Laporan Praktikum KI3261

METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

Percobaan 1

Penyiapan Larutan Buffer, Media dan Larutan Pendukung Eksperimen

Nama : Dedy Wicaksono

NIM : 10515009

Kelompok :1

Tanggal Percobaan : 8 Februari 2018

Tanggal Pengumpulan : 15 Februari 2018

Asisten : Hafizh Iqbal (10514072)

LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

BANDUNG

2018
 Percobaan 1

Penyiapan Larutan Buffer, Media dan Larutan Pendukung Eksperimen

I. Tujuan Percobaan
1. Menentukan cara sekaligus melakukan penyiapan larutan buffer atau larutan pendukung
praktikum / penelitian yang umum digunakan pada laboratorium biokimia

II. Teori Dasar

Dalam percobaan di laboratorium biokimia, diperlukan beberapa larutan pendukung ,
media dan larutan penyangga. Larutan penyangga dapat digunakan untuk mempertahankan
pH ketika ada penambahan asam atau basa dalam jumlah yang sedikit. Larutan penyangga
dapat terdiri larutan asam dan basa konjugasinya , ataupun sebaliknya. Selain larutan
penyangga , dibutuhkan pula larutan dan media yang berfungsi untuk menumbuhkan mikroba
atau isolasi senyawa tertentu.

Larutan dan media yang digunakan harus bersifat steril. Media dapat dibagi menjadi
tiga berdasarkan sifat fisiknya, yaitu : media padat, semi padat dan cair. Media padat dan
semi padat mengandung agar sebagai pemadat ketika disterilkan. Larutan lain yang
digunakan adalah larutan EDTA yang dibuat dengan cara melarutkan padatan EDTA. Larutan
TAE merupakan larutan yang dibuat dari campuran Tris base, asam asetat glasial, dan
EDTA. Etanol 70% dibuat untuk mendapatkan keadaan aseptik. Keadaan aseptik adalah
keadaan bebas dari mikroorganisme penyebab penyakit. Teknik aseptik dilakukan untuk
mencegah masuknya organisme kedalam tubuh.

Larutan glukosa digunakan sebagai nutrisi pada pertumbuhan mikroorganisme. Media

untuk kultur bakteri dapat berupa media nutrient agar (NA) atau nutrient broth (NB).
Perbedaan antara NA dengan NB adalah NA merupakan medium berupa padatan atau solid
sedangkan NB berupa cairan.
III. Data Pengamatan
a. Pembuatan 250 mL larutan buffer fosfat 50 mM pH 7,0

pKa yang digunakan = 7,2

pH buffer yang diinginkan = 7,0
Volume buffer yang diinginkan = 250 mL
Konsentrasi buffer yang diinginkan = 50mM

Data Larutan Stok yang dibuat,

Konsentrasi
Zat Massa (g) Mr (g/mol)
(mM)
KH2PO4 1,36 136 100
K2HPO4 1,742 174 100

b. Pembuatan larutan standar 25 mL glukosa 1mg/mL

Massa Glukosa Baku yang digunakan = 25 mg

c. Pembuatan media NB cair 20mL

Data komposisi media NB cair 20 mL,

Presentase dalam
Zat Massa (g)
Media NB (%)
Pepton 0,5 0,10
Ekstrak Beef 0,3 0,06
NaCl 0,5 0,10

d. Pembuatan media NA padat 50 mL

Data komposisi media NA padat 50 mL,
Presentase dalam
Zat Massa (g)
Media NB (%)
Pepton 0,5 0,25
Ekstrak Beef 0,3 0,15
NaCl 0,5 0,25
Agarose 2,0 1,00

e. Pembuatanan 200 mL larutan etanol 70%

Volume Etanol 96% =146 mL
 f. Pembuatan 20 mL larutan EDTA 0,5 M pH 8,0
Massa Padatan Na2EDTA.2H2O = 3,72 g
Massa Padatan NaOH = 0,40 g

g. Pembuatan 20mL larutan TAE 50x

Massa Padatan trisbase = 4,840 g
Massa Padatan Na2EDTA.2H2O = 0,744 g
Volume Asam Asetat Glasial = 1,142 mL

IV. Pengolahan Data

a. Pembuatan 250 mL larutan buffer fosfat 50 mM pH 7,0
Pembuatan 100 mL larutan standar KH2PO4 100 mM
Mol KH2PO4 = M x V = 100 mM x 100 mL
= 10 mmol
Massa KH2PO4 = 10 mmol x 136 g/mol
=1,36 gram

Pembuatan 100 mL larutan standar K2HPO4100 mM

Mol K2HPO4 = M x V = 100 mM x 100 mL

= 10 mmol
Massa K2HPO4 = 10 mmol x 174,2 g/mol
=1,742 gram

Perbandingan jumlah larutan KH2PO4 dan K2HPO4

[H2 PO4 − ] [H3 O+ ] 10−7

2− = = = 1,62
[HPO4 ] Ka 10−7,21

b. Pembuatan larutan standar 25 mL glukosa 1mg/mL

Massa glukosa = 25 mL x 1 mg/mL = 25 mg = 0,025 gram
c. Pembuatan media NB cair 20mL
Massa pepton = 0,5 x (1 g/100 mL) x 20 mL = 0,1 gram
Massa ekstrak sapi = 0,3% x (1 g/100 mL) x 20 mL = 0,06 gram
Massa NaCl = 0,5 x (1 g/100 mL) x 20 mL = 0,1 gram
 d. Pembuatan media NA padat 50 mL
Massa pepton = 0,5 x (1 g/100 mL) x 50 mL = 0,25 g
Massa ekstrak sapi = 0,3% x (1 g/100 mL) x 50 mL = 0,15 g
Massa NaCl = 0,5 x (1 g/100 mL) x 50 mL = 0,25 g
Massa agar = 2,0 x (1 g/100 mL) x 50 mL = 1,00 g

e. Pembuatanan 200 mL larutan etanol 70%

M1 x V1 = M2 x V2
70% x 200 = 96% x V2
V2 = Vetanol 96% = 146 mL
f. Pembuatan 20 mL larutan EDTA 0,5 M pH 8,0
Massa Na2EDTA.2H2O = 18,6 g x (20 mL / 100 mL) = 3.72 gram
Massa NaOH = 2,00 g x (20 mL / 100 mL) = 0,4 gram

g. Pembuatan 20mL larutan TAE 50x

Massa tris base = 24,2 g x (20 mL / 100 mL) = 4,84 g
Massa Na2EDTA.2H2O = 3,72 g x (20 mL / 100 mL) = 0,744 g
Volume asam asetat glasial = 5,71 mL x (20 mL / 100 mL) = 1,142 mL

V. Pembahasan

Larutan buffer adalah suatu larutan yang mengandung campuran antara asam lemah
dengan basa konjugasinya ataupun basa lemah dengan asam konjugasinya. Larutan buffer
dapat digunakan untuk mempertahankan nilai pH agar stabil ketika penambahan sedikit asam
ataupun sedikit basa.

Pada percobaan ini, dibuat larutan buffer fosfat pada pH 7 dengan menggunakan
larutan dari ion H2PO4- dan HPO42-. Larutan buffer fosfat dapat bekerja sesuai dengan reaksi
(i) ketika ditambahkan asam dan reaksi (ii) ketika ditambahkan sedikit basa. Reaksi yang
terjadi adalah

(i)

(ii)

Larutan buffer diatur pada pH 7,0 karena proses pertumbuhan mikroorganisme pada
umumnya akan optimal pada pH tersebut, yang notabene identik dengan besarnya pH pada
organ manusiasecara umum. Larutan buffer fosfat dalam bidang biokimia sering digunakan
sebagai kultur sel seperti proses pencucian sel sebelum disosiasi, transportasi sel atau
jaringan, melarutkan sel, dan untuk menyimpan reagen.

Larutan lain yang dibuat yaitu larutan glukosa dengan konsentrasi 1 mg/mL. Dalam
eksperimen biokimia, larutan standar glukosa pada umumnya digunakan sebagai sumber
nutrisi untuk sel.

Pada percobaan ini juga dibuat media penumbuhan mikroba yaitu media NA (
Nutrient Agar ) dan NB ( Nutrient Broth). Media tersebut terdiri dari senyawa peptop yang
digunakan sebagai sumber nitrogen organik untuk pertumbuhan organisme, beef extract yang
digunakan sebagai sumber vitamin dan karbohidrat. Sedangkan Garam NaCl merupakan
larutan yang bersifat isotonis sehingga dapat menjaga bentuk sel agar sel tidak mengalami
krenasi atau lisis. Contoh lain dari media pertumbuhan adalah lactose agar, chocolate agar
dan blood agar. Apabila jika dilihat dari fungsinya NB pada umumnya digunakan untuk
memperbanyak sejumlah mikroorganisme apapun secara umum tanpada pengelompokkan
ataupun karakterisasi sedangkan media NA digunakan untuk mengisolasi atau menentukan
karakteristik koloni suatu mikroorganisme tertentu. Kedua media tersebut kemudian
dilakukan sterilisasi dengan teknik autoklaf. Autoklaf merupakan teknik sterilisasi yang
ditujukan untuk membunuh endospore dengan cara pemberian suhu dan tekanan yang tinggi.

Teknik aseptik merupakan teknik yang digunakan sebagai batas antara

mikroorganisme yang akan dikultur dengan lingkungan yang steril sehingga tidak akan
terjadi kontaminasi. Larutan etanol yang dibuat digunakan sebagai kerja aseptik dalam
penumbuhan mikroba. Larutan etanol yang dibuat adalah larutan etanol 70%. Tidak
digunakan etanol 95% dikarenakan etanol dengan persentase yang besar akan sangat mudah
menguap sebelum dapat mensterilkan tempat kerja di laboratorium. Oleh karenanya
digunakan etanol dengan persentase yang rendah sehingga akan mengalami proses penguapan
yang cukup lama. Larutan EDTA dibuat untuk menjadi chelating agent bagi ion-ion logam
yang berbahaya yang dapat merusak mikroorganisme yang akan dikultur. Pada pembuatan
larutan EDTA digunakan garam Na2EDTA.2H2O. Penambahan NaOH berfungsi untuk
mengatur pH larutan , jika pH 8 garam tersebut dapat larut dalam air sedangkan jika di bawah
pH 8 akan sulit untuk larut di dalam air.
 Larutan TAE adalah larutan yang mengandung campuran dari Tris-base, asam asetat
dan EDTA. Tris-base dan asetat digunakan untuk regulasi pH dan konduktivitas elektrik.
Adanya komponen tris-base berfungsi sebagai buffer penjaga pH, asam asetat berfungsi
sebagai elektrolit yang menyuplai ion untuk mendukung konduktivitas dan EDTA digunakan
sebagai ligan yang dapat membentuk komples dengan ion logam sehingga dapat memicu
terjadinya proses nukleasi dan deaktivasi DNA yang dianalisis.

VI. Kesimpulan
Pada percobaan berhasil dibuat larutan 250 mL buffer fosfat 50 mM pH 7,0, larutan
standar 50 mL glukosa 1mg/mL, media NB cair 20 mL, media NA 50 mL, 20 mL larutan
TAE 50x, larutan etanol 70%, dan 20 mL larutan EDTA 0,5 M pH 8.

VII. Daftar Pustaka

Brody, J.R., Kern, S.E. (2004) History and principles of conductive media for standard DNA
electrophoresis. Anal Biochem. 333(1):1-13.
Tris Buffer Function in DNA Extraction. Diakses pada Minggu, 11-Februari-2018 pukul
14.20 WIB dari https://sciencing.com/function-tris-buffer-dna-extraction-6370973.html
Downes F. P. and Ito K., (Ed.), 2001, Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods, 4th Ed., American Public Health Association, Washington, D.C.