1

Judul : Analisa Perbandingan Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat,

Kuersetin, Dan Trolox
Pemrasaran/NIM : Inda Nabilah Alwan /J3L115015
Pembahas/NIM :
Hari/ tanggal : Rabu / 23 Mei 2018
Waktu :11.00 – 12.00 WIB
Ruangan :
Dosen Pembimbing : Prof Dr Drs Adi Santoso, MSi

Menyetujui,

Prof Dr Drs Adi Santoso, MSi

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menunda, menghambat, dan mencegah
terjadinya suatu proses oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam
lemak tak jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah, basa DNA, dan jaringan lipid sehingga
menimbulkan penyakit (Rumengan dan Mantiri 2015). Radikal bebas ini cenderung
mengadakan reaksi berantai yang apabila terjadi di dalam tubuh akan dapat menimbulkan
kerusakan-kerusakan yang berlanjut dan terus menerus. Kerusakan yang disebabkan oleh
radikal bebas tersebut menyebabkan senyawa antioksidan memiliki peranan penting dalam
menghancurkan dan menetralkan radikal bebas yang menimbulkan kerusakan sel dan juga dapat
menyebabkan kerusakan biomolekul seperti DNA, protein, lipoprotein dalam tubuh yang dapat
memicu terjadinya penyakit degeneratif seperti kanker, jantung, dan hati (Salamah dan
Widyasari 2015).
Asam askorbat, kuersetin, dan trolox merupakan senyawa yang memiliki aktivitas
antioksidan yang kuat, kemampuan asam askorbat, kuersetin, dan trolox sebagai senyawa
antioksidan inilah menyebabkan asam askorbat, kuersetin dan trolox dijadikan sebagai kontrol
positif dalam penentuan aktivitas antioksidan. Asam askorbat, kuersetin dan trolox tentunya
memiliki kemampuan aktivitas antioksidan yang berbeda meskipun ketiganya digolongkan ke
dalam senyawa antioksidan yang kuat. Kemampuan antioksidan yang berbeda tersebut
menyebabkan kemampuan ketiga senyawa ini dalam menangkap radikal bebas pun berbeda,
karena itu penentuan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik secara kuantitatif dan
secara kualitatif penting dilakukan sehingga didapatkan senyawa antioksidan terbaik sebagai
kontrol positif penentuan aktivitas antioksidan. Penentuan aktivitas antioksidan asam askorbat,
kuersetin dan trolox dilakukan dengan metode penangkapan radikal bebas 2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH). Metode DPPH ini dipilih karena relatif mudah dan sederhana dalam
pengerjaannya.
 2

1.2 Tujuan
Praktik Kerja Lapangan (PKL) bertujuan menentukan senyawa antioksidan terbaik
diantara asam askorbat, kuersetin, dan trolox sebagai kontrol positif dengan metode
penangkapan radikal bebas DPPH.

2 Metode

2.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah Falcon® microplate, Epoch microplate spektrophotometer
BioTek, micropipette volume 10-100μl, micropipette volume 100-1000μl, microtube eppendorf,
tips kuning 10-100μl, tips biru 100-1000μl, gelas piala 100 ml, labu ukur 50 ml.
Bahan yang digunakan adalah DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), kuersetin, asam
askorbat, trolox, etanol absolut , dan dimetil sulfoksida.

2.2 Prosedur Kerja

Pembuatan Larutan DPPH
Pembuatan larutan DPPH 125µM dilakukan dengan cara sebanyak 2.5 mg DPPH
ditimbang terlebih dahulu kemudian dilarutkan dengan etanol absolut sebanyak 30 ml ke dalam
gelas piala 100 ml. Larutan DPPH kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml dan ditera
dengan etanol absolut hingga tanda tera dan dihomogenkan.

Pengujian aktivitas antioksidan asam askorbat, kuersetin, dan trolox dengan metode
DPPH (Salazar 2009)
Preparasi larutan asam askorbat, kuersetin, dan trolox dilakukan dengan cara membuat
larutan stok asam askorbat, kuersetin, dan trolox 10000 ppm terlebih dahulu. Larutan asam
askorbat, kuersetin, dan trolox 10000 ppm kemudian disonikasi selama 45 menit. Larutan asam
askorbat, kuersetin, dan trolox 10000 ppm kemudian diencerkan menjadi 1000 ppm dan
100ppm dengan etanol absolut. Larutan asam askorbat, kuersetin, dan trolox dengan konsentrasi
100 ppm diencerkan masing – masing menjadi konsentrasi 20,10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.315 ppm
dengan pengenceran bertingkat di dalam microplate sebanyak 100 µL. Larutan asam askorbat,
kuersetin, dan trolox yang telah diencerkan menjadi konsentrasi 20,10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, dan
0.315 ppm sebanyak 100 µL kemudian ditambahkan 100 µL DPPH 125 µM dilakukan
sebanyak enam kali ulangan. Kontrol negatif asam askorbat, trolox, dan kuersetin dibuat dalam
microplate yang berisi larutan asam askorbat dengan konsentrasi 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625,
0.315 ppm yang telah diencerkan dari larutan asam askorbat 100 ppm dan ditambahkan 100 µL
etanol absolut.
Blanko dibuat dengan cara sebanyak 100 µL etanol absolut dipipet kemudan
ditambahkan 100 µL DPPH 125 µM. Kontrol blanko dibuat dengan cara sebanyak 200 µL
etanol absolut ke dalam microplate. Larutan asam askorbat, kuersetin, trolox, kontrol negatif.
blanko dan kontrol blanko kemudian diinkubasi di ruang gelap selama 30 menit. Larutan asam
askorbat, kuersetin, trolox, kontrol negatif, blanko dan kontrol blanko yang telah diinkubasi
diukur pada panjang gelombang 517 nm dengan microplate spectrophotometer reader.

Uji F dan uji t aktivitas antioksidan asam askorbat, kuersetin, dan trolox
Uji F dapat dilakukan ketika nilai IC50 telah didapatkan. Uji F dilakukan dengan cara
membandingkan nilai IC50 dua control positif seperti asam askorbat dengan trolox, asam
 3

askorbat dengan kuersetin, dan trolox dengan kuersetin dengan cara mencari standar deviasi dari
masing – masing control positif terlebih dahulu. Uji F dilakukan dengan cara membandingkan
nilai F hitung yang didapatkan dibagi dengan nilai F tabel yang didapatkan dari tabel F. Nilai F
hitung disapatkan dengan cara standar deviasi kuadrat terbesar dibagi dengan standar deviasi
kuadrat terkecil. Uji F dinyatakan beda nyata signifikan apabila nilai F hitung lebih besar dari
nilai F tabel.
Uji t dilakukan setelah uji F dilakukan. Uji t dilakukan dengan membandingkan nilai t
hitung dengan nilai t tabel. Apabila nilai t hitung lebih besar dibandingkan dari nilai t tabel,
maka hasil uji t dinyatakan beda signifikan. Apabila nilai t hitung lebih kecil dibandingkan
dengan nilai t tabel, maka hasil uji t tidak berbeda signifikan. Apabila nilai t hitung lebih
besardibandingkan dengan nilai t tabel, maka hasil uji t berbeda signifikan

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Metode penangkapan radikal bebas DPPH merupakan metode penentuan aktivitas
antioksidan yang banyak dipilih karena metode ini relatif mudah dan sederhana dalam
pengujiannya. Aktivitas antioksidan suatu kontrol positif seperti asam askorbat, kuersetin dan
trolox dapat dilihat dari kemampuannya dalam meredam aktivitas radikal bebas DPPH melalui
donasi atom hidrogen atau elektron. Pendonoran atom hidrogen pada DPPH akan mengubah
bentuk DPPH yang radikal menjadi non-radikal yang dapat diamati secara visual melalui
perubahan warnanya dan secara kuantitatif melalui absorbansinya pada panjang gelombang 517
nm. Apabila terdonasi atom hidrogen, DPPH akan berubah menjadi bentuk non-radikal yang
ditandai dengan memudarnya warna ungu menjadi lebih muda hingga kuning (Romadanu et al
2014).
Kurva hubungan antara konsentrasi dan persen penangkapan radikal bebas DPPH oleh
asam askorbat, kuersetin, dan trolox menunjukkan persen penangkapan radikal bebas yang
meningkat seiring dengan bertambahnya konsentrasi larutan asam askorbat, kuersetin, dan
trolox. Kurva hubungan antara konsentrasi dan persen penangkapan radikal bebas DPPH oleh
asam askorbat, kuersetin, dan trolox dapat dilihat pada Gambar 1,2, dan 3.
80.00
Penangkapan
radikal bebas
DPPH (%)

60.00
40.00 y = 10.403x + 17.392
20.00 R² = 0.9989
0.00
0 2 4 6

Konsentrasi asam askorbat (ppm)

Gambar 1 Kurva hubungan antara persentase penangkapan radikal bebas DPPH dengan
konsentrasi asam askorbat.
 4

100.00

radikal bebas DPPH

80.00

Penangkapan
60.00
40.00 y = 13.256x + 13.414

(%)
20.00 R² = 0.9974
0.00
0 2 4 6

Konsentrasi kuersetin (ppm)

Gambar 2 Kurva hubungan antara persentase penangkapan radikal bebas DPPH dengan
konsentrasi kuersetin.
80.00
radikal bebas DPPH

60.00
Penangkapan

40.00
y = 7.8724x + 21.909
(%)

20.00 R² = 0.9947
0.00
0 2 4 6
Konsentrasi trolox (ppm)

Gambar 3 Kurva hubungan antara persentase penangkapan radikal bebas DPPH dengan
konsentrasi trolox.
Pola kurva yang semakin linier menunjukkan nilai r2 yang didapatkan semakin besar dan hal
ini menunjukkan potensi senyawa asam askorbat, kuersetin, dan trolox sebagai antioksidan
semakin besar. Hubungan antara konsentrasi senyawa antioksidan dengan persentase
penangkapan radikal bebas akan berbanding lurus sehingga menunjukkan semakin besar
konsentrasi suatu senyawa antioksidan maka kemampuan untuk menangkap radikal bebas
DPPH akan semakin besar.
Nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50) merupakan parameter dalam penentuan aktivitas
antioksidan, semakin kecil nilai IC50, semakin besar kemampuan suatu senyawa dalam
menangkal atau menghambat suatu radikal bebas (Nurani 2013). Nilai IC50 yang dihasilkan
dari asam askorbat, kuersetin dan trolox secara berturut – turut ialah 3.06; 2.74; dan 3.56 ppm.
Senyawa kuersetin memiliki aktivitas antioksidan paling baik dibandingkan asam askorbat dan
trolox. Kuersetin dikatakan sebagai antioksidan paling baik dikarenakan nilai IC50 yang paling
kecil di antara asam askorbat dan trolox, yang artinya pada konsentrasi sebesar 2.74 ppm
senyawa kuersetin mampu menangkap radikal bebas DPPH sebesar 50 %. Perbedaan aktivitas
antioksidan antara asam askorbat, kuersetin, dan trolox dapat disebabkan oleh beberapa faktor
seperti perbedaan kemampuan dalam mentransfer atom hidrogen ke radikal bebas, dan struktur
kimia senyawa antioksidan (Nurani 2013).

3.2 Uji F dan Uji t Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat, Kuersetin, dan Trolox
Uji F dan uji t aktivitas antioksidan dilakukan karena aktivitas antioksidan yang
dihasilkan oleh senyawa asam askorbat, kuersetin, dan trolox berbeda-beda. Uji F dan uji t
tersebut bertujuan mendapatkan senyawa antioksidan dengan aktivitas antioksidan terbaik. Hasil
uji F antara asam askorbat dengan kuersetin menunjukkan nilai F hitung yang lebih besar
dibandingkan dengan nilai F tabel. Hasil ini menunjukkan standar deviasi asam askorbat
 5

berbeda signifikan dengan standar deviasi kuersetin. Hasil uji t antara asam askorbat dengan
kuersetin menunjukkan nilai t hitung lebih besar daripada nilai t tabel. Hasil ini menunjukkan
aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH oleh asam askorbat berbeda nyata dengan aktivitas
penangkapan radikal bebas DPPH oleh kuersetin.
Hasil uji F antara asam askorbat dengan trolox menunjukkan nilai F hitung yang lebih
besar dibandingkan dengan nilai F tabel. Hasil ini menunjukkan standar deviasi trolox berbeda
signifikan dengan standar deviasi asam askorbat. Standar deviasi yang berbeda nyata ini
menunjukkan adanya keragaman data yang besar antara asam askorbat dengan trolox. Hasil uji t
antara asam askorbat dengan trolox menunjukkan nilai t hitung lebih besar dibandingkan nilai t
tabel. Hasil ini menunjukkan aktivitas antioksidan asam askorbat dengan trolox berbeda nyata.
Hasil uji F antara kuersetin dengan trolox menunjukkan hasil yang tidak berbeda
signifikan, hal ini dikarenakan nilai f hitung yang lebih kecil dibandingkan nilai f tabel. Hasil ini
dapat diartikan standar deviasi trolox dengan kuersetin tidak berbeda signifikan. Hasil uji t
kuersetin dengan trolox menunjukkan hasil yang aktivitas antioksidan yang berbeda nyata, hal
ini dapat dilihat pada hasil uji t dimana nilai t hitung lebih besar dibandingkan nilai t tabel.
Berdasarkan uraian diatas, aktivitas antioksidan kuersetin memiliki perbedaan yang
signifikan dengan aktivitas antioksidan asam askorbat dan trolox. Nilai IC50 yang dihasilkan
oleh kuersetin lebih kecil dibandingkan asam askorbat dan trolox, sehingga dapat dikatakan
senyawa antioksidan terbaik sebagai kontrol positifpenentuan aktivitas antioksidan ialah
kuersetin.

4 SIMPULAN
Berdasarkan penentuan aktivitas antioksidan, didapatkan nilai IC50 dari asam askorbat,
kuersetin dan trolox yaitu 3.06; 2.74; dan 3.56 ppm. Hasil uji t antara asam askorbat dengan
kuersetin, asam askorbat dengan trolox maupun trolox dengan kuersetin menunjukkan nilai t
tabel > nilai t hitung, sehingga hasil uji t dapat disimpulkan adanya perbedaan aktivitas
antioksidan yang signifikan antara asam askorbat, kuersetin, dan trolox. Berdasarkan uraian
diatas secara kuantitatif, dapat disimpulkan aktivitas antioksidan terbaik dimiliki oleh kuersetin
dan secara kualitatif dapat disimpulkan aktivitas antioksidan terbaik dapat diurutkan dari
kuersetin > asam askorbat > trolox. Antioksidan terbaik ini dilihat dari nilai IC50 yang
dihasilkan saat penentuan akyivitas antioksidan.

5 DAFTAR PUSTAKA
Nurani. 2013. Isolasi dan uji penangkapan radikal bebas dpph oleh isolat-1, fraksi etil asetat,
dan ekstrak etanol akar pasak bumi (Eurycoma longifolia jack). Jurnal Ilmiah Kefarmasian.
3(1): Hlm 95-104.
Romadanu, Rachmawati, Lestari. 2014. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak bunga lotus
(Nelumbo nucifera). Fistech. 3(1) : Hlm 1-7.
Rumengan, Mantiri. 2015. uji aktivitas antioksidan ekstrak alga Dictyosphaeria cavernosa dari
perairan teluk manado. Jurnal LPPM Bidang Sains dan Teknologi. 2(2) : Hlm 71
Salamah, Widyasari. 2015. aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun kelengkeng (Euphoria
longan (l) steud.) dengan metode penangkapan radikal 2,2’-difenil-1-pikrilhidrazil.
Pharmaciana. 5(1) : Hlm 25-34.
Salazar, L´opez, Garza. 2009. Antimicrobial and antioxidant activities of plants from northeast
of mexico [artikel]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Mexico
(MX) : Hindawi Publishing Corporation.