FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE

UNIVERZITET U BEOGRADU

Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla

MONITORING HIGIJENE POVRŠINA TOKOM PROIZVODNJE,

PRERADE I PROMETA HRANE METODOM
BIOLUMINISCENCIJE

Specijalistički rad

Marina Stanojković
Diplomirani veterinar

Beograd 2014
 Uvod

• Bolesti koje nastaju kao posledica konzumiranja hrane,

kontaminirane patogenim miroorganzmima, sa gledišta zaštite
zdravlja ljudi predstavljaju značajan problem u celom svetu.

• Kod većine alimentarnih epidemija utvrđeno je da je prisustvo

patogenih mikroorganizama u hrani posledica unakrsne
kontaminacije nastale zbog loše higijenske prakse za vreme
proizvodnje i pripreme hrane.
• Rizik od bolesti prenosivih hranom, koje se dovode u vezu sa
unakrsnom kontaminacijom, zavisi od dva faktora:

 nivoa kontaminacije površina patogenim mikroorganizmima i

 verovatnoće da su oni preneti u hranu koja će biti konzumirana.
 Biofilm

• Biofilmovi se opisuju kao mikroorganizmi pričvršćeni za čvrste

površine koji na njima ispoljavanju sposobnost proliferacije.
• Kada se jednom pričvrste na površini, mikroorganizme je znatno
teže ukloniti, zbog njihovih strukturnih karakteristika unutar
biofilmova.
• Bakterije unutar biofilmova znatno su otpornije prema
dezinficijensima, što utiče na njihov opstanak u objektima za
preradu i proizvodnju hrane.
 Higijena hrane

• Svaka specifična dokumentovana aktivnost ili kapaciteti (oprema i

prostorije) treba da ispunjavaju opšte zahteve o higijeni hrane,
Codex-a alimentariusa, kao i Dobre proizvođačke prakse, što će
omogućiti da se ispune osnovni zahtevi za proizvodnju bezbedne
hrane u svim karikama lanca.
 Higijena hrane

• Unakrsna kontaminacija nastaje kada hrana prolazi preko

kontaminiranih površina ili kada je izložena aerosolima ili
kondenzatima koji potiču sa kontaminirane površine.
• U cilju sprečavanja kontaminacija sa površina i iz ambijenta, veoma
važno održavanje higijene površina i sredine u kojoj se hrana
proizvodi, skladišti i stavlja u promet.
• Budući da je higijena površina važna sa gledišta bezbednosti hrane
postupci dobre higijenske prakse i provera njihove primene su
integrisani u sistem HACCP-a.
 Higijena hrane

• Za praćenje higijene površina koristi se nekoliko različitih postupaka.

• Za uzimanje uzoraka radi utvrđivanja ispunjenosti kriterijuma

higijene procesa, kao referentna metoda, primenjuje se ISO
standard 18593.
 Higijena hrane

• Primenom referentnih metoda rezultati se dobijaju posle dva do tri

dana.

• U industriji hrane su potrebne metode kojima se higijena površina

može oceniti za nekoliko minuta pre procesa proizvodnje.

• U tu svrhu razvijena je metoda bioluminiscencije.

 Metode za ispitivanje higijene površina

• Sve površine koje dolaze u kontakt sa hranom moraju da budu

higijenski ispravne.

• Higijenska ispravnost površina se proverava vizuelno, dokazivanjem

ostataka organskih materija i bakteriološkim ispitivanjem uzorka
uzetih sa povrsina.
 Metode za ispitivanje higijene površina

• Rezultati mikrobiološkog ispitivanja površina dobijaju se najranije za

48h.
Dok potencijalni uzročnik oboljenja bude detektovan, hrana je već
servirana. Stoga se za ispitivanje higijene površina u objektima za
proizvodnju hrane i restoranima preporučuju testovi koji daju rezultat
za nekoliko minuta.
 Mikrobiološke metode za ispitivanje
higijene površina

• Mikrobiološke metode za ocenjivanje higijene radnih površina koje

dolaze u kontakt sa hranom se zasnivaju na određivanju broja
aerobnih kolonija (Aerobic plate count -APC) ili broja kolonija
mikroorganizama značajnih za ocenu higijene u određenim
objektima za poslovanje hranom.
 Uzimanje briseva

• Brisevi se uzimaju s poznate površine ograničene pomoću šablona.

• Mikroorganizmi skinuti brisom s površine suspenduju se u poznatu

zapreminu sterilne destilovane i puferisane vode ili peptonske vode.
 Metode za ispitivanje higijene površina

• Veća bezbednost proizvedene hrane se postiže ako se za

monitoring higijene površina koriste brze metode zasnovane na
fizičko-hemijskim osobina mikroorganizama nego konvencionalne
metode.
 Brze metode za kontrolu higijene na
površinama

• Za proveru higijenske ispravnosti površina koje dolaze u kontakt s

hranom mogu da koriste alternativne metode.

• Prednost alternativnih metoda:

 lako se primenjuju,
 osetljive su ,
 kod nekih metoda rezultati se dobijaju brzo za jedan do dva minuta.
 Brze metode za kontrolu higijene na
površinama

• Alternativne metode za kontrolu higijene na radnim površinama:

 Otkrivanje ostataka proteina i ugljenih hidrata,

 Uzimanje otisaka,
 Petri film metoda,
 ATP bioluminiscencija.
 Brze metode za otkrivanje ostataka
proteina i ugljenih hidrata na površinama

• Ovom metodom dokazuju se ostaci proteina ili ugljenih hidrata na

površini.

• Za ovo ispitivanje koristi se bris za jednokratnu upotrebu. Bris se

uzima s odabrane površine i prenosi u epruvetu sa odgovarajućim
rastvorom koji reaguje sa proteinima ili ugljenim hidratima, pri čemu
dolazi do promene boje rastvora.
 Brze metode za otkrivanje ostataka
proteina i ugljenih hidrata na površinama

Dokazivanje organskih materija na površini

 Uzimanje otisaka

• Za uzimanje otisaka koriste se pločice na koje je sa obe strane

naneta hranljiva podloga.

• Pločica se izvadi iz plastične posude i prisloni na površinu s koje se

uzima otisak, a zatim se pločica vrati u plastičnu posudu i stavi na
inkubaciju.

• Temperatura inkubacije i dužina inkubacije zavise od vrste

mikroorganizama koja se očekuje na hranljivoj podlozi.
 Uzimanje otisaka

Uzimanje otisaka Inkubacija

Rast mikroorganizama na otisku uzetom sa površine

 Petri film metoda

• Petri film se sastoji od standardne hranljive podloge i želatinozne

materije rastvorljive u hladnoj vodi.

• Donji deo filma je obložen hranljivom podlogom, a gornji deo filma je

obložen želatinoznom materijom i TTC indikatorom.

• Indikator boji kolonije crveno, što olakšava očitavanje rezultata.

 Petri film metoda

Petrifilm- uzimanje otisaka i prikaz očitavanja sa površina čija se

higijenska ispravnost proverava
 ATP bioluminescencija

• Adenozin 5’-trifosfat (ATP) je izvor energije svih živih organizama i

prisutan je kod svih ćelija biljnog, životinjskog ili mikrobiološkog
organizma.

• Metoda ATP bioluminiscenca se koristi kao pokazatelj prisustva

bioloških rezidua na radnim površinama i indikator nečistoće.
 ATP bioluminescencija

U prisustvu ATP-a, dolazi do aktivacije sistema luciferin-luciferaza,

i nastanka oksiluciferina, koji je nestabilan i teži razlaganju usled čega
dolazi do oslobađanja svetlosti.
 ATP bioluminescencija

• Sistem je podešen tako da daje linearnu korelaciju između

oslobođene svetlosti i koncetracije ATP-a.

• Rezultati se dobijaju za par sekundi i izražavaju se u Relative Light

Units (RLU).

• Ova jedinica se koristi jer luminometri ne mogu da mere koncetraciju

ATP-a direktno u jedinicama fotonima.
 ATP bioluminescencija

• Metoda ATP bioluminiscencije se najčešće koristi za proveru

higijene površina u restoranima i kuhinjama.

• ATP bioluminiscencija je jednostavna metoda i jeftinija u odnosu na

referentnu mikrobiološku metodu.
 ATP bioluminescencija

• Za izvođenje metode bioluminiscencije potreban je luminometar i

bris u epruveti u kojoj se nalazi sistem luciferin-luciferaza.
• Bris se uzima sa odgovarajuće površine, vraća nazad u epruvetu i
potisne do dna epruvete da dođe u kontakt sa sistemom luciferin-
luciferaza.
• Ako na površini, s koje je uzet bris, ima mikroorganizama, ATP
mikroorganizama katalizuje reakciju luciferina i luciferaze, pri čemu
se oslobađa svetlost.
• Količina oslobođene svetlosti se očitava na luminometru posle 1 do
2 minuta.
 ATP bioluminescencija

Određivanje higijenske ispravnosti površina metodom bioluminiscencije

 Cilj rada

• Cilj ovog specijalističkog rada je da se uporedno prikažu standardne

mirobiološke metode za monitoring higijene površina i metoda ATP
bioluminiscencije kao alternativna brza metoda.
 Uporedni prikaz mikrobiološke i metode ATP
bioluminiscencije za kontrolu higijene na
plastičnim površinama

• Linearna korelacija je uočena pri broju bakterija od 10³ - 107

cfu/25cm2, a pri broju bakterija od 109 cfu/25cm2 nije utvrđena
linearna korelacija.
 Uporedni prikaz mikrobiološke i metode ATP
bioluminiscencije za kontrolu higijene na
plastičnim površinama
• Na osnovu rezultata ispitivanja autori su zaključili da je koncetracija
od 107 cfu/25cm2 gornji prag za metodu ATP bioluminiscencije.
Koncetracija od 10³ cfu/25cm2 je donji prag osetljivosti za test ATP
bioluminiscencije.
• Uradili su i ispitivanje sa koncetracijom od 101 cfu/25cm2, i pri tome
dobili rezultat nula.
• Rezultati ove grupe autora navode na zaključak da su
mikrobiološka metoda i metoda ATP bioluminiscencije u uskoj
linearnoj korelaciji kada je koncetracija mikroorganizama veća ili
jednaka 10³ cfu ali niža od 107 cfu/25cm2 na plastičnoj površini.
 Uporedni prikaz mikrobiološke i metoda ATP
bioluminiscencije za kontrolu higijene na inoks
površinama

• Autori su potvrdili da se 97,5% ispitivanih površina može smatrati

čistim na osnovu rezultata dobijenih primenom obe metode
(mikrobiološkom metodom i metodom bioluminiscencije).
• Preostalih 2,5% ispitivanih površina ponovo su podvrgnuti čišćenju
na osnovu rezultata dobijenih metodom ATP bioluminiscencije, dok
mikrobiološka metoda nije pokazivala potrebu za ponovnim
čišćenjem.
 Uporedni prikaz mikrobiološke i metode ATP
bioluminiscencije za kontrolu higijene na
površinama pre i posle pranja

• Prilikom provere mikrobiološkom metodom higijene cisterne za

mleko izrađene od inoksa na površini od 100 cm2, je utvrđeno da je
93-98% površina posle pranja bilo čisto. Međutim, primenom
metode ATP bioluminiscencije samo je 63-89% povšina ocenjeno
kao čisto.
 Efikasnost primene postupaka higijene površina
• Dnevna rutinska čišćenja mogu doprineti smanjenju nivoa
kontaminacije ispod nivoa određenih limita.
• Specifične fizičke osobine radnih površina mogu usloviti rezultat
dobijen ATP bioluminiscencijom.
• Efikasnost čišćenja i dezinfekcije zavise od više faktora:
 načina čišćenja,
 tip dezinficijensa i
 mehanočko čišćenje.
• Ukoliko je površina oštećena i više nije glatka, to može biti razlog
zašto su rezultati čišćenja i dezinfekcije loši.
 Uporedni prikaz kontrole higijene metodom
bioluminiscencije kod rukovanja različitim
komponentama za pripremu instant supa

• Autori su uporedno prikazali rezultate ispitivanja higijene radnih

površina koje su bile u kontaktu sa sledećim sastojcima instant
supe: meso, salama (Dehydration), suvi hleb (Evaporation), suvi
proizvodi mesa (Meat Drying), mleveno meso (Meat Balls), paste
(Paste), slanina (Bacon), suve leguminoze (Legumes), instant pire
(Mashes), pakovanja (Packages).
Uporedni prikaz srednjih vrednosti dobijenih
ATP bioluminiscencom na razlićitim uzorcima
 Kvalitet higijene površina

• Kvalitet higijene na različitim površinama jasno zavisi od strukture

materijala od koje je površina izrađena kao i od karakteristika
proizvoda koji dolazi u kontakt sa njom.
• Limit ATP vrednosti mora biti drugačiji za različite površine.
 Limiti za različite površine postavljeni ATP
analizom (u RLU /100 cm2)

Ocena Čisto Uslovno čisto Neprihvatljivo

čisto

Inoks 0-500 501-1000 >1000

Plastika 0-600 601-1200 >1200

Obojena 0-1000 1001-2000 >2000

plastika
 Zaključak

• Korelacija između rezultata ispitivanja higijene površina

standardnom metodom i metodom bioluminiscencije je visoka.
• Stepen higijene radnih površina određen metodom ATP
bioluminscencije se ocenjuje kao:
 čisto,
 uslovno čisto ili
 neprihvatljivo čisto.
• ATP bioluminiscencija ima veliki značaj jer daje rezultat za nekoliko
minuta.
• Korektivne mere se mogu preduzeti pre početka proizvodnje.