thủy phân hoàn toàn không giống
nhau, phụ thuộc chính ở nguồn cung cấp dầu và chất béo. Toàn bộ sự
khác biệt đó được trình bày trong hình 7.16.
Dầu olỉve Dấu đậu nành

100
Mỡ bò
ổ
? 80 - Dầu cọ
<C0 Dẩu castor
Q. 60
o>.
Dẩu khỉ
3
i"
X
20
# 1
2 3 4 5 6
- Thởỉ gian phản ứng (0iữ)
Hình 7>16 Ảnh hưởng cửa nguồn dầu đến khả năng thủy phân cửa lipase
Trong chế biến dầu và chất béo, cổ hai quá trình có ý nghĩa rất
quan trọng trong kỹ thuật: quá trình ester hóa bên trong và quá trình 1
ester hóa chuyển tiếp.
Quá trình ester hóa bên trong (interasterrificaiion) là quá trình
làm thay đổi tính chất triglyceride bằng sự chuyển hóa các thành phần
acid béo trong đó. Quá trình này thường được thực hiện bằng sự xúc tác
hóa học (chemicalcatalyst). Trong kỹ thuật, chất xúc tác hóa học thường
được sử dụng là Na-methylate. Trong phản ứng triglyceride mới được
tạo thành với nhũng acid béo tự do hay các acid béo methylester.
Sau này, các nhà khoa học đã tìm ra enzym l,3regiospecific
lipase thì quá trình ester hóa bên trong được thực hiện chủ yếu bằng
enzym. Nhờ hoạt động của enzym này mà sản phẩm được tạo ra
không phải là một triglyceride mà đến ba triglyceride mới. Các phản
ứng đổ xảy ra như sau:
hay phản ứng xảy ra như sau:

518 Chương 7
Nãm 1985, Macrae đã tổng hợp bơ cacao bằng phản ứng sau:
Dầu cọ + methyl stearate 1,3 re9iospeciflc l>pas» bợ cacao + methyl oteaỉe
Ngoài ra, người ta cũng cố thể sản xuất bơ cacao theo phản ứng
sau nhờ glycerol tristearate (tristeamine)
E°‘EỈ— ErErErErE:
trong đó: o - oieic acid (18:1); p = palmitic acid (16:0); s = stearic acid (18:0)
Theo Tanaka (1986), theo cách này ông ta nhận được các
triglyceride với S-OS là 45-70%, P-O-S là 25-45% và P-O-P là 10%.
Những ứng dụng khác của lipase là tạo phản ứng ester chuyển
tiếp (transesterification). Theo đổ, người ta làm dầu bằng lượng acid
béo không no.
Ngày nay, nhiều nơi sử dụng enzym lipase cố định (immobilized
lipase) trong ester chuyển tiếp. Enzym lipase dược cố định trong
silicagel hay kaolin (aluminum silicate). Các enzym ỉipase được cố
định thường được sản suất từ Aspergillus niger. Sản phẩm quá trình
ester hóa được trình bày ở bảng 7.52.
Bảng 7.52 Các sàn phẩm ester hóa chuyển tiếp bằng ỉipase của AspergỉUus niger
Triglyceride Oẩu cọ, phán S in phẩm Triglyceride Dấu cọ, phân Sẩn phẩm
đoạn trong (%) ester hóa đoạn trong (%) ester hóa
P-O-P 58 19 s-s-o 7 2
p-o-s 13 32 s-ao 4 11
s-o-s 2 13 ■ s-s-s 5 13
S-L-S 9 7
7.4.4 ứng dụng enzym trong công nghỉệp da

Đã từ lâu, loài người đă biết sử dụng thịt động yật, da động vật và
lông động vật phục vụ cho đời sống hàng ngày của minh. Trong đó, da
thú được sử dụng như một dạng nguyên liệu tự nhiên có ứng dụng rất
rộng rãi để tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau. Chính vì th ế việc xử lý,
chế biến da trở thành một ngành sản xuất có ý nghĩa kinh tế rất cao.
1- Thành phần da động vật

Da động vật được xem như một tấm áo của động vật, đóng vai
trò bảo vệ, vai trò giữ nhiệt, vai trò điều hòa, vai trò trao đổi chất và
cả vai trò làm đẹp cho động vật.
Tùy loài động vật và tùy điều kiện sống, da động vật có những
tính chất rấ t khác nhau. Thành phần hóa học đặc trưng của da động
vật được trình bày trong hình 7.17.
Hình 7.17 Thành phần hóa học của da động vật
2• Enzym trong chế biến da động vật

Cổ rấ t nhiều loại enzym được ứng dụng trong chế biến da động
vật. Các loại enzym đó bao gồm protease acid, protease pancreatic,
protease trung tính, protease kiềm của vi khuẩn, protease nấm sợi,
papain và bromelin.
520 Chương 7
Trong quá trình chế biến da, người Da dộng vật

ta phải thực hiện rất nhiều công đoạn
khác nhau. Toàn bộ các công đoạn đó
được trình bày tóm tắt như hình 7.18.
T
Ướp muối
ị ------ Ngâm với enzym
Trong các giai đoạn này, giai đoạn
ngâm (soaking) với enzym đóng vai trò Cạo lông
rất quan trọng. Trong giai đoạn này,

người ta thường dùng protease kiềm của X
Làm sạch
vi khuẩn, pancreatin, nấm sợi. Các
enzym này, ngoài khả năng hoạt động
trong môi trường kiềm, chúng còn phải
L
Ép (cán)
có khả nâng chịu được tác động của NaCI

và phải có hoạt tính cao. Người ta I sáy
thường cho 50-200 gram protease có
hoạt tính 100.000LVƯ/gam dể tách một
I
Bán thành phẩm Hỉnh 7,18
tấn lông.
Thời gian ngâm kéo dằi khoảng 6-12 giờ. Một số' điều kiện kỹ
thuật khi sử dụng enzym như:
Trước khi ngâm: 600% nước; 4% carbonate natrium; 0,1% chất bảo
quản; 0,8% surfactant; thời gian ngâm 12-18 giờ; pH 9,3-9,6 và 27°c.
Thời gian ngâm enzym: 500% nước có nhiệt độ 28°C; 0,5%
surfactant; 0,6% enzym từ Bacillus subtiỉis, A. sojae, Pancrease, có
tổng hoạt tính là 4000LVU/gam; 1,5-2% soda; thời gian 12-18giờ; pH
9,3-9,6; nhiệt độ 27-28°C.
Gừủ đoạn cạo lông: 250% nước có nhiệt độ 28°C; 1,7-2,3% hỗn hợp
enzym vi khuẩn, nấm sợi Asojae có tổng hoạt tính 6000LVU/gam; 2,5-3,0%
soda; 0,5% surfactant; thời gian 16-20 giờ; pH 9,3-9,5; nhiệt độ 27°c.
Giai đoạn làm sạch cuối cùng. Dung dịch làm sạch có thành
phần như sau: 0,4% protease từ B.aỉkalophilus với 500LVU/g; 1,0%
sulfite freeliming agent (ErahavitF. CRM); 1,0% Na-sulfhydrate 72%;
1,0% Ca-hydroxide; 0,8% Na-suflte, 60%; thời gian xử lý 20 giờ.
Ngày nay, người ta đã cải tiến phương pháp xử lý da nhiều giai
đoạn như trên bằng phương pháp một giai đoạn. Phương pháp này bao
gồm nhiều điều kiện kỹ thuật như sau: 50-100% nước có nhiệt độ 28°C;
0,2-0,3% enzym; 0,2*0,3 Na-hydroxide; 3,0-5,0% Ca-hydroxide; 1,2-2,0%
lining agent; 0,3-0,5% Na-sulfhydrate 95%; 0,3-0,5% Na2S, 60%
Khi sử dụng enzym, quá trình tách lông sạch hơn, da có chất
lượng tốt hơn.
Chương 8
TI ÌỊ TRƯỜNG ENZYM
VÀ
CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG TƯƠNG LAI
8.1 THỊ TRƯỜNG ENZYM
Trước năm 1965 toàn thế giới chỉ thu được vài triệu USD về
buôn bán các chế phẩm enzym công nghiệp. Trong đó các chế phẩm
enzym công nghiệp dùng trong công nghệ chất tẩy rửa chiếm tỷ lượng
rất lớn trong những năm 60 của thế kỷ 20. Enzym sử dụng trong công
nghệ sản xuâ't chất tẩy rửa có một giai đoạn giảm rất mạnh. Sau đó,
các loại enzym sử dụng trong lĩnh vực này lại tăng rất nhanh.
Những năm 1972-1974, các enzym sử dụng để sản xuất siro có
ỉượng fructose cao được giới thiệu rất mạnh, được sản xuất và tiêu thụ
rết nhiều.
Từ năm 1974-1986, lượng enzym sản xuất theo quy mô công nghiệp
tăng dần lên. Giá trị enzym công nghiệp táng hàng năm 10-15%.
Đến 1989 tổng giá trị buôn bán enzym công nghiệp trên toàn
thế giới là 500x106USD. Cho đến nay, công nghiệp enzym đã phát
triển rất mạnh. Các loại enzym sử dụng trong sản xuất chất tầy rửa
vẫn đạt mức cao nhất.
Bảng 8.1 Tỷ lượng enzyrn ứng dụng trong các ngành sản xuất
được buôn bán trên thế giới
Ngành sán xuít Tý lượng Ngành sản xuất Tỷ lượng
stt stt
sử dụng enzym buôn bán (%) sử dụng enzym buôn bán (%)
1 Chất tẩy rửa 40- 45 6 Sản xuất bánh kẹo 1 -2

2 Chế biển bột 20- 25 7 Sản xuất giấy, dệt 4-6
3 Chế biến sữa 12-15 8 Sản xuất da 1 -2
4 Sản xuất bia 2 -4 9 Thực phẩm gia súc 0- 1
5 Sản xuất nước 3 -5 10 Nhửng ngành sản 5 - 10
quả rượu vang xuất khác
522 Chương 8
Nếu phân tích từng loại enzym được buôn bán trên th ế giới,
người ta cho thấy rằng enzym protease từ vi khuẩn Bacillus sp. được
sản xuất với sô' ỉượng lớn nhất. Sau đó, là enzym amylase cũng từ
Bacillus. Ta có thể tham khảo bảng sô' liệu sau:
B ảng £~2 Tỷ lượng các ỉoại emyrn được buôn bán trên thế giới
Tỷ lượng Tỷ lượng
s tt Loại enzym stt Loại enzym
buôn bán (%) buôn bán (%)
1 Protease Bacillus 3 0 -3 5 7 Pectinase 4 -5

2 Gluco amylase 8 -1 0 8 Pancreatin, trypsin 2 -4
3 Amylase Bacillus 1 0 -1 2 9 Papain, bromelin 4 -6
4 Glucose isom erase 5 -7 10 Lipase 2 -3
5 Rennet dộng vật 1 0 -1 2 11 Các loại enzym khác 5 -1 0
6 Rennet vỉ sinh vật 2 -4
Thị trường emzym công nghiệp phát triển m ạnh nhất ở Mỹ. Tại
đây, lượng enzym được sản xuất, tiêu thụ nhiều nhất th ế giới, s ố liệu
buôn bán enzym tại Mỹ trong năm 1990 được liệt kê trong bảng 8.3.
Bảng 8.3 Thị trường enzym tại Mỹ và các nước khác (triệu USD)
Phẩn còn l«i của

Stt Lĩnh vực úhg dụng Thi trường Mỹ
th| trưởng th ế gtđl
1 Chế biến tinh b ộ t dextrin, glucose 20 14

2 Siro fructose 95 3
3 Bia 12 13
4 C hế btén trái cây 10 10
5 Rượu vang 8 6
6 S ản xuất bánh 15 20
7 Rennet dộng vật 20 12
8 Rennet vỉ sinh vật 20 22
9 S ản xuất phomai 3 1
10 Sản xuất kẹo 1 1
11 Sản xuất thực phẩm gia súc 8 8
12 S ản xuẩt giấy, dệt 4 4
13 S ản xuất da - 70
14 C ác chất tẩy lửa - 300
Khi phân tích mức độ chi phí enzym được ứng dụng trong các
ngành công nghiệp khác nhau, các nhà kinh tế cho thấy rằng, mức chí
phí này không cao mặc dù hiệu quả thu được rấ t lớn.
Thị trư ờ ng enzym và công nghệ enzym tro n g tương lai 523
B ảng 8.4 Mức chi phí enzym trong các ngành công nghiệp
Sản phắm và ngành Enzym sử dụng cho Chi phỉ enzym so với
Stt
ứng dụng enzym s in phẩm (ppm) glá trf sản phẩm (%)
1 Chất tẩy rửa 150 - 200 1 -4
2 Dextrose 150-200 1
3 Siro fructose 150-200 2 -3
4 Ethanol 3 0 0 -4 0 0 2 -3
‘co
©
5 Phomai 3 -6
o
Hiện nay trên thị trường thế giới, giá lkg chế phẩm enzym rất
khác nhau, phụ thuộc rất nhiều vào mức độ tinh sạch, mức độ xúc tác
và cả khả năng kinh doanh. Sô" liệu được trình bày trong bảng 8.5
được tính trung bình cho từng loại chế phẩm.
B ảng 8.5 Giá Ikg chế phẩm enzym công nghiệp (USD/kg)
GIA 1kg enzym Tỷ lượng trong Dạng

Stt Enzym
(USD) sàn xuất (%) s in phẩm
1 Gluco amylase 30 5 -1 0 Lỏng
2 a-amylase 250 1 -2 Lòng
3 Gluco isomerase 250 5 -1 0 Dạng viên cố định
4 Protease dùng ừong chất tẩy rửa 100 3 -6 Viôn, lỏng
5 Rennet động vật 5000 0,1 - 0,2 Bột, lòng
6 Rennet vi sinh vật 500 0,2 - 0,4 Lòng, đặc
Trong lịch sử nghỉên cứu enzym, các nước châu Âu là những

nước đầu tiên phát hiện ra khả năng xúc tác của enzym và cũng là
những nước đã biết sử dụng enzym từ rấ t lâu trong sản xuất các sản
phẩm tờ sữa, sản xuất bia và một số sản phẩm thực phẩm lên men
truyền thống khác trước khi họ hiểu bản chất của enzym.
Tuy nhiên, việc sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng enzym vi
sinh vật (vsv) theo quy mô công nghiệp lại là những nhà nghiên cứu
và doanh gia người Nhật. Nhưng khi những phát minh này sang được
qua nước Mỹ, người Mỹ đã phát triển chúng rất nhanh. Những nghiên
cứu và ứng dụng của người Mỹ và châu Âu phát triển rấ t m ạnh trong
cuối thế kỷ 19, đầu th ế kỷ 20 và còn tiếp tục phát triển cho đến ngày
nay và cho đến mãi mai sau. sỏ dĩ các nước châu Âu, châu Mỹ phát
triển rấ t mạnh v iệ c nghiên cứu và ứng dụng enzym và đã thu được
nhiều lợi nhuận là do họ có tiềm lực khoa học và kinh tế vượt xa các
nước khác. Nhờ sự phát triển mạnh ngành công nghệ sinh học, các
524 Chương 8
nước châu Mỹ và châu Âu đã làm chủ được rấ t nhiều công nghệ có sử

dụng hoạt độụg củâ' enzym.
Trong các nước có ngành công nghệ enzym phát triển mạnh ở
châu Âu, trước tiên phải kể đến Pháp, Đan Mạch, ở châu Mỹ là
Canada và Mỹ. Các loại enzym quan trọng được sản xuât theo quy mô
công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi, đem lại lợi nhuận khổng lồ
được trình bày trong những bảng số liệu sau:
Bảng 8.6 Sản xuất và tiêu thụ enzym ở Mỹ
's t t Enzym Nguổn enzym ứng dụng
1 a-amylase Aspergillus niger Sàn xuất cổn và các sản phẩm

Aspergillus oryzae từ nguổn tinh bột
Bacillus licheniform is
2 p-amylase Malt Sàn xuất bia
3 Bromelin Ananas comosus Làm mém thịt, sản xuất bia
Ananas bracteatus
4 Cataiase Aspergillus niger Sản xuất lemonade, chế biến
Gan động vật bột trứng
5 Ceilulase Aspergillus niger Sàn xuất cổn dịch cà phè, dịch
Trichoderma reeset các chất gia vị
6 Ficin Ficus sp. ứng dụng giống bromelin
7 a- galactosidase M orteireila vinacea Sản xuất nước quả, chế biến sữa
8 p-galactosidase Aspergillus niger —
Candida pseudotropicanlis
9 Gluco amylase Aspergillus niger Sản xuất đường tinh bột
A. ozyzae, Rhizopus niveus
10 Glucose Actinom yces m issaunriensis Sản xuấỉ dường và các sản
isomerase Arthrobacter globiform is phẩm từ tinh bột
Streptom yces olivacens
S.olivochromogenes
11 Glucose oxidase A spergillus niger Lemonade và dịch thủy phản
trứng, bột trứng
12 Invertase S. cerevisiae Sàn xuất đưởng nghịch đảo
13 Lipase A. niger Sản xuất phomai
A. oryzae
fìộng vật
14 Lipase esterase Mucor m iehei Sản xuất phomai
15 Papain Papaya Sản xuất bia, làm mổm thịt,
chữa vết thương
16 Rennet Động vật. endithia, parasitica, Sản xuất phomai
B. cereus, mucor
17 Trypsin Tụy Sản xuất phomai, thuốc
Thị trư ờ n g enzym và công nghệ enzym tro n g tương laỉ 525
Bảng 8,7 Sản xuất và tiêu thụ enzym tại Canada
stt Enzym Nguổn enzym ứng dụng
1 Amyloglucosidase Aspergillus niger Bia, bánh mì, sỉro chocolate, cổn, các
Aspergillus oryzae sản phẩm tử tinh bột
Rhizopus oryzae
2 Amyloglucosidase Rhizopus rtiveus Sản xuất cổn
f t delemar sản xuất giấm
3 Bromelin Ananas comosus Bia. dịch chiết malt bia, làm mểm thịt,
Ananas bracteatus thủy phân protein sữa, thực vật
4 Catalase Aspergillus niger Lemonade
5 Cellulase Aspergillus niger Sản xuất cổn, dịch cafe đậm đặc, dịch
các chất gia vị
6 Ficin Mủ quả sung ứng dụng giống bromelin
7 Glucanase Aspergillus niger Sàn xuất cổn
Bacillus subtilis sản suất giấm
8 Glucose isomerase Bacillus coagulans Isomer hóa glucose
S.olivochomogenes
S.olivaceus
Actinoplanes
m issouriensis
9 Glucose oxidase Aspergillus niger Lemonade, dịch thủy phân lòng ỉrắng.
lòng đỏ trứng gà
10 Hemiceilulase Bacillus subtilis Giống cellutase
11 Invertase Saccharomyces sp. Bánh kẹo
12 Lactase Aspergillus niger Sản xuất sữa
Saccharomyces sp.
13 Lipase Aspergillus niger Sản xuất sữa, bột trứng
14 Enzym đông tụ sữa Mucor m iechei Sản xuất phomai
M .pusiiius
15 Papain Carica papaya ứng dụng giống bromelin
16 Pectinase Aspergillus niger Sàn xuất nước quả, rượu vang
Rhizopus oryzae
17 Pentosanase Aspergillus niger Sản xuất bia, sản xuấỉ giấm
Badlius saietilis
18 Pepsin Động vật ứng dụng giổng protease
19 Protease Aspergillus oryzae Sản xuất bia, bánh mì, rượu cổn, làm
Aspergillus niger mổm thịt....
Bacillus subtilis
20 Rennet Động vật Sản xuất phomai và chế biến các sản
phẩm khác từ sữa
526 ChUffngS
Bảng 8.8 Sản xuất và tiêu thụ ernym tại Pháp

s tt Enzym Nguổn enzym ứng dụng
1 a-am ylase B adllus subtilis Sản xuất các sản phẩm ỉừ tinh bột
Bacillus licheniform is Sản xuất bia, bánh mì, nước trai
Aspergillus niger cây, mật quả
Aspergillus oryzae
2 Amyloglucosidase Aspergillus niger Sàn xuất các sản phẩm từ tinh

bột. bánh pure, bìa
3 Invertase Saccharomyces Đường nghịch đào, các chất ngọt
4 Papain Carica papaya Bia
5 Protease B. SubtHis Bánh ngọt bia

Aspergillus oryzae Dịch trái cây, mật quả
Aspergillus w entii
6 Protease acid Mucor pusillus Sản xuất phomai từ sữa bo

Mucor m iehei
Endothia parasitica
7 Pectinase Aspergillus niger Dịch quả, nước trái cây lên men
Aspergillus w entii
8 Glucose Sfreptomyces violaceo niger Siro glucose

isomerase Streptomyces
olivochromogenes
B-coaguians
8.2 CÔNQ NGHỆ ENZYMTRONG TƯƠNG LAI

Enzym là thành phần không thể thiếu được trong mọi tế bào
sinh vật. Chúng đóng vai trò quyết định cho mọi chuyển hóa vật chất
trong tế bào và quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi
trường sấng.
Enzym là chất tham gia trao đổi chất (m eta b o lism ) và lầ chất
tham g ia chuyển hóa sinh học (bioconversion). Chính vì vai trò to lớn
của chúng trong sự sống của tế bào và sự chuyển hóa vật chất ngoài
tê bào nên enzym đã trở thành đối tượng rấ t quan trọng trong nghiên
cứu không chỉ các nhà khoa học sinh bọc, công nghệ sinh học mà còn
là mối quan tâm rấ t ỉớn của những nhầ khoa học trong nhiều ÌTnh vực
khoa học có liên quan.
Thị trư ờ ng enzym và công nghệ enzym tro n g tương lai 527
Bắt đầu cuối th ế kỷ 19 đến nay, nhiều kết quả nghiên cứu
enzym đã được đưa vào sản xuất theo quỵ mô công nghiệp, thúc đẩy
công nghệ enzym trớ thành một trong những chuyên ngành rấ t quan
trọng trong công nghệ sinh học. Trong những năm cuối của th ế kỷ
20 và những năm đầu của th ế kỷ 21, công nghệ sinh học trong đó có
công nghệ enzym đã phát triển rấ t mạnh, dự báo cho những thành
công lớn trong khoa học và trong kỉnh tế. Các nhà khoa học cũng
đưa ra nhiều dự báo tùy theo lĩnh vực nghỉên cứu và chuyên môn sâu
của mình. Những dự báo đó được tóm tắ t trong những nội dung
chính như sau.
1- T ạ o n g u ồ n e n z y m cổ c h ấ t lư ợ n g c a o v à c ổ t h ể s ả n x u ấ t
th e o q u y m ô c ô n g n g h iệ p
Như những phần trình bày ở những chương trình trước cho
thấy, đã từ rấ t lâu, loài người thu nhận và ứng dụng enzym chủ yếu
từ ba nguồn: động vật; vi sinh vật; thực vật.
Nguồn enzym từ động vật được khai thác từ rấ t lâu để sản xuất
các sản phẩm từ sữa. Đến gỉữa thế kỷ 20, người ta khai thác các
enzym protease này để sản xuất các chế phẩm enzym dùng để chữa
một số bệnh về tiêu hóa.
Đối với nguồn enzym từ động vật và thực vật, ở th ế kỷ 19 và
20, người ta thường chỉ khai thác những gì sẵn cố trong thiên nhiên,
như khai thác bromelỉn từ dứa, papain từ đu đủ, amylase từ malt, các
protease từ động vật. Chưa có một nghiên cứu cải tạo các giống thực
vệt và động vật nhằm mục đích nâng cao hoạt tính các enzym trên.
Những nghiên cứu tạo giống thực vật và động vật hiện nay chủ yếu
nhằm thu nhận sinh khối (lá, thân, rễ, hoa, quả, trúng, sữa, th ịt hoặc
3ông). Các nhà khoa học trên th ế giới nhận biết được điều này nhưng
việc khai thác enzym từ nguồn động vật và thực vật khó đưa ra được
một quy trình công nghệ theo mô hình công nghiệp hoàn chỉnh và còn
phự thuộc rấ t nhiều vào thời tiết, vào bệnh tạt. Nhiều yếtí tố rủi ro,
nhièu khó khăn trong đầu tư trang thiết bị và hơn hết là enzym khai
thác từ nguồn động vật và thực vật chưa phải là sản phẩm chính của
ngành chăn nuôi và trồng trọt nên trước th ế kỷ 21 vẫn chưa có công
528 Chương 8
trình nào về chọn giống để thu nhận enzym có hoạt tính sinh học cao.
Các nhà khoa học cũng dự đoán rằng trong th ế kỷ 21, sẽ xuất hiện
theo hướng nghiên cứu theo hướng cải tạo giống để thu nhận enzym
có hoạt tính cao bằng kỹ thuật di truyền. Tuy nhiên, những nghiên
cứu này sẽ không nhiều.
Cuối th ế kỷ 19 và suốt thế kỷ 20, ngành công nghệ enzym rất
phát triển và phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzym
dựa vào hoạt động sống của vsv. Nguồn enzym từ vsv rấ t phong phú
và hoàn toàn khác với nguồn enzym từ động vật và thực vật là ta có
thể ứng dụng các kỹ thuật công nghiệp để sản xuất enzym. Công nghệ
sản xuất enzym bằng v s v hoàn toàn có thể tự động hóa, cơ giới hóa
và hoàn toàn có thể kiểm soát được toàn bộ quá trình tạo ra sản
phẩm enzym.
Trong thiên nhiên, v s v được coi như giới sinh vật phát triển
phong phú và da dạng nhất. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều
loại enzym trong cùng một thời gian. Việc điều khiển bằng các yếu tố
ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp rất dễ thực hiện. Trong thiên
nhiên, hiện tượng đấu tranh sinh tồn trong giới v s v xảy ra rấ t mãnh
liệt, do đó cuối th ế kỷ 19 và đầu thế kỷ 20, sản xuất enzym chủ yếu
vẫn dựa vào các chủng v s v có trong thiên nhiên. Các chủng này có
nhiều ưu điểm như khả năng thích nghi với diều kiện môi trường, rất
cao, khả năng chông lại các điều kiện bất lợi cũng rấ t cao. Nhưng các
chủng lấy từ điều kiện tự nhiên lại có nhược điểm rấ t lớn là hoạt tính
enzym có giới hạn và không thích hợp ngay, thậm chí không phù hợp
với quy mô công nghiệp. Bắt đầu từ giữa thế kỷ 20 đến nay xuất hiện
hàng loạt các công trình khoa học về cải tạo giống vsv hoang dại
bằng kỹ thuật di truyền cổ điển như phương pháp lai, phương pháp
gây dột biến bằng hóa chất, bằng các yếu tố vật lý. Những phương
pháp này đã đóng góp một phần không nhỏ trong cải tạo và nâng cao
chất lượng giông v sv từ tự nhiên.
Cuối th ế kỷ 20 đến nay, có nhiều nghiên cứu rấ t thành công
trong cải tạo và nâng cao chất lượng giống v sv tổng hợp enzym bằng
kỹ thuật tái tể hợp gen. Những nghiên cứu khỏi phát này sẽ là nền
tả n g cho sự bùng phát tạo ra giống mới cho công nghệ enzym. Thế kỷ
T hị trư ờ n g enzym v à công nghệ enzym tro n g tương lai 529
21 sẽ là th ế kỷ kỷ thuật tái tố hợp. Khi đó, chúng ta sẽ có nhỉều

giếng v s v được lắp ghép gen có khả năng vừa tăng sinh khốỉ mạnh
vừa có thể sính tống hợp nhiều enzym cỗ giá trị theo ý muốn. Việc tạo
giống v sv sinh tổng hợp enzym cao có ý nghĩa kinh tế rất ỉớn trong
công nghệ enzym. Nó quyết định tới vốn đầu tư, quyết định đến chất
lượng enzym, qựyết định đến sấ lượng enzym và quyết định cả đến giá
thành enzym. Do đó, th ế kỷ thứ 21 sẽ là th ế kỷ tạo giống vsv. Trong
đó, các giống v sv đặc biệt đuợc quan tâm và phát triển rất mạnh.
Mục tiêu của công nghệ sinh học là tiến tới ngành công nghiệp
công nghệ sinh học (Industial bwtechnology). Các quá trình sinh học
để tạo ra sản phẩm phái được sản suất hàng loạt, có kiểm soát chất
lượng sản phẩm và sản phẩm đổ phảỉ đáp ứng được yêu cầu cuộc
sống ỉoài người. Dựa vào tốc độ phát triển rấ t mạnh của công nghệ
sinh học trong những năjn cuối th ế kỷ 20 và đầu th ế kỷ 21, dựa vào
nhu cầu p h át triển của cống nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược
phẩm, nông nghiệp, các nhà khoa học cho thấy việc tạo giông cho
công nghệ enzym là quan trong nhất, do đó th ế kỷ 21 sẽ cổ nhiều
giếng có giá trị hơn.
2- Phát hiện ngày càng nhiều enzỵm trong thế giới sinh vật
Cho đến nay, các nhầ khoa học đã lịẢát hiện ra rất nhiều enzym
và đã có nhỉều loại enzym được nghiên cứu kỹ và dã được ứng dụng có
hiệu quả trong sản xuất công nghiệp. Nhờ có những nghiên cứu đó mà
các ngầnh sản xuất thưc phẩm, dược phẩm phát triển rất mạnh. Từ
sự hiểu biết còn rấ t hạn chế, loài người đã hiểu được bản chất của
từng loại enzymt biết úng dụng chúng và đã thiết ỉập được nhiều quy
trình công nghệ sản xuất nhờ hoạt động của enzym theo quy mô
công nghiệp. Nhiều công nghệ truyền thống đá được phát triển theo
quy mô công nghiệp. Chính những tiến bộ công nghệ này đã giúp
cho công nghệ sinh học có một nền tảng sản xuất công nghiệp rấ t
vững. Có th ể khẳng định rằng tỊiế kỷ 20 là th ế kỷ th iế t lập nền
tảng công nghiệp công nghệ sinh học, th ế kỷ 21 là th ế kỷ công
nghiệp công nghệ sinh học^r
Bí m ật thiên nhiên, trong đó có các quá trình chuyển hóa trong
tế bào sinh vật vẫn chưa được khám phá hết. Các quá trinh chuyển
hóa trong t í bào thực chất là các quá trinh enzym. Còn rấ t nhiều vấn
đề xung quanh các quá trình chuyển hóa ta hoàn toàn chưa hiểu hết
530 Chương 8
và thậm chí còn chưa biết đến. Những enzym mà ta đã biết, đã áp

dụng vào trong sản xuất so với số ỉượng enzym tham gia hàng loạt các
phản ứng trong tế bào chỉ chiếm một ỉượng rấ t nhô. Như vậy, các nhà
khoa học còn cần phải tìm kiếm các ỉoại enzym mới. Có ba phương
pháp tiếp cận với công nghệ enzym.
a- Dựa vào những quá trình lên men truyền thống đề tìm ra cơ
chế chuyển hóa. Từ đó nâng khả năng hoạt động của enzym, tối ưu
hóa quá trình, cơ giới hóa tự động hóa quá trình và chuyển chúng
thành dạng sản xuất công nghiệp.
ò' Dựa vào những chuyển hóa tự nhiên, quá trình sinh trưởng,
sinh sản, qua trình gây bệnh, lành bệnh để tìm ra những cơ chế biến
đổi sỉnh lý của cơ thể. Từ đó, thúc đẩy việc nghiên cứu điều khiển
hoạt động của enzym và chuyển sự tổng hợp tự phát sang sản xuất có
điều khiển theo quy mô công nghiệp.
c- Dựa vào các quy luật sinh lý, sinh hóa, biến dị thích nghi,
biến dị di truyền tạo ra những giống sinh vật mới có khả nảng sinh
tổng hợp enzym với số lượng rấ t ldn trong một khoảng thời gian ngắn
và tiến tới thiết lập quy trinh công nghệ theo quy mồ công nghiệp để
đáp ứng nhanh và đầy đủ yêu cầu cuộc sống.
Trong những năm gản dây, nhiều enzym inới dược các nhà khoa
học phát hiện và nghiên cứu rất sâu bản chất của từng loại enzym.
Những enzym này sẽ là những enzym đỏng vai trò chủ yếu trong điều
khiển sự sống của tế bào. Như vậy, bức tranh về công nghệ enzym sẽ
là hiện tượng phát hiện ra nhiều enzym điều khiển các hoạt động của
tế bào. Thế kỷ 20 trỏ về trước là những nghiên cứu các loại enzym
thủy phân, enzym chuyển hóa vật chất trong và ngoài tế bào. Thế kỷ
21, ngoài việc ứng dụng có hiệu quả cắc loại enzym đã phát hiện đã
sản xuất thành công ở th ế hỷ 20 sẽ là những nghiên cứu sản xuất và
ứng dụng enzym điều khiển các quá trình sự sống tế bào. Các loại
enzym này có ý nghĩa rấ t lớn trong cuộc sống. Các loại enzym này sẽ
được sản xuất với sấ ỉượng không nhiều như các ỉoạỉ enzym tham gia
thủy phân, nhưng hiệu quả cỏa chúng đem lại sẽ rấ t lớn. Những
enzym này nằm trong hai hướng ứng dụng cơ bản:
- Enzym trong dược học
- Enzym trong công nghệ gen.
Cùng với những loại enzym đã và đang được khám phá và phát
triển, ứng dụng như ở th ế kỷ 20, các enzym sẽ được tìm thấy, sẽ được
sản xuất và ứng dụng ở th ế kỷ 21 sẽ làm thay đổi rấ t m ạnh cuộc sống
ỉoài người.
Thị trư ờ n g enzym và công nghệ enzym tro n g tườtag lai 531
Ngoài ra, các nhà khoa học cũng dự báo những enzym mới ứng
dụng trong phân tích sẽ được nghiên cúu nhiều hơn và được ứng dụng
nhiều trong phân tách. Các nhà khoa học cũng dự đoán rằng sẽ có
ngành sản xuất enzym nhản tạo. Những enzym này được mô phỏng
theo cấu tạo, tính chất cỏa những enzym sinh vật được tổng hợp để
sản xuất ra chúng hoàn toàn bằng các phương pháp ngoài hệ thống tế
bào. Đến nay đã cố một số enzym đơn giản được nghiên cứu theo
hướng này.
Một trong những hướng sẽ phát triển mạnh nhất trong công
nghệ enzym là hướng tạo ra những enzym mới trong tế bào sinh vật
bằng kỹ thuật gen. Nhờ đó, người ta thiết lập hệ thống điều khiển bởi
gen tạo ra khả n&ng sinh tổng hợp enzym ở một sinh vật chủ. Trước
đây, sinh vật này không có khá nảng sinh tổng hợp enzym mớỉ này.
Kỹ thuật gen sẽ tạo ra giống sinh vật mới cổ khả nâng đáp ứng
những yêu cầu cơ bản của loài người.
£- H o à n th iệ n c á c p h ư ơ n g p h á p th u n h ậ n , tín h s ạ c h v à
ứ n g d ụ n g e n z y m th e o q u y m ô c ô n g n g h iệ p
Cống nghệ enzym phát triển chu yếu dựa vào sự tiến bộ của các
phương pháp thu nhận, tinh sạch và kỹ thuật sản xuất công nghiệp.
Nếu th ế kỷ 19 và thế kỷ 20 là thế kỷ tạo ra những phương pháp
thu nhận enzym bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt, nuôi cấy chìm và
enzym cố định thì th ế kỷ 21, theo các nhà khoa học sẽ phát triển rấ t
mạnh các phương pháp cố định enzym để tạo ra các sản phẩm sạch
nhờ các quá trình enzym. Các loại enzym cố định hiện đang được ứng
dụng trong một số ngành công nghiệp và đã thể hiện được tính ưu
việt của chúng, cũng như những nhược điểm cần phải khắc phục và
hoàn chỉnh. Kỹ thuật cố định enzym sẽ được hoàn chỉnh hơn và sẽ
được ứng dụng rộng rãi hơn trong công nghiệp và trong bảo vệ môỉ
trường. Cùng với sự phát triển công nghệ cố định enzym, các nhà
khoa học sẽ phát triển công nghệ cố định tế bào v sv và ứng dụng
rộng rãi trong các quá trình ỉên men. Việc sản xuất và chuyển hốa
trong quy mô công nghiệp sẽ dựa chủ yếu vào công nghệ vi sinh. Công
nghệ này sẽ phát triển mạnh ở quy mô công nghiệp, hình thành nên
những công ty công nghiệp vi sinh rất mạnh. Bằng những kỹ thuật
này , m ộ t lo ạ t các s ả n p h ẩ m sạch sẽ được s ả n x u ấ t v à ứng dụng sẽ
m ạ n h n h ấ t tro n g lĩn h vực dược và công n g h iệp thư c p hẩm .
532 Chương 8
Phương pháp cố định enzym và cố đỉnh tế bào sẽ được áp dụng

có hiệu quả trong bảo vệ và làm sạch môi trường. Các phương pháp
tinh sạch enzym sẽ được hoàn thiện hơn với thời gian ngắn hơn và
hiệu quả kinh tế sẽ cao hơn. Việc ứng dụng enzym ngày càng đòi hỏi
mức độ enzym tinh sạch hơn. Do đó, các phương pháp tinh sạch sẽ
được nghiên cứu hoàn chỉnh và sẽ được ứng dụng vào trong thực tế
theo quy mô công nghiệp. Khỉ đó các chế phẩm enzym ứng dụng trong
phân tích, trong y học và trong kỷ thuật di truyền sẽ có giá thảnh rẻ
hơn hiện nay nhiều lần. Các chế phẩm enzym tính khiết sẽ được bán
đại trà trong thị trường th ế giới như các hóa chất thông dụng dang
được tiêu thụ ở thị trường hiện nay.
4- Mở rộng ứng dụng emyrn trong nhiều B nh vực hỹ th u ậ t tìn h vi
Thế kỷ 21 sẽ ỉà th ế kỷ hoàn thiện và phát triển nhiều loại máy
móc cảm ứng sinh học (bwsensswn) và sẽ tạo ra một bước ngoặt quan
trọng trong việc thiết lập các phương tiện phân tích nhạy cảm, cho
kết quả phân tích rấ t nhanh để ứng dung trong y học, trong phân tích
chất độc, trong phân tích thành phần thực phẩm và cả phân tích v sv
gây bệnh trong thực phẩm, trong y học. Những thiết bị cảm ứng sinh
học có ý nghĩa rấ t lớn không chỉ trong kỹ thuật mà cả trong kinh tế.
Cuối th ế kỷ 20 và đầu th ế kỷ 21 đã xuất hiện nhiều báo cáo khoa học
và có nhiều thông báo về khả năng thiết kế, chế tao và ifrng dụng các
ỉoại thiết bị cảm ứng sinh học. Thế kỷ 21, các th iết bỉ cảm ứng sinh
học sẽ được sản xuất hàng ỉoạt và đa dạng, nó sẽ thay th ế nhiều
phương pháp phân tích cổ điển vừa m ất thời giqn vừa phức tạp và
không kinh tế.
Ngoài ra, các nhà khoa học cũng dự báo, enzym sẽ thám nhập
vào lĩnh vực rấ t mới đó là tin sinh học (bwinformatic). Chính những
cơ chế chuyển hóa cửa enzym trong lĩnh vực sinh học phân tử sẽ giúp
các nhà kỹ thuật tạo ra cơ chế truyền thông tin mới. Nếu th à n h công
trong lĩnh vực này cả về kỹ thuật và kinh tế, nó sẽ ỉà cuộc cách mạng
lớn nhất trong những cuộc cách m ạ n g tin học.
533
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A.F.Nameynhicov, Hóa học trong cồng nghệ thực phẩm , NXB

KHKT Hà Nội, 1977.
2. Alan Wiseman, Handbook of enzyme biotechnology, Third Edition,
Ellis Horwood, London, 1999.
3. B. Mattiason, Immolized Cells and Organelles, Chemical Rubber c.
Cleveland Ohio, 1983.
4. C.A.Macdonald và M.A.W.Thomas - Biochimica Et Biophysica
ACTA - The Rennin - sensitive bond of bovine K. Casein, 1969.
5. Chiba, Immobilized enzyme, Research and development (in
Japanes), Kodansha, Tokyo, 1978.
6. G.F. Bicker Staff, Immobization of enzymes and cells, Humana
Press, Totowa N.J. 1977.
7. Helmut Uhlig, Industrial enzym and their applications, John Wiley
and Sons, inc, 1998.
8. James E. Bailey, David F. Ollis, Biochemical engineering
Fundamentals, Me - Graw - Hill, book company, 1986.
9. James. B. Summer, G. Fred somers - Chemistry and Methods of
enzyms - Academic Press Inc, Publishers New York, N.Y, 1966.
10. K . Mosbach, Methods in enzymology. Vol. 44, Academic, New York, 1976.
11. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Enzym vi sinh vật, tập 1, tập 2, NXB
KHKT, Hà Nội, 1982.
12. M.D. Lilly, Enzyme Microb*Technol 8, 315 (1986).
13. Martin Chaplin, Christopher Bucke, Enzym technology, Cambridge
universtity press, 1990.
14. M asaki' Suzuki và cộng sự - Purification and characterization of
goat pepsinogens and pepsins - Elsevier, 1999.
534
15. Michael c . Flickinger, Stephen W.Drew, Bioprocess technology:

Fermentation, biocatalysis and Bioseperation, Volume 1, 2, 3, 4,
John Wiley anh Sons, Inc, 1999.
16. Ngô Tuấn Kỳ, Enzym và đời sống, NXB KHKT, Hà Nội, 1998.
17. Nguyễn Hữu Chấn, Enzym và xúc tác sinh học, NXB Ỳ học, Hà
Nội, 1983.
18. P. F. Fox, Food enzymology, Elsevier applied Science, London, 1998.
19. Paul De Boyer - Henry Lardy - Karl - NyrBack - The enzyme -
volume and second edition, Academic Press Ine, 1959.
20. Pepsin - PDB - www.resb.org/pdb/molecules/pdb 12_l.html
21. Phạm Thị Trân Châu, Những hiểu biết mới về enzym, NXB
KHKT, Hà Nội, 1983.
22. Report On Follow Ship Training Abroad For Experimental
Production of Raw - Materrials From Animal Organs Obtained
From The Slaughterhouses - 6/1993.
SỔ. S. Visser et al, Biochimica et Biophysica Acta, Peptide substrates
for chymosin, Netherlands, 1975.
24. Shuichi AIBA, Arthur E. Humphrey, Nancy F. Millis, Biochemical
. engineering, Academic press. In. 1973.
25. V.M. Stepanov và E.A. Vakhitova - Biochim. Biophys. Acta - •>
Sequence of amỉnoacids surrounding the phosphoserine residue in
hot pepsin - USSR, 1965.
26 . Visser và các cộng sự - Biochimica Acta - Peptide substrates for
chymosin - Netherlands, 1975.
27. Worfgang Gerhartz, Enzymes in industry, VCH, Germany, 1990.
CONG NGHỆ ENZYM
Nguyỗn Đức Lưựng (chủ biên), Cao Cường, Nguyễn Ảnh Tuyết,
Lê Thị Thủy Ticn, Huỳnh Ngục Oanh, Nguyễn Thúy Hương,
Phan Thị Huyền, Tạ Thu Hằng
NHẢ XUẤT BẢN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ồ CHÍ MINH
03 Công trường Quốc tế, Q. 3, TP HCM
ĐT: 823 9 1 7 0 - 823 9171 - Fax: 823 9172
Emaỉl: VNUHP("M;mail.vnn.vn
'k ■&
Chịu trách nhiệm xuất bản:

PGS-TS NGUYỄN QUANG ĐIỂN
Hiên tập:
TRẦN VÀN THẮNG
Sửa bàn in :
PHẠM THỊ ANH TÚ
Trình bày bìa:
TRƯƠNG NGỌC TUẤN
ln 500 cuốn, khổ 16 X 24 cm. Giấy phép xuất bản số: 60/87/XB-QLXB
do Cục Xuất bản cấp ngày 21/01/2003. Giây Iríeh ngang số: 215/KHXB
ngày 24/6/2004. in tại Xưởng in Đại học Bách khoa - Đại học Quốc gia
TP. HCM. Nộp lưu chiểu tháng 7 năm 2004.

Cong Nghe Enzyme Nguyen Duc Luong PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cong Nghe Enzyme Nguyen Duc Luong PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Chủ Biên )

s NHÀ XUẢT BÀN

N guyễn Đức Lượng (Chủ biên) - Cao Cường

CÔNG NGHỆ ENZYM

NHÀ XUẤT BẲN ĐẠI HỌC QUỐC GIA

LỜỈ NÓI ĐẦU 5

Chương 1 NHỮNG HlỂư BIẾT c ơ BẢN VỀ ENZYM

1.3 Cơ chế tác dụng của enzym 32

stt Năm Nộf dung nghién cứu, phát triển

1 1833 Pay en và Persoz tách được diatase từ malt

11 1928 Fleming phát hiện ra penicilline

1.2 KHÁI NIỆM vé ENZYM

Vật chát dỊ hóa

Vật chất có Vật chất tổng hợp

Hình 1.1 Hệ thống mở cảa tế bào sinh vật

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về enzym, và đã đi đến

2- Nhỏm enzỵm đa cấu tử

B ảng số 1,2 Một số enzym C.Ó chửa kim loại

stt Enzym Kim loại

1 Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe)

4 Peptidase Manganese (Mn), sắt (Fe),

5 Phosphatase Magnesium (Mg)

6 Arginase Manganese (Mn)

Trung tâm hoạt động

2- Cấu trúc đa nguyên

Phức hợp enzym này có trọng lượng phân tử là 4.000.000 và có

1.2.5 C ác tiề n c h ấ t c ủ a enzym

Pepsinogen là tiền chất của pepsin. Chúng có phân tử lượng vào

Chất ức chế là một pepsin có trọng lượng phân tử khoảng 3240,

H ìn h 1.5 Quá trình hoạt hóa pepsinogen thành pepsin

2-Trypsỉnogen và quá trình hoạt hóa chúng tạo thành trypsin

Phản ứng tạo ra protein không hoạt động:

Hình 1.6 Quá trình hoạt hóa trypsinogen thành trypsin

3- Chymotrypsinogen và quá trinh hoạt hóa chúng tạo thành

N eochym otrypsinogen 71 - C hym otrypsin + Ser - Arg

H ình 1.7 Cơ chế ỉioợt hóa chỵmoirypsiIìogvìì thành a-chyniotrypsin

Các proenzym hay-zymogen thường là những protease. Các tiền

1 Pepsinogen Pepsin Pepsin

H ình 1.8 Cơ chế hoạt dỘỊìỊí của imidazol

Thay thế H2N - R'

RSH + (CH3C 0)20 -------- ► R - s - C - CH3 + CHgCOOH

d- A lk y l hóa nhóm -SH

R S - S R + RS'«■■■ " " ĩ RS —SR’ + RS"

RS —SR’ + R’S"— t R*S— SR' + RS"

Trong phân tử enzym tồn tại ba nhóm -SH:

1.3 C ơ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYM

1.3.1 Ý nghĩa quá trìn h xúc tác tro n g tế bào sinh v ậ t

ở đây: E - enzym (enzyme); s - cơ chất (substrate); p - sản phẩm (products)

lượng hoạt hóa khi có enzym

H ìn h 1.9 Sự chuyền hồa năng ỉượng trong phản ứng enzym

Cơ chế xúc tác acid-base được trình bày như hình 1 . 10 .

s tt GỐC amlno acld Loại enzym Cơ chế xúc tác

3 Histidine Các enzym vận chuyển

Nếu chia hai vế cho K1# thay K2 + K3 bằng hằng số Michaelis-

Từ đó, ta có thể thiết lập được cân bằng:

Chia hai vê cho vma* ta sẽ có: -T = [S] . Từ dó ta có:

Km+ [s] = 2[S] và Km= [S] khi Vo = Vmax/2

H ìn h 1.11 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất H ìn h 1.12 Đồ thị biểu diễn

Năm 1934 Line weaver và Burk đưa ra phương trình từ phương

Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng: y = ax + b

Từ phương trình trên, ta dễ dàng xác định được vị trí vmax, Km

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Qio dể biểu thị ảnh hưdng

trong đó: K - hằng số vận tốc phản ứng

H ìn h 1.17 Sự phụ thuộc l / v vào 1/[SJ khi có (--*-) và không có