MODUL PRAKTIKUM

Mata Kuliah MIKROBIOLOGI LAUT

Semester Gasal 2010

Disusun oleh:

Drs. Subagiyo, Msi

Dra. Wilis Ari Setyati, MSi

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Universitas Diponegoro
Semarang
2014

1
UNIVERSITAS DIPONEGORO
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN

GARIS – GARIS BESAR PROGRAM PRAKTIKUM

MATA KULIAH : MIKROBIOLOGI LAUT

KODE MK/SKS/SEMESTER
TIM PENGAMPU KULIAH & PRAKTIKUM :
WAKTU DAN TEMPAT PRAKTIKUM
DESKRIPSI SINGKAT MATA KULIAH
STANDAR KOMPETENSI MATA KULIAH
: PKK 304 P/ 3 SKS/III
Dr Ocky Karna Rajasa MSc
Anggota Dr. Ir. Agus Sabdono, MSc
Drs. Subagiyo, Msi
Dra. Wilis Ari Setyati,Msi
Dr. Ir. Delianis Pringgenis, MSc
: Semester Gasal 2010
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Laut Jurusan Ilmu Kelautan FPIK Univ. Diponegoro
: Mata kuliah mikrobiologi laut mempelajari mengenai kedudukan peran mikrobia dialam dan khususnya dilaut serta nilai
ekonominya bagi manusia, struktur sel dan kimia sel mikrobia laut, nutrisi dan pertumbuhan, genetika mikrobia,
ekologi mikrobia laut, taksonomi dan keanekaragaman hayati mikrobia laut, fenomena viable but non culturable,
biodegradasi dan bioremediasi, pelapukan hayati laut, serta bioteknologi kelautan berbasis mikrobia laut
: Setelah menyelesaikan mata kuliah ini mahasiswa akan dapat menjelaskan mengenai kedudukan dan peranan
mikroorganisme di alam, dan di laut khususnya, struktur sel dan kimia sel, fisiologi mikroorganisme laut ( pertumbuhan
dan genetika mikrobia ), ekologi dan keanekaragaman mikroorganisme laut serta potensi mikrobiologi laut dalam
pengembangan bioteknologi kelautan.

2
Modul 1. Kompetensi Praktikum Mikrobiologi

3
MICROBIOLOGY LABORATORY SKILLS

Use a bright field light microscope to view and interpret slides

 correctly setting up and focusing the microscope
 proper handling, cleaning, and storage of the microscope
 correct use of all lenses
 recording microscopic observations
Properly prepare slides for microbiological examination
 cleaning and disposing of slides
 preparing smears from solid and liquid cultures
 performing wet mount and/or hanging drop preparations
 performing negative staining
 performing Gram stains
 performing acid-fast staining
 performing flagella staining
 performing capsule staining
 performing endospore staing
Properly use aseptic techniques for the transfer and handling ofmicroorganisms
and instruments
 sterilizing and maintaining sterility of transfer instruments
 performing aseptic transfer
 obtaining microbial samples
Use appropriate microbiological media and test systems
 isolating colonies and/or plaques
 maintaining pure cultures
 using biochemical test media
 accurately recording macroscopic observations
Estimate the number of microbes in a sampleusing serial dilutiontechniques
 correctly choosing and using pipettes and pipetting devices
 correctly spreading diluted samples for counting
 estimating appropriate dilutions
 extrapolating plate counts to obtain the correct CFU or PFU in the starting
sample
Use standard microbiology laboratory equipment correctly
 using the standard metric system for weights, lengths, diameters, and
volumes
 lighting and adjusting a laboratory burner
 using an incubator

4
MICROBIOLOGY LABORATORY THINKING SKILLS
Cognitive processes
 formulating a clear, answerable question
 developing a testable hypothesis
 predicting expected results
 following an experimental protocol
Analysis skills
 collecting and organizing data in a systematic fashion
 presenting data in an appropriate form (graphs, tables, figures, or
 descriptive paragraphs)
 assessing the validity of the data (including integrity and significance)
 drawing appropriate conclusions based on the results
Communication skills
 discussing and presenting lab results or findings in the laboratory
Interpersonal and citizenry skills
 working effectively in teams or groups so that the task, results, and
analysis are shared
 effectively managing time and tasks allowing concurrent and/or
 overlapping tasks to be done simultaneously, by individuals and within a
group
5
  integrating knowledge and making informed judgments about microbiology
in everyday life
Microbiology Laboratory Safety
 A student successfully completing basic microbiology will demonstrate
ability to explain and practice safe

MICROBIOLOGY LABORAORY SAFETY

Microbiological procedures
 reporting all spills and broken glassware to the instructor and receiving
instructions for clean up
 methods for aseptic transfer
 minimizing or containing the production of aerosols and describing the
hazards associated with aerosols
 washing hands prior to and following laboratories and at any time
contamination is suspected
 using universal precautions and following the requirements of the
waterborne Pathogen Standard

6
  disinfecting lab benches and equipment prior to and at the conclusion of
each lab session, using an appropriate disinfectant and allowing a suitable
contact time
 identification and proper disposal of different types of waste
 reading and signing a laboratory safety agreement indicating that the
student has read and understands the safety rules of the laboratory
 good lab practice, including returning materials to proper locations, proper
care and handling of equipment, and keeping the bench top clear of
extraneous materials

Protective procedures
 wearing long pants or dresses (NO shorts); no sandals
 tying long hair back, wearing personal protective equipment (eye
protection,
 coats, gloves; glasses may be preferred to contact lenses), and using such
equipment in appropriate situations
 always using appropriate pipetting devices and understanding that mouth
pipetting is forbidden
 never eating or drinking in the laboratory
 never applying cosmetics, handling contact lenses, or placing objects
(fingers, pencils, etc.) in the mouth or touching the face
Emergency procedures
 locating and properly using emergency equipment (eye wash stations, first
aid kits, fire extinguishers, chemical safety showers, telephones, and
emergency numbers)
 reporting all injuries immediately to the instructor
 following proper steps in the event of an emergency

7
 Grup: ......................................

MODUL 2: Struktur dan Fungsi sel Tgl: .......................................

TOPIK I: Teknik Mikroskopik

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Salah satu ketrampilan mikrobiologi yang penting adalah menggunakan

mikroskop. Mikroskop adalah alat untuk membesarkan gambar obyek yang terlalu kecil
untuk dilihat dengan mata telanjang. Pembesaran merupakan cara utama untuk bisa
melihat mikroorganisme. Pembesaran gambar dicapai melalui refraksi cahaya yang
melewati lensa. Derajat refraksi dan pembesaran ditentukan oleh derajat
curvature.Mikroskop cahaya dalam memperbesar gambar menggunakan 2 sistem lensa.
Pembesaran pertama terjadi dalam lensa obyektif dan pembesaran selanjutnya terjadi
pada lensa okuler. Pengaturan jarak antara lensa obyektif dan preparat yang diamati serta
banyaknya cahaya yang masuk diperlukan untuk mendapatkan gambaran yang jelas.
Mikroskop dilengkapi dengan bagian-bagian fungsional yang berperan untuk itu. Total
pembesaran obyek dihitung dengan cara mengkalikan perbesaran lensa obyektif dengan
perbesaran lensa okuler. Sebagai contoh pembesaran lensa okuler 10 kali dan pembesaran
lensa obyektif 40 kali maka total perbesaran adalah 10 x 40 = 40 kali.
Ukuran mikroorganisme diekspresikan dalam unit meter. Pengukuran dilakukan
menggunakan okuler mikrometer. Okuler micrometer berbentuk disk terbuat dari gelas
yang didalamnya terdapat garis-garis dengan jarak yang sama dari 0 sampai 100. Okuler
micrometer dimasukan ke dalam okuler pada mikroskop dan dikalibrasi terhadap stage
micrometer. Pada stag micrometer terdapat garis-garis dengan jarak yang sudah
ditetapkan. Stage micrometer biasanya terbagi kedalam 0,01 mm dan 0,1 mm. Dimensi
mikroorganisme pada kondisi kering, difiksasi atau dicar cenderung lebih kecil 10-20 %
dibandingkan ukuran mikrobia hidup.

Tujuan
1. Mempelajari bagian-bagian dan fungsi mikroskop cahaya
2. Mempelajari bagaimana cara menggunakan mikroskop cahaya dengan benar
3. Mempelajari bagaimana cara merawat dan membawa mikroskop cahaya
4. Membuat dan melakukan pengamatan preparat basah

Kompetensi

Setiap mahasiswa mampu :

1. mengidentifikasi semua bagian mikroskop cahaya
2. menjelaskan fungsi semua bagian mikroskop cahaya
3. menjelaskan bagaimana menggunakan mikroskop cahaya dengan benar
4. menjelaskan bagaimana merawat mikroskop cahaya
5. menjelaskan bagaimana cara membawa mikroskop cahaya
6. trampil menggunakan mikroskop cahaya
7. trampil merawat mikroskop cahaya
8. trampil membuat dan melakukan pengawatan preparat
basah

8
Prosedur Kerja
a. Bahan
1. Preparat beberapa jenis bakteri yang telah dicat
(berbentuk batang, kokus dan spiral)
2. Kertas tissue

b. Alat
1. Mikroskop cahaya
2. Gelas benda (gelas obyektif)
3. Gelas penutup (deckglass)
4. Pinset
5. Pipet tetes
6. ocular micrometer
7. stage micrometer

c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Bagian A. Cara membawa dan mengangkat mikroskop

Prosedur
1. Sebelum mengangkat mikroskop, perhatikan bagian lengan dan bagian dasar
mikroskop
2. Gunakan selalu dua tangan untuk mengangkat mikroskop. Satu tangan untuk
memegang bagian lengan mikroskop dan yang satunya menyangga dari bawah
3. Praktekan cara mengangkat mikroskop sesuai dengan Gambar 2.

Gambar 1. Cara mengangkat dan memindahkan mikroskop

9
Bagian B. Mengenal nama dan fungsi bagian-bagian mikroskop Cahaya

1. Amati mikroskop yang digunakan dalam praktikum ini. Lakukan identifikasi bagian-
bagian mikroskop dengan cara membandingkan dengan gambar mikroskop yang
ada (Gambar 1). Masukan data pengamatan ke dalam Tabel pengamatan.
2. Tergantung dari model mikroskopnya, nyalakan sumber cahaya. Jika sumber
cahaya tidak menyatu dengan mikroskop atur cermin yang ada untuk
mengarahkan cahaya agar bisa masuk kedalam mikroskop.
3. Kondersor mempunyai lensa yang berfungsi untuk mengumpulkan cahaya,
gerakan kondersor ini naik dan turun menggunakan knop yang ada.
4. Diafragma berfungsi mengatur jumlah cahaya masuk ke kondensor. Temukan tuas
penggerak diafragma dan gerakan untuk membuka dan menutup diafragma. Catat
arah gerakan tuas penggerak dengan membuka atau menutupnya diafragma.

Gambar 2. Mikroskop dan bagian-bagiannya.

5. Meja benda berfungsi untuk menempatkan preparat atau obyek yang akan
diamati. Pada meja benda ini terdapat penjepit. Meja benda dapat digerakan
keatas dan kebawah serta kekanan dan kekiri dan juga ke depan dan kebelakang.
Temukan ke dua alat penggerak meja benda ini. Praktekan untuk memutar ke alat
penggerak meja ini secara bergantian. Catat arah gerakan tuas penggerak dengan
arah bergeraknya meja benda. Turunkan meja benda pada posisi paling rendah
dengan cara menggerakan alat penggerak meja benda, selanjutnya praktekan
untuk menggunakan alat penjepit ini untuk menjepit gelas benda yang telah
disediakan
10
 6. Pada bagian atas lengan terdapat tabung yang membawa lensa-lensa pembesar.
Pada bagian bawah tabung ini terdapat revolver atau rotating nosepiece dengan 3
atau 4 lensa obyektif masing dengan perbesaran yang berbeda (tanda garis merah
adalah lensa obyektif primer untuk perbesaran 4x, tanda kuning lensa perbesaran
lemah untuk perbesaran 10x & tanda hijau lensa perbesaran kuat untuk resolusi
40X). Praktekan memindah-mindahkan lensa obyektif dengan cara memutar
revolver hingga bunyi klik. Pada bagian tabung terdapat lensa okuler. Lensa ini
dapat dilepas. Praktekan untuk melepas lensa okuler dan membuka penutup lensa
okuler selanjutnya ditutup kembali dan dimasukan kembali ke posisi semula

Tabel bagian bagian mikroskop

No Nama bagian mikroskop Keterangan
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Bagian C: Menggunakan Mikroskop

1. Hidupkan lampu mikroskop.
2. Turunkan meja benda pada posisi paling rendah
3. Putar revolver hingga lensa obyektif primer tepat pada posisinya (hingga bunyi klik)
4. Letakan preparat awetan yang telah disediakan diatas meja benda dan pasang
penjepitnya.
5. Pastikan bahwa preparat yang akan diamati berada tepat dibawah lensa obyektif. Jika
belum atur dengan cara menggeser posisi meda benda.
6. Lihat melalui lensa okuler dan atur besarnya cahaya yang masuk dengan cara
mengatur diafragma.
7. Naikan meja benda dengan cara memutar knop makrometer sampai diperoleh
bayangan benda
8. Ganti lensa obyektif dengan perbesaran 10 X
9. Gerakan knop mikrometer untuk mendapatkan bayangan benda yang baik.
10. Ganti lensa obyektif dengan perbesaran 40 X
11. Fokuskan dengan memutar mikrometer secara perlahan. Hati hati dalam menggerakan
mikrometer karena pada perbesaran 40 x jarak lensa obyektif dengan preparat sangat
dekat sekali. Pada saat memfokuskan gambar menggunakan lensa obyektif 45 kali
jangan sekali-kali menggunakan makrometer.
12. Pada pengamatan dengan perbesaran 1000x (menggunakan lensa obyektif 100 x)
pada preparat diteteskan minyak imersi. Setelah selesai pengamatan bersihkan sisa
minyak emersi yang ada pada lensa obyektif menggunakan xylol.
Catatan : Selama pengamatan kedua mata harus terbuka, hindari pengamatan dengan
satu mata terpejam (meskipun menggunakan mikroskop monokuler)

11
Kekuatan Obyektif : rendah tinggi dengan imersi

Total perbesaran :

Bagian D. Prosedur membersihkan mikroskop

1. Matikan lampu dan lepas kabel dari sumber listrik, dan simpan secara benar
2. Turunkan meja benda hingga maksimum dengan memutar makrometer
3. Lepas dan ambil gelas benda (slide) dari meja benda
4. Bersihkan semua lensa menggunakan kertas pembersih lensa – lensa okuler, lensa
dengan pembesaran lemah, kuat dan minyak imersi. Jika diperlukan pakai
pembersih lensa.
5. Bersihkan sisa minyak menggunakan Kimwipes atau kertas tissue
6. Putar scanning objective ke posisinya. Gunakan makrometer untuk menggerakan
meja benda ke posisi paling dekat dengan lensa.
7. Kembalikan mikroskop ke tempat penyimpanan

Bagian E. Membuat preparat basah ( Hanging Drop Slide)

1. Ambil vaselin menggunakan tusuk gigi dan ratakan membentuk cincin disekitar
bagian cekung dari gelas benda untuk pengamatan hanging drop (gelas benda
yang cekung di bagian tengah = depresion slide) (Gambar 3.a.). Catatan : jangan
terlalu banyak mengambil vaselin
2. Ambil secara aseptic suspensi kultur bakteri dan teteskan di tengah gelas penutup
3. Letakan depresion slide, dengan bagian cekung menghadap ke bawah, ke atas
gelas penutup (Gambar 3.b), tekan secara hati-hati.
4. Balikan hanging drop slide menghadap ke atas (Gambar 3.c) kemudian tempatkan
di atas meja benda dan amati dengan perbesaran lemah hingga kuat. Agar dapat
melihat sel dengan jelas, atur diafragma untuk meningkatkan kontras.

12
 Gambar 3. Preparasi hanging drop slide

Bagian F. Kalibrasi okuler micrometer

Kalibrasi Okuler micrometer

1. Letakan okuler micrometer di bagian okuler (ambil lensa okuler dan buka penutup
bagian atas, masukan okuler meter, kemudian ditutup kembali). Amati okuler
micrometer, akan tampak seperti Gambar 4.a.
2. Letakan obyek micrometer di meja benda. Amati, akan tampak seperti Gambar
4.b.
3. Jika kedua micrometer ditempatkan ditempatnya masing-masing, maka akan
tampak seperti gambar 4.c.
4. Puter okuler sampai tampak kedua micrometer sejajar (gambar 4.d). Tepatkan
garis-garis yang ada di kedua micrometer dengan menggerakan meja benda.
5. Hitung jarak sebenarnya antar garis-garis yang ada di lensa okuler (dalam mm)
dengan rumus

13
Gambar 4. Kalibrasi okuler micrometer

14
Pembahasan

1. Bagian-bagian mikroskop

2. Fungsi bagian-bagian mikroskop

a. Fungsi lensa diafragma ………………………………………………………………………………

b. Fungsi kondensor…………………………………………………………………………………….

c. Fungsi revolver………………………………………………………………………………………..

d. Fungsi makrometer……………………………………………………………………………….

e. Fungsi micrometer……………………………………………………………………………………..

d. Fungsi penjepit pada meja benda…………………………………………………………….

15
3. Perhatikan mikroskop yang digunakan dalam praktikum ini
a. Jumlah lensa okuler………………… mempunyai perbesaran …………………………………
b. Jumlah lensa obyektif yang ada di revolver ….......................................................
c. Sebutkan masing-masing perbesaran lensa obyektif tersebut……………………………
d. Hitung total pembesaran untuk tiap tiap kombinasi okuler/obyektif dari mikroskop
yang digunakan untuk praktikum ini

Perbesaran Okuler X Perbesaran Obyektif = Total perbesaran

Menggunakan Mikroskop

1. Cara meletakan preparat yang akan diamati dengan mikroskop

2. Cara mengatur besarnya cahaya yang mengenai preparat

3. Cara mengatur agar preparat berada tepat dibawah lensa obyektif

4. Cara menempatkan lensa obyektif sesuai dengan perbesaran yang diinginkan

5. Cara mendapatkan focus bayangan

6. Perbedaan antararesolving power dan magnifying power lensa

7. Mengapa pada saat menyimpan atau membawa mikroskop lensa obyektif

diposisikan pada lensa dengan kekuatan yang paling kecil ?

16
8. Mengapa minyak imersi diperlukan pada saat menggunakan lensa obyektif
perbesaran 100

9. Apa fungsi iris diaphragm

10. Bagaimana meningkatkan resolusi mikroskop anda

11. Di mikrobiologi lensa obyektif dengan kekuatan berapa yang biasa

digunakan? Jelaskan

12. Di mikrobiologi lensa okuler dengan kekuatan berapa yang biasa digunakan?
Jelaskan

13. Mengapa diperlukan untuk melakukan kalibrasi ocular micrometer

17
Simpulan dan Saran

Pustaka

Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The

McGraw−Hill Companies, 449 p

J. A. Morello, P. A. Granato, H. E. Mizer, 2003, Laboratory Manual and Workbook in

Microbiology, The McGraw−Hill Companies, 285 p.

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

18
 Grup: ......................................

Tgl: .........................................
TOPIK II: Teknik Pengecatan

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. .......................................

Teori Pengantar

Sel bakteri pada umumnya tidak berwarna dan hampir tidak dapat dilihat karena tidak
mempunyai kontras dengan air. Oleh karena itu pengecatan dibutuhkan agar sel-sel
bakteri dapat dilihat untuk diamati baik morfologi maupun struktur inraseluler.
Pengecatan didasarkan pada muatan yang berlawanan saling tarik menarik dan muatan
yang sama tolak menolak. Sebagian besar bakteri bila diletakan dalam lingkungan akuosa
dengan ph netral (sekitar 7) mempunyai muatan listrik negative. Sel sel yang bermuatan
negative ini akan menarik molekul-molekul yang bermuatan positif dan menolak molekul-
molekul yang bermuatan negative. Ion bebas dari cat asam (acidic dyes) adalah anion
(bermuatan negative) akan berkombinasi dengan kation, yaitu bagian basa dalam sel-sel
dan membentuk garam. Sedangkan cat basa (basic dyes) mengandung kation (bermuatan
positif) dan akan berkombinasi dengan suatu asam membentuk garam. Sel bakteri kaya
akan asam ribonukleat sehingga sangat mudah untuk dicat dengan cat basa. Cat basa
meliputi methilen blue, crystal violet dan safranin.Cat-cat ini digunakan untuk pengecatan
sederhana.Jika suatu cat ditolak oleh bakteri (biasanya cat asam), warna cat akan
mewarnai latar belakang sel bakteri dan sel tampak tidak berwarna. Contoh cat asam
adalah nigrosin.Cat netral (neutral stains) dibuat dengan mengkombinasikan antara cat
asam dan cat basa. Cat ini sangat berguna untuk pengecatan sel-sel kompleks karena
adanya diferensiasi struktur interior sel. Sel dan struktur sel yang tercat dengan cat basa
disebut basophilic dan yang tercat dengan cat asam disebut acidophilic.

Tujuan
1. mempelajari fungsi teknik pengecatan pada bidang mikrobiologi
2. mempelajari bermacam-macam jenis cat dan mekanisme pengecatannya
3. melakukan pengecatan sel dan struktur sel (flagella, endospora dan kapsula)

Kompetensi

Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa akan mampu :

1. menjelaskan fungsi pengecatan
2. menjelaskan mekanisme pengecatan
3. menjelaskan bermacam-macam cat
4. trampil membersihkan gelas benda
5. trampil membuat smear dari kultur padat dan kultur cair
6. trampil melakukan pengecatan sederhana
7. trampil melakukan pengecatan gram
8. trampil melakukan pengecatan asam
9. trampil melakukan pengecatan flagella
10. trampil melakukan pengecatan kapsula
11. trampil melakukan pengecatan endospora

Pengecatan negative

Pengecatan negative disebut juga pengecatan tidak langsung atau pengecatan latar Cat
yang digunakan dalam pengecatan negative ini adalah cat negative seperti nigrosin, tinta
India atau eosin Pada pengecatan negative cat tidak masuk ke dalam sel dan mewarnai
sel-sel bakteri . hal ini terjadi karena adanya tolak menolak antara muatan negative dari

19
cat dengan dinding sel bakteri yang bermuatan negative. Sebaliknya cat ini menghasilkan
deposit disekitar bakteri atau menghasilkan latar belakang gelap, sehingga sel bakteri yang
tidak tercat tampak tidak berwarna dengan latar belakang gelap.

Bahan:

1. Kultur cair Bacillus subtilis, Micrococcusluteus, Spirillum volutans umur 24-48 jam
2. Larutan Dorner’s nigrosin , India ink, atau eosin blue

Alat :
1. Gelas benda
2. Jarum ose / inoculating loop
3. Minyak immersi
4. mikroskop
5. Kertas pembersih lensa dan pembersih lensa
6. Pensil
7. Lampu spiritus / Bunsen burner

Prosedur
1. Beri label pada sudut kiri gelas benda dan tulis nama praktikan dan nama bacteria
yang akan dicat
2. Ambil s edikit biakan bakteri menggunakan jarum ose dan letakan diatas gelas
benda (Gambar 1.a)
3. Tambahkan 1 sampai 2 loop larutan cat nigrosin , tinta india atau eosin dan
campur dengan cepat (Gambar 1.b)
4. Ratakan campuran suspensi bakteri dan cat menggunakan gelas benda. Gelas
benda bersih diletakan diatas gelas benda yang telah diberi bakteri dan larutan cat
dengan sudut 45o kemudian ditarik untuk membentuk lapisan tipis suspensi
bakteri-cat (Gambar 1.c)
5. Keringanginkan. Jangan dipanaskan.
6. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran lemah
7. Gunakan minyak emersi untuk pengamatan pada perbesaran kuat.
8. Gambar hasil pengamatan dan beri keterangan

20
Gambar 5. Prosedur pengecatan negatif

21
Hasil

Bacillus subtilis, Micrococcusluteus, Spirillum volutans

1. Kapan dilakukan pengecatan negative

2. Sebutkan tiga cat yang dapat digunakan untuk pengecatan negative

a……………………………………………………………………………………
b……………………………………………………………………………………
c…………………………………………………………………………………...

3. Mengapa sel bakteri tetap tidak tercat pada prosedur pengecatan sederhana ?

4. Apa keuntungan pengecatan negative ?

5. Mengapa pada pengecatan negative suspensi bakteri tidak boleh difiksasi dengan
panas sebelum pengecatan?

6. Mengapa pengecatan negative disebut juga pengecatan tidak langsung ?

7. Mengapa pada waktu membuat smear tipis gelas benda diposisikan pada sudut 45 o
diatas gelas benda yang mengandung suspensi bakteri-cat ?

22
Membuat preparat smear dan fiksasi

Pengamatan mirkoskopik merupakan teknik identifikasi yang sangat berguna.Untuk dapat

melihat mikrobia diperlukan untuk mempersiapkan preparat mikroorganisme. Preparasi
mikroskopik dapat berupa preparat segara atau smear. Preparat segar (wet mount)
dilakukan dengan menempatkan sel-sel dalam setetes air kemudian ditutup dengan gelas
penutup, setelah itu langsung diamati dibawah mikroskop. Di bidang mikrobiologi sebagian
besar organisme yang diamati adalah bakteri, karena ukuran yang sangat kecil sehingga
sulit untuk dilihat tanpa pengecatan.Wet mount merupakan preparasi yang bersifat
sementara dan sulit untuk dilakukan pengecatan. Sedangkan smear merupakan preparasi
sel yang telah mengering di atas gelas benda. Materi ini kemudian dilekatkan ke gelas
benda dengan pemanasan atau penambahan bahan kimia. Suatu smear bersifat lebih
permanent dan dapat dicat dengan berbagai teknik pengecatan. Heat fixing selain
membantu melekatkan sel ke gelas benda, sehingga tidak akan lepas pada saat dilakukan
pencucian selama proses pengecatan juga berperan mematikan sel-sel sehingga slide
menjadi tidak berbahaya bagi peneliti, mengubah dinding sel untuk pengecatan.

Jumlah sel yang ditempatkan diatas gelas benda merupakan factor yang sangat penting.
Jumlah organisme yang terlalu sedikit akan menyulitkan untuk menemukannya pada saat
diamati dengan mikroskop. Jumlah yang terlalu banyak akan menyulitkan untuk
mengamatan individu sel terutama untuk menentukan bentuk dan morfologi. Sekurang-
kurangnya 500.000 sel per mL diperlukan untuk dapat dilakukan pengamatan dengan baik.

Heat fixing membantu melekatkan sel ke gelas benda, sehingga tidak akan lepas pada saat
dilakukan pencucian selama proses pengecatan, mematikan sel-sel sehingga slide menjadi
tidak berbahaya bagi peneliti, mengubah dinding sel untuk pengecatan.

Bahan

1. Kultur E coli
2. Akuadest
3. Gelas benda

Alat
1. Jarum ose
2. Lampu spiritus
3. Jarum ose

Prosedur

1. Bersihkan gelas benda

2. Jika smear dibuat dari kultur pada medium padat, teteskan air terlebih dahulu ke
atas gelas benda
3. Secara aseptik pindahkan inokulum dari kultur ke atas gelas benda, jika kultur
berasal dari kultur pada medium padat suspensikan sel-sel ke dalam air yang telah
ditetskan di atas gelas benda (Gambar 6 a dan b)
4. Ratakan inokulum (Gambar 6 c dan d)
5. Keringanginkan (Gambar 6 e)
6. Lewatkan ke atas nyala api spiritus untuk memfiksasi bakteri (Gambar 6 f)

23
 Gambar Preparasi smear bakteri

1. Kenapa sebelum dilakukan pengecatan bakteri dilakukan terlebih dahulu pembuatan

smear dan fiksasi?

2. Pada waktu membuat smear mengapa kultur yang dipindahkan ke gelas benda tidak
boleh terlalu banyak?

3. Mengapa pada proses fiksasi dengan pemanasan, smear tidak boleh terlalu lama
dipanaskan diatas lampu spiritus?

24
Pengecatan Acid-Fast

Beberapa bakteri seperti dari genus Mycobacterium dan Nocardia,serta parasit

Cryptosporidium tidak dapat dicat menggunakan cat sederhana. Mikroorganisme ini dapat
dicat dengan memanaskannya dengan carbolfuchsin dan tahan terhadap peluntur
sehingga disebut acid-fast. Sifat acid-fast ini disebabkan oleh kandungan lipid yang tinggi
dalam dinding sel. Prosedur pengecatan Ziehl-Neelsen acid-fast dikembangkan oleh ahli
bakteriologis kebangsaan Jerman yang bernama Franz Ziehl dan ahli pathologi
berkebangsaan Jerman bernama Friedrich Neelsen. Pengecatan acid-fast merupakan
teknik pengecatan diferensial. Mikroorganisme acid fast akan tampak berwarna merah,
sedangkan mikroorganisme non acid fast akan tampak berwarna biru atau coklat. Warna
ini disebabkan oleh adanya counterstaining berupa methylen blue setelah dilakukan
pelunturan dengan alcohol asam.

Bahan
1. Kultur cair Escherichia coli
2. Kultur pada media nutrient agar miring Mycobacterium smegmatis atau
Mycobacterium phlei umur 5 hari
3. Ziehl’s carbolfuchsin
4. alkaline methylene blue
5. alcohol asam

Alat
1. gelas benda
2. jarum ose (inoculating loop)
3. hot plate
4. mikroskop
5. kertas penghisap
6. kertas lensa dan pembersih lensa
7. minyak imersi
8. rak pengecatan
9. pipet

Procedure
1. Buat smear campuran E. colidan M. smegmatis.
2. Kering anginkan dan fiksasi diatas lampu spiritus.
3. Letakan gelas benda diatas hot plate, tutup smear dengan sepotong kertas tissue yang
telah dipotong seukuran gelas benda dan jenuhkan kertas dengan Ziehl’s
carbolfuchsin. Panaskan 3-5 menit. Hindari gelas benda menjadi kering dan pemberian
cat berlebihan, juga hindari terjadinya smear yang mendidih dengan mengatur suhu
hot plate.
4. Ambil gelas benda dan dinginkan, cuci dengan air selama 30 detik
5. Tambahkan alcohol asam tetes demi tetes sampai berwarna merah muda (selama 10-
30 detik)
6. Cuci dengan air selama 5 detik
7. Tambahkan counterstain dengan alkaline methylene blue selama 2 menit.
8. Cuci dengan air selama 30 detik.
9. Keringkan dengan bibulous paper
10. Amati dengan mikroskop mulai dari perbesaran lemah hingga perbesaran kuat

25
 Gambar 7. Prosedur pengecatan acid-fast

Hasil

E. coli dan M. smegmatis.

1. Apa tujuan pemanasan selama pengecatan acid-fast?

2. Apa fungsi counterstain pada pengecatan acid-fast?

26
 3. Apakah bakteri acid-fast itu gram positif atau gram negative ? Jelaskan
jawabanmu

4. Apa yang membuat mikroorganisme bersifat acid-fast?

5. Senyawa apa yang bertanggungjawab terhadap sifat acid-fast pada mycobacteria?

Pengecatan Gram

Nama gram, pada teknik pengecatan gram diambil dari nama ahli bakteriologis Denmark
Hans Christian Gram (1853 –1938). Metode pengecatan diferensial ini membedakan jenis
bakteri ke dalam dua kelompok besar berdasarkan sifat fisik dan kimia dinding selnya yaitu
gram positif dan gram negative.Reaksi gram ini membagi eubacteria kedalam dua
kelompok dasar berdasarkan kemampuannya untuk dicat merupakan salah satu dasar
identifikasi bakteri.Pengecatan gram tidak digunakan untuk mengklasifikasi archae karena
mikroorganisme memberikan respon yang sangat bervariasi.
Pengecatan gram terdiri dari empat komponen yaitu :
 Gram utama (Crystal violet, methyl violet atau Gentian violet)
 Mordant (Gram's Iodine)
 Decolourizer (ethyl alcohol, acetone atau 1:1 ethanol-acetone mixture)
 Counterstain (carbol fuchsin, safranin atau neutral red)

Bahan
1. Kultur cair Staphyloccus aureus, Escherichia coli, dan campuran S. aureus dan E.
coli
2. Larutan crystal violet,
3. Gram’s iodine (2 gpotassium iodide dalam 300 ml akuades ditambah 1 g iodine
crystals),
4. 95% ethanol dand/atau campuran isopropanol-acetone (3:1 v/v),
5. safranin

Alat
1. Gelas benda
2. Jarum ose (inoculating loop)
3. Bunsen burner
4. bibulous paper
5. microscope
6. Kertas lensa atau pembersih lensar
7. Minyak imersi
8. Pemanas gelas benda
9. rak pengecatan

Prosedur :

1. Buat smear E. coli, S. aureus, dan campuran E. coli dan S. Aureus diatas gelas
benda.
2. Fiksasi diatas lampu spiritus (bunsen)
3. Letakan gelas benda di rak pengecatan
4. Teteskan smear dengan kristal violet dan biarkan selama 30 detik (Gambar 2.1)
5. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2.2)
6. Tambahkan gram iodine mordant, biarkan selama 1 menit (Gambar 2.3.)
7. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2.4)
8. Tambahkan Decolourizer, diamkan selama 30 detik (Gambar 2.5)
27
 9. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2.6)
10. Tambahkan Counterstain, dan diamkan selama 60 detik
11. Cuci dengan air mengalir
12. Keringanginkan dan beri Label (gambar 2.7)
13. Amati dibawah mikroskop mulai dari perbesaran lemah hingga kuat (dengan
minyak imersi)

Gambar 8. Prosedur pengecatan Gram

Hasil

E. coli, S. aureus, campuran E. coli dan S. Aureus

28
Pembahasan

1. Bagaimana sifat gram bakteri Lactobacillus dan Pedrococcus ? Jelaskan

2. Apa perbedaan antara pengecatan sederhana dengan pengecatan diferencial?

3. Sebutkan nama reagent dan tujuan penggunaan masing-masing pada pengecatan

gram
a. Mordant

b. Cat utama

c. Decolorizer

d. Counterstain

4. Tahapan mana yang paling penting atau yang paling menjadi penyebab hasil
pengecatan gram yang buruk? Jelaskan

5. Mengapa kultur muda yang dipakai dalam pengecatan gram ?

6. Apa yang dimaksud dengan gram variabel?

7. bagian sel apakah yang paling terlibat dalam pengecatan gram ? mengapa?

8. Jelaskan bagaimana mekanisme respon bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif terhadap tiap tahapan dalam prosedur pengecatan gram !

29
Pengecatan Flagella

Flagela bakteri merupakan alat pergerakan berbentuk silinder dengan diameter 10-30
nm. Pengamatan flagella menggunakan mikroskop cahaya dapat dilakukan dengan
cara menebalkan flagella dengan melapisi menggunakan mordan seperti tannic acid
danpotassium alum, kemudian dicat dengan basic fuchsin(Gray method),
pararosaniline (Leifson method), silvernitrate (West method; nama belakang Marcia
West, ahli mrikobiologi klinis) atau crystal violet (Difco’s method). Meskipun prosedur
pengecatan flagella sulit dikerjakan, tetapi memberikan informasi mengenai adanya
dan lokasi flagella. Pengecatan Difco’s SpotTest Flagella menggunakan larutan crystal
violet beralkohol sebagai cat utama dan tannic acid serta aluminum potassium sulfate
sebagai mordants. Alkohol akan menguap selama pengecatan sehingga crystal violet
membentuk endapan disekitar flagella dan akan meningkatkan ukuran .

Gambar 9. Letak flagella pada sel bakteri

a. monotrichous
b. lophotrichous
c. amphitrichous
d. peritrichous

Bahan
1. Kultur Alcaligenes faecalis dan and
Pseudomonasfluorescens pada media tryptic soy agar
miring umur 18 jam
2. Minyak imersi
3. Kertas lensa dan pembersih lensa
4. West stain
5. solution A
6. solution B

Alat
1. pencil
2. jarum ose (inoculating loop)
3. Gelas benda
4. Akuades
30
 5. Water bath
6. Pipet
7. Mikroskop

Procedure (West)
1. Beri label pada ujung kiri gelas benda dengan nama bakteri dan nama praktikan
2. Pindahlkan secara aseptic bakteri menggunakan jarum ose dan suspensikan
didalam 3 tetes akuadest di bagian tengah gelas benda
3. Ratakan suspensi hingga area 3 cm menggunakan jarum inokulasi
4. Kering anginkan selama 15 menit
5. Tambahkan larutan A(mordan) dan biarkan selama 4 menit.
6. Cuci dengan akuades
7. Letakan potongan kertas tissue di atas smear dan dijenuhi dengan larutan B
(cat). Panaskan gelas benda dalam water bath selama 5 menit. Tambahkan cat
untuk mencegah gelas benda menjadi kering.
8. Ambil kertas dan cuci larutan B yang berlebih dengan akuades. Aliri gelas benda
dengan akuades dan biarkan selama 1 menit.
9. Cuci sekali lagi dengan akuades
10. Kering anginkan pada suhu kamar
11. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat.

Gambar 10..Prosedur pengecatan flagella

31
Hasil

Alcaligenes faecalis Pseudomonasfluorescens

Pembahasan

1. Bagaimana susunan flagella pada Alcaligenes faecalis dan

Pseudomonasfluorescens?

2. Mengapa flagella sulit dicat?

3. Mengapa digunakan kultur muda untuk pengecatan flagella?

4. Mengapa pada pengecatan flagella gelas benda harus bebas lemak dan
minyak?

5. Sebutkan 4 jenis susunan flagella

a. …………………..
b. …………………..
c. …………………..
d. ………………….

6. Apa yang terjadi pada flagella setelah dilakukan pengecatan?

32
Pengecatan Endospora

Endospora dihasilkan didalam sitoplasma sel bakteri oleh beberapa genus bakteri seperti
Bacillus dan Clostridium. Endopsora dibentuk pada saat sel sel bakteri berada pada kondisi
yang tidak baik seperti kkeringan, kekuranga nutrien, temperatur yang ekstrim dan adanya
agensia kimia seperti antibiotik dan adanya radiasi pengion. Adanya endopsora dapat
diamati melalui teknik pengecatan. Tekinik ini dikembangkan berdasarkan kharakteristik
dinding endospora. Teknik pengecatan endospora yang sering dipakai adalah SCHAEFFER-
FULTON endospore stain yang menggunakan malachite green sebagai pewarna endospora.

Bahan :
1. Kultur agar miirngBacillus subtilis umur 5 hari
2. Kultur agar miring Staphylococcus epidermidis umur 24 jam
3. Malachite green solution
4. Safranin solution

Alat
1. Gelas benda
2. Pensil
3. Rak gelas benda
4. beaker glass 500 mL
5. Tripod dengan asbestos mat
6. Penjepit

Prosedur
1. Bersihkan gelas benda menggunakan alkohol untuk menghilangkan lemak dan
minyak serta kotoran yang ada
2. Ambil satu ose air steril secara asetik dan letakan diatas gelas benda
3. Ambil secara aseptik satu ose kultur bakteri dan campurkan dengan air steril yang
ada di atas gelas benda.
4. Ratakan dan buat smear bakteri
5. Tambahkan larutan Malachite green secara berlebihan
6. Letakan gelas benda pada pemanas selama 5 menit, dijaga jangan sampai kering
dengan cara menambahkan menambahkan cat bila tampak kan mengering dan
jangan sampai mendidih.
7. Ambil gelas benda dan dinginkan, kemudian cuci dengan air mengalir selama 30
detik atau sampai air menjadi tidak berwana hijau lagi.
8. Tambahkan larutan cat safranin selama 30 detik
9. Cuci dengan air mengalir dan kering-anginkan
10. Amati dengan mikroskop pada perbesaran kuat menggunakan minyak imersi
11. Catat hasil pengamatan bagaimana warna endospora dan bagaimana warna sel
vegetatif dan tentukan letak endospora (sentral, terminal atau sub terminal),

33
 Gambar 11. .Prosedur pengecatan endospora

Hasil

Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis

1. Bagaimana letak endospora pada Bacillus subtilis dan Staphylococcus epidermidis?

2. Mengapa pemanasan diperlukan pada prosedur pengecatan endospora?

3. Dimana letak endospora didalam sel vegetatif?

34
 4. Apa fungsi endospora?

5. Mengapa endospora sulit untuk dicat?

6. Mengapa endospora sulit di cat?

Pengecatan Kapsula

Banyak bakteri menghasilkan lapisan seperti lendir yang biasanya dirujuk sebagai kapsula.
Komposisi kapsula bervariasi antar spesies. Polysaccharides, polypeptides, dan
glycoproteins hampir selalu ditemukan pada setiap kapsula. Ada dua cara konvensional
untuk menentukan adanya kapsula yaitu Anthony’s capsule
staining method (E. E. Anthony, Jr., seorang bacteriologist dari University of Texas,
Austin, pada tahun 1930 an) (figure 11.1b) dan prosedur menurut Graham andEvans
(Florence L. Evans, seorang bacteriologist dari University of Illinois pada tahun 1930an) .
Pada prosedur Anthony’s digunakan dua jenis reagent yaitu cat utama berupa crystal
violet, yang memberikan pewarnaan ungu tua pada kapsula dan sel. Tidak seperti sel,
kapsula bersifat nonionik sehingga cat utama tidak dapat terikat. CuSO4 merupakan
agensia peluntur akan menghilangkan cat utama, pada waktu yang sama CuSO4 juga
berfungsi sebagai counterstain yang akan diserap oleh kapsula, sehingga kapsula akan
berwarna biru muda atau merah muda. Pada prosedur pengecatan ini smear tidak
dilakukan fiksasi dengan pemanasan.

Bahan
1. Kultur Klebsiella pneumoniae dan Alcaligenes denitrificans umur 18 jam
2. Tyler’s crystal violet (1% aqueous solution) atau
3. Gram’s crystal violet (1% aqueous solution)
4. larutan copper sulfate (CuSO4 5H2O)n 20% (w/v)
5. minyak imersi

Alat
1. mikroskope
2. kertas lensa dan pembersih lensa
3. gelas benda
4. pensil
5. kertas penghisap
6. jarum ose

Procedure:
Pengecatan kapsula metode Anthony’s

1. Bersihkan gelas benda dan beri label pada ujung kiri nama bakteri yang akan
dicat
35
 2. Ambil secara aseptic menggunakan jarum ose kultur bakteri dan letakan diatas
gelas benda. Ratakan dan kering-anginkan. Jangan difiksasi dengan panas.
3. Tempatkan pada rak gelas benda
4. Tambahkan larutan cat crystal violet secara berlebihan dan diamkan selama 4-7
menit.
5. Cuci dengan larutan CuSO4 20%. Hisap kelebihan atau sisa larutan CuSO4 dengan
yertas penghisap.
6. Amati dengan mikroskop pada perbesaran kyat dengan
minyak imersi. Catat warna sel dan warna kapsula.

Gambar 12. .Prosedur pengecatan kapsula

Hasil

Klebsiella pneumoniae Alcaligenes denitrificans

1. Bagaimana hasil pengecatan kapsula pada Klebsiella pneumoniae dan Alcaligenes

denitrificans

2. Senyawa apa sajakah yang telah diidentifikasi merupakan penyusun kapsula

3. Apa fungsi kapsula bagi bakteri

36
4. Apa fungsi ganda Cu SO4 pada pengecatan kapsula

5. Sebutkan jenis-jenis bakteri lain yang menghasilkan kapsula

Pustaka

Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The

McGraw−Hill Companies, 449 p

J. A. Morello, P. A. Granato, H. E. Mizer, 2003, Laboratory Manual and Workbook in

Microbiology, The McGraw−Hill Companies, 285 p

Nilai Akhir:..........................................................

Nama & Paraf Asisten: ......................................

37
 Grup: ......................................
MODUL 4: NUTRISI DAN PERTUMBUHAN
TOPIK 7 : Pembuatan Media dan Sterilisasi Tgl: .........................................

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Ada 2 jenis media yang dapat dibedakan berdasarkan komponen

dasar yang membentuknya yaitu:
1. Media kompleks: dibuat dari bahan alami yang komposisinya tidak
diketahui secara pasti. Komponen media kompleks terdiri atas hasil
penguraian atau ekstrak dari berbagai jenis jaringan tumbuhan, daging,
kasein, dan ragi yang kaya akan polipeptida, asam amino, vitamin, dan
mineral.
2. Media yang tersusun dari bahan kimia tertentu, Jenis media ini
dibuat dari beberapa jenis bahan kimia dengan konsentrasi tertentu.
Bahan kimia yang digunakan terdiri dari sumber C (misal glukosa,
dekstrosa, sukrosa, dsb); sumber N (misalnya NH4NO3, NH4C1, urea,
dsb), sumber P {misal KH2PO4), K2HPO4), vitamin, dan sumber mineral
seperti Fe, Mn, S, dsb.

Jenis media berdasarkan komposisi medianya

Atas dasar komposisinya media antara lain terbagi atas:
1. Media umum, yaitu media yang mempunyai komposisi dasar
untuk pertumbuhan bakteri (NB- nutrient Broth; NA- nutrient Agar atau
LB-Lactose Broth; LA- Lactose Agar); sedangkan media umum untuk
jamur digunakan PDB-Potatoes Dextrose Broth, PDA- Potatoes
Dextrose Agar).
2. Media diperkaya (enriched media), yaitu media sintetik yang
mengandung komponen-komponen asal makhluk hidup, seperti: darah,
serum, atau ekstrak jaringan tumbuhan dan hewan.
3. Media Selektif, yaitu media sintetik yang dibubuhi zat kimia tertentu
yang dapat mencegah pertumbuhan sekelompok mikroba tanpa
menghambat pertumbuhan mikroba lainnya. Contohnya adalah brilliant
green lactose Bile broth (BGLBB) yang digunakan dalam penentua
bakteri coli tinja, jenis media ini dapat menghambat pertumbuhan
bakteri pemfermentasi selain bakteri coliform.
4. Media diferensial yaitu media yang mengandung senyawa kimia
tertentu yang dapat membedakan sifat mikroba tertentu dalam suatu
kultur campuran dari jenis mikroba lainnya karena adanya perbedaan
respon terhadap senyawa kimia tersebut. Sebagai contoh adalah
eosine methylene blue (EMB) yang digunakan dalam uji
konfirmasi bakteri E. Coli di dalam uji MPN menampilkan tipe
koloni yang berwarna metalik kehijauan. Sedangkan bakteri
enterobacter menunjukkan warna merah muda tanpa unsur metalik.

38
Jenis media berdasarkan komposisi bentuknya
Berdasarkan konsistensi media terdiri atas : Padat (solid medium), misalnya
bulyon agar dan agar nutrisi (konsentrasi agar 2%); Cair (fluid medium),
misalnya air pepton airdan Setengah padat (semi solid medium), misalnya agar
nutrisi dengan konsentrasi agar 0,5%

Bentuk-bentuk agar padat adalah:

1. agar miring (slant agar)
2. agar diri (deep tube agar)
3. agar-agar datar (plate agar)

Hal-hal penting untuk Persyaratan Medium Pertumbuhan

Mikroorganisma

- Diperlukan adanya zat-zat yang dibutuhkan oleh mikroba untuk membangun

bagian dari badannya sendiri maupun membentuk turunan (reproduksi).
- Penambahan agar-agar bertujuan agar bila mikroba tersangkut di suatu bagian
pada medium tersebut, mikroba tersebut akan tumbuh dan menghasilkan
mikroba murni yang hanya terdiri dari satu species saja (terdiri atas keturunan
dari satu jenis species).
- Penambahan zat-zat Iain bertujuan untuk melihat metabolit yang merupakan
hasil
pencemaan dari mikroba tersebut. Dengan demikian sifat sifat mikroba dapat
diketahui. Hasil tersebut sangat berguna untuk kepentingan diagnosa.
- Dapat dikatakan bahwa sebagian besar badan bakteri terdiri air dan protein.
Karena itu pada umunya pembenihan dibuat dari air dan protein dalam bentuk
rebusan daging (kaldu). Disamping itu untuk mempermudak permulaan tumbuh
bakteri diberikanlah protein-protein yang tidak terlalu besar, seperti air pepton.
- Untuk pertumbuhan juga diperlukan tekanan osmotik yang optimal. Untuk
itu ditambarikan NaCl sebanyak 0,5%. Hal lainnya adalah pengaturan kondisi
pH. pH optimal bagi medium tumbuh adalah sekitar pH7.
- Semua ini merupakan komponen medium dasar kesatu (basal medium satu)
yang
dinamakan medium bulyon yang terdiri dari : air kaldu + pepton 1% + CaCL
0,5% dengan pH yang sesuai untuk suatu jenis mikroba (komposisi medium
pada lampiran 1).
- Medium ini haruslah tidak mengandung mikroba hidup jenis apapun sebelum
dipakai (medium harus steril). Selanjutnya bila medium ini ditanami, maka yang
ditemukanadalah mikroba yang berasal dari bahan yang ditanam saja.

Teori tentang sterilisasi medium

Sterilisasi adalah proses pemusnahan semua bentuk kehidupan pada media dan
peralatan. Guna memusnahkan sel dan spora mikroba dilakukan upaya sterilisasi..
Sel vegetatif ragi dan cendawan dapat dimusnahkan pada suhu 50 - 60° C
selama 5 - 1 0 menit, sedangkan sporanya pada suhu 70 - 80° C. Sel-sel
vegetatif bakteri dapat dimusnahkan pad suhu 60 - 70 °C selama 5 - 2 0
menit, sedangkan sporanya membutuhkan suhu lebih tinggi dan waktu
sterilisasi lebih lama. Misalnya spora Bacillus antrhracis musnah pad suhu 100 C
selama 15 menit atau pada suhu 105° C selama 5 - 1 0 menit. Pemusnahan spora
B. Subtilis memerlukan waktu beijam-jam pada suhu 100° C atau 5-25 mn2it
pada suhu 105°C.

39
Jenis-jenis Sterilisasi
Pada dasarnya sterilisasi terdiri atas:

A..Pemanasan:
1. Pemanasan udara panas: - 160 - 180° C selama 1,5 - 3 jam ,
digunakan untuk sterilisasi alat- alat dan gelas.

2. Pemanasan lembab/basah: Pengaliran uap pada suhu 100°C secara

intermiten, digunakan untuk sterilisasi bahan-banahn thermolabil seperti
susu, larutan gula, dsb.
3. Pemanasan suhu tinggi: pemanasan uap denga uap bertekanan 15 Ib/in2
atau 1,1 kg/cm2 (suhu 121,5 C), dengan alat autoklaf (lihat modul 1).
Digunakan untuk sterilisasi media, larutan yang termostabil, peralatan
injeksi, dan sebagainya.

B. Filtrasi Membran Filter: mempergunakan milipore selulose asetat, asbestoz

Seitz, membran diatom, membran gelas. Digunakan untuk sterilasasi larutan
thermolabil.

C Zat kimia: seperti ethilen oksida, akohol, dll untuk sterilisasi pipet dan cawan
petri;beta propiolakton : untuk steriliasi jaringan hidup.

Tujuan:
1. Mahasiswa dapat mengetahui macam-macam medium untuk pertumbuhan
mikroorganisma.
2. Mahasiswa mampu menakar dan menyiapkan media sintetis untuk
pertumbuhan mikroba.
3. Mahasiswa mampu melakukan sterilisasi media pertumbuhan mikroba
dengan cara sterilisasi autoklaf.

Kompetensi

1. Mahasiswa mampu menjelaskan fungsi nutrisi bagi mikroorganisme

2. Mahasiswa mampu menjelaskan jenis-jenis media
3. Mahasiswa mampu menjelaskan bermacam-macam sterilisasi media
4. Mahasiswa mampu dan trampil membuat media dengan benar
5. Mahasiswa mampu dan trampil mensterilisasikan media dengan benar.

Prosedur Kerja

a. Bahan :
1. Media Nutrient Broth (NB)
2. Media Nutrient Agar (NA)
3. Media Zobel Broth dan Agar
4. Media Potato Dekstro Agar (PDA )
5. Air laut steril

40
b. Alat :
1. Autoklaf
2. Tabung reaksi
3. Kapas penyumbat
4. Cawan Petri
5. Lampu spirtus
6. Kertas Koran pembungkus

c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Prosedur Penyiapan Media Tumbuh Mikroba

1. Larutkan komponen-komponen media yang dibutuhkan sesuai resep

(lampiran 1)
dalam air laut steril
2. Atur pH larutan sehingga mencapai pH optimum yang diperlukan
dengan
menggunakan kertas pH atau pH meter. Gunakan larutan encer HCL
untuk
menurunkan pH dan larutan encer NaOH untuk menaikkan pH.
3. Masukkan larutan media dalam wadah yang sesuai, yaitu tabung
reaksi atau
erlenmeyaer, kemudian sumbat wadah tersebut dengan sumbat yang
sesuai atau
dengan kapas babas lemak padat.
4. Lakukan sterilisasi media dengan autoklaf

Prosedur Pembuatan Media:

1. Persiapkan media NA, NB, PDA, Zobel padat dan cair menurut petunjuk
pemakaian dengan volume sesuai kebutuhan. Panaskan hingga agar
larut.(lihat lampiran 1. resep media )
2. Tuangkan media yang sudah dimasakatau larut ini dengan hati-hati ke
dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml. untuk media agar miring dan 10 ml
untuk agar din dan datar. Sumbat baik-baik dengan kapas dan sebagian
dimasukkan dalam erlenmeyer 250 cc. Taruhlah tabung-tabung reaksi
tersebut dalam wadah dan tutupi dengan kertas..
3. Taruh tabung reaksi yang berisi agar dan erlenmeyer dalam autoklaf dan
sterilisasikan .
4. Setelah tahap sterilisasi selesai, dinginkan media yang telah dibuat
pada suhu kamar.
5. Media tersebut dapat disimpan pada lemari pendingin (suhu 4°C),
dengan tujuan untuk menghindarkan kontaminasi dan
mengurangi dehidrasi media. Pergunakan media tersebut pada
saat yang diperlukan pada tahap praktikum selanjutnya.
6. Catatan : untuk media yang mau dibuat agar miring didinginkan
dalam posisi miring sehingga apabila memadat media tersebut
sudah dalam posisi miring pada tabung reaksi.

41
Prosedur sterilisasi media menggunakan Non-disposable filtration
apparatus

1. Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld,

ChamberlandZeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer
penampung.
2. Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi
corong dengan larutan yang akan disterilkan.
3. Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan
pompa.
4. setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer,
maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas steril

Prosedur sterilisasi media menggunakan autoklaf

1. Isi Autoklafe dengan air bersih hingga tanda batas
2. Masukkan angsang
3. Masukkan media dalam erlenmeyer yang akan disterilisasikan
4. Tutup aotoklafe dengan cara memutar klem yang ada searah jarum jam
5. Nyalakan pemanas dan buka katup pengaman
6. Setelah udara yang ada di dalam autoklafe keluar yang ditandai dengan
keluarnya uap air pada katup pengaman segera tutup katup pengaman
tersebut.
7. Amati jarum indikator tekanan uap hingga mencapai tekanan 1 atm, 121 o C ,
pertahankan tenanan tersebut salama 15 menit kemudian pemanasan
diperhentikan..
8. Setelah penunjuk tekanan menunjukkan angka nol, buka katub pengaman
untuk membuang sisa uap yang masih ada di dalam autoklaf. Kemudian
autoklaf dibuka untuk mengeluarkan media .

42
Pembahasan

1. Jelaskan fungsi media pada penelitian mikrobiologi

2. Jelaskan ada berapa jenis media berdasarkan konsistensinya

3. Apa fungsi pemanasan pada saat membuat media agar

4. Kenapa pada saat membuat media agar dilakukan pengadukan secara

menerus ?

5. Kenapa media pada penelitian mikrobiologi perlu dilakukan sterilisasi ?

6. Ada berapa macam sterilisasi media yang anda ketahui ? jelaskan jawaban
anda !

7. Kenapa pada saat sterilisasi menggunakan autoklaf perlu dilakukan

pengeluaran udara dalam autoklaf?

8. Apa fungsi katup pengaman pada autoklaf ?

43
Simpulan dan saran :

Pustaka

1. Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The

McGraw−Hill Companies, 449 p
2. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, UNSOED

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

44
Lampiran 1.Resep media

Media Nutrient Agar

1. Beef extract 3 g
2. Peptone 5 g
3. Agar 15 g
4. Air laut steril s.d 1000 ml

Media Nutrient Broth

1. Beef extract 3 g
2. Peptone 5 g
3. Air laut steril s.d 1000 ml

Media Potato Dextrose Agar (PDA)

1. Potato/kentang 3 g
2. Peptone 5 g
3. Agar 15 g
4. Air laut steril s.d 1000 ml

Media Zobel Agar

1. Yeast extract 1 g
2. Peptone 4 g
3. Agar 15 gr
3. Air laut steril s.d 1000 ml

Media Zobel Broth

1. Yeastextract 1 g
2. Peptone 4 g
3. Air laut steril s.d 1000 ml

45
 Grup: ......................................
MODUL 4: NUTRISI DAN PERTUMBUHAN
TOPIK 8:Penanaman dan Isolasi Tgl: .........................................

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri
dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri
inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut
merupakan prosedur pengambilan sampel.

A. Sampel Sedimen , tumbuhan lamun dan rumput laut

Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam sedimen ,
tumbuhan lamun dan rumput laut maka cara pengambilannya disesuaikan dengan
tujuan dan kebutuhan.

B. Sampel air laut

Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal
dari air laut yang botolnya dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus
air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat
dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka
sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1.Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam air laut steril. Tujuan
dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam
preparsi bergantung kepada bentuk sampel :

1.1. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang
memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada
benda tersebut. Contohnya adalah permukaan daun lamun dan rumput laut ,
permukaan karang atau organisme laut dll. Caranya dengan mengusapkan
cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak
dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan
terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.

46
1.2. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel
pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun
lamun dan rumput laut atau organisme laut dll. Rinse merupakan prosedur kerja
dengan mencelupkan sampel ke dalam air laut steril dengan perbandingan 1 : 9
(w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas
dengan air laut steril 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.

1.3. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk

dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam
dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air laut steril . Contoh sampelnya
spong, karang atau daun lamun dan rumput laut . Perbandingan antar berat
sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v).

47
2. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah

mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya
tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1 : 9 (w/v) untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

3. Teknik Penanaman.

3.1. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya
untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung
pengenceran terakhir.

3.1.1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di
permukaan agar diperoleh kultur murni.

3.1.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 ºC) untuk dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan
agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang
tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar
yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.

48
3.2. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru. Ada 3 jenis teknik goresan yaitu :

1. Goresan Sinambung
2. Goresan T
3. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Tujuan:

1. Mahasiswa dapat menanan mikrobia dari sampel ke media agar .

2. Mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari hasil penanaman di cawan petri
ke agar miring.
3. Mahasiswa dapat memurnikan isolat mikrobia sehingga diperoleh kultur
murni.

Kompetensi
1. Mampu menjelaskan bermacam-macam cara menanam
mikroorganisme yang berasal dari sampel
2. Mampu menjelaskan bermacam-macam teknis isolasi
mikroorganisme yang berasal dari sampel
3. Mampu menjelaskan teknik memindahkan mikrobia ‘
4. Mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya
sehingga didapat kultur murni.
5. Trampil menanam mikrobia dengan benar
6. Trampil mengisolasi mikrobia dengan benar
7. Trampil memindahkan mikrobia dengan benar

Prosedur Kerja

a. Bahan :
1. Media Nutrient Broth (NB)
2. Media Nutrient Agar (NA),
3. Media Zobel Agar dan Broth
4. Media Potato Dekstro Agar (PDA )
5. Sampel sedimen
6. Sampel air laut
7. Sampel biota laut

b. Alat :
7. Autoklaf
8. Tabung reaksi dan durham
9. Kapas penyumbat
10. Cawan Petri
11. Lampu spirtus
12. Mikropipet
13. Pipet tetes dan ukur
14. Erlemmeyer
15. Mortal dan pestle
16. Beaker glass
17. Kertas Koran pembungkus
18. Batang L dan jarum ose
19. Cotton bud
49
c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Spread Plate (agar tabur ulas)

Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian

teteskan diataspermukaan agar yang telah memadat.
2. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar
diatasbunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa
detik.
3. Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya
tetesansuspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
4. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-selmikroorganisme dapat mati karena panas.

Gambar1. Teknik spreading plate dengan menggunakan batang L

Pour Plate (agar tuang)

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Siapkan cawan steril, tabling pengenceran yang akan ditanam dan media padat
yangmasih cair (>45°C).
2. Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong.
3. Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk
menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

50
 Gambar 2. Teknik Pour Plate (Agar Tuang)

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour
plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,
sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

a. Goresan Sinambung
Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
setengahpermukaan agar.
2. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180°C lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni
tunggal,melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

Gambar 3. Teknik goresan sinambung

51
b. Goresan T
: Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi

daerah 1 dengan streak zig-zag
2. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah
2 {streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan
hal yang sama pada daerah 3

Gambar 4. Teknik goresan T

c. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat.I>aerah 1
merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mxroorganisma. Gores an selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertamasehingga
jumlah semakin sedikit dan akhimya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Gambar 5.6. Teknik goresan kuadran

Gambar 5. Teknik goresan kuadran

Isolasi Bakteri dari Sampel Sedimen

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Sedimen seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate
3. pada medium NA atau Zobel , setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam.
4. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloniyang relatif terpisah
dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali.
5. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA atau media Zobel baru
dengan teknik streak kuadran.

52
 Gambar 6. Teknik isolasi bakteri

Isolasi Jamur dari Sedimen

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Sedimen dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30menit dengan
cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
2. Sedimen yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung
3. pengenceran bertingkat.
4. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate kemedia PDA yang
ditambah streptomycin atau penicillin.
5. Kemudiandiinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
6. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
7. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

53
 Gambar 7. Teknik

lsolasi Mikroba pada Medium Cair

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Ose dibakar sampai pijar, kemudian didinginkan kembali di daerah dekat api I Biakan bakteri
diambil dan sumbatnya dibuka, kemudian mulut tabung dibakar.

2. Ose dimasukkan ke dalam biakan bakteri tersebut, kemudian ose dikeluarkan lagi. -. Medium
cair yang akan ditanami, dibuka sumbatnya, mulut tabungnya dibakar dan ose yang sudah
mengandung suspensi bakteri dimasukkan ke dalamnya.
3. Ose dikeluarkan, mulut tabung dibakar kembali dan ditutp dengan sumbatnya.
4. Ose bekas pakai kemudian dibakar kembali hingga pijar.
5. Nama dan tanggal penanaman kemudian dituliskan pada tabung dengan bantuan potlot gelas
6. spidol) pada tabung yang baru ditanami. S. Medium yang telah mengandung bakteri
dimasukkan ke dalam inkubator (lemari pengeram).
7. Suhu dan lamanya bergantung pada keperluan dan menurut sifat bakterinya.

Pembiakan pada agar miring

Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut: ;.
1. Ose dipanaskan sampai pijar.
2. Setelah ose dingin, bakteri diambil dengan ose tersebut dan seterusnya (langkah-langkah
samaseperti pada medium cair). Yang berbeda adalah cara penamannya yaitu ose digoreskan
secarazigzag pada permukaan media agar miring.

54
Penanaman pada Lempeng Agar
Adapun prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Ose dipanaskan sampai pijar kemudian didinginkan.

2. Biakan diambil dan digoreskan pada lempeng agar yang akan ditanami.
3. Cawan petri ditaruh di meja dengan bagian tutup berada disebelah bawah, lalu bagian
yangada lempengnya dipegang dengan tangan kin dan diangkat keluar dari tutupnya..
4. Dengan ose tadi dibuat garis-garis di atas permukaan lempeng sedemikian rupa, dibuat garis
sebanyak mungkin tetapi tidak saling menempel. Dapat dilakukan dengan goresan
sinambung,goresan T, atau goresan kuadran. f Kemudian lempeng dimasukkan dalam
tutupnya dan ose dipanaskan sampai pijar kembali iengan tujuan untuk membunuh sisa
bakteri yang masih melekat pada ose tersebut. : Nama dan tanggal dituliskan pada bagian
yang ada mediumnya.
5. Media dieramkan dalam inkubator dengan posisi tutup cawan petri ada dibawah. Suhu
6. inkubasi dan lamanya tergantung keperluan menurut sifat bakteri yang ditanam (padaumunya
1 x 24 jam atau 2 x 24 jam.

55
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknikaseptis

56
Menindahkan biakan secara aseptis

57
Memindahkan biakan dari cawan

58
Memindahkan cairan dengan pipet

59
Menuang media

Saran-saran kerja aseptis :

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer

sebaiknya bagian mulut (bagian yang
2. memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
3. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.
4. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat
ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang
terjadi.
5. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.
6. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar
Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi
aseptisnya

60
Pembahasan

1. Jelaskan bagaimana menggunakan mikropipet

2. Apa tujuan pemijaran pada teknik aseptic

3. Apa tujuan sub kultur ?

4. Dalam melakukan subkultur kapan menggunakan jarum ose

5. Bagaimana mungkin bisa terjadi kontaminasi subkultur ?

6. Bagaimana menentukan bahwa media yang akan digunakan benar-benar steril sebelum
digunakan

7. Bagaimana tanda-tanda terjadinya pertumbuhan pada medium cair

8. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur cair dan apa bedanya dengan kultur miring

3. Apa fungsi mineral oil steril dalam pemeliharaan stok kultur

4. . Jelaskan bagaimana suatu kultur dapat di lyophilisasi

61
5. Apa yang dimaksud dengan koloni bakteri

6. Mengapa diperlukan membuat seri pengenceran agar proses penanaman dan isolasi mikrobia

7. Jelaskan bermacam macam bentuk bentuk koloni

8. Apa tujuan teknik spread-plate

9. Pada semua pekerjaan laboratorium yang menggunakan cawan petri, kenapa label diletakan di
bawah cawan petri

10. Pada teknik streak-plate, bagaimana mikroorganisme diencerkan dan disebar untuk membentuk
koloni individu

11. Pada area yang mana dari media dalam cawan petri yang akan ditumbuhi paling padat oleh
pertumbuhan bakteri ? Dan dimana yang terdapat pertumbuhan paling sedikit ? jelaskan

12. Apakah setiap koloni yang terpisah menggambarkan pertumbuhan satu sel ? Bagaimana
membuat agar diperoleh koloni tunggal?

62
 13. Bagaimana streak-plate dapat terkontaminasi

14. Bagaimana hasil metode pou-plate dibandingkan dengan streak-plate dan spread-plate

15. Sebutkan keuntungan utama metode pour-plate dibandingkan metode isolasi bakteri yang lain?

16. Mengapa agar (yang telah dilelehkan) pada suhu 48° dan 50°C tidak mematikan sebagian
besar bakteri.

17. Jelaskan bagaimana pour-plate dapat digunakan untuk isolasi jamur

18. Mengapa cawan petri harus dibalik pada saat dilakukan inkubasi

Daftar pustaka

Harley-Prescott, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition.McGraw-Hill Companies,

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, UNSOED

63
 MODUL 5: Penghitungan Jumlah Total bakteri
TOPIK I: Teknik Total Plate Count

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Banyak penelitian memerlukan penentuan kuantitatif populasi bakteri. Metode yang paling banyak
digunakan untuk menentukan jumlah bakteri adalah metode standar, yaitu metode plate count dan
spektrofotometri (turbidimetri). Meskipun kedua metode ini agak mirip tetapi ada perbedaan yang jelas.
Sebagai contoh, metode plate count merupakan metode pengukuran standard kepadatan sel secara tidak
langsung dan nilai yang terungkap adalah hanya untuk bakteri yang hidup saja. Sedangkan pada analisis
spektrofotometri didasarkan pada kekeruhan danbersifat pengkuran tidak langsung, dan hasil
pengukuran merupakan keselruhan sel yang ada baik hidup maupun mati. Metode plate count terdiri dari
pengenceran sampel dengan larutan garam steril atau dapar fosfat hingga diperoleh populasi bakteri
yang cukup encer untuk penghitungan yang akurat.
Pada penghitungan dengan plate count dipersyaratkan jumlah koloni dalam cawan petri adalah antara
25-250 koloni. Jumlah koloni yang kurang dari 25 tidak dapat diterima untuk alasan statistik,dan untuk
jumlah koloni lebih dari 250koloni cenderung menghasilkan koloni terlalu dekat satu sama lain. Asumsi
yang digunakan dalam metode ini adalah bahwa setiap sel bakteriyang layak adalah terpisah dari yang
lain dan akan berkembang menjadi satu koloni diskrit(CFU). Dengan demikian, jumlah koloni
memberikan informasi jumlah bakteri hidup yang dapat tumbuh di bawah kondisi inkubasi yang
digunakan. Plating secara duplo atau triplikat diperlukan untuk mendapat nilai yang tepat.

Tujuan
1. menghitung jumlah total bakteri secara langsung
2. menghitung jumlah total bakteri menggunakan teknik plate count

Kompetensi

Setiap mahasiswa mampu :

1. menjelaskan prinsip dan prosedur metode standard penghitungan jumlah total bakteri
2. menjelaskan fungsi pengenceran dalam metode plate count
3. trampil melakukan kegiatan pengeceran
4. trampil melakukan penanaman bakteri dengan cara pour-plate
5. trampil menganalisis hasil penghitungan bakteri dengan metode plate count

Prosedur Kerja
a. Bahan
1. Sampel jaringan ikan laut
2. 4 tabung larutan buffer phosphate steril
3. 6 tabung berisi 10 mL NA 48° sampai 50°C
4. Larutan cuka 40%
5. Larutan cat rose bengal
b. Alat
3. Mikroskop
4. Gelas benda
5. Pipet 1 mL dan 0,1 mL
6. 6 cawan petri
7. Bunsen burner
8. Rak tabung reaksi
9. Inkubator

64
c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Bagian A. Cara melakukan penghitungan secara langsung

Prosedur
1. Haluskan contoh jaringan dengan mortar setril
2. Timbang 10 gram dan masukan ke dalam 99 mL larutan garam steril yang mengandung 0,015 %
agar, selanjutnya digojog hingga homogeny
3. Pipet 0,1 mL suspense ke atas gelas benda, ratakan seluas 1 x 4 cm
4. Keringkan noda secara mendatar di atas uap air mendidih
5. Setelah dingin rendam dalam larutan asam cuka 40% selama 3 menit, cuci dengan air mengalir dan
kering anginkan
6. Bubuhkan larutan cat rose Bengal 1 % pada noda, keringkan diatas uap air mendidih ( minimal 1
menit)
7. Setelah dingin cuci dengan air mengalir dan kering anginkan
8. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Tentukan jumlah bakteri rata-rata tiap bidang
pemandangan dari 25 bidang pemandangan, dan hitung jumlah bakteri tiap mL contoh suspense
bakteri

Tabel pengamatan

Bidanf pemandangan ke Jumlah bakteri

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Bagian B. Cara melakukan penghitungan jumlah bakteri dengan metode plate count

1. Siapkan 8 cawan petri setril, beri kode 1:10.000. 1:100.000, 1:1.000.000.

2. Haluskan jaringan ikan dalam mortar steril
3. Timbang 10 gram contoh secara aseptic
4. Masukan 10 gram contoh ke dalam 90 mL larutan garam (diperoleh pengenceran 1:10)
5. Gojok hingga homogen
6. Diambil 1 mL suspensi hasil pengenceran 1:10 dan pipetkan kedalam 9 mL air garam, gojok hingga
homogen (diperoleh pengenceran 1:100)
7. Diambil 1 mL suspensi hasil pengenceran 1:100 dan pipetkan kedalam 9 mL air garam, gojok hingga
homogeny (diperoleh pengenceran 1:1000)
8. Demikian seterusnya hingga diperoleh pengenceran 1:10.000.000
65
9. Inokulasikan 100 uL suspense pengenceran 1:10.000, 1:100.000 dan 1:1.000.000 ke dalam cawan
petri seteril, kemudian tuang secara aseptic medium agar yang telah dicairkan, putar cawan petri
hingga suspense bahan tercampur secara merata dengan medium.
10. Biarkan dingin dan memadat, kemudian cawan petri dibungkus kertas dan diinkubasi secara terbalik
pada suhu kamar selama 24-48 jam
11. Hitung jumlah koloni yang ditumbuh pada masing-masing petridish
12. Pilih cawan petri yang mengandung 25-250 koloni. Cawan petri dengan jumlah koloni lebih dari 250
tidak dapat dihitung dan ditetapkan sebagai terlalu banyak untuk dihitung (TNTC). Cawan petri
dengan jumlah koloni kurang dari 25 dinyakatan sebagai terlalu sedikit untuk dihitung (TFTC)
13. Hitung jumlah bakteri (CFU) per gram contoh bahan dengan cara membabagi jumlah koloni dengan
factor pengenceran. Sebagai contoh pada pengenceran 10-6 diperoleh jumlah koloni per mL adalah
230 maka dihitung :
Jumlah bakteri/mL = 230 : 10-6 = 1.3 x 108

No Pengenceran Jumlah koloni Jumlah bakteri tiap

gram contoh

66
 1. Mengapa teknik plate count dianggap sebagai pengukuran tidak langsung dari kepadatan sel?

2. Apa keunggulan metode plate count dibandingkan metode spektrofotometri?

3. Berikan beberapa alasan mengapa perlu untuk mengguncang kosong air 25 kali!

4. Apa yang dimaksud dengan CFU?

Pustaka

Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The McGraw−Hill Companies, 449 p

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

67
 MODUL 4: Hidrolidid polimer
TOPIK I: Hidrolisis Pati

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Banyak bakteri memproduksi enzim yang disebut hidrolase. Hidrolase mengkatalisis pemecahan
molekul organik menjadi molekul yang lebih kecil dengan adanya air. Latihan ini akan menyajikan
hidrolisis karbohidrat pati.
Molekul pati terdiri dari dua unsur: amilosa, suatu polimer glukosa bercabang (200 sampai 300
unit) dan amilopektin, polimer bercabang besar. Kedua amilopektin dan amilosa dengan cepat
dihidrolisis oleh bakteri tertentu, menggunakan α-amylases, untuk menghasilkan
dekstrin, maltosa, dan glukosa.
Yodium Gram dapat digunakan untuk menunjukkan kehadiran pati. Ketika kontak pati, membentuk biru
kompleks coklat. Pati terhidrolisis tidak menghasilkan perubahan warna. Jika area yang jelas muncul
setelah menambahkan yodium Gram ke media yang mengandung pati dan pertumbuhan α-amylases,
telah diproduksi oleh bakteri (gambar22.1). Jika tidak ada kliring, pati belum terhidrolisis.

Tujuan
1. Memahami biokimia hidrolisis pati
2. Melakukan uji hidrolisis pati

Kompetensi

Setiap mahasiswa mampu :

1. menjelaskan biokimia hidrolisis pati
2. trampil melakukan pengujian aktivitas hidrolisis pati

68
Prosedur Kerja
a. Bahan
1. 24- to 48-hour tryptic soy agar slant cultures of Bacillus subtilis (ATCC 6051), Escherichiacoli (ATCC
11229), dan Proteus vulgaris (ATCC 13315)
2. 1 starch agar plate
3. Gram’s iodine (1 g I2, 2 g KI, 300 ml distilledwater)
4. Bunsen burner
b. Alat
1. cawan petri
2. wax pencil
3. inoculating loop
4. Bunsen burner
5. Inkubator

c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Bagian A. Cara melakukan pengujian hidrolisis pati

Prosedur
Tahap 1.
1. Dengan penisilin, membagi cawan petri pati agar menjadi tiga bagian lurus seperti yang
ditunjukkan. Beri label setiap bagian yang akan diinokulasi dengan bakteri. Tambahkan
nama dan tanggal ke cawan petri.
2. Menggunakan teknik aseptik , streak (goresan) bakteri secara lurus masing-masing ke cawan
petri sesuai dengan kode yang telah dibuat.
3. Inkubasi piring selama 24 sampai48 jam pada 35 °C.

Tahap ke 2
Periodekedua
1.Tempatkan beberapa tetes yodium Gram pada masing-masing garis-garis pada plate pati agar.Jika
daerah sekitar garis pertumbuhan terdapat zona bening berarti pati telah dihidrolisis, dan tes ini
positif; jika disekitar garis pertumbuhan berubah biru, pati belum terhidrolisis, dan tes negatif.

69
1. Jelaskan fungsi hidrolase.

2.Jelaskan kimia pati hidrolisis.

3.Reagen kimia yang digunakan untuk mendeteksi kemampuan mikrobia menghidrolisis pati
adalah…………………..

4. Apa indicator terjadinya hidrolisis pati oleh mikrobia?

5.Amilase adalah enzimyang menyerang pati. Produk terkecil hidrolisis ini disebut ………………

6.Bagaimana mungkin bahwa bakteri dapat tumbuh pada pati agar tetapi tidak harus menghasilkan α-
amilase?

7. Apa saja penyusun pati agar?

Pustaka

Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The McGraw−Hill Companies, 449 p

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

70
 MODUL 6: Hidrolidid polimer
TOPIK 2: Hidrolisis Protein

Nama: NIM: Ttd:

........................................................... .............................................. ........................................

Pengantar Teori Praktikum

Banyak bakteri memproduksi enzimyang disebut hidrolase. Hidrolase mengkatalisis pemecahan
molekul organik menjadi molekul yang lebih kecildengan adanya air. Latihan ini akan menyajikan
hidrolisis karbohidrat pati. Molekul protein terdiri dari monomer asam amino. Protein dengan cepat
dihidrolisi soleh bakteri tertentu, menggunakan protease, untuk menghasilkan asam amino. Adanya
aktivitas hidrolisis oleh enzim protease ekstraseluler mikrobia ditunjukan dengan terbentuknya zona
jernih disekitar pertumbuhan bakteri di medium skim milk agar.

Tujuan
1. Memahami biokimia hidrolisis protein
2. Melakukan uji hidrolisis protein

Kompetensi

Setiap mahasiswa mampu :

1. menjelaskan biokimia hidrolisis protein
2. trampil melakukan pengujian aktivitas hidrolisis protein

Prosedur Kerja
a. Bahan
1. 24- to 48-hour tryptic soy agar slant cultures of Bacillus subtilis (ATCC 6051), Escherichia coli (ATCC
11229), dan Proteus vulgaris (ATCC 13315)
2. 1 skim milk agar plate
b. Alat
1. cawan petri
2. wax pencil
3. inoculating loop
4. Bunsen burner
5. Inkubator

c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Bagian A. Cara melakukan pengujian hidrolisis protein

Prosedur
Tahap 1.
1. Dengan pensillilin, membagicawan petri patiagarmenjaditiga bagianlurusseperti yang
ditunjukkan. Beri label setiapbagian yang akandiinokulasidenganbakteri. Tambahkan
namadan tanggalke cawan petri.
2. Menggunakanteknik aseptik , streak (goresan) bakterisecara lurus masing-masing ke cawan petri
sesuai dengan kode yang telah dibuat.
5. Inkubasipiringselama 24 sampai48 jampada 35 °C.

71
Tahap ke 2
Periodekedua
1. Amatipadamasing-masinggaris-garispada plateskim mlikagar.Jikadaerahsekitar
garispertumbuhanterdapat zona bening berartipatitelahdihidrolisis, dantes inipositif; jika
disekitar garis pertumbuhan berubah biru, patibelumterhidrolisis, dantesnegatif.

Jenis bakteri Indikator hidrolisis Keterangan

1. Jelaskan fungsi enzim protease ekstraseluler

2. Jelaskankimiahidrolisis protein oleh enzim protease

3. Indikator terjadinya hidrolisis protein pada medium skim milk adalah ……………………..

4. 5..Produkterkecilhidrolisisprotein oleh enzim protease adalah ………………

Pustaka

Harley−Prescott:, 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition, The McGraw−Hill Companies, 449 p

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

72
 MODUL 7: Uji aktivitas antibakteri
TOPIK 1. Hole-plate Diffusion Method

Pengantar Teori Praktikum

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan diantaranya melalui metode diffusi, menggunakan teknik paper disc atau
hole-plate.Paper disc method merupakan metode yang paling sederhana.Kertas cakram steril diletakan secara
teratur di atas media agar yang telah diinokulasi dengan bakteri uji di dalam cawan petri. Kemudian bahan yang
akan diuji dipipetkan dengan volume tertentu tergantung dari ukuran kertas cakram. Terbentuknya zona jernih
yang merupakan zone penghambatan pertumbuhan merupakan indicator terjadinya aktivitas
antibakteri.Sedangkan metode hole-plate, menggunakan 2 lapis agar.Lapis pertama adalah agar keras dan lapis
ke dua adalah agar lunak yang telah diinokulasi dengan bakteri uji.Lubang sumuran dapat dibuat menggunakan
cetakan atau menggunakan alat pelubang agar.

Tujuan
1. Memahami prinsip kerja metode diffuse untuk uji aktivitas antibakteri
2. Melakukan uji aktivitas antibakteri dengan metode hole-plate agar

Kompetensi

Setiap mahasiswa mampu :

1. menjelaskan prinsip kerja metode difusi agar untuk pengujian aktivitas antibakteri
2. trampil melakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan metode hole-plate agar

Prosedur Kerja
a. Bahan
1. antibiotic
2. mediumNutrien agar
3. Seed culture bakteri Bacillus dan Vibrio harveyii

b. Alat
1. cawan petri
2. wax pencil
3.
4. pipet ukur
5. Bunsen burner
6. Inkubator

c. Metoda dan Hasil Pengamatan

Bagian A. Membuat stok larutan antibiotic

1. Buat stok larutan antibiotic , dengan cara melarutkan antibiotic hingga diperoleh konsentrasi yang setara
dengan 50 mg.
2. Buat seri konsentrasi antibiotic 0,5 ug/ml, 1 ug/ml, 5 ug/ml dan 50 ug/ml

Bagian B, membuat mediabase layer

1. 10 mL medium NutrientAgar keras dicairkan dalam penangasair 100ºC. Setelah mencair kemudian
didinginkanhingga 50º C, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril, selanjutnya diratakan dengan
cara cawan petri digoyang.
2. Diamkan hingga dingin dan memadat.

Bagian C. membuat mediaseed layer

1. 20 ml Nutrient Agarlunak dicairkan dalam penangasair 100 ºC.
2. Biarkan hingga mendingin (50ºC)

73
 3. Inokulasi 100 uL kultur cair bakteri uji ke dalam medium NA lunak ini, kemudian dihomogenkan.
4. Tuang media seed layer ini ketas maedia based layer yang telah memadat .
5. Buat lubang menggunakan pelubang agar, pilih ukuran lubang 6 atau 8 mm.
6. 50 uL larutan antibiotic dipipetkan ke dalam lubang sumuran
7. Inkubasi pada suhu kamar 24 atau 48 jam.
8. Amati terbentuknya zone penghambatan pertumbuhan disekitas lubang suluran dan ukur diameter zone
hambat menggunakan jangka sorong. Daya hambat antibiotic ditentukan berdasarkan diameter zone
bening yang terbetuk disekitar lubang sumuran.

Hasil pengamatan
Bakteri Uji Konsentrasi antibiotik Diameter zona hambat

1. Jelaskan yang dimaksud dengan difusi agar :

2. Kenapa pada metode hole-plate agar menggunakan 2 lapis agar?

3. Jelaskan kelebihan metode hole-plate agar disbanding metode paper disk

4. Jelaskan factor apa saja yang mempengaruhi besarnya diameter zone hambat

Nilai Akhir:...............................................................................

Nama & Paraf Asisten: ............................................................

74