ISOLASI DNA

LAPORAN PRAKTIKUM
disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Biologi Molekuler
Dosen Pengampu:
Dr. Hj. Amy Fitriani M.Si
Dr. Hj. Diah Kusumawaty M.Si
Dr. Topik Hidayat M.Si

oleh :
Biologi C 2015
Kelompok 2
Cipta Adi Nugraha 1504609

Fridayova Meidiana 1501205

Intan Fauziah 1500384

Rizki Amelia 1501634

Ryan Kurniawan Syahisyah 1504146

PROGRAM STUDI BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2018
A. Judul
Isolasi DNA
B. Waktu Pelaksanaan
Hari : Kamis, 8 Januari 2018
Waktu : 07.00 – 09.30 WIB
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi

C. Tujuan
1. Mengetahui prinsip dasar dalam isolasi DNA.
2. Terampil melakukan isolasi DNA
3. Mengetahui cara untuk menghitung kualitas dan kuantitas DNA.
D. Dasar Teori
Isolasi DNA merupakan metode pengeluaran DNA dari tempat awalnya
(ekstraksi atau lisis) dilakukan dengan cara homogenasi dan pemberian buffer
ekstraksi ataupun buffer lisis untuk mencegah rusaknya DNA (Yuwono, 2008).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan
membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA
merupakan organel lainnya seperti mitokondria dan juga kloroplas. Karena
DNA terdapat di daerah nukleus, maka diperlukan metode pelisisan sel hingga
pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi
DNA (Elrod, 2007).
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan
dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi
protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara
berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian
DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,
membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara
kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk
memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan
pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan
secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan
sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk
mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA ( Istanti, Annie. 1999).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi
ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun
isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap
jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi
tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan
dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat
memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel
yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang
terpretisipasi juga akan sedikit ( Murray,2009).
Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA ( Solomon, 2002).
1. Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. Pemecahan dinding sel.
3. Pemecahan membran sel.
4. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan
tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita
lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses
dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan
yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah
memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur
utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita
gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk
melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar ( Solomon,
2002).
 Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin
berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat
jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-
layang di permukaan ( Solomon, 2002).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis
deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan
karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel
terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke
dalam buffer ekstraksi. Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan
senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi
senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan
oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi
untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida,
poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk
melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua
bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel ( Solomon, 2002).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak
dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan
agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian
etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk
mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari
ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris
electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan
menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA
atauEthylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat
yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas
berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan
menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA
dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial
 of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga
akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita
DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

E. Alat dan Bahan

1. Alat
Tabel E.1 Alat yang digunakan untuk isolasi DNA

No Nama Alat Jumlah

1. Tips Steril 1000 µL, 200 µL, 20 µL Secukupnya
2. Mikropipet Steril (0,5-20 µL, 20-200 µL, 200-1000 µL) Secukupnya
3. Mikrosentrifuge (Eppendorf) 1 set
4. Mikrotube 1,5 mL Secukupnya
5. Water Bath 1 Unit
6. Mortar dan Pastel 1 Set
7. Spektrofotometer 1 set
8. Vortex 1 set
9. Kuvet 2 Unit

2. Bahan
Tabel E.2 Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA

No Nama Bahan Jumlah

1. Isolat Broth Kapang endofit 8 Isolat
2. Buffer Ekstraksi (250 mM Tris-HCL pH=8.0; 20 mM EDTA 10 ml
pH=8.0; 200 mM NaCl; 10% CTAB; 0,15% SDS)
3. TE (Tris EDTA) 1x (250 µM Tris HCL; 20 mM EDTA) 10 ml
4. ddH2O 10 ml
5. Reagen Ekstraksi (Cholorofoam; Isoamyl Alkohol, 23:2) 10 ml
6. Reagen Presipitasi (Isopropanol) 10 ml
7. Reagen Pencuci (Ethanol 100%) 10 ml
F. Langkah Kerja

Miselia hasil subkultur yang sudah dimasukan kedalam tabung 1,5 ml

disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.

Miselia yang telah disentrifugasi dicucI 2 kali dengan ddH2O sebanyak 1

ml, kemudian disentrifugasi lagi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000
rpm.

Ditambahkan 500 µL SDS-CTAB-Chlorofoam-Isoamilalchohol (S-CCI)

Buffer ekstraksi.

lalu di vorteks dan dipanaskan dalam water bath 50 oC selama 10 menit.

Setelah itu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000

rpm.lalu supernatan dipindahkan ke tube yang baru dan ditambahkan
kloroform: isoamil-alkohol (23:2) sebnyak 500 mL, kemudian
disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan10.000 rpm

Supernatan bagian atas dipindahkan ke tabung lain dan ditambahkan

isopropanol dingin sebanyak 500 ml, lau dibolak-balik dengan perlahan.

lalu disimpan dalam -20 oC selama 30 menit. setelah itu tabung

disentrifugasi lagi selama 5 menit dengan kecepetan 10.000 rpm

supernatan dibuang, setelah itu ditambahkan 500 µL ethanol 70%

melalui dinding tabung dan disentrifugasi lagi selama 1 menit dengan
kecepatan 10.000 rpm dan dikeringkan dalam laminar steril.

DNA yang terisolasi diresuspensi dengan 100 µL ddH2O dan disimpan

pada suhu -20 oC untuk dilakukan analisis berikutnya
H. Pembahasan

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari

bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan
Rapley, 2008; Dolphin, 2008).

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada
berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal
teknik dan bahan yang digunakan. Membran sel pada setiap sel organisme
dapat mengalami kerusakan yang disebabkan oleh pengaruh senyawa-senyawa
kimia. Senyawa kimia yang mampu merusak membran dan dinding sel antara
lain adalah enzim lisozim yang mampu mempengaruhi kerja dari senyawa
polimerik sehingga kekakuan sel tidak lagi dapat terjaga dengan stabil. Selain
itu, ada pula senyawa EDTA (etilen-diamin-tetraasetat) yang berguna untuk
mengikat ion Mg2+ yang dapat mempertahankan struktur selubung sel serta
menghambat enzim yang dapat merusak DNA.

Senyawa CTAB-Chlorofoam-Isoamilalcohol (S-CCI) ditambahkan

pada isolat untuk mendenaturasi protein agar enzim endonuklease tidak
berfungsi sehingga tidak bisa mendegradasi DNA. Lalu untuk merombak
membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi ditambahkan
larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merombak
molekul lipid dan protein pada membran. Selanjutnya isolat di-vorteks agar
larutannya homogen.

Pada tahapan selanjutnya ditambahkan reagen ekstraksi yaitu

Kloroform isoamyl alkohol (CIAA) yang berfungsi mendenaturasi protein
yang masih menempel pada kromosom sehingga akan didapatkan DNA yang
murni,
 Lalu selanjutnya ditambahkan larutan presipitasi yaitu isopropanol
dingin pada supernatant berjutuan untuk melakukan proses presipitasi DNA.
Penambahan ethanol 70% bertujuan untuk proses untuk memperitifikasi DNA.
Ethanol dingin akan mempercepat proses tersebut. Larutan ddH2O berfungsi
untuk mengendapkan kembali DNA yang sudah terisolasi untuk dianalisis
lebih lanjut.

Setelah proses isolasi DNA selesai, selanjutnya dilakukan analisis uji

kualitas dan kuantitas DNA. Uji kualitas dan kuantitas DNA dilakukan untuk
menguji kualitas DNA hasil isolasi. Uji kuantitas dilakukan dengan
spektofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 260 mm dan 280 mm.

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙𝑜𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 260 𝑛𝑚

𝐾𝑒𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖𝑎𝑛 𝐷𝑁𝐴 =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙𝑜𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 280 𝑛𝑚

Kemurnian DNA yang baik ada pada angka berkisar 1,7-1,9 (Facthiyah,2011)

Berdasarkan standar kemurnian DNA, pada kegiatan praktikum isolasi

DNA yang dilakukan oleh kelompok 1 menghasilkan isolate DNA dengan
kemurnian yang baik yakni berada pada angka 1, 786. Hasil tersebut
menunjukkan kemurnian DNA yang baik karena berada di rentang 1,7-1,9.

Konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

[DNA] = Å260 x 50 x factor pengenceran

Berdasarkan rumus tersebut isolat di kelompok 1 mempunyai konsentrasi

DNA 625.

I. Kesimpulan
DNA dapat diisolasi dengan 3 prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat.
Pada praktikum isolasi DBA menghasilkan isolate dengan kemurnian yang
baik yaitu 1,786 dan konsentrasi DNA 625.
 DAFTAR PUSTAKA

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.UGM.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.
Academic Press, Inc., San Diego.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga :

Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed.
John Wiley & Sons Inc., New York.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Julisaniah, N.I., Sulistyowati, L., Sugiharto, A.N.. 2008. Analisis Kekerabatan

Mentimun (Cucumis sativus L.) menggunakan Metode RAPD-PCR dan
Isozim. Jurnal Biodiversitas Vol.9

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing
Co. : Columbus, Ohio.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech

Publisher : Rijeka, Croatia.

Murray, Robert K.2009.Biokimia Harper.Jakarta:EGC

Solomon, E.P, Berg, L.R, Martin, D.W. 2002. Biology. 6th Ed. Brooks/Cole
Thompson Learning. USA.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011. 451 hlm.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.