Instituto Tecnológico de Monterrey - CCM

Mariana Becerril Calzada

A01338346
Dra. G. Cristina Enríquez
Laboratorio de Ingeniería Genética
Práctica n°2
Extracción de ADNg de diferentes fuentes

Preguntas para analizar antes de la práctica:

1. ¿Qué características deben tener las soluciones utilizadas con el fin de extraer el ADN de las células
de la forma más pura que sea posible? Explica tu respuesta

Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la memmbrana
celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones de lisis
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contienen también EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg e impide el funcionamiento de
las Dnasas.
Los buffers que se utilizan continenen sales, con el fin de controlar el pH de lisado y crear una presión
osmótica.

2. Describa la composición del DNA e indique ¿cuál es su carga neta y qué molécula proporciona
dicha carga?

El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un polim ́ ero de alto peso molecular, formado por dos cadenas o
hebras de monómeros llamados nucleótidos. Cada nucleótido está conformado por moléculas más
pequeñas: una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina o timina), un hidrato de carbono (desoxirribosa)
y un grupo fosfato. Los cuatro tipos de nucleótidos difieren solamente en el tipo de base nitrogenada, las
cuales pueden ser púricas (adenina o guanina) o pirimídicas (citosina o timina). Esta molécula cuenta con
una carga negativa, gracias a los grupos fosfafto que la conforman.

3. ¿Cuál es la diferencia entre ADN genómico y ADN cromosómico?

 La principal diferencia entre ADN y cADN es que el primero cuenta con intrones en su
estructura, el segundo no.
 El cDNA es lo que se obtiene de la transcripción inversa del mRNA, mientras que el ADNg
es u material genético natural.
 4. ¿Qué diferencia existe entre células procariontes y eucariontes?, e indica como lisarías cada una de
ellas.
Células eucarióticas Células procariotas
La célula animal no tiene pared celular, la vegetal Pared celular de peptidoglucanos.
tiene una pared de celulosa y las fúngicas, de
quitina.
Con núcleo Sin núcleo
Organización de ADN en cromosomas lineales ADN organizado en una sola molécula circular
Hay ribosomas y orgánulos membranosos Únicamente cuenta con ribosomas
Se reproduce por mitosis Fisión binaria
Tamaño: 10 y 100 micrómetros 1 a 10 micrómetros

1. Citólisis: los ambientes hipotónicos pueden hacer que el exceso de agua se mueva hacia las
células. Las células con solo membranas celulares, como células animales, eventualmente se
hinchan y estallan. Sin embargo, la citolisis no puede ocurrir en las células vegetales, bacterias y
levaduras debido a sus paredes celulares fuertes.

2. Plasmólisis: el entorno hipertónico o las condiciones climáticas calientes / secas pueden hacer
que las células, con una pared celular, pierdan agua. Este proceso finalmente induce a la membrana
celular a colapsar dentro de la pared celular dando como resultado espacios entre la pared celular
y la membrana celular y la lisis ocurre cuando la célula se encoge y muere.

El procedimiento de lisis celular en condiciones de laboratorio implica el uso de amortiguadores

que ayudan a imitar las condiciones naturales. La estructura de la célula es un aspecto importante.

Las células procariotas y eucariotas tienen diferentes paquetes de células. La pared celular
contenida por todos los organismos procariotas (bacterias), plantas y algunas células eucariotas
individuales como la levadura, le da a la célula una fuerza adicional. Por lo tanto, tiene que ser
descompuesto usando circunstancias estrictas. Durante la lisis celular, el proceso principal es
descomponer la pared / membrana de la célula y el compartimento sin dañar el material de ácido
nucleico. Hay dos formas de interrumpir el paquete de la célula.

LISIS QUÍMICO

LISIS MECÁNICA: LOS MÉTODOS INVOLUCRAN EL MOLIENDO, LA CORTAR, EL

FRACASO Y EL CHOQUE

Este método implica el uso de equipos tales como sonicador, homogeneizador, cyrogrinders,
licuadora, vórtice y disrupción de perlas para facilitar la interrupción celular. En cada caso, el
método de elección para la lisis celular debe depender de las características del paquete de células.
 La lisis mecánica es a menudo preferida para las células con una pared celular. En el caso de las
plantas, debido a su alto contenido de celulosa en sus paredes celulares, se aplica una fuerza más
estricta al congelar el tejido en nitrógeno líquido y descomponer la célula mediante una trituradora.

5. En que se basa la extracción de ADN de una muestra celular

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos
hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la celula. Se
empieza por lisar (romper) la célula mediante un detergente. El detergente hace que la célula vacié su
contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN en ese momento, el tampón
contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en
menor proporción las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas mas
pequeñas y separadas de el por acción del detergente. Solo queda, por tanto, extraer el ADN de esa muestra
de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico . Realizar la extracción de ADN de tejidos
animales y vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su composición con sencillas técnicas. Observar la
estructura fibrilar del ADN. Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quimico-
fisicas del ADN.

6. Menciona los tipos de extracción de ADN que existen, y escribe un ejemplo de cada una.

Métodos orgánicos

MÉTODO DE FENOL CLOROFORMO

Tanto el fenol como el cloroformo pueden formar fases.
Las proteínas son más solubles en la mezcla de fenol y cloroformo que el ADN y el ARN. La adición de
cloroformo también ayuda a la eliminación de lípidos, y se agrega alcohol isoamílico al fenol y cloroformo
para evitar la formación de espuma.

BROMURO DE CETILTRIMETILAMONIO
Este método generalmente es adecuado para extraer ácido nucleico de organismos productores de
polisacáridos altos, tales como plantas y algunas bacterias Gram negativas. CTAB es un detergente no
iónico. El procedimiento implica mezclar el lisado con un CTAB que contiene una solución de alta
concentración iónica en el que CTAB no puede precipitar ácidos nucleicos y formar complejos con
proteínas. La etapa de centrifugación permite recoger el sobrenadante que contiene la muestra de interés, y
la muestra se precipita con alcohol.

Métodos inorgánicos

MÉTODO SALTING-OUT
Este proceso se llama salazón. Esta técnica implica la precipitación de proteínas que usan altas
concentraciones de sal, como cloruro de sodio o acetato de amonio. La centrifugación elimina el artefacto
orgánico precipitado. Debido a que este procedimiento también provoca la precipitación de pequeñas
cantidades de ácidos nucleicos, tiende a haber una pérdida de material y, a veces, las proteínas no pueden
eliminarse por completo.
SEPARACIÓN MAGNÉTICA
Las partículas de perlas están rodeadas por un grupo funcional de unión a ácido nucleico específico. NA en
el lisado se une a las perlas que luego se colocan en un área magnética que las separa de los medios. Las
perlas se recogen, se lavan y la muestra se recupera de las perlas con un tampón especial.

7. Mencione brevemente algunas técnicas de análisis del ADN

Espectofotometría
PCR

8. Indica la longitud de onda en la que absorben los ácidos nucleicos

ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentración mediante es-
pectrofotometriá .

Referencias
 Amelia Cornejo Romero, Alejandra Serrato Díaz, Beatriz Rendón Aguilar, Martha Graciela Rocha
Munive. (2014). Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos.
México: Gob.

 Debmalya Barh, Vasco Azevedo. (2018). OMICS TECHNOLOGIES AND BIO-ENGINEERING

Towards Improving Quality of Life. United Kindom: Elsevier Inc.

 Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of
Biomedicine and Biotechnology. 2009;2009:574398. doi:10.1155/2009/574398.
Protocolo de extracción de ADN genómico bacteriano:
1. Centrifugar a 13,000 rpm durante 5 minutos un cultivo fresco saturado de bacterias.
2. Resuspender el pellet formado con 200 μl de amortiguador de lisis
3. Añadir 66 μl de NaCl 5M y homogenizar (para remover la mayor cantidad de proteínas).
Puede calentar por 10 minutos a 65ºC para mayor lisis celular.
4. Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min, transferir el sobrenadante a un microtubo
nuevo.
5. Añadir 1 vol de fenol/cloroformo o cloroformo y mover invirtiendo el microtubo
gentilmente hasta ver una solución blancuzca. Es recomendable hacer una segunda extracción
con cloroformo para mayor limpieza del DNA.
6. Centrifugar a 13,000 rpm durante 3 min, transferir sobrenadante a un microtubo nuevo.
7. Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto (frío) para precipitar el DNA dejar reposar
durante 15 minutos (si se coloca en hielo o en -20ºC se puede precipitar mayor cantidad de
DNA), centrifugar a 13,000 rpm durante 5 min.
8. Descartar el sobrenadante y añadir 500 μl de etanol al 70% para lavar el DNA, centrifugar
a 13,000rpm durante 5 minutos.
9. Descartar el sobrenadante y dejar que se evapore el etanol remanente.
10. Resuspender en 40-70μl TE 1X incubar durante toda la noche a 4°C.

11. Cuantificar el ADN obtenido por electroforesis y espectrofotometría.

o

12. Guardar a -20 C

Protocolo de extracción de ADN genómico de hojas de planta.

1. Triturar las hojas de planta con etanol absoluto a -20°C.

2. Buscar el protocolo de extracción de DNAzol y escoger de acuerdo al tipo de células a
trabajar.
3. Cuantificar el ADN obtenido por electroforesis y espectrofotometría.
4. Guardar a -20 °C

Cuantificación de ADN
5. Tome dos celdas limpias. En una añada 1000 μl de TE (esta solución será su estándar). En
la segundo cubeta añada 2 µL de ADN y 998 µL de TE.
6. Ajuste la longitud de onda del espectrofotómetro a 260 nm.
7. Coloque el estándar y calibre el espectrofotómetro.
8. Proceda a tomar la medida de Absorbancia de su muestra.
9. Repita el paso 2, 3 y 4 con una longitud de onda a 280 nm.
10. Anote sus medidas en la tabla que se le provee continuación.
11. Calcule la concentración de su muestra de DNA.

[Ácido nucleico] µg/ml = (Abs )( factor de dilución recíproco)(factor de conversión de

260nm
concentración)

El factor de conversión de concentración se elegirá bajo las siguientes consideraciones:

A260nm de DNA de cadena doble = 50 µg / mL

A260nm de DNA de cadena sencilla = 33 µg / mL
A260nm de RNA de cadena sencilla = 40 µg / mL