Diabetes autoimun dan Resistensi terhadap xenograft Transplantasi Toleransi di

Mencit NOD

Costimulation blokade menginduksi tikus islet berkepanjangan dan xenograft kulit

kelangsungan hidup di C57BL / 6 tikus. Obes diabetes (NOD) tikus, yang digunakan
untuk model diabetes autoimun manusia, tahan terhadap costimulation blokade-
diinduksi toleransi allograft. Kami menguji hipotesis bahwa tikus NOD juga akan tahan
terhadap costimulation blokade-diinduksi tikus toleransi xenograft. Kami melaporkan
bahwa tikus pulau xenograft kelangsungan hidup pendek pada tikus NOD spontan
diabetes yang diobati dengan rejimen tolerizing transfusi-donor spesifik dan antibodi
anti-CD154. Tikus pulau xenograft hidup hanya sedikit lebih lama pada tikus NOD kimia
diabetes diobati dengan costimulation blokade tetapi berkepanjangan lebih lanjut dalam
NOD IDD tikus congenic bantalan C57 yang diturunkan kromosom 3 lokus. Timbal balik,
kehadiran NOD diturunkan kromosom 3 lokus pendek pulau xenograft kelangsungan
hidup pada tolerized C57BL / 6 tikus. Islet xenograft bertahan hidup lebih lama di NOD
tolerized CD4a -. / - Dan (NOD × C57BL / 6) tikus F1 dari pada tikus NOD tapi masih jauh
lebih pendek daripada di C57BL / 6 tikus.Kelangsungan hidup xenograft Skin (NOD ×
C57BL / 6) tikus F1 diobati dengan costimulation blokade pendek, menunjukkan
resistensi genetik yang kuat untuk xenograft kulit toleransi induksi. Kami menyimpulkan
bahwa perlawanan dari tikus NOD untuk xenograft toleransi induksi melibatkan beberapa
mekanisme yang juga berpartisipasi dalam ekspresi autoimunitas dan mekanisme lain
yang berbeda.

 DST, transfusi-donor tertentu

 mAb, antibodi monoklonal

 MST, median waktu survival

Mouse NOD adalah model yang sangat baik diabetes tipe manusia 1 ( 1 , 2). Ini
mengembangkan insulitis dan diabetes yang tergantung T-sel, dengan baik + CD4 dan
CD8 + T-sel subset berkontribusi terhadap penyakit ( 1 , 2 ). Selain menghancurkan
target β-sel pankreas ( 3 , 4 ), tikus NOD juga menunjukkan banyak cacat dalam sistem
kekebalan tubuh mereka ( 2 ). CD8 + T-sel mereka telah dilaporkan untuk menjadi
resisten terhadap induksi antigen-induced apoptosis ( 5 ), dan mereka rentan terhadap
penyakit autoimun kambuhan lainnya, termasuk tiroiditis dan sialadenitis ( 2 ).
Kerentanan terhadap diabetes pada manusia dan tikus NOD secara genetik kompleks
( 6 , 7 ). Pada tikus NOD, sebanyak 27 lokus IDD pada 11 kromosom yang berbeda telah
terlibat dalam kerentanan penyakit atau resistensi ( 8 , 9 ). Untuk mempelajari peran
lokus ini pada pengembangan diabetes, peneliti telah menggunakan introgresi congenic
untuk menggantikan lokus pada tikus NOD dengan lokus berasal dari strain tahan
penyakit. Tikus NOD congenic bantalan IDD resistensi lokus pameran berbagai tingkat
perlindungan dari insulitis dan diabetes ( 10 - 13 ).
Kami sebelumnya telah mendokumentasikan bahwa selain autoimunitas, tikus NOD
memiliki resistensi genetik yang melekat untuk allograft toleransi disebabkan oleh
protokol blokade costimulation terdiri dari transfusi-donor tertentu (DST) dan anti-
CD154 antibodi monoklonal (mAb) ( 14 ).Hambatan dari tikus NOD toleransi allograft
kulit bertekad untuk menjadi sifat genetik yang dominan karena juga menjadi ciri khas
(NOD × C57BL / 6) tikus F1 ( 15 ). Sebaliknya, resistensi tikus NOD untuk islet toleransi
allograft disebabkan oleh costimulation blokade adalah sifat genetik resesif yang
tampaknya dikendalikan sebagian oleh lokus pada kromosom 3 ( 16 ).
Karena ketersediaan pulau alogenik untuk transplantasi manusia terbatas, ada
kebutuhan untuk menyelidiki potensi prosedur induksi toleransi untuk memperpanjang
kelangsungan hidup pulau xenograft. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa
pengobatan kimia diabetes C57BL / 6 tikus dengan DST dan anti-CD154 mAb
menyebabkan kelangsungan hidup berkepanjangan tikus islet dan xenografts kulit
( 17 , 18 ) dan kelompok sel islet babi neonatal xenogeneic ( 19 ). Demikian pula, anti-
CD45RB mAb ( 20 ), anti-CD4 mAb ( 21 ), atau penggunaan bersama CTLA4-Fc dan
anti-CD154 mAb ( 22 , 23 ) menyebabkan berkepanjangan pulau xenograft
kelangsungan hidup pada tikus. Toleransi xenograft Islet juga telah dilaporkan pada
monyet yang diberikan anti-CD3 immunotoksin, siklosporin, dan steroid ( 24 ).
Di sini, kami menguji kemanjuran toleransi xenograft protokol induksi kami didasarkan
pada DST dan anti-CD154 mAb di NOD, NOD congenic, KO, dan (NOD × C57BL / 6) tikus
F1. Kami menguji hipotesis bahwa elemen genetik yang berkontribusi terhadap
kerentanan diabetes pada tikus NOD juga berpartisipasi dalam kontrol pulau dan
kelangsungan hidup xenograft kulit yang disebabkan oleh costimulation blokade.
Bagian SebelumnyaBerikutnya Bagian

DESAIN DAN METODE PENELITIAN

C57BL / 6 (H2 b) tikus diperoleh dari National Cancer Institute (Frederick, MD)
atau dari Laboratorium Jackson (Bar Harbor, ME). NOD /
MrkTacfBR(H2 g7), NOD.B6 Idd3/Idd10/Idd18 R323 (g7 H2, baris 1538 di Taconic), dan
NOD.B10 Idd9 (g7 H2, baris 1104 di Taconic) tikus diperoleh dari Taconic Farms
(Germantown, NY). Pasangan pemuliaan dari B6.NOD.C3(H2 b) diperoleh dari Dr Ed
Leiter di Laboratorium Jackson dan dibesarkan di fasilitas kami ( 25 ). NOD CD8a - / -
(g7
H2) tikus (penunjukan resmi: NOD.1029S2 (B6) - Cd8a tm1Mak / Soundsystem). NOD
dan CD4a - / - (g7H2) tikus (sebutan resmi:. NOD.129S2 (B6) - Cd4a tm1Knw / Soundsystem)
diperoleh dari koloni peternakan yang dikelola oleh salah satu penulis (DVS) di
Laboratorium Jackson. Yang terakhir dua saham congenic tikus NOD homozigot untuk
penanda linkage menggambarkan semua yang dikenal IDDlokus dari NOD asal ( 26 -
28 ). NOD CD8a -. / - Tikus (1/17 perempuan diabetes pada usia 30 minggu) ( 15 .) dan
NOD CD4a - / - tikus (0 dari 18 perempuan diabetes pada usia 30 minggu) ( 28 )
keduanya sangat resisten diabetes. Tikus CKA (RT1 l) diperoleh dari Harlan Sprague
Dawley (Indianapolis, IN).

Semua hewan ditempatkan dalam kondisi bebas patogen spesifik di kandang

steril dengan tutup microisolator dan diberikan diautoklaf makanan dan air ad
libitum. Tikus dan tikus yang digunakan dalam studi ini telah disertifikasi untuk menjadi
serologis bebas dari virus Sendai, virus pneumonia tikus, sialodacryoadenitis virus, tikus
corona virus, Kilham tikus virus, H1 (virus Toolan itu), GD7, Reo-3, limfositik virus
choriomeningitis, mouse adenovirus, virus Hantaan, Mycoplasma pulmonis, dan cuniculi
Encephalitozoon. Semua hewan yang dipelihara sesuai dengan rekomendasi dalam
Prinsip Pemerintah AS untuk Pemanfaatan dan Perawatan Hewan Vertebrata digunakan
dalam Pengujian, Penelitian, dan Pelatihan: Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan
Hewan Laboratorium ( 29 ) dan pedoman kelembagaan lokal.

Transplantasi islet pankreas.

Tikus NOD spontan diabetes adalah ~ berumur 4-5 bulan pada saat
okulasi. C57BL / 6, NOD, dan tikus galur resipien congenic pada 8-10 minggu usia yang
diberikan hiperglikemia dengan injeksi intraperitoneal tunggal 150 atau 160 mg / kg
streptozotocin. Glukosa plasma diukur dengan menggunakan analisa glukosa Beckman II
(Beckman, Fullerton, CA). Diagnosis diabetes pada penerima cangkok didirikan oleh
pengamatan plasma glukosa konsentrasi> 250 mg / dl pada setidaknya dua hari yang
berbeda sebelum transplantasi. Pulau pankreas dipanen dari tikus donor oleh kolagenase
pencernaan ( 30 ) dan ditransplantasikan pada dosis 15-20/kg tubuh wt ke ruang
subkapsular ginjal penerima. Donor Islet sudah pensiun peternak tikus jantan
CKA. Cangkok yang dinilai telah ditolak setelah konsentrasi glukosa plasma meningkat
menjadi> 250 mg / dl pada 2 hari berturut-turut setelah minimal 2 hari
normoglycemia. Hanya satu hewan, sebuah (NOD × C57BL / 6) F1 penerima, tidak
pernah menjadi normoglycemic dan dikeluarkan dari analisis sebagai kegagalan
teknis.Tingkat utama nonfunction pulau xenograft antara semua tikus diabetes
ditransplantasikan streptozotocin diinduksi ( Gambar. 1 dan 2 ) adalah 0,7% (1 dari
149). Untuk memastikan fungsi graft pada penerima yang normoglycemic pada akhir
periode pengamatan, nephrectomy sepihak ginjal graft-bantalan dilakukan; cangkok
yang dinilai telah fungsional jika konsentrasi glukosa plasma meningkat menjadi> 250
mg / dl atau, dalam beberapa kasus, dengan dokumentasi histologis graft utuh (lihat di
bawah).
Transplantasi kulit.
Penerima cangkok kulit adalah laki-laki C57BL / 6 dan NOD tikus atau strain tikus
congenic pria atau wanita seperti yang dijelaskan di atas ditransplantasikan pada ~ 10
minggu usia. Spesimen kulit full-thickness untuk transplantasi diperoleh dari 3 - 6-
minggu-tua tikus CKA perempuan.Donor kulit disiapkan dan ditransplantasikan seperti
yang dijelaskan ( 31 ).Survival cangkok kulit dinilai tiga kali seminggu dengan
pemeriksaan visual dan taktil. Waktu penolakan didefinisikan sebagai hari pertama di
mana seluruh permukaan epidermis graft adalah nekrotik.

Pengobatan pulau dan xenograft kulit penerima dengan DST dan anti-CD154
mAb.
Tikus CKA tewas dalam suasana 100% CO 2. Limpa telah dihapus, mekanis
tersebar dalam media steril (RPMI-1640), dicuci, dan dihitung menggunakan
hemositometer. Sel diuji untuk kelayakan menggunakan metode eksklusi biru tripan,
dan dalam semua kasus viabilitas adalah> 90%. Hamster dimurnikan anti-tikus CD154
mAb (clone MR1) diproduksi oleh Sel National Culture Center (Minneapolis, MN) dan
afinitas dimurnikan di laboratorium kami ( 32 ). Konsentrasi mencemari endotoksin
ditentukan secara komersial (Charles River Endosafe, Charleston, SC) dan seragam <10
unit / mg ( 15 ). Anti-CD154 mAb terdilusi menjadi konsentrasi 1 mg / ml dan diberikan
pada dosis 0,25 atau 0,5 mg. Islet dan xenograft kulit penerima menerima baik tidak
ada perawatan, satu rangkaian anti-CD154 mAb, atau terapi kombinasi dengan kedua
reagen seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 17 ). DSTS terdiri dari 10 × 10 6 layak sel
limpa CKA dalam volume 0,20-0,4 ml diberikan melalui vena ekor 7 hari sebelum
okulasi.Program anti-CD154 mAb terdiri dari empat dosis diberikan intraperitoneal dua
kali awal mingguan pada hari injeksi sel limpa.

Histologi.
Ginjal bantalan graft-pulau difiksasi dalam 10% buffer formalin netral.Paraffin-
embedded disiapkan dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin;bagian tambahan yang
bernoda imunohistokimia untuk kehadiran insulin.Seorang ahli patologi yang memenuhi
syarat (Michel C. Appel), yang tidak menyadari status pengobatan donor, dievaluasi
semua spesimen islet graft untuk kehadiran sel-sel inflamasi dan insulin. Karena tidak
ada cangkok kulit selamat tanpa batas waktu, tidak ada yang dipelajari secara histologis.

Statistik.
Durasi rata-rata kelangsungan hidup korupsi disajikan sebagai
median.Perbandingan statistik kelangsungan hidup korupsi antara kelompok-kelompok
dilakukan dengan menggunakan metode Kaplan Meier dan ( 33 );persamaan distribusi
xenograft kelangsungan hidup bagi hewan dalam kelompok perlakuan yang berbeda diuji
dengan menggunakan statistik log-rank ( 34 ). nilai P <0,05 dianggap signifikan secara
statistik.
Bagian SebelumnyaBerikutnya Bagian

HASIL
Tikus pulau xenograft kelangsungan hidup pada tikus NOD
Tikus pulau xenograft kelangsungan hidup pada tikus NOD spontan diabetes.
Kami pertama kali transplantasi CKA tikus pulau ke tikus NOD spontan
diabetes. Seperti yang diharapkan, pada tikus NOD diabetes jika tidak diobati, penolakan
graft adalah cepat; median waktu survival (MST) adalah 8 hari (group 1) ( Tabel
1 ). Demikian pula, pulau xenograft hidup itu pendek pada penerima NOD spontan
diabetes diobati dengan anti-CD154 mAb monoterapi (kelompok 2, MST = 8 hari). Kami
selanjutnya diperlakukan tikus NOD diabetes dengan donor-DST ditambah anti-CD154
mAb, sebuah protokol yang menginduksi berkepanjangan pulau xenograft kelangsungan
hidup pada kimia diabetes C57BL / 6 tikus ( 17 ).Pengobatan dengan DST ditambah anti-
CD154 mAb pada dosis 0,25 mg (kelompok 3, MST = 10 hari) atau 0,5 mg (kelompok 4,
MST = 13 hari) gagal untuk memperpanjang kelangsungan hidup islet korupsi.

Islet xenograft kelangsungan hidup pada tikus NOD kimia diabetes.

Tikus NOD baru-baru ini telah ditunjukkan untuk melawan toleransi
ALLOTRANSPLANTATION berdasarkan costimulation blokade; resistensi ini diamati
berlaku untuk kulit dan allografts pulau kecil dan dapat dipisahkan genetik dari fenotip
autoimunitas ( 14 , 15 ). Untuk mulai membedakan antara mekanisme potensial yang
mendasari pendek pulau xenograft kelangsungan hidup pada tikus NOD diabetes
autoimun, kita selanjutnya ditransplantasikan tikus xenografts pulau ke penerima NOD
kimia diabetes.
CKA tikus islet xenograft kelangsungan hidup, seperti yang diharapkan, pendek di NOD
kimia diabetes jika tidak diobati (MST = 12 hari) dan C57BL / 6 (MST = 10 hari; Gambar
1 C. ) penerima. Pengobatan dengan anti-CD154 mAb monoterapi hidup secara
signifikan berkepanjangan tikus pulau xenograft pada tikus NOD (MST = 22 hari; <0,025
vs kontrol tidak diobatiP) dan ke tingkat yang lebih besar di C57BL / 6 tikus (MST = 32
hari; . Gambar 1 B , P <0.001 vs diobati C57BL / 6 kontrol dan P <0,05 vs diperlakukan
tikus NOD) tikus. Pengobatan dengan baik DST dan anti-CD154 mAb monoterapi lebih
lama tikus pulau xenograft bertahan hidup di kedua NOD (MST = 32 hari, P <0,01) dan
C57BL / 6 (MST = 116 hari; . Gambar 1 A , P <0,001) tikus. Sekali lagi, kelangsungan
hidup korupsi dalam ini C57BL / 6 penerima secara signifikan lebih lama daripada yang
diamati pada tikus NOD sama diobati (P <0,001).

Tikus islet hidup di Idd tikus congenic NOD. IDD tikus congenic.
Untuk menyelidiki dasar genetik untuk kelangsungan hidup miskin xenografts
islet pada tikus NOD berikut costimulation blokade, kami mempelajari IDD tikus NOD
congenic. Kami pertama kali bertanya apakah C57 yang diturunkan IDD lokus diabetes
tahan yang mengurangi frekuensi insulitis dan diabetes pada tikus NOD akan
mengembalikan kerentanan terhadap induksi toleransi xenograft pulau. Dua kelompok
tikus congenic NOD diuji. Yang pertama adalah congenic saham NOD
(NOD. Idd3/10/18)membawa C57BL/6-derived Idd3, Idd10, dan Idd18 resistensi
lokus. Insiden diabetes pada usia 7 bulan di NOD. Idd3/10/18 congenic tikus berkisar 3-
9% ( 10 , 35 , 36 ). Durasi tikus islet xenograft kelangsungan hidup secara signifikan
lebih lama di NOD Idd3/10/18 tikus congenic. (MST = 58 hari; . Gambar 1 A ) diobati
dengan costimulation blokade dari pada tikus NOD sama diobati (P <0,001). Namun,
kelangsungan hidup korupsi pada tikus congenic itu lagi secara signifikan lebih pendek
dari yang dicapai dalam C57BL / 6 tikus (P <0,001). Seperti yang diharapkan, tikus
xenografts pulau dengan cepat ditolak NOD diabetes jika tidak diobati
tikusIdd3/10/18 congenic (MST = 11 hari;. . Gambar 1 C ).
Kami selanjutnya mempelajari NOD saham congenic untuk lokus C57BL/10-
derived Idd9 ( 37 ). Insiden diabetes pada tikus ini hanya 3%. Waktu kelangsungan
hidup rata-rata xenografts tikus islet pada tikus NOD.B10Idd9 diobati dengan DST dan
anti-CD154 mAb hanya 31 hari ( Gambar 1. A) dan secara statistik serupa dengan yang
diamati pada tikus NOD (P = NS). Xenografts tikus pulau, seperti yang diharapkan,
dengan cepat ditolak diabetes tikus NOD.B10 Idd9 jika tidak diobati (MST = 13 hari; .
Gambar 1 C ).

C57BL / 6. IDD tikus congenic.

Tikus islet xenograft kelangsungan hidup berkepanjangan pada tikus NOD
bantalan segmen kromosom 3 yang berasal dari tikus diabetes C57BL/10-tahan. Untuk
mengkonfirmasi kontribusi lokus pada kromosom 3 sampai berkepanjangan pulau
xenograft bertahan hidup, kita selanjutnya mempelajari tikus C57BL/6.NOD.C3. Tikus-
tikus ini membawa diabetes rentan NOD diturunkan Idd3, Idd17, Idd10, dan Idd18 alel
pada kromosom 3 ( 25 ). Waktu kelangsungan hidup rata-rata xenografts tikus islet
pada tikus C57BL/6.NOD.C3 diobati dengan DST dan anti-CD154 mAb adalah 63 hari
( Gambar. 2 A ). Ini secara signifikan lebih pendek dari yang dicapai dalam sama
diperlakukan diabetes C57BL / 6 (MST> 168 hari, . Gambar 2 A, P <0,001). Seperti yang
diharapkan, xenograft pulau kelangsungan hidup singkat pada tikus C57BL/6.NOD.C3
diabetes jika tidak diobati (MST = 9 hari; . Gambar 2 B ). Data ini mendukung temuan
kami dari peran penting dari interval congenic pada kromosom 3 dalam pengendalian
induksi toleransi terhadap tikus xenografts islet pada tikus NOD.

Mekanisme seluler yang mendasari resistensi NOD untuk tikus kelangsungan

hidup xenograft pada tikus NOD berikut costimulation blokade
Islet xenograft kelangsungan hidup dalam NOD CD4a -. / -Tikus.
Kelangsungan hidup xenografts tikus di C57BL / 6 tikus yang diobati dengan DST
dan anti-CD154 mAb dapat lebih diperpanjang oleh pengobatan bersamaan dengan
habisnya anti-CD4 mAb ( 18 ). Kami selanjutnya hipotesis bahwa penghapusan genetik
dari CD4 + T-sel akan memfasilitasi pulau xenograft kelangsungan hidup pada penerima
NOD. . Islet xenograft kelangsungan hidup dalam NOD CD4a - / - tikus yang diobati
dengan DST dan anti-CD154 mAb secara signifikan lebih lama (MST = 73 hari)
dibandingkan sama diperlakukan tikus wild type NOD ( Gambar
2 A. ; P<0,01). Xenograft kelangsungan hidup pulau kecil di NOD dinyatakan tidak
diobati CD4a - / - tikus (MST = 32 hari;. . Gambar 2 B ) juga lebih lama dari pada
penerima NOD tidak diobati (P <0,025).

Islet xenograft kelangsungan hidup dalam NOD CD8a -. / - Tikus.

Kelangsungan hidup allograft pada tikus yang diobati dengan costimulation
blokade sebagian bergantung pada penghapusan CD8 + T-sel ( 38 - 42 ), dan CD8 + T-sel
pada tikus NOD dilaporkan menolak induksi toleransi perifer ( 5 ). Untuk menentukan
apakah perlawanan dari tikus NOD untuk xenograft toleransi berdasarkan costimulation
blokade melibatkan kegagalan untuk menghapus CD8 + T-sel, kita selanjutnya
mempelajari NOD CD8a -. / - Tikus. Tikus pulau xenograft kelangsungan hidup dalam
NOD CD8a - / - tikus yang diobati dengan DST ditambah anti-CD154 mAb. (MST = 49; .
Gambar 2 A ) tidak berbeda secara signifikan dibandingkan yang dicapai pada tikus NOD
sama diobati (P = NS).

Islet xenograft kelangsungan hidup pada (NOD × C57BL / 6) tikus F1.

Data ini menunjukkan bahwa ketahanan terhadap toleransi xenograft tikus islet
sebagian diatasi dalam NOD tikus congenic yang menanggung spesifik
perlawanan IDD lokus pada kromosom 3 atau kurangnya CD4 + T-sel.Namun, kehadiran
kelompok ini Idd resistensi lokus tidak memperpanjang kelangsungan hidup xenograft
pulau sejauh yang dapat dicapai di C57BL / 6 tikus. NOD Kebanyakan IDD lokus
kerentanan yang resesif ( 7 ). (NOD × C57BL / 6) tikus F1 heterozigot sama
sekali IDD lokus dan dengan demikian menanggung sejumlah besar C57BL/6-derived
alel resistensi diabetes.(NOD × C57BL / 6) tikus F1 benar-benar terlindungi dari diabetes
autoimun ( 43 ), tapi mengejutkan mereka tetap tahan terhadap induksi toleransi
allograft kulit dengan costimulation blokade ( 15 ). Untuk menentukan apakah mereka
sama akan menolak xenograft toleransi induksi, kimia diabetes (NOD × C57BL / 6) tikus
F1 diobati dengan DST dan anti-CD154 mAb dan ditransplantasikan dengan pulau
tikus. Durasi rata-rata kelangsungan hidup korupsi adalah 83 hari ( Gambar. 2 A ), hasil
signifikan lebih unggul dari yang dicapai dalam NOD (P <0,001) tikus tetapi lebih rendah
daripada yang dicapai dalam C57BL / 6 (P <0,001) tikus.

Tikus kulit xenograft kelangsungan hidup pada (NOD × C57BL / 6) tikus F1.
Perlawanan dominan allograft toleransi induksi pada (NOD × C57BL / 6) tikus F1
didokumentasikan dalam studi menggunakan kulit tidak islet cangkok ( 15 ). Oleh
karena itu kami menguji hipotesis bahwa xenograft kulit survival (NOD × C57BL / 6)
tikus F1 diobati dengan DST dan anti-CD154 mAb akan pendek.
Seperti yang diharapkan, xenografts kulit tikus dengan cepat ditolak oleh diobati C57BL
/ 6 (MST = 7 hari), NOD (MST = 10 hari), dan (NOD × C57BL / 6) F1 (MST = 7
hari, 3 B Gambar. ) tikus . Sekali lagi, seperti yang diharapkan, tikus xenograft kulit
kelangsungan hidup berkepanjangan di C57BL / 6 tikus yang diobati dengan DST
ditambah anti-CD154 mAb (MST = 59 hari; . Gambar 3 A ). Durasi xenograft kulit
kelangsungan hidup pada sama diperlakukan (NOD × C57BL / 6) tikus F1 secara
signifikan lebih pendek (MST = 18 hari, P <0,001) dan secara statistik serupa dengan
yang diamati pada tikus NOD sama diperlakukan (MST = 14 hari; . Gambar 3 A , P =
NS).

Tikus xenograft kulit kelangsungan hidup dalam NOD CD4a -. / - Dan NOD CD8a -.
/-
Tikus.
Kami selanjutnya menyelidiki peran dari CD4 + dan CD8 + sel dalam kelangsungan
hidup xenografts kulit tikus pada tikus NOD diobati dengan costimulation
blokade. Kelangsungan hidup xenograft kulit di NOD CD4a -. / - Tikus yang diobati dengan
DST dan anti-CD154 mAb (MST = 51 hari) adalah sedikit lebih pendek daripada yang
diamati dalam C57BL / 6 tikus (P<0,05), tetapi jauh lebih lama daripada yang diamati
pada tikus NOD (P<0,001; . Gambar 3 A ). . Sebaliknya, kelangsungan hidup xenograft
kulit NOD CD8a - / - tikus secara signifikan lebih pendek (MST = 18 hari) daripada yang
diamati dalam C57BL / 6 tikus (P <0,001; Gambar 3 A. ) dan statistik serupa dengan
yang diamati pada tikus NOD (P = NS). Kulit xenograft kelangsungan hidup dalam NOD
diobati CD4a - / - (MST = 11 hari) dan NOD CD8a - / - (MST = 18 hari;.. Gambar 3 B. )
tikus pendek.
Bagian SebelumnyaBerikutnya Bagian

PEMBAHASAN
Dokumen Data ini bahwa costimulation blokade tidak efektif dalam
memperpanjang kelangsungan hidup xenograft pulau pada tikus NOD. Hal ini berlaku
dari kedua tikus NOD spontan diabetes dan tikus NOD dengan induksi kimia
hiperglikemia. Untuk menentukan apakah ketidakefektifan costimulation blokade adalah
karena autoimunitas berulang atau ketahanan umum dari tikus NOD induksi toleransi
( 14 , 15 , 44 ), kami menggunakan tikus NOD congenic dan (NOD × C57BL / 6) tikus
F1. Data kami menunjukkan bahwa toleransi pulau xenograft induksi diatur sebagian
olehIdd lokus pada kromosom 3 dan melibatkan CD4 + T-sel. Kami mengamati bahwa
pulau xenograft kelangsungan hidup berkepanjangan di (NOD × C57BL / 6) tikus F1
tetapi tetap jauh lebih pendek daripada yang diamati dalam C57BL / 6 tikus. Observasi
ini tak terduga mengingat fakta bahwa kelangsungan hidup pulau allograft pada tikus
normal membutuhkan kehadiran CD4 + T-sel ( 31 ) dan permanen (NOD × C57BL / 6)
tikus F1 diobati dengan costimulation blokade ( 16 ). Data ini dalam dokumen Model
xenograft bahwa perbedaan penting ada dalam mekanisme yang mengontrol resistensi
tikus NOD induksi allograft dibandingkan toleransi xenograft.
Berbeda dengan kelangsungan hidup allografts pulau kecil di (NOD × C57BL / 6)
tikus F1 diobati dengan costimulation blokade ( 16 ), yang permanen, pulau xenograft
kelangsungan hidup hewan-hewan ini yang berkepanjangan tetapi tidak permanen. Hasil
ini menunjukkan bahwa berbeda dengan islet induksi toleransi allograft ( 15 ),
ketahanan terhadap islet xenograft toleransi induksi pada tikus NOD adalah sifat genetik
yang dominan. Ketika diterapkan pada kulit xenografts, costimulation blokade tidak
efektif dalam memperpanjang kelangsungan hidup korupsi baik NOD atau (NOD ×
C57BL / 6) tikus F1. Hasil ini menunjukkan bahwa, seperti halnya perlawanan mereka
terhadap kulit allograft toleransi induksi ( 15 ), ketahanan terhadap kulit xenograft
toleransi induksi pada tikus NOD juga merupakan sifat genetik yang dominan.
Dokumen Data kami yang islet xenograft kelangsungan hidup pada tikus NOD diabetes
autoimun diobati dengan costimulation blokade pendek. Hal ini dapat mengakibatkan
baik dari kekambuhan autoimun atau ketahanan umum dari tikus NOD untuk
xenotolerance induksi oleh costimulation blokade. Kami sebelumnya telah menunjukkan
bahwa dalam kimia diabetes NOD tikus congenic dan (NOD × C57BL / 6) tikus F1,
fenotip diabetes autoimun dan toleransi transplantasi tidak berada di bawah kontrol
genetik benar-benar tumpang tindih ( 14 - 16 , 45 ). Dalam studi, kami mengamati tidak
ada hubungan dari Idd lokus dengan induksi toleransi allograft kulit (14 ), dan, yang
mengejutkan, kami menemukan bahwa allograft kulit kelangsungan hidup singkat
bahkan dalam (NOD × C57BL / 6) tikus F1 ( 15). Namun, ketika allografts islet diuji,
kelangsungan hidup allograft permanen diamati pada (NOD × C57BL / 6) tikus F1
( 16 ). Penelitian yang lebih lanjut mencatat bahwa Idd lokus pada kromosom 3 adalah,
setidaknya sebagian, yang bertanggung jawab untuk pengaturan pulau allograft survival
pada tikus NOD diobati dengan costimulation blokade ( 16).
Untuk menentukan apakah kontrol IDD lokus tikus pulau xenograft kelangsungan
hidup pada tikus NOD kimia diabetes diobati dengan costimulation blokade, kami
menguji tiga strain congenic. Dalam NOD.B6Idd3/10/18 tikus congenic, frekuensi
kumulatif diabetes pada usia 7 bulan adalah 3-9% ( 35 , 36 ), namun tikus congenic
dipamerkan xenograft hidup hanya sedikit lama dibandingkan dengan tikus NOD. Lebih
mencolok, tikus NOD.B10 Idd9, di mana frekuensi kumulatif diabetes pada usia 7 bulan
hanya 3% ( 37 ), tidak menunjukkan berkepanjangan pulau xenograft survival
dibandingkan dengan tikus NOD. Data ini menunjukkan bahwa kontrol genetik
autoimunitas dan toleransi terhadap xenografts pulau yang sebagian berbeda.
Untuk mengkonfirmasi pentingnya kromosom 3 lokus sebagai penentu pulau
xenograft bertahan hidup, yang tidak dapat diasumsikan a priori, kita diuji
C57BL/6.NOD.c3 tikus congenic. Tikus-tikus ini menanggung segmen besar NOD
kromosom 3 yang meliputi Idd3, Idd17, Idd10, dan Idd18 ( 25 ). Dari khususnya
bunga Idd3, yang telah dipersempit ke interval kecil berisi delapan gen. Tiga gen
ini, IL2, IL21, dan Fgf2, telah diketahui fungsi yang dapat berkontribusi pada
pembentukan toleransi imunologi ( 46 dan LSW, LBP, pengamatan tidak
diterbitkan). Karena Idd3 telah terbukti menjadi penting dalam induksi toleransi allograft
islet oleh costimulation blokade (16 ), kami sedang menyelidiki apakah gen dalam
wilayah Idd3 bertanggung jawab atas efek kromosom 3 pada toleransi xenograft pulau
induksi.
Hasil studi kami menggunakan tikus congenic mendokumentasikan bahwa
pengurangan genetik autoimunitas pada tikus NOD tidak selalu menyebabkan
berkepanjangan pulau xenograft kelangsungan hidup setelah costimulation
blokade. Bahkan lebih mengejutkan adalah penemuan kami yang islet xenograft
kelangsungan hidup pada (NOD × C57BL / 6) tikus F1 diobati dengan costimulatory
blokade, meskipun relatif lama dengan yang diamati pada tikus NOD, jauh lebih pendek
dari yang dicapai di C57BL / 6 tikus. Dalam (NOD × C57BL / 6) tikus F1 diobati dengan
DST dan anti-CD154 mAb, pulau allograft adalah permanen ( 16 ). Secara keseluruhan
mereka, data ini menyiratkan bahwa beberapa gen harus mengontrol pulau xenograft
kelangsungan hidup pada tikus diperlakukan dengan costimulation blokade. Data lebih
lanjut menunjukkan bahwa mekanisme genetik yang mengontrol pulau allograft dan
xenograft survival hanya sebagian tumpang tindih. Penafsiran ini didukung oleh analisis
kita tentang subset sel islet penting dalam kelangsungan hidup xenograft. NOD CD4a -. / -
Tikus yang diobati dengan costimulation blokade pameran berkepanjangan pulau
xenograft kelangsungan hidup sedangkan pengobatan anti-CD4 mAb benar-benar
membatalkan islet allograft survival, bahkan pada tikus normal ( 47 ).
Toleransi allograft kulit, bagaimanapun, tampaknya dikendalikan oleh mekanisme
yang berbeda dari orang-orang penting untuk toleransi islet allograft. Dalam model
sistem CD40 knockout lengkap, allograft survival islet yang berkepanjangan sedangkan
allograft kulit hidup itu pendek ( 48). Baru-baru ini, kami telah menemukan bahwa
penipisan CD25 + sel kulit lebih pendek allograft survival sedangkan memiliki efek
minimal pada islet allograft survival ( 47 ). Kami berspekulasi bahwa allograft kulit hidup
lebih tergantung pada kehadiran T-sel peraturan daripada kelangsungan hidup allograft
pulau, hipotesis ini sedang diselidiki.
Berdasarkan pengalaman yang diterbitkan dengan allografts, itu tidak
mengherankan bahwa kelangsungan hidup xenograft kulit pada tikus NOD diobati
dengan costimulation blokade tampaknya dikendalikan setidaknya sebagian oleh
mekanisme yang berbeda dari orang-orang yang mengendalikan hidup xenograft
pulau. Pertama, kami mengamati bahwa durasi pulau xenograft bertahan hidup agak
lama di NOD dinyatakan tidak diobati CD4a -. / - Tikus, sedangkan xenografts kulit segera
ditolak. Kedua, kami mengamati durasi pulau xenograft kelangsungan hidup pada (NOD
× C57BL / 6) tikus F1 relatif lama, sedangkan xenograft kulit kelangsungan hidup sangat
pendek. Data ini menunjukkan bahwa kulit dan pulau xenograft hidup dikendalikan oleh
mekanisme seluler yang berbeda dan bahwa perlawanan terhadap xenograft kulit
toleransi induksi adalah sifat dominan pada tikus NOD.
Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa beberapa cacat NOD seperti yang
dikoreksi dalam (NOD × C57BL / 6) tikus F1, sedangkan yang lain secara genetik cacat
seluler dominan ( 15 ). Misalnya, cacat NOD seperti dalam fungsi sel pembunuh alami
dan pengembangan makrofag dikoreksi dalam (NOD × C57BL / 6) tikus F1, sedangkan
kelainan NOD seperti dalam pematangan sel dendritik secara genetik dominan. Yang
menarik adalah pengamatan bahwa sel-sel pembunuh alami tampak normal di (NOD ×
C57BL / 6) tikus F1. Sel NK memiliki peran penting dalam xenograft penolakan ( 49 -
51 ), dan meskipun cacat pada tikus NOD ( 2 ), cacat ini tampaknya tidak menjadi
penyebab ketahanannya terhadap xenograft toleransi induksi. Ini masih harus
ditentukan jika cacat seluler lain, seperti pematangan abnormal sel-sel dendritik,
berkontribusi terhadap resistensi relatif (NOD × C57BL / 6) tikus F1 untuk xenograft
toleransi induksi.
Singkatnya, tikus NOD tahan untuk tidak hanya allograft ( 14 , 15 ), tetapi juga
xenograft toleransi induksi. Resistensi ini sebagian besar tergantung dari tingkat
perlindungan dari diabetes yang diberikan oleh Idd resistensi lokus. Data menyoroti
perbedaan genetik dikendalikan antara kulit dan pulau toleransi xenograft disebabkan
oleh costimulation blokade, dan mereka memberikan dukungan ke "ambang genetik"
hipotesis untuk ketahanan tikus NOD toleransi transplantasi.

Gambar. 1.
Tikus delapan minggu berusia berbagai strain (ditunjukkan dalam gambar) dari kedua
jenis kelamin disuntik dengan streptozotocin untuk menginduksi diabetes seperti yang
dijelaskan dalam DESAIN PENELITIAN DAN METODE. Semua tikus menerima xenograft CKA
tikus islet A:.Tikus menerima transfusi tunggal yang terdiri dari 1 × 10 7 CKA sel tikus
limpa intravena pada hari ke 7 dan empat suntikan intraperitoneal 0,25 mg anti-CD154
mAb seperti yang ditunjukkan pada hari-hari -7, -4 ., 0, dan 4 relatif terhadap
transplantasi islet pada hari 0 B: Tikus menerima anti-CD154 mAb pada jadwal yang
sama tetapi tidak ada DST C:. Tikus yang diterima hanya pulau xenograft A:. * P<0.001
vs semua kelompok lain dan . ** P <0,001 NOD vs B: * P <0,05 vs NOD. Tidak ada
perbandingan berpasangan lainnya yang signifikan.Vertikal bar kecil menunjukkan data
yang disensor, yaitu tikus yang ditemukan mati atau telah dihapus dari studi untuk
analisis lainnya.

Lihat versi yang lebih besar:

 Dalam jendela ini
 Di jendela baru
 Unduh sebagai Slide PowerPoint

Gambar. 2.
Tikus delapan minggu berusia berbagai strain (ditunjukkan dalam gambar) dari kedua
jenis kelamin disuntik dengan streptozotocin untuk menginduksi diabetes seperti yang
dijelaskan dalam DESAIN PENELITIAN DAN METODE. Semua tikus menerima CKA tikus islet
xenograft A:.Tikus menerima CKA tikus DST tunggal yang terdiri dari 1 × 10 7sel limpa
intravena pada hari ke 7 dan empat suntikan 0,5 anti-CD154 MAb intraperitoneal seperti
yang ditunjukkan pada hari -7, -4, . 0, dan 4 B: Tikus hanya menerima xenograft
islet A: * P <0,05 vs NODCD4a - / - dan ** P <0,0025 vs semua kelompok
lain B:... * P <0.0025 vs NOD. Tidak ada perbandingan berpasangan lainnya yang
signifikan.Vertikal bar kecil menunjukkan data yang disensor, yaitu tikus yang
ditemukan mati atau telah dihapus dari studi untuk analisis lainnya.

Lihat versi yang lebih besar:

 Dalam jendela ini
 Di jendela baru
 Unduh sebagai Slide PowerPoint

Gambar. 3.
Tikus delapan minggu berusia berbagai strain (ditunjukkan dalam gambar) dari kedua
jenis kelamin secara acak dan diberi CKA tikus xenograft kulit A:.Tikus menerima CKA
tikus DST tunggal yang terdiri dari 1 × 10 7sel limpa intravena pada hari ke 7 dan empat
suntikan 0,5 anti-CD154 mAb intraperitoneal pada hari -7, -4, 0, dan 4 B:. Tikus hanya
menerima xenograft kulitA:. * P <0.001 vs semua kelompok lain dan ** P <0.001 vs
NOD. Tidak ada perbandingan berpasangan lainnya yang signifikan. Vertikal bar kecil
menunjukkan data yang disensor, yaitu tikus yang ditemukan mati atau telah dihapus
dari studi untuk analisis lainnya.

Lihat tabel ini:

 Dalam jendela ini
 Di jendela baru

TABEL 1
Durasi tikus islet xenograft kelangsungan hidup pada tikus diabetes spontan
mengangguk