Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001

TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT

HISTOPATOLOGI DARI JARINGAN HEWAN
DENGAN PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN
EOSIN (H&E)

MOHAMAD MUNTIHA
Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E Martadinata 30, BOGOR

RINGKASAN

Untuk pembuatan preparat histopatologi dibutuhkan bahan utama

berupa jaringan segar, yang difiksasi dalam larutan formalin (BNF) 10% .
Jaringan dipotong clan diatur dalam tissue cassetes, didehidrasi secara otomatis
dengan mesin dehidrasi, dikeringkan dengan mesin vaccum, clan diblok dengan
cairan parafin, selanjutnya blok tersebut dipotong 3 - 5 ~tm dengan mesin
mikrotom clan potongan tersebut dilekatkan pada kaca obyek . Setelah itu kaca
obyek diwarnai secara manual dengan hematoksilin clan eosin . Pewarnaan
tersebut akan memberikan keseimbangan warna biru clan merah dengan jelas
padajaringan, sehingga komponen sel dapat diidentifikasi denganjelas.

PENDAHULUAN

Dengan beberapa pengecualian, kebanyakan jaringan tak berwarna

sehingga sulit untuk memeriksa jaringan yang ticlak diwarnai di bawah
mikroskop . Oleh karena itu telah ditemukan metode-metode pewarnaan
jaringan yang ticlak hanya membuat berbagai komponen jaringan menjadi
menyolok, tetapi memungkinkan pula diidentifikasi komponen-komponennya.
Pewamaan Hematoksilin clan Eosin (H&E) adalah jems pewarnaan rutin yang
paling umum dipakai . Prosedur ini digunakan dalam proses pembuatan preparat
histopatologi dari berbagai spesies hewan sakit atau mati clan memerlukan
pemeriksaan histopatologi untuk peneguhan diagnosis hewan yang
bersangkutan .
Tulisan ini ticlak dimaksudkan untuk menggambarkan perubahan dari
kerusakan tiap-tiap jaringan yang diperiksa, tetapi untuk menjelaskan teknik
pembuatan preparat histopatologi dengan prosedur pemrosesan jaringan clan
teknik pewarnaan yang baku untuk mendapatkan keseimbangan warna antara
hematoksilin (biru) clan eosin (merah) pada preparat. Prosedur ini digunakan di
laboratorium patologi Balai Penelitian Veteriner Bogor.
 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

BAHAN DAN CARA KERJA

Bahan

Bahan utama berupa potongan jaringan hewan yang telah difiksasi

dengan Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% . Larutan yang diperlukan adalah,
ethanol absolute, xylol, parafin, glyserin 99,5 %, ewit (albumin), larutan
hematoksilin, lithium carbonat, larutan eosin, DPX, dan larutan dekalsifikasi
(untuk jaringan tulang).

Alat

Talenan, pisau scalpel, pinset, saringan, tissue casset, mesin processor

otomatis, mesin vaccum, mesin bloking, freezer (-20 °C), mesin microtome,
pisau microtome, water bath 46 °C, kaca obyek, kaca penutup, rak khusus untuk
pewarnaan, oven 60°C.

CARA KERJA

Persaratan dalam Melakukan Pengambilan Sampel

1 . Sampel untuk pemeriksaan histopatologi harus segar, artinya jaringan

diambil secepat mungkin setelah hewan mati. Keterlambatan pengambilan
jaringan, terlebih dalam suhu lapangan yang panas, mengakibatkan
jaringan cepat menjadi busuk.
2 . Apabila di dalam kelompok hewan yang mati masih ada hewan lain yang
sedang sakit, maka dianjurkan untuk mengambil sampel dari hewan
tersebut. Pada jaringan yang mengalami perubahan maka diambil jaringan
pada perbatasan antara jaringan yang sakit (mengalami perubahan) dengan
jaringan yang sehat.
3 . Ukuran jaringan yang diambil sekitar 1 cm3. Jaringan tersebut harus segera
difiksasi. Potongan jaringan yang terlalu besar mengakibatkan jaringan
yang terletak di dalamnya tidak terfiksasi dengan serripurna, sehingga dapat
membusuk .
4. Jika jaringan berupa tulang, maka perlu dilunakkan terlebih dahulu dalam
larutan dekalsifikasi dengan perbandingan antara jaringan dan larutan 1
20 dengan waktu perendaman selama 24 jam.

Meredam Jaringan dengan Larutan Buffered Neutral Formalin

(BNF) 10%

Biasanya dilakukan dengan cara merendam jaringan di dalam zat-zat

kimia yang berfungsi sebagai bahan pengawet agar terhindar dari pencernaan
jaringan oleh enzim-enzim (otolisis) atau bakteri dan untuk melindungi struktur

157
 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

fisik sel . Bahan pengawet yang rutin digunakan adalah larutan Buffered Neutral
Formalin (BNF) 10% dengan pH berkisar antara 6.5 - 7 .5. pH ideal adalah
7.0.
Untuk membuat 1 liter BNF 10% yaitu dengan menimbang garam
NaH 2PO4 . H2O sebanyak 4,0 gram, dan Na2HP0 4 . 2H20 sebanyak 6,5 gram
larutkan dengan akuades 1 liter kemudian tambahkan 100 ml formaldehyde
(37%-40% .)
Agar fiksasi jaringan dengan larutan tersebut berlangsung sempurna,
maka perbandingan antara organ dan larutan yaitu 1 : 10, sedangkan lamanya
fiksasi minimal 2 hari.

Larutan Dekalsifikasi

Larutan dekalsifikasi yaitu larutan yang berfungsi untuk

menghilangkan garam-garam kalsium dari jaringan tulang sebelum
pemotongan sehingga tulang menjadi lunak, selain itu juga untuk memudahkan
pemotongan. Dekalsifikasi hanya bisa dilakukan apabila jaringan difiksasi
dengan sempurna. Larutan dekalsifikasi dapat dibuat dengan cara mencampur
asam format sebanyak 160 ml dengan formalin teknis sebanyak 100 ml,
kemudian larutan tersebut ditambahkan akuades sebanyak 1 .740 ml, larutan
tersebut siap untuk digunakan dengan perbandingan antara jaringan dan
larutan 1 : 20 dengan waktu perendaman selama 24 jam.

Proses Pembatan Preparat Histopatologi

1. Memotong jaringan organ

Setelah jaringan organ yang berada di dalam larutan fiksatif matang,

jaringan ditiriskan pada saringan selanjutnya dipotong menggunakan pisau
scalpel dengan ketebalan 0,3 - 0,5 mm dan disusun ke dalam tissue cassette,
kemudian sejumlah tissue cassette dimasukkan ke dalam keranjang khusus
(basket) .

2. Proses dehidrasi

Keranjang (basket) yang di dalamnya berisi jaringan organ,

dimasukkan ke dalam mesin processor otomatis (Gambar 1). Selanjutnya
jaringan mengalami proses dehidrasi bertahap dengan putaran waktu sebagai
berikut : ethanol 70% (2 jam) ethanol 80% (2 jam) aethanol 90 % (2
jam) a ethanol absolute (2 jam)a ethanol absolute (2 jam) xylol (2 jam)
xylol (2 jam) parafin cair (2 jam) aparafin cair(2jam) .
Selanjutnya keran-jang yang berisi tissue cassette dikeluarkan untuk dilakukan
proses berikutnya.

15 8
 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001

3 . Vakum

Setelah proses dehidrasi dilakukan, kemudian dilanjutkan dengan

penghilangan udara dari jaringan dengan menggunakan mesin vakum yang di
dalammya terdapat tabung untuk menyimpan keranjang yang diisi parafin cair
dengan temperatur (59 - 60°C) di vakum selama 30 menit. Keranjang diangkat,
tissue cassette dikeluarkan dan disimpan pada temperatur 60° C untuk
sementara waktu sebelum pencetakan dilakukan dengan parafin cair.

Gambar 1 . Mesin Processor Otomatis

4 . Mencetak blok parafin

Cetakan dari bahan stainles steel dihangatkan di atas api Bunsen, lalu ke dalam
setiap cetakan dimasukkan jaringan sambil diatur dan sedikit ditekan .
Sementara An ditempat lain telah disiapkan parafin cair dalam tempat khusus,
sehingga dicapai suhu 60°C. Parafin cair tersebut dituangkan ke dalam jaringan
sampai seluruh jaringan terendam parafin . Parafin dibiarkan membeku di atas
mesin pendingin (Gambar 2 .). Selanjutnya blok parafin dilepas dari cetakan
dan disimpan difreezer (-20°C) sebelum dilakukan pemotongan.

5. Memotong blok jaringan

Blok parafn yang mengandung jaringan, kemudian dipotong dengan

menggunakan mesin mikrotom (Gambar 3) dengan ketebalan berkisar 3 - 4
pm.
Potongan tersebut diletakkan secara hati-hati di atas permukaan air
dalam waterbath bersuhu 46° C . Pada kesempatan ini bentuk irisan dirapikan,
kemudian diletakkan di atas kaca obyek yang telah diolesi ewith, yang

159
 Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

berfungsi sebagai bahan perekat . Kaca obyek dengan jaringan di atasnya

disusun di dalam rak khusus dan dimasukkan ke dalam inkubator bersuhu 60°C
sampai preparat siap untuk diwamai .

D15!'E NSIrJV ' V(-AlAO

(,HVO CONSOLE CONSOLE CCwSOIE

Gambar 2 . Mesin Pencetak Blok

PERSIAPAN LARUTAN UNTUK PEWARNAAN

Larutan hematoksilin

Timbang serbuk hematoksilin I gram, potasium aluminium sulfat

sebanyak 50 gram dan sodium iodate ( Na 103 ) sebanyak 0,2 gram dilarutkan
dalam 1 liter akuades menggunakan alat pengaduk (stirer) dengan sedikit
dipanaskan, kemudian disimpan satu malam dalam temperatur ruangan .
Keesokkan harinya larutan tersebut ditambahkan asam sitrat (C6H807)
sebanyak 50 gram dan chloral hydrate (CZH3CL30Z) sebanyak 50 gram. Larutan
dipanaskan dan diaduk selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring .
Larutan akan stabil selama 1- 2 tahun dalam botol berwama gelap pada
temperatur ruangan .

Larutan eosin

Timbang serbuk eosin Y sebanyak 7,5 gram, erythrosin sebanyak 7,5

gram dan calcium chlorida sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam akuades 1 liter
kemudian disaring . Larutan akan stabil selama 6 - 12 bulan dalam botol gelap
pada temperatur ruangan .

160
 Temu Teknis Fungsional Non Peneliri 2001

Larutan pembiru

Lithium carbonat sebanyak 1,5 gram dilarutkan dengan akuades 1 liter

dan diaduk hingga homogen .

Gambar 3. Mesin Mikrotom

PROSES PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSIN

Preparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak khusus clan

dicelupkan secara berurutan ke dalam larutan dengan waktu sebagai berikut
" Xylol 3 menit
" Xylol 3 menit
" Ethanol absolute 3 menit
" Ethanol absolute 3 menit
" Ethanol 90% 3 menit
" Ethanol 80% 3 menit
" Bilas dengan air keran 1 menit
" Larutan hematoksilin 6-7 menit
" Bilas dengan air keran 1 menit
" Larutan pembiru 1 menit
" Air keran 1 menit
" Larutan eosin 1 - 5 menit
" Bilas dengan air keran 1 menit
 Temu Teknis Fungsionai Non Penelui 2001

" Ethanol 80 % 10 celupan

" Ethanol 90 % 10 celupan
" Ethanol absolute 10 celupan
" Ethanol absolute 1 menit
" Xylol 3 menit
" Xylol 3 menit
" Xylol 3 menit

Preparat diangkat satu persatu dari larutan xylol dalam keadaan basah,
diberi satu tetes cairan perekat ( DPX ) dan selanjutnya ditutup dengan kaca
penutup . Hasil pewarnaan dapat dilihat di bawah mikroskop .

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) dapat dilihat pada

(Gambar 4). Dari hasil pewarnaan yang dilakukan pada jaringan otot rangka
kerbau terlihat dengan jelas bahwa inti sel berwarna biru sedangkan otot
berwarna merah muda sampai merah.
Proses pembiruan dalam hematoksilin akan merubah warna merah
kecoklatan dari hematoksilin menjadi biru kehitaman, dimana akan terlihat
lebih jelas setelah dilakukan counter stain dengan eosin yang berwarna merah
menjadi merah muda. Proses ini akan terjadi dalam air keran yang bersifat
alkali atau juga dapat dibantu dengan penambahan garam lithium carbonat yang
menjadikan air lebih bersifat alkali .

Gambar 4. Otot rangka kerbau, inti sel berwarna biru (a), Otot berwarna merah
muda sampel merah (b), Pewarnaan H & E 40 x

162
 Temu Teknis Fungsional Non Penelfti 2001

Dengan menggunakan prosedur penggunaan waktu yang standar, tidak

menjamin akan mendapatkan hasil yang baik. Pengaturan waktu dalam proses
pewarnaan ini sangat penting . Karena ketepatan waktu akan dipengaruhi oleh
tipe dari tiap jaringan yang diproses, sehingga penggunaan waktu bisa berubah
sesuai dengan kebutuhan .

KESIMPULAN

Pewarnaan hematoksilin dan eosin sangat bermanfaat untuk

mengidentifikasi morfologi / komponen-komponen sel suatu jaringan dari
organ tubuh hewan, sehingga kelainan histopatologi pada preparat dapat
didiagnosis dengan baik.

SARAN

Bahan pengawet sebaiknya menggunakan buffer neutral formalin

(BNF) 10 % dan tidak dianjurkan untuk menggunakan larutan alkohol dan
gliserin

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-

besarnya kepada Ibu Drh . Rini Damayanti atas bimbingan dan bantuan dalam
penulisan makalah ini . Juga kepada tim makalah atas komentar dan sarannya
untuk perbaikan makalah ini kami ucapkan terima kasih .

DAFTAR BACAAN

CULLING, C.F.A. 1974. Handbook of Histopatological and Techniques . Third

Edition, Butterworths & CO.
JUNQUERA . L.C. J. CARNEIRO. 1980. Histolog i Dasar ( Basic Histology ).
Ed 3 . Lange Med . Publication . Los Altos. California .
KEN, A. 1985. Laboratory Manual Histopathology. ATA-219 . Balitvet Project .
VACCA, L.L. 1985 . Laboratory Manual of Histochemistry. Raven Press . New
York.