LAPORAN PRAKTIKUM

LABORATORIUM BIOLOGI MOLEKULER

Hari/Tanggal : Senin/24 Oktober 2016

Nama/NIM : Komang Nicko Juliasa/1670121015
Pukul : 10.30-11.30

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Agar mahasiswa/mahasiswi dapat:
1. Melakukan isolasi DNA dari darah
2. Memahami prinsip dasar PCR dan Elektroforesis Agarose
3. Menggunakan alat elektroforesis dengan benar untuk membaca nilai base
pair fragment DNA
4. Mengolah data yang diperoleh dari praktikum untuk memperoleh base pair
fragment DNA
5. Mengumpulkan data dari hasil praktikum.

B. ALAT DAN BAHAN

Bahan dan reagen :
-RNA isolation kit
-Carrier RNA
-Superscript III RT
-Taq Dna Polymerase
-dNTP
-Buffer
-MgCl2
-Serbuk agarose
-100 bp DNA leader
-loading dye
-RNAse Out ribonuclease inhibitor
-5x first standard buffer
-DTT
-Etanol absolute
-Syber safe stain
-Ultrapure distiled water
-Ultrapure DNAse/RNAse-free
-Buffer Tris Boric EDTA(TBE) 1x
Bahan habis pakai:
-PCR tube 0.2 μL
-Microtube 1.5 mL
-White tips
-Yellow tips
-Blue tips
-Falcon tube 15mL
-Gloves
-Masker
-Tissue
-Jas Lab
Peralatan:
-Pipettor satu set
-Biosafety cabinet class 2A
-PCR cabinet / laminar air flow cabinet
-Meja PCR
-Vortex
-Rak tabung PCR
-Rak tabung PCR berpendingin
-Mesin PCR
-Freezer -20°C
-Freezer -40°C
 -Microsentrifugasi
-Apparatus elektriforesis dan power supply
-System gel dokumentasi

C. CARA KERJA
ProtoKol 1 :
Ekstraksi RNA virus dengue dari sampel serum menggunakan QIAamp Vira Mini
Kit
Ekstraksi RNA dikerjakan dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1. Tabung diberi label dank ode sampel kemudian sebanyak 560 Ul Buffer AVL
dimasukkan kedalam tabung mikro 1,5 mL kemudian 5,6 µLCarrier RNA
diatmbahkan dan homogenkan,
2. Sebanyak 140 µL serum dimasukkan kemudian vortex selama 15 detik dan
inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang,
3. Sentrifugasi beberapa detik, sebanyak 500 µL ethanol (96-100%) ditambahkan
kemudian vortex selama 15 detik, lalu sentrifugasi beberapa detik,
4. Sebanyak 630 µL solution masukkan kedalam QIAamp Mini spin column
kemudian sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, tabung
collection yang berada di bawah QIAamp Mini spin column terdapat filtrate
dibuang dang anti dengan tabung collection yang baru,
5. Ulangi prosedur diatas sebanyak 630 µL sisa solution kemudian masukkan
kedalam QIAamp Mini spin column, sentrifgasi pada kecepatan 8.000 rpm
selama 1 menit, kemudian pindahkan QIAamp Mini spin column kedalam tabung
collection yang baru, sebanyak 500 µL Buffer AW1 masukkan kedalam QIAamp
Mini spin column,
6. Sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, kemudian QIAamp Mini
spin column kedalam tabung collection yang baru, sebanyak 500 u L Buffer
AW2 masukkan kedalam QIAamp Mini spin column,
7. Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, pindahkan QIAamp
Mini spin column kedalam tabung mikro 1,5 Ml yang baru dan sentrifugasi pada
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit,
 8. Pindahkan QIAamp Mini spin column kedalam tabung mikro 1,5mL yang baru,
sebanyak 60µL LAVE dimasukkan kedalam QIAamp Mini spin column, dan
inkubasi selama 1 menit pada suhu ruang,
9. Sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, buang QIAamp Mini spin
column dan hasil saringan berupa RNA pada tabung mikro 1,5 mL kemudian
disimpan di freezer pada -80o C.

PROTOKOL 2 :
Protocol RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) untuk deteksi dan serotype DENV
Dalam tabung PCR berisi campuran reaksi RT-PCR yang terdiri dari komponen
berikut :
Komponen Jumlah µL
Nuclease-free water 6.5
0.1 M DTT 1
10 m M Dntp Mix 1
D2 Primer (10 pmol) 0.5
RNA 6
-Sentrifuge sebentar-
-inkubasi pada suhu 65o C selama 5 menit, letakkan segera ke dalam es lalu
tambahkan-
5x first standard duffer 4
RNAse Out 0.5
Super script III RT 0.5
TOTAL 20

Thermal cycle setting :

25oC selama 5 menit
42oC selama 60 menit
70oC selama 15 menit
4oC
- Didapatkan Cdna lalu disimpan di freezer pada -20oC.
 Protocol 3 :
Protocol untuk deteksi DENV
Dalam tabung PCR berisi campuran reaksi PCR yang terdiri dari komponen berikut
:
Komponen Jumlah (µL)
Nuclease – free water 17.75
10x Roche buffer 2.5
10 m MdNTP Mix 0.5
50 Mm MgC12 1.5
D1 Primer (10 pmol) 0.3
D2 Primer (10 pmol) 0.3
Roche Taq DNA Polymerase 5 U/µL 0.15
Cdna 2
TOTAL 25

Thermal cycle setting :

95oC selama 2 menit
95oC selama 30 detik
60oC selama 1 menit
72oC selama 1 menit 30 detik
72oC selama 10 menit
4oC
- Didapatkan DNA template lalu disimpan di freezer pada -40oC.

Protocol 4 :
Protocol untuk gel agarose elektroforesis
1. Sebanyak 1,2 gr agarose ditimbang lalu masukkan kedalam Erlenmeyer,
kemudian sebanyak 60 m L TBE masukkan dan homogenkan,
2. Larutan dipanaskan sampai bening, kemudian dinginkan dirasa hangat-hangat
kuku dan sebanyak 6 µL sybrsafe dimasukkan, kemudian homogenkan tuang
kedalam cetakan gel dan tunggu sampai memadat.
3. Cetakan sumur dilepas dan memasukkan gel kedalam alat elektroforesis,
kemudian larutan TBE 1 X perlahan dituang kedalam alat sampai gel tergenang,
sebanyak 4 µL loading gel campurkan up-down dengan produk seerotipe,
kemudian masukkan kedalam sumur gel sebanyak 20 µL,
4. Sebanyak 1 µL DNA leader 100 bp sebagai marker kedalam semur berikutnya,
kemudian melakukan running pada alat elektroforesis dengan tegangan sebagai
berikut :
Tegangan 80V
Arus 200Ma
Waktu 45 menit
5. Lakukan pencatatan hasil dan foto gel.

D. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Hasil

Gambar 1. Foto hasil elektroforesis agarose dengan menggunakan geldok.

2. Pembahasan
 Sebelum dilakukan elektroforesis, teknologi PCR dilakukan terlebih dahulu
terhadap sampel. Perlakuan yang dilakukan pada sampel saat pada PCR:
- Denaturasi pada suhu 95oC selama 45 detik sebanyak 35 siklus (DNA
memisah) - Annealing pada suhu 600C selama 45 detik (pimer menempel)
- Extensi pada suhu 720C selama 45 detik (DNA diperpanjang)
- Extensi pada suhu 72oC selama 7 menit
- Soaking pada suhu 4oC (dilakukan untuk menurunkan suhu)
Pada penggunaan agar-agar untuk eletroforesis agarose, agar-agar yang
digunakan tidak boleh terlalu panas saat dituang ke dalam cetakan karena jika
terlalu panas cetakan akan retakretak dan agar-agar juga tidak boleh terlalu dingin
karena agar-agar akan mengental dan tidak dapat menjadi sumur. Saat menuang
agar-agar ke dalam cetakan yang harus diperhatikan adalah gelembung udara
karena tidakboleh ada gelembung udara pada saat menceta agar-agar.
Pada saat melakukan elektroforesis tahap pertama yang dilakukan adalah
mengisi masingmasing sumur, dimana setiap agar-agar harus diisi dengan marker,
negatif dan sampel. Untuk sampel digunakan pewarna sebanyak 2µL dan sampel
(DNA) sebanyak 8µL, pewarna dan DNA dijadikan satu di atas parafilm kemudian
dimasukkan ke dalam masing-masing sumur. Setelah y = 33734e-0.572x R² =
0.9842 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1 10 Basepairs (bp) Jarak (cm)
Grafik Hasil Elektroforesis Agarose Expon. (Series1) marker, negatif dan sampel
DNA diisi pada setiap sumur, arus dijalankan pada elektroforesis. Adanya arus
dapat diketahui dari gelembung gas yang keluar dan arus berlangsung dari negatif
ke positif.
Hasil elektroforesis yang terlihat hanya band DNA yang berasal dari darah
sedangkan yang dari sel epitel tidak muncul. Hal ini menunjukkan bahwa pada
pengerjaan untuk mendapatkan DNA dari sel epitel kurang teliti, mungkin pada saat
menggosok bagian dalam pipi tidak tepat atau pada saat memperoleh endapan nya
yang kurang baik pengerjaan nya.
Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil elektroforesis agarose diperoleh
rumus untuk menghitung basepairs dari sampel. Pada sampel diketahui jarak nya
adalah 7,5 cm dan diperoleh basepairs sampel 469,31 bp. Dalam hal ini marker yang
digunakan untuk 360 bp dan gen MMIF (Makrofag Migration Inhibitor Factor).
Dari hasil yang diperoleh basepairs sampel adalah 469,31bp sedangkan marker
yang digunakan untuk menentukan 360 bp. Dalam hal ini tidak sesuai marker
dengan sampel yang berarti tidak ada gen MMIF pada DNA yang diteliti.

E. KESIMPULAN
-Teknologi PCR digunakan untuk memperbanyak sampel DNA.
- DNA yang diperoleh dari darah lebih banyak daripada DNA.
- Pada saat memanen sel dari sel epitel, mulut dalam keadaan bersih dan saat
menggosok bagian dalam pipi harus tepat, jika tidak tepat DNA tidak akan
diperoleh.
- Marker yang hasil dari elektroforesis bertumpuk diakibatkan karena saat
memasukkan marker ke dalam sumur kurang hati-hati dan mungkin
diakibatkan karena kurangnya waktu saat elektroforesis.
- Dari hasil elektroforesis yang diperoleh hanya band yang berasal dari darah,
sedangkan yang berasal dari sel epitel tidak terlihat.
- Setelah data diinterpretasikan ke dalam grafik diperoleh basepair dari
fragment DNA darah adalah 469.31 bp dengan jarak band 7.5 cm. Hal ini
tidak sesuai dengan primer yang digunakan.