Dosage de l’Acétylcholinestérase 

 
  L’acétylcholinestérase  (AChE)  dégrade  l’Acétylcholine  (Ach).  Expérimentalement  on  utilise 
l’Acétylthiocholine (ASCh) comme substrat de cet enzyme, le produit de la réaction est la Thiocholine 
(SCh).  L’activité  de  l’AChE  est  déterminée  suivant  la  méthode  colorimétrique  d’Ellman  et  al.  (1961) 
basée sur la réaction de la Thiocholine avec le DTNB (5, 5’ dithio‐bis (2‐nitrobenzoate) qui donne un 
composé  jaune  (TNB :  S  Thio‐  2‐  N  nitroBenzoate)  qui  absorbe  à  412  nm.  L’absorbance  du  TNB 
mesurée  à  l’aide  du  spectrophotomètre  est  proportionnelle  à  l’activité  enzymatique  de 
l’Acétylcholinestérase. 
 
  ASCh   +  H2O‐‐‐‐‐‐Æ SCh   +   acide acétique 

  SCh      +  DNTB ‐‐‐‐‐Æ  SCh‐TNB   +  TNB 
 
 
¾ mode opératoire : 
Le tableau suivant  résume le mode opératoire de cette étape : 
 

Cuve Blanc (un blanc  Cuve Essai (6 essais  Hydrolyse spontanée (HS) 

Solution (uL) 
pour chaque essai)  pour chaque site)  2 Tubes 

Tampon Tris 
1050  1000  1050 
100mM,pH7,4 

DTNB 0,008M  50  50  50 

S9  50  50  0 

ASCH 0,045mM  0  50  50 

Les cuves sont bouchées et agitées, puis la DO est mesurée à 412nm toutes les 15s durant 2min. 

Calcul de l’activité spécifique de l’AChE : 

L’activité Spécifique (AS)=   ∆DO/min    x    1000 
 
 
ε   x   [Protéines]
∆DO/min   : variation de la densité optique par minute 
[Protéines] : concentration des protéines en mg/ml de S9 

ε : Coefficient d’extinction molaire de la TNB à 412 nm avec  

εTNB= 13.6 * 10‐6 M‐1.cm 
 Dosage des protéines  

¾ Principes de dosages 

    Le  taux  des  protéines  totales  de  S9  est  déterminé  par  la  méthode  de  Lowry  et  al.  (1951). 
Cette technique colorimétrique combine la réaction de biuret avec l’action du réactif mercurique de 
phénol  (Réactif  de  folin‐ciocalteu).  Ceci  permet  de  doser  les  liaisons  peptidiques.  L’intensité  de 
coloration (bleue) est proportionnelle à la quantité de protéines présente dans le milieu. Les mesures 
sont  réalisées  à  650  nm  à  l’aide  d’un  spectrophotomètre  Varian  DMS.  La  concentration  dans 
l’échantillon est déterminée à partir d’une gamme étalon en utilisant SAB (Standard Serum Albumin 
Bovin) comme protéine standard, diluée dans l’eau distillée. 

¾ Réactifs et solutions 

‐ Solution mère SAB 400 µl/ml :  4mg de SAB + 10 ml d’eau distilée 
‐ Solution A : NaOH (0,1)/(Na2CO3) 2% ; 45g de NaOH + 84g Na2CO3 + 1000 ml d’eau distillée. 
‐ Solution B: CuSO4 0, 5% / Tartrate double ; (Na,K)= 1g de CuSO4(5H2O) + 2g de tartrate double + 
1000 ml d’eau distillée. 
‐ Solution C : Folin Ciocalteu ; 50ml de Folin Ciocalteu + 250 ml d’eau distillée. 
 

¾ Mode opératoire : 

Solutions  GAMME ETALON DE SAB  ESSAI 

[SAB]ug/mL  gamme  0  20  40  80  120    ‐ 

étalon  

Solution  SAB  0  125  250  500  750    ‐ 

400ug/mL (uL) 

S9 (uL)  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  50 

H2O (uL)  1000  875  750  500  250    950 

Sol A (uL)  500  500  500  500  500    500 

Sol B  500  500  500  500  500    500 

Vortexer et incuber pendant 20’ en obscurité à T° ambiante

Sol C  500  500  500  500  500    500 

 Vortexer et incuber pendant 30’ en obscurité à T° ambiante

Lire la DO à 650 nm