RINGKASAN PROTOKOL

A. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan Bahan
Bahan yang digunakan pada pengujian antikanker adalah daun Afrika Selatan (Vernonia
amygdalina Del.) yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO),
Bogor.

2. Determinasi Tumbuhan
Determinasi daun Afrika Selatan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani-
Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.
3. Pembuatan Serbuk Simplisia
a. Penyiapan Bahan Uji
Daun Afrika Selatan yang telah dikumpulkan ditimbang sebagai berat segar, selanjutnya
dicuci dengan air bersih yang mengalir, kemudian dikeringkan. Simplisia yang sudah kering
dihaluskan menggunakan blender dan diayak sehingga diperoleh serbuk dengan ukuran partikel
yang seragam.
b. Pembuatan Ekstrak dengan Maserasi
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu memasukkan serbuk simplisia ke dalam
botol bermulut lebar sebanyak 1000 g kemudian ditambahkan 2,5 liter pelarut etil asetat ke
dalam botol dan kemudian botol ditutup rapat. Rendam selama 6 jam pertama sambil sesekali
diaduk agar zat aktif yang terdapat pada simplisia terlarut, kemudian diamkan selama 18 jam.
Saring ampas dengan menggunakan kertas saring, ulangi proses penyarian sekurang-kurangnya
dua kali dengan jumlah pelarut yang sama sampai filtratnya hampir tidak berwarna.
Maserat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator pada 50oC
dengan kecepatan 50 rpm hingga kental tapi masih bisa dituang (Depkes RI, 1986).
c. Perhitungan Rendemen
Perhitungan rendemen dilakukan dengan menghitung berat masing-masing ekstrak yang
diperoleh terhadap simplisia yang belum dilakukan ekstraksi, kemudian dikalikan 100% (Depkes
RI, 2000).

Rendemen (%) = x 100%......................................(1)

4. Pemeriksaan Karakteristik Mutu Ekstrak

a. Pemeriksaan Organoleptis
 Pemeriksaan organoleptis meliputi pemeriksaan bentuk, warna dan bau ekstrak (Depkes
RI, 2000).
b. Susut Pengeringan
Ekstrak ditimbang seksama 1 – 2 g, kemudian dimasukkan ke dalam botol timbang yang
sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105ºC dan telah ditara. Bahan diratakan dalam botol
timbang dengan menggoyakan botol, hingga menjadi lapisan setebal lebih kurang 5 – 10 mm.
Selanjutnya, botol timbang tersebut dimasukkan ke dalam oven, dibuka tutupnya dan
dikeringkan pada suhu penetapan hingga diperoleh bobot tetap (Depkes RI, 2000).

% susut pengeringan = x 100%.........................................................(2)

Keterangan : A = Bobot sampel sebelum dipanaskan (g)

B = Bobot sampel setelah dipanaskan (g)

5. Skrining Fitokimia dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Penentuan kromatogram dilakukan dengan cara menotolkan ekstrak pada plat silika gel
60 F254 dengan jarak antartotolan sekitar 1 – 1,5 cm. Diameter totolan diusahakan sekecil
mungkin dan dibiarkan mengering. Kemudian plat KLT dimasukan ke dalam bejana (yang telah
dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak) dengan posisi tegak, lalu fase gerak dibiarkan
merambat hingga batas jarak rambat. Selanjutnya plat KLT dikeluarkan dari dalam bejana dan
dikeringkan di udara. Bercak-bercak yang terbentuk pada plat KLT diamati di bawah sinar UV
dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, kemudian plat KLT disemprot dengan pereaksi
yang sesuai untuk masing-masing senyawa (Hanani, 2015).
Tabel 2. Skrining Fitokimia dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Senyawa Fase diam Fase gerak Pereaksi semprot

Alkaloid Silika gel 60 Toluen: etil asetat: Dragendorff*

F254 dietilamin
(70: 20: 10)
Flavonoid Silika gel 60 Kloroform: aseton: asam AlCl3*
F254 format
(75: 16,5: 8,5)
Saponin Silika gel 60 Kloroform: metanol: air Vanilin-asam
 F254 (64: 50: 10) sulfat*
Steroid Silika gel 60 Toluen : Etil asetat Vanilin-asam
F254 (93 : 7) sulfat**
Tanin Silika gel 60 Toluen: Aseton: asam FeCl3*
F254 format
(6: 6: 1)
Terpenoid Silika gel 60 Kloroform: metanol Liebermann-
F254 (2 : 8) Burchard**

Keterangan : * = Hanani, 2015

** = Prastiwi, 2011

6. Sterilisasi Alat
Pada pengujian antikanker harus menggunakan bahan dan alat steril yang dikerjakan
secara aseptis di laminar air flow (LAF). Alat-alat gelas yang akan digunakan sebaiknya di cuci
dengan menggunakan antiseptic sampai bersih dan dikeringkan. Setelah dibungkus dengan
kertas, disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit kemudian dikeringkan
dalam oven pada suhu 1600C selama 1 jam (Depkes, 1979).
7. Pembuatan Reagen
a. Pembuatan Larutan Phospat Buffer Saline (PBS)
1 tablet PBS dilarutkan dalam 100 ml akuades, kemudian disaring menggunakan
mikrofilter. Selanjutnya dimasukan kedalam wadah steril dan dilakukan di dalam biological
safety cabinet (BSC). Larutan PBS kemudian disimpan di dalam lemari pendingin.

b. Pembuatan Medium Komplit

FBS 10%, penisilin streptomisin 1% dan L-glutamin 1% dicampur hingga homogen,
kemudian disaring menggunakan mikrofilter. Selanjutnya dimasukan kedalam wadah steril dan
tertutup rapat lalu disimpan dilemari pendingin.

c. Pembuatan MTT
Sebanyak 20 mg serbuk MTT dimasukan kedalam wadah steril, kemudian dilarutkan
dengan 5 ml PBS di dalam biological safety cabinet (BSC).
8. Kultur Sel (Preparasi Sel)
a. Pasasi Sel
Sebanyak 5 ml sel dimasukan ke dalam mikrotube dan disentrifuge. Cairan hasil
sentrifuge dibuang dan sisanya (pelet) ditambahkan PBS 10 ml lalu disentrifuge kembali. Cairan
hasil sentrifuge dibuang dan sisanya (pelet) ditambahkan 1 ml medium komplit dan
dihomogenkan. Hasilnya kemudian dibagi menjadi 4 dan ditambahkan medium komplit hingga 5
ml lalu diinkubasi selama 24 jam.

b. Tripsinisasi
Setelah diinkubasi, medium komplit diambil menggunakan pipet dan sel yang masih
menempel dibilas dengan PBS 3 – 5 ml, digoyang-goyangkan selama beberapa saat lalu PBS
dibuang. Kemudian ditambahkan tripsin sesuai ukuran flask (flask 75 = 2 ml tripsin, flask 25 =
800 μl tripsin) dan digoyang-goyangkan agar sel lepas lalu diinkubasi selama 5 – 10 menit.
Setelah itu ditambahkan medium komplit (2 kali lipat jumlah tripsin), dipipet dan dimasukan
kedalam tabung sentrifus lalu disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Cairan
hasil sentrifus dibuang dan sisanya (pelet) ditambahkan 1 ml medium komplit lalu
dihomogenkan.

9. Perhitungan Kepadatan Sel

Perhitungan kepadatan sel dilakukan dengan menggunakan hemocytometer. Sel yang
akan dihitung diambil sebanyak 10 μl dan dimasukan kedalam tabung mikrosentrifus.
Ditambahkan PBS 10 μl dan tripan blue 80 μl lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex
mixer. Kemudian sebanyak 20 μl dimasukan ke hemocytometer dan dihitung menggunakan
mikroskop. Jumlah sel yang diperoleh dari keempat bidang besar diambil nilai rata-ratanya,
kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor koreksi untuk setiap bidang besar.
Jumlah sel per ml dapat dihitung dengan cara:

= rata-rata jumlah sel x P x 104 sel/ml……………….……………...(3)

10. Pembuatan Larutan Uji

 10 mg ekstrak etil asetat daun afrika selatan dilarutkan ke dalam 1 ml DMSO. Larutan ini
dijadikan larutan induk dengan konsentrasi 10000 ppm. Kemudian dari larutan induk dibuat
larutan uji dengan seri konsentrasi sebesar 9,4; 12,40; 16,35; 21,58; 28,48; 37,6 μg/ml. Adapun
pembanding yang digunakan adalah cisplatin dengan konsentrasi 4; 6: 8; 12; 19; 30 μg/ml
(Widowati dan Mudahar, 2009).
11. Uji Aktivitas Antikanker dengan Metode MTT
Uji aktivitas antikanker menggunakan plat kultur jaringan 96 sumuran. Sebanyak 100 μl
suspensi sel dalam medium komplit dimasukan ke dalam setiap sumuran, lalu diinkubasi dalam
inkubator CO2 selama 24 jam. Kemudian setiap sumuran dimasukkan larutan uji dengan
konsentrasi yang telah ditentukan dan diinkubasi kembali pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah
diinkubasi, microplate dibalik untuk membuang sisa cairan lalu pada masing-masing sumuran
ditambahkan 20 μl larutan MTT. Sel diinkubasi kembali selama 2-4 jam. Selanjutnya absorbansi
masing-masing sumuran dibaca dengan alat ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.

11. Analisis data

Hasil persentase penghambatan yang dihasilkan dalam pengujian, dikonversikan kedalam
nilai probit. Nilai tersebut digunakan untuk menghitung nilai IC50 dengan analisa probit. Dari
data ini dibuat regresi linear hubungan antara logaritma konsentrasi sebagai X dengan nilai
probit sebagai Y. IC50 diperoleh dengan cara memasukan nilai 5 sebagai probit ke dalam
persamaan regresi linear, kemudian hasil subtitusi di antilogaritma dan hasil tersebut merupakan
nilai IC50.

Persen Inhibisi (%) = x 100%.................(4)