UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

BOGOTÁ, COLOMBIA

INFORME LABORATORIO BIOQUÍMICA –

EXTRACCION E IDENTIFICACION DE ADN

Moreno Héctor -20161180076, Guevara Daniel – 20162180463,

Naranjo Nicolás – 20162180135 , Santos Hamilton – 20152180213

RESUMEN

El procedimiento general de extracción de ácidos nucleicos consiste en cinco etapas

principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos,
precipitación y redisolución del ADN, en este laboratorio se realizaron los respectivos
procedimientos para extraer tomando como muestra vegetal , 5 gramos de hígado y por
ultimo para identificar y poder distinguir cadenas de ADN, se hizo la prueba de difenilamina
para que en la muestra se obtuviera un color azul, dándonos a entender que en esta etapa
estarían reaccionando solo aquellos nucleótidos que contenga adenina o guanina.

PALABRAS CLAVES: ADN, EXTRACCION E IDENTIFICACION, DIFENILAMINA,

NUCLEOTIDOS.

ABSTRACT

The general nucleic acid extraction procedure consists of five main stages: tissue
homogenization, cell lysis, separation of proteins and lipids, precipitation and redissolution
of DNA, in this laboratory the respective procedures were performed to extract, taking as a
vegetable sample, 5 grams of liver and finally to identify and be able to distinguish DNA
strands, the diphenylamine test was made so that a blue color was obtained in the sample,
giving us to understand that at this stage only those nucleotides containing adenine or
guanine would be reacting.

KEY WORDS: DNA, EXTRACTION AND IDENTIFICATION, DIFENYLAMINE,

NUCLEOTIDES.
 INTRODUCCIÓN

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las

características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de
nucleótidos unidas entre sí formando una doble hé- lice. Los nucleótidos están integrados por
un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina
o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas
se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal (Figura
1).

Figura 1. Estructura del ADN. En la estructura helicoidal del ADN, las cadenas se unen
por puentes de hidrógeno dos entre adenina y timina, tres entre guanina y citosina. El
enlace fosfodiéster que une a cada nucleótido, se forma entre el fosfato (H3PO4) que se
encuentra en el carbono 5 y el grupo hidróxilo (–OH) del carbono 3 de la desoxirribosa.
Los grupos fosfato son la parte hidrofílica del ADN y tienen carga negativa.(Velázquez-
Año)

Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN
una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para
su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga
negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante
alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan
expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como
Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el
ADN precipite (Sambrook et al. 1989). Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le
permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente (Nasón 1965,
Travaglini 1973, Sambrook et al. 1989, Sinden 1994).
Una de las más notables características de la hélice de DNA y que además es crucial para sus
funciones durante la replicación y la transcripción, es la facilidad con que sus cadenas
componentes pueden separarse y volverse a juntar. Son muchas las técnicas que se han
encontrado para medir esta conducta de fusión y "reannealing" (reasociación). Sin embargo,
quedan por resolver importantes cuestiones acerca de la cinética y la termodinámica de la
desnaturalización y la renaturalización y acerca de cómo estos procesos pueden estar
influenciados por otras moléculas, tanto en el tubo de ensayo como en la célula.

 Desnaturalización: Las cadenas del DNA dúplex se separan cuando se rompen los
enlaces de hidrógeno existentes entre las bases. Esta fusión de la estructura
secundaria puede llevarse a cabo en solución, aumentando la temperatura ó bien por
titulación con ácidos ó álcalis. Los ácidos protonizan los nitrógeno s del anillo de A,
G y C; los álcalis desprotonizan los nitrógeno s del anillo de G y T. La poco corriente
labilidad de los enlaces glicosídicos de la purina a bajo pH hace que la utilización de
ácidos no sea conveniente para' los experimentos de desnaturalización.

 Renaturalización: La desnaturalización es reversible incluso después de que las dos

cadenas han sido totalmente separadas. Cuando se incuban cadenas complementarias
a una temperatura de 250 por debajo de la Tm' empiezan a reasociarse y llega un
momento en que vuelven a formar la hélice original. La renatuuralización suele
medirse en función del descenso en la absorbencia (efecto hipocrómico), por su
comportamiento durante la sedimentación ó bien por su falta de susceptibilidad frente
a las nucleasas específicas para cadenas sencillas.

Todo organismo vivo está formado por la ampliamente estudiada y conocida molécula de
DNA. Sabemos que los organismos vivos provienen de una única célula ancestral llamada
LUCA. Este hecho nos indica que entre organismos vivos compartimos mucho más de lo que
a veces nos podríamos llegar a imaginar. Por ejemplo, los humanos compartimos el 50% del
DNA con el plátano. Sin embargo, el porcentaje de DNA que compartimos depende de cómo
se mida. Si medimos secuencias idénticas de pares de bases, entonces es bastante bajo, pero
si nos fijamos en los genes con funciones idénticas o similares entonces es de hecho el 50 %.

Algunas de las cosas para las que estos genes codifican son de bioquímica básica: la
replicación del DNA, la transcripción, la traducción, el metabolismo del DNA
(recombinación, reparación), el metabolismo de la célula (catabolismo y anabolismo) y la
regulación del ciclo celular (mitosis). Este tipo de genes son nombrados por los biólogos
como “secuencias conservadas”. Para poder estudiar esta molécula con detalle se precisa
generalmente su aislamiento de la célula, y para ello es necesario un conjunto de material e
instrumentos de laboratorio complejos. Lo que este experimento pretende es un acercamiento
simple y sencillo a la técnica de extracción de DNA que se puede realizar en cualquier hogar
con materiales de la vida cotidiana. (Martinez 2015)
PROCEDIMIENTO:

1. Aislamiento y caracterización de ADN

Pesar 5 g de bazo de cerdo (o hígado), cortarlo en pedazos muy pequeños y transferirlos a

un mortero que contenga 5mL de cloruro de sodio 0,1 Molar y EDTA 1x 10-4 Molar (el
EDTA es un detergente que rompe las células) y arena lavada. Macerar con el pistilo hasta
obtener una pasta homogénea. Repartir el macerado en tubos de centrifuga (cuidando de
depositar igual cantidad de cada uno) y centrifugar durante 10 minutos.
Descartar el precipitado, tomar el sobrenadante y agregarle un volumen igual de fenol al
90% (el fenol tiene la función de degradar las nucleoproteínas asociadas al ADN) y agitar
la mezcla durante 20 minutos y permitir que decante.
Descartar el precipitado, tomar el sobrenadante y agregarle un volumen igual de fenol al
90%; agitar la mezcla durante 15 minutos y permitir que decante.
Separar el sobrenadante y añadirle un volumen igual de éter (con el fin de desengrasar),
agitar durante 10 minutos; permita que decante y descarte el sobrenadante; tome el
precipitado y agregue un volumen igual de etanol (para precipitar el ADN). Amedida que
agrega el etanol agitar con una varilla de vidrio lavada en solución de cloruro de sodio 0.14
Molar.
2. Reconocimiento de ADN

La presencia de ADN se puede determinar empleando la reacción de la difenilamina, cuyo

fundamentos consiste en que en solución ácida el monosacárido desoxirribosa se vuelve
altamente reactiva y reacciona con la difenilamina para dar un complejo de color azul,
reaccionado solo aquellos nucleótidos que contenga adenina o guanina.
RESULTADOS

(Moreno, 2018)
Como resultado de los respectivos procedimientos que se realizaron en el laboratorio, se
obtuvo la anterior solución en la que se logran ver partículas muy pequeñas de color azul ,
que es lo esperado después de aplicar la prueba de difenilamina, aunque a comparación de
otros resultados de mis compañeros en donde se puede apreciar mejor la presencia de ADN
en color azul ,en este resultado no se ve con gran apreciación, esto pudo haber sido por
técnicas empleadas en los distintos procedimientos, sin embargo el resultado fue aceptable
en medida que se pudo extraer e identificar cadenas de ADN.

(Moreno 2018)
En esta imagen se puede apreciar una comparación con otro resultados de un grupo
compañero en el que se puede diferenciar que en el tubo de ensayo del respectivo grupo que
es una mezcla homogénea en el que también se ven pequeñas partículas azules de ADN, y
en el tubo de nosotros un pequeño precipitado y una prueba no tan homogénea y mas
traslucida.

ANALISIS DE RESULTADOS
En la práctica de laboratorio al extraer el ADN del tejido animal procedente de un hígado
de res,fue necesario homogeneizar el tejido rompiendo las células para separar el núcleo
mediante el macerado en presencia de una pequeña cantidad de NaCl, liberando su
contenido disperso muy replegado, debido a que se encuentra en el interior del núcleo de
las células eucariotas rodeado de proteínas (histonas) que lo mantienen compactado, por lo
que para poder aislarlo se debe deshacer la membrana plasmática, en esta homogenización
también se mezclo junto con arena .
Al concluir el proceso de homogenización mediante la trituración, se agregó el EDTA, este
compuesto se une a cationes metálicos en la solución eliminando cationessolubles y
cationes de las enzimas ADNasas, las cuales degradan el ADN; el NaCl(cloruro de sodio)
forma una capa protectora alrededor del ADN que lo protege dela degradación,
posteriormente se dispuso el macerado en un tubo y se centrifugo durante 10 minutos,
descartando el sobrenadante producto de este proceso, agregando a la muestra resultante
un volumen igual de fenol al 90 %, el fenol es un compuesto útil para descomponer
materiales celulares no deseados que contaminan la muestra de ácido nucleico, puesto que
es un compuesto no polar,los ácidos nucleicos altamente polares no pueden ser disueltos,
además al poseer una densidad mayor que la del agua la muestra permanecerá separada en
dos fases, una fase polar acuosa en la parte superior de la solución que contiene ácidos
nucleicos y agua, y una fase orgánica que contiene proteínas desnaturalizadas junto a otros
componentes celulares en la parte inferior de la solución.
Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos se requiere células en cantidad suficiente y
en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos
nucleicos por nucleasas. Una completa extracción de ácidos nucleicos es fundamental para
la determinación indirecta. Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis
de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones
fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por lo tanto obtenemos como producto ácidos
nucleicos sin bases púricas, las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren
deshidratación dando aldehídos δ- hidroxi-levulínicos(Marton Garcia, 2018). Estos
reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. Así, la reacción de
difenilamina servirá para caracterizar, indirectamente, la presencia de ADN.(Universidad
Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, 2018)
Como último paso se realizó un baño en frio, El agua fría ayuda a mantener el DNA intacto
durante el proceso de extracción. El enfriamiento de la solución ayuda a prevenir la
desnaturalización que podría destruir el DNA si se expusiera al calor de manera prolongada
(protege el DNA de enzimas que pueden destruirlo como las DNAasas ya que la
refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas).
CONCLUSIONES
 Todos los procesos de extracción, purificación y almacenamiento se basan en las
características fisicoquímicas del ADN.
 Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus Capa de
ALCOHOL INTERFASE con el ADN Capa de FILTRADO están compuestos por
moléculas de ácido desoxirribonucleico (comúnmente llamado ADN).
 La fase acuosa es siempre en la parte superior de la orgánica, ya que, como se
mencionó anteriormente, el fenol es más denso que el agua. Los ácidos nucleicos
son polares, por lo tanto permanecen en la fase acuosa, los componentes de células
no polares se mueven en la fase orgánica.
  Las moléculas de ADN están rodeadas de proteínas del tipo histonas, y para obtener un
extracto más puro de ADN es necesario eliminarlas. Para ello hay que utilizar enzimas
proteolíticos.

BIBLIOGRAFIA
 Alejo Velazquez, L., & Aragon Martinez, M. (2 de Mayo de 2018). Extraccion y
purificacion de ADN. Obtenido de
http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/710/extraccion.pdf
 Marton Garcia, S. (2 de Mayo de 2018). Para evidenciar la presencia de ácidos
nucleicos se requiere células en cantidad suficiente y en medio libre de
interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos nucleicos
por nucleasas. Obtenido de https://hera.ugr.es/tesisugr/21457268.pdf
 Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. (2 de Mayo de 2018).
Química Biológica I TP 8 DNA: extracción, identificación y reconocimiento .
Obtenido de Facultad de ciencias naturales y ciencias de la salud:
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2010/08
 Zavala J.2005. Manual de técnicas básicas de biología celular. 1ra ed. UADY.
México: 19,27-28,43-49
 Concepción J. 2005. Prácticas de biología molecular. 1ra ed. PUJ. Colombia: 15-17
 Martínez Anaïs, 2015,Extraccion de ADN animal, Universidad Continental,
https://es.slideshare.net/anawii/extraccin-de-adn-animal
 Martínez Laura,2015, Extracción de DNA, Experimentos con reactivos de la vida
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http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez
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 Sambrook J., E. F. Fritsch y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU.
 Sinden R. R. 1994. DNA Structure and Function. Academic Pres, EE.UU
 Martínez, Velázquez, Romero, 2015, Extracción y Purificación de ADN, Institución Nacional
de Ecología y Cambio Climático.