PERCOBAAN 4

Kromatografi Kolom & Kromatografi Lapis Tipis: Isolasi

Kurkumin dari Kunyit (Curcuma Longa L.) dan Pemisahan Zat
Pewarna Makanan

I. Tujuan Percobaan

1. Menentukan nilai Rf hasil perolehan kemurnian fraksi kurkumin

dengan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
2. Menentukan nilai Rf hasil pemisahan zat warna pada tiap-tiap fraksi
eluat kromatografi kolom.
II. Teori Dasar
Kurkumin atau 1,7-bis-(4 hidroksi-3-metoksi fenol) hepta-1,6-diena-
3,5 dien merupakan senyawa hasil isolasi dari tanaman Curcuma sp. (Meiyanto,
1999). Kurkumin yang dikenal sebagai bahan alam berupa zat warna kuning ini
memiliki berat molekul 386.126 gram per mol. Senyawa kurkumin biasanya
terdapat sekitar 1.5-2% dari berat rimpang kunyit kering (Aggarawal et al., 2003).
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing
komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang didalamnya
diisikan dasa stasionerdiam yang dapat berupa padatan/cairam. Campuran
ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan
bantuan pengemban/ pembawa yang cocok (fasa gerak). Pemisahan dicapai
oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom yang
ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa gerak
dan fasa diam (Yoshito, 2009).

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terdapat fasa gerak yang akan

merayap/bergerak sepanjang fasa diam dan terbentuk kromatogram. KLT
disebut juga kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, sensitif dan
cepat dalam pemisahan. Kecepatan pemisahan yang tinggi dan mudah juga
dimiliki KLT (Khopar, 2003).
 1. Hasil KLT Referensi
Tabel 4 Data referensi hasil uji KLT pada sampel pewarna ungu

Jarak Noda Jarak Eluen

Sampel Warna
(cm) (cm)

Jingga tua 1.7 4

Pewarna Ungu Jingga 1.5 4

kuning 1.1 4

III. Perhitungan dan Pengolahan Data

A. Isolasi Kurkumin dari Kunyit

Tabel 5 Perhitungan Rf KLT dan KLT Preparatif isolat kurkumin

KLT KLT Preparatif

Rf jingga tua = Rf jingga tua =

= = 0.55 = = 0.75

Rf jingga = Rf jingga =

= = 0.3625 = = 0.51

Rf kuning = Rf kuning =

= = 0.30 = = 0.33
 B. Isolasi Zat Pewarna Makanan
Tabel 6 Perhitungan Rf KLT dan Rf KLT referensi

KLT KLT Referensi

Rf biru = Rfref biru =

= = 0.375 = = 0.425
h h
Rf merah = Rfref merah =

= = 0.325 = = 0.375

Rf ungu = Rfref ungu =

= = 0.225 = = 0.275

IV. Pembahasan

Penyampuran 20 gram rimpang kunyit kering -yang digunakan saat

percobaan adalah bubuk rimpang- dengan 50 ml diklorometana akan
menjadi suatu larutan. Larutan tersebut kemudian direfluks selama 1 jam
(sambil menunggu melakukan percobaan pemisahan zat pewarna makanan).
Digunakan CHCl2 / diklorometana karena pelarut organik yang baik dan
mudah menguap. Proses refluks dimaksudkan agar memekatkan larutan
rimpang kunyit-diklorometana, dengan menguapkan senyawa diklorometana.
Selanjutnya refluktan (campuran pekat) di saring dengan penyaring vakum
lalu ambil filtrat berupa larutan kuning. Kemudian larutan dipekatkan
melalui distilasi penangas air 50 oC, diperoleh distilat berupa diklorometana
dan residu berupa kurkumin. Residu kemerah-merahan yang didapat
kemudian dicampurkan dengan 20 ml n-heksana dan diaduk merata.
Penambahan n-heksanan pada campuran bertujuan untuk menggumpalkan
campuran menjadi padat, memisahkan diri dari pelarut dan kemudian
disaring lagi dengan penyaring vakum. Penyaringan dimaksudkan agar
diperoleh kurkumin murni berupa padatan yang tertinggal (residu) pada
saringan vakum. Selanjutnya padatan dianalisis dengan kromatografi lapis
tipis menggunakan eluen CH2Cl2 : MeOH = 97:3, akan memunculkan 3
komponen utama. 3 komponen utama yang didapat, timbul warna (Rf)
adalah kuning (1.2), jingga (1.45) dan jingga tua (2.2).
Setelah uji KLT selesai, dilakukan pemisahan dengan KLT preparatif.
Dengan menyiapkan kaca berukuran 7x5 cm yang dilapisi silika gel. Diberi
batas bawah (2 cm dari ujung pelat) dan atas dengan pensil, penggunaan
KLT preparatif 1 kelompok untuk 2 percobaan. Perlu menyiapkan sampel
yang akan dielusi, yaitu 0.1 gram ekstrak kasar (residu vakum) dilarutkan
sesedikit mungkin pelarut CH2Cl2 : MeOH = 99:1. Setelah itu diteteskan
perlahan, secara menyebar dengan menggunakan pipet tetes. Perlakuan
dilakukan beberapa kali untuk memastikan semua sampe terserap pada pelat
silikat KLT preparatif. Perlu dicatat, setiap pengulangan tetesan, tunggu
sampai kering penetasan sebelumnya dan tetesan selanjutnya berada di
lokasi tetesan sebelumnya
Setelah noda kering, dilakukan elusi dengan eluen CH2Cl2 : MeOH =
97:3 untuk melihat pergerakan sampel. Digunaka eluen tersebut karena
sebagai fasa gerak pada pengujian yang merupakan senyawa polar
disamping fasa diam berupa silika gel, senyawa polar. Langkah selanjutnya
sampel beserta KLT preparatif dilihat dibawah sinar lampu UV, untuk
memunculkan dengan jelas pita komponen warna utama. Akhirnya diperoleh
3 warna utama hasil uji sampel, yaitu kuning 0.33 cm, jingga 0.51 cm dan
jingga tua 7.5 cm. Diketahui bahawa zat yang memiliki kepolaran tinggi
akan tertahan lebih lama pada fasa diam, saat ini ditunjukkan oleh senyawa
demetoksi kurkumin yang berwarna kuning. Kepolaran lebih rendah diikuti
oleh bisdemetoksi kurkumin (warna jingga) dan jarak terjauh diperoleh oleh
kurkumin ditunjukkan warna jingga tua.
Sebenarnya sebelum mengecek jarak noda 3 warna utama, dilakukan
dahulu pemisahan komponen yang dipilih dengan mengerok lapisan silika
dan ditampung pada kertas. Silika Silika dipindahkan ke dalam gelas kimia
dan dilarutkan saring dan cuci dengan diklorometana. Filtrat kemudian
diuapkan dengan evaporator (atau distilasi penangas air 60 oC. Yang terakhir
dilakukan uji kemurnian fraksi dengan KLT (eluen CH2Cl2 : MeOH = 97:3).
Tapi karena waktu praktikum telah selesai, maka tidak dapat
dilakukan proses seperti pada paragraf diatas. Yang hanya dilakukan adalah
mengamati jarak pada KLT preparati sebagai pengganti uji kemurnian
fraksi KLT. Keberadaan 3 warna utama yang terpisah menunjukkan bahwa
kurkumin benar adanya dalam sampel yang telah kita uji pada bubuk
rimpang kunyit kering.
Sembari percobaan seputar isolasi kurkumin dilakukan, diuji cobakan
juga pemisahan zat pewarna makanan. Penyiapan sampel adalah dengan zat
pewarna makanan sebesar 0.5 gram dilarutkan dalam sedikit air atau
etanol:air = 1:2. Larutan disimpan setelah penyiapan kromatografi kolom
selesai.

Kromatografi kolom dapat dibuat dengan dua car, yaitu dengan

syringe plastik ditambah 1.5 – 2 gram silika gel atau dengan kolom pipet
tetes bersama silika gel yang memenuhi 3/4 kolom. Yang dipilih dalam
percobaan menggunakan syringe plastik bersama 1.5-2 gram silika gel..
yang sebelum ditambah silika gel diberi kapas atau tisu yang di gumpalkan
didasar syringe (output point). Setelah itu digunakan pelarut larutan NaCl
1% untuk membasahi dan mengembangkan silika gel dalam kolom.

Setelah semua siap, diteteskan 10 tetes sampel larutan zat warna

pekat ke dalam kolom. Lalu ditambahkan pelarut NaCl 1% lagi sampai
memenuhi (dikira-kira). Penambahan pelarut terus dilakukan sampai terlihat
pita-pita berwarna. Tiap pita yang keluar dengan warna berbeda disimpan
dalam tabung reaksi berbeda. Setelah pita pertama keluar, pelarut NaCl 1%
diganti dengan etanol:air 1:4 dan terakhir aqua dm / air keran. Penggantian
pelarut tiap pergantian pita warna yang muncul adalah agar warna yang akan
dikeluarkan dapat keluar dan tidak tercampur kembali dengan warna
sebelumnya. Jika larutan pertama adalah warna jingga tua yang memiliki
sifat lebih polar dari warna berikutnya (ditunjukkan pada KLT, bahwa warna
coklat akan tertinggal lebih lama di fasa diam, dan terlletak paling dekat
dengan batas awal) makan diperlukan senyawa nonpolar sebagai pelarut
untuk mengeluarkan warna itu, maka digunakan NaCl 1% (yangl kepolaran
dibawah air). Proses pelarut selanjutnya perlu diganti dengan yang lebih
polar yaitu etanol:air = 1:4 agar warna yang memiliki sifat nonpolar dapat
keluar. Jika pelarut tidak diganti maka dapat dipastikan warna yang keluar
akan bercampur dengan warna yang diatasnya dan warna akan menjadi
seperti warna awal sebelum dipisahkan karena saling melarutkan polar-polar
dan nonpolar-nonpolar (hal ini telah dicoba secara sengaja oleh praktikan).

Setelah didapat hasil pemisahan warna, warna-warna sebelum dan

sesudah kromatografi kolom di uji pada KLT dengan menotolkan sampel zat
pewarna dengan larutan warna baku yang telah tersedia pada pelat KLT
7x5cm. Perlu digunakan pelarut butanol:etanol:ammonia 2% = 3:1:2 sebagai
eluen. Didapat 3 warna penyusun warna utama, yaitu biru dengan jarak 1.5
cm, merah dengan jarak 1.3 cm dan ungu dengan jarak 0.9 cm. Dari sini
dapat diketahui bahwa biru menempati posisi teratas dalam pemisahan
warna, yang menunjukkan sifat warna biru, dengan Rf= 0.375, yang lebih
nonpolar dari yang lainnya (karena tidak tertahan lama pada fasa diam).
Sedangkan ungu memiliki sifat zat yang paling polar dengan Rf= 0.225 dan
merah berada diantara kedua sifat biru dan ungu dengan Rf = 0.325.

Telah diketahui Rfref dari pada KLT zat pewarna makanan, yaitu
warna biru= 0.425, merah= 0.375 dan ungu= 0.275. Terdapat perbedaan
yang signifikan antara Rf hasil percobaan dengan Rf referensi. Rfref selalu
memiliki nilai yang lebih besar dibanding Rf, hal ini mengindikasikan
bahwa jarak masing-masing senyawa yang diuji pada referensi lebih jauh
terhadap batas bawah KLT dibanding pada jarak hasil KLT percobaan.
Penyebabnya karena kepolaran senyawa-senyawa yang kami isolasi dari
kunyit memilliki kepolaran lebih tinggi dibandingkan isolasi referensi.
Kepolaran yang lebih tinggi ini disebabkan karena pelarut yang digunakan
dalam pemisahan warna pada kromatografi kolom terlalu banyak, sehingga
meningkatkan kepolaran senyawa-senyawa pewarna tersebut. Pelarut setelah
tetesan pertama keluar dan yang terakhir digunakan pada pemisahan adalah
 etanol:air = 1:4 dan aqua dm. Kedua pelarut ini memili polaritas yang lebih
tinggi dibandingkan zat pewarna setelah warna pertama keluar. Dengan
penambahan tiap tetes pelarut pada pewarna, menyebabkan kepolaran zat
pewarna tersebut meningkat. Sehingga dapat dipastikan hasil dari KLT akan
diperoleh jarak yang cenderung lebih dekat dibandingkan jarak pewarna
yang murni terhadap batas bawah KLT karena kepolarannya yang rendah
(yang sesuai referensi).
V. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan diperoleh nilai Rf hasil perolehan
kemurnian fraksi kurkumin pada KLT yaitu 0.55 dan pada KLT Preparatif
sebesar 0.75 yang ditunjukkan oleh warna jingga tua. Nilai Rf hasil
pemisahan zat pewarna pada masing-masing fraksi adalah warna biru
sebesar 0.375, warna merah sebesar 0.325 dan warna ungu sebesar 0.225.