Percobaan 07

Isolasi Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ronaldo Gregorius Sitanggang

NIM : 10515011
Kelas : 01
Kelompok : 02
ronaldositanggang.rs@gmail.com

Abstrak
PCR ( Polymerase Chain Reaction ) adalah suatu reaksi yang melibatkan enzim polimerase untuk
memisahkan untai DNA panjang menjadi untai tunggalnya. PCR digunakan untuk membuat fragmen DNA
spesifik dari untai panjangnya. Sebagian besar metode PCR bergantung pada siklus termal, yang melibatkan
pemaparan   reaktan   pada   siklus   pemanasan   dan   pendinginan   berulang,   menghasilkan   reaksi   tertentu   yang
bergantung pada suhu. 
Pada   percobaan   ini   dilakukan   pemisahan   untai   DNA   panjang   menjadi   fragmen   18S   rDNA   dari   sel
eukariotik. Fragmen 18S rDNA adalah komponen dari subunit ribosom kecil dari sel eukariotik. Fragmen 18S
rDNA spesifik untuk setiap spesies yang bersel eukariotik.
Hasil isolasi fragmen 18S rDNA diidentifikasi dengan elektroforesis sel agarosa. Elektroforesis sel agarosa
adalah   metode   pemisahan   makromolekul   seperti   protein   atau   DNA   berdasarkan   muatan   atau   ukuran   dan
panjang.    
Kata kunci: PCR ( Polymerase Chain Reaction ), fragmen 18S rDNA, elektroforesis sel agaorsa.

Abstract
PCR (Polymerase Chain Reaction) is a reaction using polymerase enzymes to separate a long DNA strands into
their single strands DNA. PCR is used to create a specific DNA fragment from its long strand. Most PCR
methods depend on the thermal cycle, which involves the exposure of reactants to recurrent heating and cooling
cycles, producing a temperature-dependent reaction.
In this experiment, the separation of long DNA strands into 18S rDNA fragments from eukaryotic cells. The
18S rDNA fragment is a component of the small ribosomal subunit of eukaryotic cells. 18S rDNA specific
fragment for each eukaryotic species.
The results of 18S rDNA fragment isolation were identified by agarose cell electrophoresis. Agarose cell
electrophoresis is a seperation method of macromolecules proteins or DNA based on their charge/size and
length.
Keywords: PCR ( Polymerase Chain Reaction ), 18S rDNA fragments, agarose cell electrophoresis.

1. PENDAHULUAN molekul   DNA   untai   ganda,   penempelan   primer

PCR  ( Polymerase Chain Reaction ) adalah
teknik  amplifikasi   dan  isolasi  suatu  rantai  DNA
menjadi   rantai   tunggalnya.   Amplifikasi   DNA
dengan   PCR   dilakukan   menggunakan   primer
oligonukleotida   yang   disebut   sebagai   amplimer.
Primer   ini   adalah   suatu   DNA   untai   tanggal
pendek yang berkomplemen dengan ujung urutan
DNA   polimerase   dengan   keberadaan
deoksinuleosida   trifosfat   (dNTPs)   pada   kondisi
reaksi yang sesuai. Proses ini akan menghasilkan
rantai   DNA   baru   yang   berkomplemen   dengan
rantai templat sehingga menghasilkan DNA untai
ganda   yang   baru.   Sintesis   rantai   DNA   baru   ini
dapat   diulang   melalui   proses   denaturasi   termal
pada   DNA   dan   pemanjangan   primer   oleh   DNA
polimerase   pada   temperatur   yang   sesuai   dengan
kerja enzim. 
Rantai DNA baru yang ingin diperoleh adalah
fragmen 18S rDNA. Fragmen 18S rDNA adalah
fragmen   yang   bersifat   spesifik   untuk   setiap
spesies bersel eukariotik. Fragmen 18S rDNA ini
akan   dipisahkan   dari   untai   DNA   mikroalga
Chlamydomonas Reinhardtii.
Isolasi   fragmen   18S   rDNA   diidentifikasi
dengan   elektroforesis   sel   agarosa.   Elektroforesis
sel   agarosa   adalah   teknik   pemisahan   DNA
berdasarkan  ukuran  (berat  molekul)  dan struktur
fisik molekulnya. 
 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
( ­ )   (+)    S       M 
2. METODE PERCOBAAN
2.1 Lisis Sel Mikroalga
Bakteri diinokulasi dari cawan petri dengan
tusuk gigi steril ke dalam tabung mikro yang
sudah mengandung 50 µL ddH2O steril.
Campuran didihkan selama 10 menit
kemudian didiamkan sampai suhu ruang.
Tabung mikro disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 x g selama 1 menit.
Supernatan diambil dan dipisahkan ke tabung
mikro.
Dibuat campuran yang memiliki komposisi    
20 µL buffer dream Taq polimerase, 10 µL
dNTP 10 mM, 4 µL primer maju, 4 µL primer
mundur, 0,5 µL dream Taq plomerase, 49,5 µL
ddH2O, 8 µL MgCl2 25 mM dipipet ke dalam
tabung reaksi. Dimasukkan sebanyak 24 µL
campuran kedalam tiga tabung mikro berbeda.
Ketiga tabung mikro dinamai dengan tabung
sampel, kontrol positif dan kontrol negatif.
Tabung sampel ditambahkan 1 µL DNA
template. Tabung kontrol negatif ditambahkan
1 µL ddH2O dan tabung kontrol positif
ditambahkan 1 µL DNA kromosom alga.
Ketiga tabung dimasukan ke dalam mesin
PCR dengan kondisi 95C selama 7,5 menit,
50C selama 30 detik, 72C selama 5,5 menit, Gambar   1.   Skala   panjang,   hasil   elektroforesis
dan didinginkan hingga 12C. agaraso, gene ruler 1 kb DNA ladder.
Keterangan :
2.2 Elektroforesis Agarosa S : sampel
Gel agarosa dibuat dengan melarutkan
(­) : kontrol negatif
0,75% agarosa dengan buffer TAE 1x melalui
pemanasan. Campuran reaksi didinginkran (+) : kontrol positif
hingga 50C. Campuran ditambahkan dengan M : marker
Gel Red 0,5 µL. Larutan campuran dituang ke Dari   gambar   diatas   diketahui   bahwa   jarak
dalam cetakan gel dan dibiarkan hingga migrasi   total   sebesar   7   cm.   Sehingga   diperoleh
membeku. Gel diletakan ke alat elektroforesis
dan diisi buffer TAE 1x. pengolahan data sebagai berikut :
Sampel ditambahkan larutan pemberat Jarak
(bromfenol biru 0,1% dan sukrosa 40%) Uruta
migras Rf Mr (bp) log Mr
dengan perbandingan 5:1 di atas parafilm. n
i (cm)
Elektroforesis dilakukan pada 80V selama 35
menit. 1 5,2 0,743 250 2,398
2 4,7 0,671 500 2,699
3 4,3 0,614 750 2,875
4 4 0,571 1000 3,000
5 3,6 0,514 1500 3,176
6 3,3 0,471 2000 3,301
7 3,1 0,443 2500 3,398
8 2,9 0,414 3000 3,477
9 2,7 0,386 3500 3,544
10 2,6 0,371 4000 3,602
11 2,4 0,343 5000 3,699
12 2,2 0,314 6000 3,778
 13 2 0,286 8000 3,903
14 1,9 0,271 10000 4,000
Tabel 1. Tabel perhitungan Rf dan log Mr.
Dari  tabel diatas dapat diplot Rf sebagai  garis­x
dan   log   Mr   sebagai   garis­y   sehingga   diperoleh
grafik sebagai berikut :
Diketahui   jarak   migrasi   sampel   sebesar   4,8   cm
sehingga diperoleh Rf sampel sebesar 0,686. Dari
kurva   diatas   dapat   dihitung   Mr   fragmen   18S
rDNA dengan cara berikut :
 y = ­3,1893x+4,8077
logMr = ­3,1893(0,686)+4,8077
logMr =  2,6198
Mr = 416,716
PCR  ( Polymerase Chain Reaction ) adalah
suatu reaksi enzimatik untuk mengisolasi dan
mengamplfikasi suatu untai DNA menjadi untai
atau fragmen tunggalnya secara in vitro. In vitro
adalah kultur sel, jaringan, atau bagian organ
tertentu di dalam laboraturium. Amplifikasi DNA
dengan   PCR   dilakukan   menggunakan   primer
oligonukleotida   yang   disebut   sebagai   amplimer.
Primer   ini   adalah   suatu   DNA   untai   tanggal
pendek yang berkomplemen dengan ujung urutan
DNA   polimerase   dengan   keberadaan
deoksinuleosida   trifosfat   (dNTPs)   pada   kondisi
reaksi yang sesuai. Proses ini akan menghasilkan
rantai   DNA   baru   yang   berkomplemen   dengan
rantai templat sehingga menghasilkan DNA untai
ganda   yang   baru.   Sintesis   rantai   DNA   baru   ini
dapat   diulang   melalui   proses   denaturasi   termal
molekul   DNA   untai   ganda,   penempelan   primer
pada   DNA   dan   pemanjangan   primer   oleh   DNA
polimerase   pada   temperatur   yang   sesuai   dengan
kerja enzim.  Teknik PCR banyak dilakukan pada
bidang forensik. Penggunaan PCR berfungsi
untuk mendapatkan konsentrasi DNA yang lebih
besar sehingga mudah untuk melakukan
identifikasi. Selain itu PCR banyak digunakan
untuk klasifikasi organisme.   Tahapan dari  PCR
terbagi sebagai berikut :
1. Denaturasi
Pada tahap ini dua rantai molekul DNA target
dipisahkan   dengan   pemanasan.   Pemanasan
dilakukan pada suhu 94C untuk memutuskan
ikatan hidrogen pada rantai DNA.
2. Annealing (penempelan primer)
Pada tahap ini satu primer akan mengenali
dan melekat pada rantai DNA hasil
pemutusan. Tahap ini dilakukan pada suhu
45-60C. Penggunaan suhu ini dikarenakan
pada suhu dibawah 45C penempelan primer
tidak akan spesifik sedangkan pada suhu lebih
dari 60C rantai DNA hasil pemutusan akan
mengalami denaturasi lagi.
3. Extension (pemanjangan)
Tahap ini DNA polimerase mengikat ujung 3’
bebas dan menggunakan dNTPs untuk
mensintesis rantai DNA baru pada arah 5’ ke
3’. Rantai DNA baru yang telah disintesis
akan menjadi templat baru untuk siklus
amplifikasi berikutnya.
Ion Mg2+ perlu ditambahkan karena berfungsi
sebagai kofaktor bagi enzim.
Berikut macam­macam tipe dari PCR :
1. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode
analisa yangdikembangkan dari reaksi PCR.
Real time ini juga dikenal sebagai quantitative
real time polymerasechain reaction atau Q-
PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk
mengamplifikasi sekaligus menghitung
jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut.
2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR)
merupakan metode yang digunakan untuk
mengamplifikasi cDNA dari mRNA. RT- PCR
digunakan untuk mendapatkan kembali dan
menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA,
menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak
dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT
-PCR dapat dengan mudah digunakan untuk
mengidentifikasi mutasi, polimorphisme dan
mengukur kekuatan ekspresi gen. Konsep
utama yang digaris bawahi pada teknik ini
yaitu mengkonversi mRNA ke bentuk rantai
tunggal untuk cetakan cDNA.
3. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik
perbanyakan (replikasi) sampel DNA
menggunakan bantuan enzim DNA
polymerase yang menggunakan dua pasang
primer untuk mengamplifikasi fragmen.
Dengan menggunakan nested PCR, jika ada
fragmen yang salah diamplifikasi maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi
untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua.
Dengan demikian, nested PCR adalah PCR
 yang sangat spesifik dalam melakukan
amplifikasi.
4. Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set
primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran
yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus,
informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-
tes tunggal yang tidak akan membutuhkan
beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu
untuk melakukan. Temperatur Annealing
untuk masing masing set primer harus
dioptimalkan untuk bekerja dengan benar
dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon.
Artinya, panjangnya pasangan basa harus
berbeda cukup untuk membentuk band yang
berbeda ketika divisualisasikan dengan
elektroforesis gel, dll.
Jumlah siklus yang dilakukan pada PCR
bergantung pada jumlah fragmen yang ingin
dihasilkan (amplikon). Setiap siklus PCR
menggandakan jumlah fragmen DNA. Jumlah
DNA yang teramplifikasi dapat ditentukan
dengan rumus berikut: 2n – 2n, dengan n
menyatakan jumlah siklus.
Pada percobaan ini, fragmen DNA yang
diisolasi merupakan fragmen 18s yang berasal
dari Chlamydomonas reindhartii. Fragmen 18s
merupakan daerah lestari yang tidak mengalami
perubahan akibat evolusi dan spesifik setiap
spesies makhluk hidup eukariotik. Oleh karena
itu kedekatan dari tiap-tiap organisme dapat
ditentukan dengan menentukan urutan DNA pada
fragmen 18s. Organisme yang memiliki urutan
DNA yang sama pada fragmen 18s dapat
dikelompokkan pada kelompok yang sama.
Elektroforesis agarosa berfungsi untuk
memisahkan senyawa berdasarkan perbedaan
massa, ukuran, dan bentuk molekulnya. Sehingga
massa fragmen 18S rDNA dapat ditentukan
dengan elektroforesis agarose karena massa dan
ukurannya yang relatif kecil. Penggunaan gene
ruler 1 kb DNA ladder berfungsi untuk
menunjukkan hubungan antara jarak tempuh
senyawa dengan massanya.
Penggunaan kontrol negatif berfungsi untuk
memastikan tidak terjadinya kontaminasi pada
larutan yang telah dibuat. Tidak munculnya pita
pada kontrol negatif menunjukkan larutan tidak
terkontaminasi. Penggunaan kontrol positif
berfungsi sebagai standar terhadap larutan DNA
yang telah diamplifikasi. Pita pada kontrol positif
seharusnya sejajar dengan pita pada larutan DNA
sampel.
Pada percobaan ini, diperoleh pita pada sel
agarosa Hasil ini menunjukkan adanya fragmen
DNA yang mengalami amplifikasi. Mr fragmen
yang diperoleh melalaui perhitungan sebesar
416,716. Menurut data standar Mr fragmen 18S
rDNA sebesar 450-500.
4. KESIMPULAN
Pada percobaan berhasil dilakukan isolasi dan
amplifikasi pada untai DNA mikroalga
Chlamydomonas reindhartii ini. Diperoleh pita
pada sel agarosa. Hasil ini menunjukkan adanya
fragmen DNA yang mengalami amplifikasi. Mr
fragmen yang diperoleh melalaui perhitungan
sebesar 416,716. Menurut data standar Mr
fragmen 18S rDNA sebesar 450-500 dan
perhitungan Mr melalui percoba mendekati data
standar.
UCAPAN TERIMAKASIH
Puji   dan   syukur   saya   panjatkan   kepada   Tuhan
Yang Maha Esa karena berkat dan kebaikan­Nya lah
saya   dapat   menyelesaikan   segala   modul   praktikum
Metabolisme   Informasi   dan   Genetika   dengan   baik.
Saya   juga   mengucapkkan   terimakasih   kepada
pemimpin praktikum Metabolisme dan Informasi
Genetik Dr. Reza Aditama S.Si.,M.Si. Dosen
pengajar Metabolisme dan Informasi Genetik, Ibu
Enny Ratnaningsih dan Ibu Dessy Natalia Ph. D yang
telah membimbing saya selama di kelas, kakak-kakak
asisten praktikum, dan terakhir teman-teman
kelompok II.
 
DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, A. L. 2004. Dasar-Dasar Biokimia, (alih
bahasa: Thenawidjaja M), edisi kedua.
Erlangga. Jakarta.
Meyer, A.; Todt, C.; Mikkelsen, N. T.; and Lieb, B.
(2010).   “Fast   evolving   18S   rRNA
sequences from  Solenogastres  (Mollusca)
resist standard PCR amplification and give
new insights into mollusk substitution rate
heterogeneity”.  BMC   Evolutionary
Biology. 10: 70.
Rychlik,   W.;   Spencer,   W.   J.;   and   Rhoads,   R.   E.
(1990).   “Optimization   of   the   annealing
temperature for DNA amplification in vitro”.
Nucleic Acids Res. 18 (21): 6409­6412.
https://www.fishersci.com/shop/products/thermo-
scientific-o-generuler-1-kb-dna-ladder-ready-
to-use-250-10-000-bp-250-10000bp-0-1-g-
l/fersm1163 waktu akses: 05 April 2019 10.34
WIB