ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA 2017-1 INHIBICION DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA OBJETIVO: Que el alumno aprecie Ia actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reaccién colorimétrica, INTRODUCCION: Para que exista una reaccién redox, en el sistema debe haber un elemento que ceda electrones y otro que los acepte: ¥ El agente reductor: Es aquel elemento quimico que suministra electrones de su estructura quimica al medio, aumentando su estado de oxidacién, es decir, oxidandose. ¥ El agente oxidante: Es el elemento quimico que tiende a captar esos electrones, quedando con un estado de oxidacién inferior al que tenfa, es decir, reducido. Cuando un elemento quimico reductor cede electrones al medio se convierte en un elemento oxidado, y la relacién que guarda con su precursor queda establecida mediante lo que se llama un par redox. Andlogamente, se dice que cuando un elemento quimico capta electrones del medio se convierte en un elemento reducido, e igualmente forma un par redox con su precursor reducido. Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones desde una molécula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente oxidante) (Jenner Us Martin, 2014). Segtin Gonzélez nos dice que las enzimas oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreduccién, es decir, transferencia de hidrégeno (H) 0 electrones (e-) de un sustrato a otro, seguin la reaccién general: Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo oxidasa. AH) +B G==A+BH) Areé + Bos S== Aox ~ Breg La succinato deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocéndria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidacién asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros acidos dicarboxilicos como el malonato, malato, oxalacético y oxalico, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulacién de ‘succinato. La succinato deshidrogenasa es una enzima que sélo se encuentra en mitocondrias, y por lo tanto la medicién de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en una fraccién subcelular. Esto se puede realizar utilizando un aceptor artificial de electrones que tenga mayor afinidad por los electrones que el FAD. En el practico utiiizaremos 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto cambia el color segun suESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA 2017-1 estado de oxidaci6n: es azul cuando se encuentra en estado oxidado e incoloro cuando esta reducido. = " HS succinato ene CN NAD < ae pdtes _ cone =¢ as ener wei, erwin, Ms r “; dlaro) 2.6-diclorofenclindotendl 44 pefenilendiamina , {incoloro) {marrén oscuro) La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del acido succinico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidacién del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna. El He cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa, CPP ox. DCPIP red, (azul) (rcoloro) La oxidacién de succinato a fumarato esta involucrada en la reaccién 6 del ciclo de Krebs; el succinato formado a partir del succinil-CoA es oxidado a fumarato por la flavoproteina succinato deshidrogenasaMm. we ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA 2017-1 En eucariotas, la enzima succinato deshidrogenasa se encuentra unida fuertemente a la membrana mitocondrial interna, en procariotas se encuentra en {a membrana plasmatica, MATERIALES Y REACTIVOS MATERIAL 04 tubos de ensayo 01 pipeta de 2 mL 02 pipeta de 1 mL 01 pipeta de 10 mL. 01 gradilla REACTIVOS: ¥ Solucién amortiguadora de fosfato monobasico de sodio 0.1 M de pH = 7.4: Irritacién y enrojecimiento de la piel por un contacto prolongado. Irritacién y ardor en los ojos. ¥ Solucién de 2,6 diclorofenolindofenol al 0.02 % en agua: Sustancia no peligrosa ¥ Solucién de malonato de sodio 0.1 M: No se descartan otras caracteristicas peligrosas. Observar las precauciones habituales en el manejo de productos quimicos. ¥ Solucién de succinato de sodio 0.2 M: Téxico y Reactivo. Irritante y Combustible, Y Solucién de cianuro de sodio 0.1 M: El polvo o neblina (solucién) puede ser irritante a las vias respiratorias y garganta. Y Acetona Y Higado fresco PROCEDIMIENTO Preparacién del homogenizado hepatico Y Se corta una porcién de higados frescos en trozos pequefios y se homogeniza en una licuadora con 100 ml de gua. Y Luego tomar 40 mL del homogenizado y se diluye hasta 200 mL con agua destilada Y Se agita la mezcla vigorosamente y la preparacién resultante se emplea en las siguientes pruebas. ‘A continuacién se dispone de 5 tubos de ensayo y se les adiciona el reactivo de acuerdo a latabla 1 Tabla 4. Inhibicién enzimatica de la succinato deshidrogenasa Tubos Tb) [2(mL) [3(ml) [4b] SO 15 ‘Solucién amortiguadora de fosfato monobasico de | 1, 12 7,0 0s O38 sodio 0.1 M de pH = 7.4 Soluci6n de 2,6 diclorofenolindofenol al 0.02 % 1,0 1,0 oh) 1,0 10) Solucién de succinato de sodio 0.1M/ 0,5 4 02 0.0 0.2 0.2 OF ‘Solucién de malonato de sodio 0.1 M 0.0 0.0 0,0 05 Oz Homogenizado hepatico 20% 0,0 0.5) 05) 0.5) 05 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar y anotar los resultados segtin el color de cada uno de los tubos.