Universidad de San Carlos de Guatemala Curso de Bioquímica

Centro Universitario de Occidente Manual de Prácticas de Laboratorio

División de Ciencias de la Salud Licda. Edna Pérez Rodas
Segundo Año Año 2018

Práctica No. 5
Determinación de Hemoglobina Glicosilada

Papel en el Cuerpo de la Hemoglobina

La hemoglobina tiene muchas funciones importantes en el cuerpo. Su papel más

importante es el transporte del oxígeno al tejido y del CO2 de regreso a los pulmones. La
molécula de la hemoglobina está diseñada para captar oxígeno en áreas de alta tensión de
oxígeno y liberarlo en áreas de baja tensión. La hemoglobina se lleva a todos los tejidos del
cuerpo por los eritrocitos. Además, la hemoglobina representa uno de los principales
sistemas amortiguadores del cuerpo. (Bishop, pág. 383)

Síntesis y degradación de la hemoglobina

La síntesis de la hemoglobina ocurre en los glóbulos rojos inmaduros de la médula
ósea: 65% en las células nucleadas y 35% en los Reticulocitos. La síntesis normal depende
del suministro adecuado de hierro, así como de la síntesis normal de hemo y proteína para
formar la porción de globina.
El hemo se sintetiza en la mitocondria de las células. El hierro se transporta a los
glóbulos rojos desarrollados por la transferrina, una proteína del plasma. El hierro atraviesa la
membrana celular y la mitocondriap para formar el hemo. La síntesis proteica de las cadenas
de globina ocurre en los Ribosomas citoplásmicos. El hemo sale de la mitocondria y se une a
las cadenas de globina en el citoplasma en la etapa final.

La hemoglobina se degrada por dos posibles rutas. A la vía normal se le denomina

extravascular porque ocurre fuera del sistema circulatorio: en el sistema reticuloendotelial, o
fagocito mononuclear. Dentro de las células fagocitarias esplénicas, o macrófagos, la
hemoglobina cede su hierro a la transferrina, su carbón alfa se expira como CO, las cadenas
de globina vuelven al grupo de aminoácidos y el resto de la molécula se convierte en
bilirrubina, que experimenta metabolismo adicional. En condiciones normales, 90% de toda la
hemoglobina se degrada de esta manera. Por lo general, menos de 10% de la hemoglobina
se libera de forma directa en la corriente sanguínea y se disocia en los dímeros alfa y beta.
Grandes cantidades se liberan durante episodios hemolíticos. (Bishop, pág. 385)

Mediciones para el control de la glucemia

La prueba de la hemoglobina glucosilada informa de la media de los niveles dd
glucosa plasmáticos durante los dos o tres meses anteriores a su realización. Los distintos
métodos se han estandarizado frente a la prueba de la HbA1c, considerada de elección en la
valoración del control glucémico. La mejora en el control de la glucemia se ha asociado con
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la prevención o retraso en la progresión de complicaciones microvasculares en la diabetes.
(John Bernard, pág. 214)

Método

la formación de glicohemoglobina ocurre irreversible y progresivamente en los eritrocitos a

través de los 120 días de vida normal de estas células. Debido a que la concentración de
glicohemoglobina en el eritrocito refleja el nivel promedio de glucosa en la sangre de las 4 a 6
semanas anteriores y es estable por la vida de los eritrocitos, la medición de la
glicohemoglobina proporciona una prueba de gran valor para evaluar el control a largo plazo
de los pacientes diabéticos.

Principio de la prueba
La sangre total se mezcla con reactivo hemolisante compuesto por un detergente e
iones borato. La eliminación de la base lábil se Schiff se consigue así durante la hemólisis.
La preparación hemolizada se mezcla por 5 minutos con una resina de intercambio catiónico
de capacidad enlazante débil. Durante este tiempo, la HbA0 se une a la resina. Empleando
un separador de resina especial se extrae la misma del líquido sobrenadante que contiene la
HbA1. El porcentaje de glicohemoglobina sobre la hemoglobina total se determina midiendo
la absorbancia de la fracción de glicohemoglobina y la hemo-globina total a 415 nm o 405
nm, en comparación con el patrón de glicohemoglobina suministrado desarrollando con él un
procedimiento de trabajo similar.

MATERIALES Y EQUIPO
1. Fotómetro con selección de longitud de onda de 545-550 nm
2. Pipetas automáticas de 5-50 µL, 50-250 µL y 200-1000 µL
3. Puntas para pipeta color amarillo y azul
4. Tubos de ensayo
5. Gradillas
6. Reactivo para la determinación de hemoglobina glicosilada.
8. Sangre completa del paciente.
9. Guantes de latex
10. Papel absorbente
11. Recipientes para la disposición de material contaminado
12. Recipiente para colección segura de desechos

PROCEDIMIENTO
Etapa 1 Hemólisis
Pipetear en CUP pre envasado 100 microlitros de STD, muestra, GGN o GCA
Mezclar, incubar por 5 minutos a 15-25°C
ETAPA 2 DETERMINACION DE HbA1
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Pipetear 100 microlitros del hemolisado de la etapa 1 en RGT marcado
Colocar SEP dentro del tubo de manera que el émbolo de goma este aproximadamente 1
cm arriba del nivel del líquido. Mezclar vigorosamente por 5 minutos. Empujar el SEP hacia
el fondo hasta que la resina esta firmemente presionada. Verter el sobrenadante dentro de
una cubeta o tubo.
Leer la absorbancia A HbA1 STD/muestra/control
Etapa 3 determinación de la hemoglobina total
Pipetear 20 microlitros del hemolisado de la etapa 1 en tubos marcados
Agregar 5 ml de agua destilada
Mezclar cuidadosamente
Leer la absorbancia A HbTotal/muestra/control.

Calculo del contenido de HbA1

Factor= A Hbtotal STD x %Hemoglobina A1 STD

A HbA1 STD

Contenido de glicohemoglobina de la muestra

%HbA1 muestra= F x A HbA1 muestra

AHbTotal de la muestra

Valores normales:

Con metabolismo normal o diabéticos estables de 4.5 a 7.0 %

Diabéticos, mal controlados o con metabolismo
Desiquilibrados mayor a 8.5%