ÚLTIMO TRABALHO DE BIOMOL

Pesquise qual o método/técnica mais eficiente de extração de DNA das matrizes:

a) Fio de cabelo;

Os bulbos capilares apresentam-se como excelentes fontes de DNA para PCR. À medida que a
quantidade de bulbos diminúi, métodos mais refinados de extração de DNA são necessários.

DIGESTÃO POR PROTEINASE K, SEGUIDA POR FENOL E CLOROFÓRMIO:

Após os pré-tratamentos das amostras, feitos em tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL, são acrescidos
98 mL de tampão de digestão por proteinase K e 2 mL de proteinase K a 20 mg/mL, perfazendo um total
de 100 mL de tampão de digestão. A mistura, então é incubada em banho-maria a 56 ºC, por três horas. A
inativação da proteinase K, acontece por fervura em banho-maria, a 100 ºC, por 8 minutos. A precipitação
do DNA é feita com 1 V de fenol (5 minutos, à temperatura ambiente, agitando) e 1 V de álcool isoamílico:
clorofórmio (1:24) (mais 5 minutos à temperatura ambiente, agitando), seguida por centrifugação, por 5
minutos a 10.000 rpm, em microcentrifuga; a fase aquosa era transferida para novos tubos, onde eram
adicionados 1/10 V de acetato de sódio a 3 M e mais 2 V de etanol 100%. Para precipitação do DNA, as
amostras são deixadas de 2 horas a toda noite, na temperatura de – 20 ºC. Segue-se nova centrifugação,
a 14.000 rpm, por 10 minutos, descarte do sobrenadante, e secagem do DNA à temperatura ambiente, ou
com a utilização de um Speedvac. O DNA é, então, diluído em 50 mL de água estéril, estando pronto para
passar pelos testes de espectrofotometria e PCR.

b) Saliva;

FERVURA EM RESINA QUELANTE (INSTAGENE MATRIX):

A resina InstaGene Matrix (Bio Rad), já vem diluída, pronta para uso. Para utilizá-la, devem ser
seguidos os seguintes passos: Nas amostras pré-tratadas dentro de tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL, são
colocados 20 mL de água estéril, e após, 200 mL de InstaGene, não deixando de agitar o frasco da resina,
durante a pipetagem. Após vórtex e centrifugação rápida, a incubação é feita em banho-maria a 56ºC, por
20 a 30 minutos. Seguindo a ação da resina, novos vórtex e centrigugação são realizados, para após,
inativar a resina através de fervura em banho-maria, por 8 minutos. Vórtex por 10 segundos,
centrifugação a 10.000 rpm, por 3 minutos e 40 mL do sobrenadante são utilizados como template para
as PCRs.

c) Tecido emblocado em parafina;

DIGESTÃO POR PROTEINASE K (SEGUIDA POR SALTING-OUT):

Após os pré-tratamentos devidos, são acrescentados 790 mL do tampão, mais 10 mL de

proteinase K a 10 mg/mL. A incubação é feita em banho-maria a 55ºC, por toda noite. Os restos celulares
são decantados, após centrifugação a 12.000 rpm, por 10 minutos. O sobrenadante é transferido para
novos tubos tipo Eppendorf, e 400 mL de cloreto de lítio a 7,5 M são acrescentados. A mistura é colocada
em congelador, por 30 minutos, para garantir a precipitação da 46 proteinase K. Nova centrifugação a
14.000 rpm, por 15 minutos, e o sobrenadante é colocado em tubo de hemólise estéril, identificado.
Nesse tubo, são colocados 2 mL de álcool etílico absoluto, e deixados a – 20ºC de duas a 24 horas. A
centrifugação subseqüente é a 2.000 rpm, por 15 minutos, e o sobrenadante desprezado, deixando-se
aproximadamente, 200 mL no tubo, para ressuspensão do DNA e sua transferência para tubo tipo
Eppendorf de 1,5 mL. Um mililitro de álcool etílico a 70% é acrescentado, nova centrifugação a 10.000
rpm, por 5 minutos, e o DNA está pronto para secar à temperatura ambiente e ser diluído em 50 a 100 mL
de água estéril, para ser encaminhado aos testes

Explique o princípio de cada método;

Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de
maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais: a lise das células presentes
na amostra e a purificação do DNA. Após a lise das células, o DNA deve ser separado dos restos celulares
e das proteínas (A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album; É capaz de digerir a
queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”. Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e
RNA), precipitado e suspenso em volume adequado de água ultrapura ou soluções-tampão adequadas.
As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de
purificação, com a finalidade de se obter melhores resultados nas amplificações.
O fenol tamponado provoca a desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio
também é usado como agente desnaturante das proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de
clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba
das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos.
O álcool isoamílico previne a formação de espuma quando a mistura é agitada, o que torna mais
fácil a separação da fase orgânica e da fase aquosa. A proteína que foi desnaturada pelo tratamento com
fenol e clorofórmio forma uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantém
na fase aquosa. Para extrair o DNA de uma amostra, usar igual volume de solução de fenol, de
clorofórmio e de álcool isoamílico (25:24:1). A extração com o fenol é dependente do pH. O fenol
empregado nas extrações de DNA deve ter o pH próximo de 8,0 (fenol tamponado), já que faixas mais
baixas de pH deslocam o DNA para a interface na hora da centrifugação. Em pH 7,0 ou acima, o DNA
permanece na fase aquosa e em pH abaixo de 7,0, ele é desnaturado e migra para a fase orgânica.