Carbohidratos FUNCION DE LOS CARBOHIDRATOS EN LA BIOESFERA Los hidratos de carbono son compuestos que contienen ademis de carbono, hidrégeno y oxigeno en proporcién de 2a 1. Este nombre también se usa para algunos de sus derivados en los que la definicién dada no se cumple estricta- mente. Cy (H2O)y yy Carbono Agua Hidrato de carbono Una fuente de energia Estos compuestos son de importancia fundamental en la bioesfera y se elabo- ran durante la fotosintesis. Por fotosintesis las plantas verdes y las algas ‘i co, + H,0 Enoria ae CO, +H,0 co, +H,0 Energia Cx(H, 0, —] Cx H, Oly <—~ Prantas verdes ]\, ‘Animales 0; 0, Figura 6.1 Ciclo del carbono en la bioesfera 152Carbohidratos. 153 pueden usar la energia solar para sintetizar hidratos de carbono a partir de bidxido de carbono atmosférico y agua. Muchas plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbono que en algunos casos, son consumidas por el hombre y los animales para su alimento. Después de que los carbohidratos complejos han sido ingeridos, la molécula se rompe en el estémago e intesti- nos dando glucosa la cual es luego oxidada a CO, y H,0, o es almacenada temporalmente como glicégeno en el higado y los musculos. Durante la oxidacién de glucosa se libera energ{a que es empleada luego por los animales. En el hombre mas del 60% de los requerimientos totales de energia proviene de la oxidacién de los hidratos de carbono. En esta forma los animales, que no pueden realizar fotosintesis, pueden aprovechar la energia solar (figura 6.1). Moléculas y estructura celular Los hidratos de carbono son también componentes importantes de algunos de los materiales estructurales de los organismos vivos, como por ejemplo, las paredes celulares en las plantas, los polisacdridos en las cépsulas de las bacterias y los mucopolisacéridos en la piel y el tejido conectivo de los animales. Ademés, los monosacéridos son parte de compuestos bioquimicos importantes como los acidos nucleicos, las coenzimas, las flavoproteinas y las sustancias antigénicas de los grupos sanguineos. ESTRUCTURA DE LOS CARBOHIDRATOS Introducci6n Quimicamente hablando, los carbohidratos son aldehidos o cetonas derivados de polihidroxy y aleoholes respectivamente se conocen como aldosasocetosas. Las unidades bdsicas de los hidratos de carbono son los monosacdridos, los cuales no se pueden subdividir por hidrélisis. Estos monémeros se nombran de acuerdo al numero de dtomos de carbono que poseen en la cadena: asi las tetrosas contienen 4, las pentosas 5 y las hexosas 6 Atomos de carbono. Estereoquimica Actividad dptica. Muchas moléculas bioldgicas, incluyendo los aziicares, poseen uno o més dtomos de carbono asimétricos y pueden, por lo tanto, te- ner estereois6meros. Por ejemplo, el gliceraldehido, uno de los azicares mas simples, tiene un carbono asimétrico y dos posibilidades de distribucién de los cuatro grupos unidos a dicho carbono. La formula de estos dos issmeros se da més abajo; en ella los carbonos asimétricos estén colocados en el centro de un tetrahedro, y los 4 grupos sustituyentes estan situados en las esquinas. La linea interrumpida indica que esta debajo del plano del papel. Las dos formas154 Bloquimiea practica pueden compararse con las imagenes de un espejo 0 con los guantes derecho e izquierdo. Estas dos configuraciones son isémeros épticos 0 enantiémeros y hacen rotar el plano de la luz polarizada en proporcién igual pero en direcciones opuestas, Cuando el plano de la luz polarizada rota a la derecha, el compuesto es dextrorotatorio y se denomina(d)o(+).Cuando el plano dela luz polarizada rota hacia la izquierda, el compuesto es levorotatorio (1) 0 (—). Espejo CHO CHO CHO CHO H-t-on gf >on woSf>H Ho-¢-H H,0H CH,0H Gi,08 © br, 08 (Dextro) (Levo) d-Gliceraldehido l-Gliceraldehido Formas D y L. Las aldosas se pueden considerar como formadas por.adicién sucesiva de grupos alcohol secundario (—CHOH) al compuesto patrén, gliceraldehido. Toda vez que el gliceraldehido puede existir en dos formas, se originan dos familias de aldosas: aquellas derivadas del d-gliceraldehido conocidas como D-azticares y aquellas provenientes del 1-gliceraldehido denominadas L-aziicares. Las letras D y L no indican actividad dptica, sino que se refieren a la configuraci6n alrededor del 4tomo de carbono vecino al que se encuentra ms alejado del extremo de la cadena que contiene el grupo aldehido o cetona. Asi, pues, un D-aziicar puede ser dextrorotatorio(D(+))0 levorotatorio (D(— )) dependiendo de la configuracién de los otros 4tomos de carbono presentes. CHO Aldosas (HOH), 1H, OH Numero de formas D L triosas n=1 7 1 tetrosas n=2 2 2 pentosas n=3 4 4 hexosas n=4 8 8Carbohidratos 155 La mas simple de las cetosas es la triosa dihidroxiacetona, pero este compues- to no tiene actividad dptica; asi que la tetrosa, D-eritrulosa, es el compuesto matriz de las D-cetosas CH, OH 0 D-Eritrulosa H-G-OH bu, OH Las pentosas, hexosas, etc., se forman por la adicién de grupos alcohol secundario. Numero de formas D L ) Tetrosas n=l 1 1 Pentosas n=2 2 2 Hexosas n=3 4 4 Numeracién de los étomos de carbono. Los étomos de carbono se numeran a partir del extremo de la cadena que contiene el grupo carbonilo reactivo, asi: ‘CHO ‘CH, OH Hq don 2ko Hod Ho-°6-H u-*¢-on H*-on n+ b-on H-°0-OH $tH, on dion Glucosa Fructosa Formula ciclica, Cuando se disuelve D(+)-glucosa en agua, se obtiene una rotacin especifica de +113 grados, pero esta cambia lentamente hasta que a as 24 horas el valor obtenido es +52.5 grados. Este fenémeno se conoce con el nombre de mutarotacién y es caracteristico de algunas pentosas, hexosas y disacdridos reductores. La raz6n para el cambio de rotacién es que la glucosa existe en solucién principalmente en la forma ciclica, la cual se obtiene por la formacién de un hemiacetal intramolecular, como se indica mds abajo.156 Bloquimica préctica Esto origina otro carbono asimétrico (C,), que da lugar a dos formas ciclicas (ay B) las cuales se conocen como anémeros. CHO An nto u-¢-on Ho-U-H sno HO-C-H 0 H-C-OH H-C—-OH H-C-OH 1H, OH du, on La forma comin de la glucosa, D(+), es la forma con una rotacién espe- cifica de + 113 grados. Cuando ésta se disuelve en agua, se establece un equili- brio con una rotacién de + 52.5 grados. Igualmente, cuando la forma B que tiene una rotacién de + 19.7 se disuelve en agua ocurre mutarrotacion dando un valor final de + 52.5 grados que es el de la mezcla en equilibrio. La forma de cadena abierta se encuentra también en equilibrio con las dos formas ciclicas y es ésta la responsable de las propiedades reductoras de los azticares. La formula ciclica mostrada arriba para la glucosa es la proyeccién de Fischer, la cual no es completamente correcta. Una mejor representacién de la estructu- ra fue dada por Haworth, que muestra el anillo en un plano con los grupos hidréxilos orientados por encima y por debajo de él. Para efectos de claridad, generalmente no se incluyen los 4tomos de hidrégeno. CH, OH CH, OH CH, OH 0. 1H 0 . OE —— (2/118 4 pessoa OH — OH eae OH HO OH on HO OH OH OH a-D-glucosa Forma de cadena abierta 8-D-glucosa Mezcla en equilibrio: 36% 0.02% 64% El anillo formado en el caso de la glucosa contiene cinco 4tomos de carbono y uno de oxigeno y es andlogo al pirano; por lo tanto se dice que la glucosa existe en forma de piranosa. Muchos de los azitcares comunes existen en la forma de anillo de piranosa, pero algunos existen como anillos de cuatro 4tomos de carbono denominados furanosas, por parecerse al compuesto furano.Carbohidratos 157 _ Por ejemplo, la fructosa se presenta en forma de furanosa en la sacarosa, pero como anillo de piranosa cuando esté libre en solucién. As{ mismo, la ribosa y la deoxiribosa muestran una estructura de anillo de furano cuando hacen parte de los acidos nucleicos, pero en el estado libre existen como estructuras de pirano. QO Pirano Furano Enlace glicosidico Glicésidos y disacéridos. El grupo carbonilo presente en todos los azticares es muy reactivo y puede formar hemiacetales o acetales con otros compuestos hidroxilicos. HH] _xon H_xon x beo + no buon 1H, OH 1H, OH Gliceraldehido —_ Glicerol Esteres. Los aztcares forman facilmente ésteres cuando reaccionan con el cloruro o el anhidrido de un Acido en presencia de un catalizador. Los ésteres de fosfato de los monosacdridos son de fundamental importancia en el metabolismo de los hidratos de carbono. Los ésteres formados con grupo alcohol primario del ultimo carbono (glucosa-6-fosfato) son usualmente los mis resistentes a la hidrdlisis acida. Los hemiacetales que se forman con losCarbohidratos 150 . grupos reductores son, por el contrario, muy inestables en dcidos (glucosa-1- fosfato). Derivados amino. El hidréxilo que se encuentra en la posicién 2 de muchos aziicares puede ser reemplazado por un grupo amino como por ejemplo en galactosamina y glucosamina. Estos compuestos existen también como los derivados N-acetilo y hacen parte de la estructura de muchos polisacéridos. La presencia de los grupos amino cerca del enlace glicosidico hace que la molécula sea més resistente a la hidrélisis. CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA BIOQUIMICA Azucares simples Los azticares simples estén ampliamente distribuidos en la naturaleza y desarrollan muchas y variadas funciones. Por razones de simplicidad, en la tabla 6.1 sélo se presentan algunos azucares simples y no se incluyen ~ derivados de los hidratos de carbono. Macromoléculas Homopolisacéridos. Son moléculas muy grandes compuestas tinicamente de un tipo de monosacérido, a pesar de que varias macromoléculas diferentes pueden ser construidas a partir de la misma unidad de monosacérido. Esto se debe a que las moléculas pueden tener tamafio diferente, grados diferentes de ramificacién y entrecruzamiento y diferentes enlaces glicosidicos. Esto se ilustra claramente para la glucosa, que es el componente basico de varios polisacéridos, en la tabla 6.2. Heteropolisacéridos. Estas moléculas se forman a partir de dos o mas unida- des basicas y estén frecuentemente asociadas con proteinas. Dichos compues- tos se conocen con el nombre de proteoglicans 0 mucoproteinas cuando el componente polisacaridico predomina en la molécula. Estos materiales, de naturaleza gelatinosa y viscosa, actéan como lubricantes o cemento intrace- lular. Los complejos proteina-carbohidrato se conocen con el nombre de glicoproteinas cuando el carbohidrato es el componente menor. Las cadenas cortas de oligosacéridos, aun en pequefias cantidades, pueden tener una in- fluencia considerable en las propiedades biolégicas de las proteinas. Por ejemplo, las propiedades antigénicas de las sustancias de los grupos sangui- neos depende de la naturaleza quimica de estas cadenas de carbohidrato. La estructura y enlace de las unidades no se conocen en muchos casos, por lo cual en la tabla 6.3 solo se dan los componentes.Bloquimica practica 160 -eyBsaua stonposd esed sefnjgo sey uo epepixo £ auBues e] ua epeyzodsues; $9 sons, By] ‘uoIonqiysip el[due sgur ap eonze [2 sq “dN 4 ‘GWN ‘GV ‘dL seurrzua0co se[ ua ugiquiey ajuasaid ‘seujajosd ap sisoy -uts ef ua edronjied anb eqnagouosoeut “(NUV) oatajanuogit Opry [ap [eouase ayuauoduoD, “SOATA souIsTUeBI0 So] ua opexquooua congue yer1ayeW [> BUAIO; anb e[nogjowouew ef (NY) odlejnuogis ~1kosap optoy [ap ayueyrodurt ayuaAnynsu09 UN, “sisojnazaqna P| ap o[!98q [ap Soprs9ay[8 soy ua e.jUANOUA as eSOUIG -B18-( eT “seIJaj0eq seunsye Jod epeyuauties 82 anbune ‘aaquioy [a ue ugIoUNy Ns 99009 as ON “sa[ejaBan seursoz ue seuvsojuad oulo9 eTTeY aS HO OH HO-H| HO esoon[3-q a, HO'HO svsoray HO HO HO. KN Bsoqii-C 0~ *HOOH HO ‘0 wot esoqunarn0%cre HOOH OH HO-HK OH esourqeze-"] sosoquad upjoung & wait enwugy £ zeonzy saqduis saseonze soungye ap ugtoung A jeanjeu opeisg 4°9 BIGeL161 Carbohidratos “ozesequia [2 ayuesnp euro ef ua ajuasasd seys9 apand £ soxaysuieur soj ap aypay e| ua esjUaNOUD ag “sauopuay soy A ofe[1,280 [a ‘soauyn3ues sodnis So] ap se1ouejsns se] ua ajuasaad eisa euturesoy -2e [88 ey] “so1se[doro[o soj ap seuesquiaui sey ua £ osoraszau oprtay [ap sopidrjooy|a soy ua eayuano -ua as & Jeanjonsysa sa jedroutad ugrouny ng “s1s}9913 ef ue sayUeyzoduut sors ~erpawrsaqUr soysanduios Uos 078}S0} ap $919189 sng ‘Teurwias opmnbyy 1a & efage ap fat ey ‘seynay se[ ua exyuanoua as sa.e9n7e So] ap do]Np SPU |G HO HO HO-H HO Yo. HO ‘0: ‘0: OH HO*HO HO'HO (esoon3-q-4'T-T1s019e[@3-q- gf) es0}e7 sopupansip HO. HO-H HO esonaeje8-q 0. OH HO"HO HO HO"HO OH (g euro) esoqonay-q HO, ugrouny £ wat pynuiigy £ xeonzy3 Bloquimica practica 162." -eyoejowas ey & seanze ap eyes ef ap ajuaurfedioutad auango as £ sejuejd se] ua exUaNIOUA ag ‘soprreoBsOUOU So] ap $2.10} -onpaz ajuaulfefouayod sodnaZ sop soy axyua euLoy as aaeiua [a anb oysand Joyonpax ou sy ‘yjeur e| ua £ ugIeUTUE -10l ua s9]eaiao so] ua ajuasaid ‘ese[fure- P| aod ugprul[e ap ugnsalip ef ayueanp epronposg, HO HO*HO OH 0~ *HOOH OHO OH HO ‘0. HO*HO (esoxonay-q-1'I-g -T1soon[8-q-») esorBoes HO HO co OH HO-H HO HO 0. 0. HO*HO HO'HO (esoon8-q-F'T-11800n[8-q- >) esoreTabla 6.2 Propiedades de algunos homopolisacdridos Carbohidratos 163 Polisacérido y unidad monosacaridica polisacéridos de reserva almidén (o.-D-glucosa) amilosa (a -D-glucosa) amilopectina (a -D-glu- cosa) glicégeno (a@-D-glucosa) inulina (6 -D-fructosa) polisacéridos estructurales celulosa (6 -D-glucosa) quitina (§-D-N-acetil- glucosamina) Estructura Es una mezcla de amilosa y amilopectina en una proporcién de 1a 4. Cadena lineal de enlaces a 1-4, peso molecular aproximado de 50 000. Cadenas lineales con enla- ces a 1-4 con ramifica- ciones de enlaces @ 1-6. Peso molecular 0.2 x 108 — 1x 106 Una molécula en forma de drbol semejante a la amilopectina pero més ramificada, peso mol. 1 x 108 - 3 x 10° Unidades de fructosa liga- das por enlaces 6 1-2. Peso mol. ~ 5000 Cadenas lineales unidas por enlaces f 1-4. Peso mol.~ 50 000. Cadena lineal con enlace B 1-4. Estado natural y funcién Es el principal hidrato de carbono de reserva de algu- nas plantas tales como papa, cereales y arroz. Presente en la mayoria de los almidones hasta en un 20%. Es el principal componente del almidén (80% aproxi- madamente). Es el polisacdrido de reser- va més ampliamente di- fundido en los animales, principalmente en el higa- do y los misculos. Carbohidrato de reserva en™ muchas plantas tales como dalias y alcachofas. El principal componente de las paredes celulares de las plantas y de algunas algas y bacterias. . El principal componente del exoesqueleto de insec- tos y crustdceos tales como cangrejos y langostas.164 Bloquimica practica Tabla 6.3 Algunos heteropolisacéridos comunes Polisacdrido Unidades monosacaridicas Estado natural y funcién mucopolisacdridos heparina (peso mol. ~ 17 000) Acido hialurénico (peso mol 1 * 108) Sulfatos de condroitina AyCc complejos de polisacéridos bacterianos Polisacaridos de la cépsula mureina Acido D-glucurénico sulfato de D-glucosamina. Acido D-glucurénico N-acetil-D-glucosamina Acido-D-glucurénico sulfato de N-acetil-D- galactosamina La composicién exacta depende del tipo de orga- nismo, N-acetil-D-glucosamina, dcido-N-acetilmuramico, cadenas de oligopéptido. Presente en las paredes arteriales y en los pulmo- mones. Es un anticoagu- lante muy util Cemento extracelular y liquido sinovial alrededor de las articulaciones donde actia como lubricante. Muy abundante en el tejido cartilaginoso. Responsable de las propie- dades antigénicas de las bacterias. Una gran red tridimensio- nal que hace parte del esqueleto de las paredes celulares bacterianas. PROPIEDADES QUIMICAS Pruebas generales para carbohidratos Se sugiere hacer las siguientes pruebas en algunos carbohidratos que se consideran tipicos de cada grupo. Para tener una idea de la sensibilidad del método deben probarse soluciones de 1 g/l y 10 g/I. Monosacaridos: Disacaridos: Polisacéridos: glucosa, fructosa, galactosa (hexosas), arabinosa, xilosa (pentosas). 100 31 de cadauno. lactosa, maltosa, sacarosa. celulosa, glicégeno, inulina, almid6n.Carbohidratos 165 EXPERIMENTO 6.1 Prueba de Molisch Fundamento El Acido sulfurico concentrado hidroliza enlaces glicosidicos para dar monosacéridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus deri- vados. Estos productos se combinan luego con @-naftol sulfonato originando un complejo purpura. Esta reaccién es general para los hidratos de carbono pero algunos otros compuestos organicos dan también furfural con dcido sulftrico concentrado. Materiales 100 1. Acido sulfurico (concentrado). 1500 ml 2, cenaftol (50 g/l en etanol; preparese fresco). 200 ml Método Agregue dos gotas de la solucién de o-naftol a2 ml de la sustancia problema. Afiada cuidadosamente por las paredes del tubo aproximadamante 1 ml de H,SO, concentrado hasta que se formen dos capas. Observe cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de los dos liquidos. Repita el procedimiento, usando agua en vez de la solucién de carbohidrato. OH i. (3 OD CO 97 CHO NG Furfural a-Naftol Antrona EXPERIMENTO 6.2 Reaccién de la antrona Fundamento La reaccién de la antrona es otra prueba general para hidratos de carbono. El fundamento es el mismo quese describié en el experimento 6.1, excepto que el furfural reacciona con antrona (10-ceto-9,10-dihidroantraceno) dando un complejo azul-verdoso). Materiales . 100 1. Solucién de antrona (2 g/1 en H,SO, concentrado). 31 Método A aproximadamente 2 ml del reactivo de antrona agregue cinco gotas de la solucién problema, mezcle fuertemente y observe el cambio de color.166 Bioquimica practica Reacciones de los azuicares reductores ‘Si se calienta una suspensi6n de hidréxido de cobre en solucién alcalina, se forma 6xido cuprico de color negro: Cu(OH), + CuO + H, 0. Sin embargo, en presencia de sustancias reductoras, se precipita éxido cupro- so de coloracién parda-orin: 2Cu(OH); > Cu,0 + H,0 +0. En la préctica, se usa una solucién alcalina de una sal de cobre y un compuesto organico que contiene un —OH alcohélico en vez de la suspensién que se menciona arriba. Bajo estas condiciones, el cobre forma un complejo soluble y el reactivo es estable. Los hidratos de carbono que poseen un aldehido libre o potencialmente libre o un grupo ceténico tienen propiedades reductoras en solucién alcalina. Ademés, los monosacaridos actian como agentes reductores en soluciones débilmente dcidas. EXPERIMENTO 6.3 Prueba de Benedict Fundamento En la modificacién de la prueba de Fehling introducida por Benedict, se usa fnicamente una solucién, lo cual la hace mucho més simple, con la ventaja adicional de que el reactivo es més estable que el de Fehling. Materiales 100, 1. Reactivo de Benedict. (Disuelva 173 gde citrato de sodio y 31 100 g de carbonato de sodio en aproximadamente 800 mi de agua caliente. Filtre a través de papel de filtro en una probeta de 1000 ml y complete con agua hasta 850 ml. Mientras tanto, disuelva 17.3 g de sulfato de cobre en aproximadamente 100 ml de agua y complete hasta 150 ml. Vierta la primera solucidn en un vaso de precipitados de 2 ly afiada lentamente la solucién de sulfato de cobre agitando continuamente.) 4 i ? Método ql Agregue cinco gotas de la solucién problema a2 ml del reactivo de Benedict y ‘# coloque en un bafio de agua hirviendo por 5 min. Examine lasensibilidaddela prueba de Benedict usando diluciones crecientes de glucosa.Carbohidratos 167 EXPERIMENTO 6.4 Prueba de Barfoed Fundamento EI reactivo de Barfoed es débilmente dcido y solamente puede ser reducido por monosacéridos. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar disacdridos dando asi reacciones falsamente positivas. El precipita- do de éxido cuproso es menos denso que en los métodos previos y se recomienda dejar el tubo hasta que el precipitado sedimente. El color del éxido cuproso es también diferente, tendiendo més a rojo ladrillo que al pardo naranja obtenido en la prueba de Benedict. Materiales 100 1. Reactivo de Barfoed. (Disuelva 13.3 g de acetato de cobre 31 en aproximadamente 200 ml de agua y agregue 1.8 ml de Acido acético glacial). Método A 2m del reactivo de Barfoed afiada 1 ml de la solucién problema, hierva por 1 min y deje reposar. oe EXPERIMENTO 6.5 Preparacién de osazonas Fundamento Los compuestos que contienen el grupo -CO—CHOH— forman osazonas cristalinas con fenilhidrazina. Los cristales de osazona tienen forma y puntos de fusién caracteristicos lo cual ayuda a la identificaci6n de los azicares reductores. Otros datos que pueden ayudar son el tiempo de formacién de los cristales y precipitacién de la osazona en frio o en caliente. La fenilhidrazina reacciona con el grupo carbonilo de los azacares dando la fenilhidrazona que a su vez reacciona con dos moléculas mas de fenilhidra- zina para formar la osazona. A continuaci6n se describe la formacién de una osazona a partir de una aldosa; sin embargo, el mecanismo de la reaccién es ms complejo de lo que aqui se muestra. La reaccién de una cetosa es bastante similar. cHO CH=N-NH-C, Hs cHon + H,N-NH-C,H; ——> CHOH +4H,0 R Aldosa Fenilhidrazina Fenilhidrazona CH=N-NH-C, Hs CH=N-NH-C, Hs I CHOH + H,N-NH~C,H; —~-> C=N-NH-C,Hs + CgHs;NH2 +NH3 Fenilhidrazona Osazona188 —_Bloquimica préctica augers omemeee aoe a Ny : ® ® — ‘Arabinosazona (agujas agrupadas en bolas ‘no muy densas) — (agujas finas agrupadas en bolas) Figura6.2_ Apariencia cristalina de las osazonas comose observan en e! microscopioa baja potencia. Tanto la glucosa, como la fructosa y la manosa forman la misma osazona, puesto que la configuracién de los 4tomos de carbono 3, 4, 5y 6 es la misma para los tres aziicares. La manosa forma cristales blancos de fenilhidrazona a temperatura ambiente, y la osazona de color ariarillo se separa al calentarla. Materiales 100 1. Acido acético (glacial). 11 2. Solucién de fenilhidrazina. 200 ml 3. Acetato de sodio. 500 g 20 4. Microscopios. Método ‘Acidifique 5 ml de la solucién de los azitcares con 10 gotas de cido acético gla- cial, agregue tres gotas de la solucién de fenilhidrazina y un poco de acetato de sodio s6lido (en la punta de un cuchillo). Caliente en un bafiode agua durante 5 min agitando ocasionalmente, filtre y caliente el filtradoen un bafiode agua por 20 min. Deje enfriar muy lentamente y examine bajo el microscopio los cristales de osazona: compare sus formas con los dibujos de la figura 6.2.Carbohidratos 169 Anote cuidadosamente el tiempo al cual precipita cada osazona y también si se forma en solucién fria o caliente (ver apéndice). Pruebas para carbohidratos individu: EXPERIMENTO 6.6 Prueba de Bial para las pentosas Fundamento Cuando se calientan pentosas con HCI conc. se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso. La reaccién no es absolutamente especifica para las pentosas, ya que el calenta- miento prolongado de algunas hexosas produce hidroximetil furfural que también reacciona con orcinol dando complejos coloreados. Materiales 100 1. Reactivo de Bial. (Disuelva 1.5 g de orcinol en 500 ml de 41 HCI cone. y afiada-20 gotas de solucién de FeCl; 100 g/1). 2. Alcohol amilico. 41 Método En un tubo de ensayo agregue aproximadamente 1 ml de la muestra a 2.5 ml de reactivo y caliente hasta que empiece a hervir. La aparicién de una coloracién azul verdosa indica resultados positivos. Enfrie el tubo, luego agregue 2-3 ml de alcohol amilico y agite. CH; Orcinol (3,5-dihidroxitolueno) HO! OH EXPERIMENTO 6.7 Prueba de Seliwanoff para las cetosas Fundamento Las cetosas se deshidratan més répidamente que las aldosas dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rojo; por lo tanto, debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se esta estudiando. OH Resorcinol (m-dihidroxibenceno) on Materiales 100 1. Reactivo de Seliwanoff (resorcinol 0.5g/1 en HC] 31 3 mol/l). ;170 Bloquimica practica Método A2ml del reactivo de Seliwanoff agregue dos gotas de soluci6n de carbohidra- to y caliente durante 1 min en un bafio de agua hirviendo. Observe la aparicién de un color rojo intenso. EXPERIMENTO 6.8 ‘Pruebas para sacarosa Fundamento La sacarosa es el Unico disacdrido comtin no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre ni forma osazonas. La sacarosaes hidrolizada en solucién dcida y luego se ensayan la glucosa y fructosa resultantes. Materiales 100 1. Solucién de sacarosa (1 g/l y 10 g/l). 11 2. Acido clorhidrico (cone.). 200 ml 3. Hidroxido de sodio (5 mol/1). il 4, Reactivos como en los experiments 6:3, 6.4, 6.5 y 6.7. Método A5 ml de solucién de sacarosa agregue cinco gotas de HCl conc., caliente durante 5 min en un bafio de agua hirviendo, enfrie y agregue NaOH hasta que la solucién sea neutra o débilmente alcalina. Con la solucién hidrolizada realice las pruebas para azucares reductores y la de Seliwanoff. Prepare la osazona usando el hidrolizado e identifique los monosacéridos constituyentes por medio de la cromatografia de capa delgada (experimento 3.12). EXPERIMENTO 6.9 Prueba del Yodo Fundamento El yodo forma complejos coloreados de adsorcién con los polisacéridos; el almid6n da un color azul con yodo, mientras que el glicégeno y el almidén parcialmente hidrolizado reaccionan dando una coloracién pardo rojiza. Materiales 100 1, Solucién de yodo (5 mmol/! en KI (30 g/1)). 100 ml 2, Celulosa, glicégeno, almidén e inulina (10 g/1). 200 ml Método ‘Acidifique la muestra con HCl diluido, agregue luego dos gotas de yodo y compare los colores obtenidos con los de yodo en agua. EXPERIMENTO 6.10 Hidrdlisis de los polisacdridos Fundamento e Los polisacéridos contienen sélo un grupo reductor por varios cientos o mas de residuos, asi que, en la practica no son reductores. La hidrélisis 4cida libera Ios monosacéridos constituyentes que pueden ser luego ensayados.Carbohidratos. 171, Materiales 100 1, Polisacéridos como en el experimento 6.9. 200 ml 2. Acido clorhidrico (conc.). 500 ml 3. Hidréxido de sodio (5 mol/l). 500 ml, 4, Solucién de yodo (aprox. 5 mol/l en KI (30 g/1)). 100 ml 5. Reactivos como en el experimento 6.3, 6.5 y 6.7. = Método Coloque en un tubo 10 ml de solucién de polisacdridos, afiada 10 gotas de HCI conc. y hierva cuidadosamente. Con una pipeta de Pasteur remueva una gota de la solucién cada minuto y mézclela con una gota de yodo en una baldosa blanca, Al mismo tiempo, retire 3 gotas de la soluci6n, coléquelas en un tubo de ensayo, neutralice con NaOH y agregue 5 ml de la solucin de Benedict. Continue sacando muestras durante 6 min o més silo cree apropiado; luego coloque los tubos que contienen la solucién de Benedict en un bafio de agua hirviendo durante 3 minutos y deje enfriar. Explique los resultados. Neutralice con Alcali el resto de la solucién e identifique el azticar o los azacares presentes hasta donde sea posible. Protocolo para la identificacion de un carbohidrato desconocido Luego de que todas las pruebas anteriores hayan sido realizadas satisfacto- riamente, disefie un protocolo para la identificacién de una solucién de carbohidratos. Compare su protocolo con el que se da en el apéndice. Todas las identificaciones deben ser confirmadas mediante cromatografia de papel ode capa delgada. En este punto se aconseja identificar, hasta donde sea posible, muestras desconocidas de carbohidratos. Polarimetria Elpolarimetro. Tal como se discutié previamente, la mayorfa de los azticares contienen uno o mas atomos de carbono asimétrico y poseen actividad 6ptica. La rotacién del plano de laluz polarizada puede demostrarse y medirse con un polarimetro (figura 6.3). La luz monocromatica atraviesa un prisma de Nicoly sale polarizada en un plano. El haz de luz polarizada pasaa través de la mues- tra de azticar, que hace rotar el plano de la luz, Se hace entonces girar el segundo prisma de Nicol hasta cuando su plano de polarizacién se encuentre en Angulo recto con el primer prisma, y por consiguiente, el rayo de luz no pueda pasar a través del instrumento. Alternativamente se hace girar el segundo prisma hasta cuando corresponda con el plano de polarizacién del primero dando as{ un campo de maxima brillantez. El instrumento se gradia en cero en cualquiera de estas posiciones usando solvente Gnicamente en la cdmara de muestra. En la prdctica, la luz emergente se ve como dos zonas semicirculares y el cero se obtiene cuando ambas mitades del campo visible172 Bloquimica practica Lente de luz Luz polarizada monocromatica | @ Polarizador Tubo del polarimetro que Analizador contiene fa muestra Figura 6.3 Componentes esenciales del polarimetro son de oscuridad o brillantez uniforme. Se reemplaza luego el solvente con la solucién que se va a investigar y se hace girar el analizador para volver a las condiciones de brillantez minima o maxima. Se toma nota entonces del grado y la direccién de la rotacién. Si el dngulo de rotacién avanzaen la direccidn en que se mueven las mane- cillas del reloj, el compuesto es dextrorrotatorio (+) y silo hace en sentido con- trario, entonces el azucar es levorrotatorio (—). Rotacién especifica. El grado de rotacién observado depende de un numero de factores que incluyen la longitud del tubo (1, dm) y la concentracién del soluto (c, g/mil), asi como la temperatura (t, °C) y la longitud de onda de la luz usada(Anm). La rotacién especifica es caracteristica de cada compuesto y se define como la rotacién de la luz monocromatica causada por 1 g/ml de un soluto épticamente activo en un tubo de 1 dm a una temperatura fija. rotacién especifica [a] { = a/(! x c) En la practica, la mayorfa de los polarimetros simples usan lémpara de sodio (A= 589 nm) y las observaciones se hacen generalmente a 20°C y, en este caso, la rotacién especifica se da como [a] }? . EXPERIMENTO 6.11 Mutarrotacidn de la glucosa Fundamento La D-glucosa puede cristalizarse bien sea en la forma ao en la fy, las soluciones frescas de estos anémeros tienen rotaciones especificas [a] }° de +113° y 19° respectivamente. Luego de un tiempo, estas soluciones muestran mutarrotacién y se obtiene una mezcla de las formas a y 8 en equilibrio con una rotacién especifica de + 52.5°. Materiales 10 1. Polarimetros. 5 2. c-D-glucosa. 100 gCarbohidratos 173 3. B-D-glucosa. 100 g 4. Carbonato de sodio (0.1 mol/l. 50 ml 5. Cronémetros. 5 Método Mutarrotacién en agua destilada, Enjuague el tubo del polarimetro con agua destilada y llénelo completamente de agua. Afiada las tiltimas gotas con una pipeta Pasteur y tape cuidadosamente asegurandose de que no hayan quedado atrapadas burbujas de aire. Ajuste el instrumento acero con el tubo del polarimetro lleno de agua. Vacie el tubo y séquelo completamente. Transfiera cuidadosamente 5 g de «-D-Glucosa a un matraz volumétrico seco de 50 ml, agregue 40 ml de agua para disolver la glucosa, y llene hasta la marca con agua destilada. Mezcle rapidamente la solucién y Ilene el tubo del polarimetro con la solucién de glucosa: tome una lectura de la rotacién tan pronto como sea posible y comience el cronometraje (tiempo cero). Mida la rotacién cada 10 minutos durante los 30 minutos siguientes y luego a intervalos mas largos hasta obtener un valor constante. Repita el experi- mento con B-D-glucosa y haga un grafico del cambio de la rotacién especifica en funcién del tiempo. : Mutarrotacién en dlcali. Repita el experimento anterior con las formas a y B de D-glucosa, pero esta vez agregue 1 ml de solucién de Na,CO, (0,1 moi/l) antes de completar hasta la marca. Obtenga la primera lectura tan pronto como sea posible y tome lecturas cada 2 minutos durante 10 minutos y luegoa intervalos més largos hasta que no se observen mas cambios. Haga un grafico del cambio en la rotacién especifica en funcién del tiempo. iHasta qué punto coinciden sus lecturas de la rotacién especifica con las que se han discutido arriba? Repita el experimento en Alcali, pero ahora use sacarosa en lugar de glucosa y explique los resultados. DETERMINACION CUANTITATIVA DE CARBOHIDRATOS EXPERIMENTO 6.12 Determinacién de carbohidratos por el método de la antrona Fundamento La reaccién de la antrona constituye la base de un método répido y conveniente para la determinacién de hexosas, aldopentosas y Acidos hexurénicos, bien sea que estén libres o formando parte de los polisacdridos. La solucién azul verdosa muestra una absorcién maxima a 620 nm, aunque algunos carbohidratos pueden dar otros colores. Esta reaccién noes adecuada sien la muestra también se hallan presentes proteinas que contengan grandes cantidades de tript6fano, puesto que en este caso se obtiene una coloracién roja. :174 Bloquimica practica : La extincién depende del compuesto investigado, pero es constante para una molécula dada. Materiales 100 1. Reactivo de antrona (2 g/] en H,SO, cone). 51 2. Glucosa (0.1 g/l). 21 3. Glicégeno (0.1 g/l). 21 4. Otros carbohidratos con la misma concentracién si 21 se quiere. Método A1 ml de una solucién de carbohidrato agregue 4 ml del reactivo de antrona ‘libre de proteina y mezcle rapidamente. (Precaucidn: dcido fuerte). Coloque los tubos en un bafio de agua hirviendo durante 10 minutos tapandolos con una bola de vidrio para prevenir pérdidas de agua por evaporacién. Enfrie y lea la extincién a 620 nm contra un blanco. 7 Prepare curvas patrones para las soluciones de glucosa y glicégeno y compérelas entre si. Recuerde que la glucosa existe en el glicogeno como glicésido (C4H,oOs) y su peso mol. es 162y no 180. Examine la pureza de varias mezclas de glicégeno comercial. EXPERIMENTO 6.13 Determinacidn de azticares reductores por el método de Somogyi-Nelson Fundamento Se calienta el azucar con una soluciéri alcalina de tartrato de cobre produciendo asf éxido cuproso, que reacciona con arsenomolibdato para dar azul de molibdeno; el color azul intenso originado se mide en un colorimetro. En la mezcla de reaccién se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada de oxigeno atmosférico a la solucién, lo cual podria causar reoxidacién del éxido cuproso. La curva de calibracién obtenida depende en cierto grado del azacar determinado, asi que el método no es apropiado para la determinaci6n de una mezcla compleja de aziicares reductores. Se deben remover las proteinas antes de proceder a ladeterminaci6n. Esto se hace utilizando hidréxido de zinc como agente de precipitacién de proteinas para obtener asi una solucién neutra libre de proteinas. Materiales 100 1. Solucién alcalina de tartrato de cobre.(Disuelva en agua4gde 21 CuS0,. 5H,0, 24 g de Na,CO, anhidro, 16 g de tartrato sédico potasico (sal de Rochelle), y 180 g de Na,SO, anhidro y complete a 11). 2. Reactivo de arsenomolibdato de Nelson (disponible 21 comercialmente).Carbohidratos 175 3. Soluciones patrones primarias de azticares (glucosa, 50 ml fructosa y maltosa 1 g/] en Acido benzoico saturado). 4. Soluciones patrones de trabajo de aziicares (glucosa, 100 ml fructosa y maltosa (descritos en 3) diluidas 1 en 10 antes de usarse para obtener concentraciones de 100 ug/ml). 5. Algunas soluciones ‘desconocidas’ de azicares. 100 ml 6. Sulfato de zinc (solucién de ZnSO, . 7H,0, 50 g/l). 250 ml 1. Hidréxido de bario (0.3 mél/l). 250 ml 8. Bafios de agua hirviendo. 5 Método En un tubo pipetee 1.5 ml de agua y 0.1 ml de la muestra que contenga50—150 ug de azticares y mezcle vigorosamente. Afiada a la mezcla 0.2 ml de la solucién de hidréxido de bario y 0.2 ml de sulfato de zinc acuoso, mezcle y centrifugue. Use 1 ml del sobrenadante para los anilisis posteriores. Agregue ala muestra 1 ml del reactivo alcalino de cobre y mezcle. Coloque una bola de vidrio encima de cada tubo y caliente en un bafio de agua hirviendo por 15 min. Enfrie los tubos en agua fria; agregue 1 ml del reactivo de arsenomolibdato y déjelo reposar por un minuto hasta que termine la efervescencia. Diluya el color azul con agua hasta un volumen final de 10 ml (u otro volumen adecuado) y lea la extincién a 510 nm. La sensibilidad puede aumentarse leyendo la extincién a 660 nm, pero se prefieren longitudes de onda menores de 510 para minimizar los efectos de variaciones en el blanco y de la reoxidacién del éxido cuproso. El tiempo del calentamiento tiene que ser controlado cuidadosamente y algunos azticares pueden necesitar perfodos ms cortos o més largos en el bafio de agua hirviendo. EXPERIMENTO 6.14 Determinacién de glucosa por medio de laenzimaglucosa owidasa (-D-glucosa; oxigeno oxidoreductasa, 1.1.3.4) Fundamento La glucosa oxidasa es una enzima que se encuentra en el medio de crecimiento de Penicillium notatum y cataliza la oxidacién de 6 -D-gluco- piranosa a D-glucono-1,5-lactona con la formacién de peréxido de hidrégeno; la lactona es luego hidrolizada lentamente a dcido D-glucénico. La enzima es especifica para $-D-glucopiranosa, pero la mayorfa de las preparaciones de la enzima contienen mutarrotasa, que cataliza la interconversion de las for- mas a y 6. La D-manosa y la D-xilosa son también oxidadas por la enzima pero a velocidades de aproximadamente 1/100 de la correspondiente D-glucosa. el otro tinico azticar comtin afectado es la D-galactosa que es oxidada con una eficiencia de s6101/1000 en relacién con la glucosa. El método es por lo tanto altamente especifico para la glucosa. En la mezcla de reaccién , se incluye también peroxidasa y o-tolidina; la enzima libera oxigeno a partir176 Bloquimica practica del peréxido de hidrégeno y reacciona con la o-tolidina para dar un color azul. La reaccién es répida a temperatura ambiente pero el color es inestable; por lo tanto, todos los tubos deben ser observados al mismo tiempo. El tiempo més conveniente es cerca de 8 minutos, pero debe ser verificado mediante la solucién patron de glucosa. B-D-glucopiranosa + FAD == D-glucono-1,5 lactona + FADH, D-glucono-1,5 lactona + H,Q ——> Acido D-glucénico FADH, +0, == H,0, + FAD B-D-glucopiranosa + H,O +O, ——» Acido D-glucénico + H,0, Se ha reportado que la o-tolidina es carcinogénica, asi que debe usarse con cuidado. No pipetee con la boca. Materiales 100 1. Sulfato de zinc (ZnSO, . 7H,O, 100 gr/1). 200 ml 2. Sulfato de sodio isotinico (93 mmol/l). 21 3. Reactivo de sulfato de sodio y sulfato de zinc. (Diluya 21 55 ml de sulfato de zinc a 1 1 con la solucién de sulfato de sodio.) 4, Hidréxido de sodio (0.5 mol/l). 250 ml 5. Amortiguador de acetato (0.15 mol/l, pH 5). 61 6. Solucién de glucosa oxidasa (Fermcozyme de Hughes y 50 ml Hughes; consérvese a 4° C). 7. Peroxidasa (1 mg/ml; prepare y conserve a 4° C). 50 ml 8. o-tolidina (10 g/l en etanol absoluto, guarde en 50 ml botella oscura). 9. Reactivo combinado de o-tolidina: 150 ml de amorti- 61 guador de acetato y 1 ml de glucosa oxidasa, 1 ml de peroxidasa, 1 ml de o-tolidina. La preparacién es activa por varias semanas si se guarda en una botella oscura a 4°C, 10. Patrén de glucosa (0.1 g/l, preparese fresco). 100 ml Método Procedimiento. En un tubo de centrifuga coloque 1.8 ml del reactivo de sulfato de sodio-sulfato de zinc y afiada 0.1 ml de la muestra (sangre, etc). Afiada 0.1 ml de hidréxido de sodio, 0.5 mol/I, centrifugue y tome.1 ml del sobrenadante. Blanco. 1 ml de agua. Patrones. 1 ml de solucién de glucosa de concentracién apropiada. ‘Agregue 5 ml del reactivo combinado de o-tolidina y mezcle vigorosamen- te. Deje reposar los tubos por 8 min exactamente y lea el color a 625 nm.Carbohidratos 177 Use los métodos de Somogyi-Nelson’y glucosa oxidasa para determinar el contenido de fructosa y glucosa en una mezcla de azticares como la que se encuentra en la miel de abejas. EXPERIMENTO CON POLISACARIDOS EXPERIMENTO 6.15 Hidrdlisis dcida de glicégeno y otros polisacaridos Fundamento La hidrélisis 4cida de los enlaces glicosidicos a 1-4 y a 1-6 que unen los resi- duos de glucosa en glicégeno ocurre al azar y, por consiguiente, se puede formar toda una gama de oligosacéridos intermediarios, a pesar de ser la glucosa el producto final. Otros polisacdridos pueden ser més resistentes 0 mas susceptibles que el glicégeno a la hidrélisis cida y algunos de ellos se incluyen en este experi- mento como tépico de investigacién. Materiales 100 1. Preparacién de glicégeno a partir del higado de rata del lg experimento 10.14. 2. Otros polisacdridos tales como celulosa, inulina y quitina. lg 3. Acido clorhidrico (2 mol/1). 11 4. Hidréxido de sodio (4 mol/l). 11 5. Resina de intercambio aniénico débil. bo 6. Reactivo dinitrosalicilato (experimento 9.9). 21 Método En 10 ml de agua disuelva aproximadamente 50 mg de glicégeno y pipetee 1 ml de esta solucion en 7 tubos. Agregue a cada tubo I ml de agua y 2ml de HC12 mol/1 y coléquelos en un bafio de agua hirviendo. Coloque una bola de vidrio encima de cada tubo para prevenir pérdidas excesivas a causa de la evapora- cién y durante una hora remueva tubo por tubo a intervalos convenientes de tiempo. Neutralice los contenidos de cada tubo afiadiendo 1 ml de NaOH 4 mol/l y calcule el poder reductor total con el reactivo de dinitrosalicilato, como se indica en el experimento 9.9. Haga un grdfico del progreso de la hidrélisis del glicégeno y compare con el de los otros polisacdridos. ‘Al mismo tiempo, en un tubo agregue 2 ml de la solucién de glicégenoa2ml de HCl 2 mol/l ¢ hidrolice por 1 hora como se indicé anteriormente. Enfrie, agite con varias porciones de la resina de intercambio aniénico débil en la for- ma hidroxilada hasta que la mezcla tenga aproximadamente un pH neutro. Decante el sobrenadante y tselo mas tarde para cromatografia. Repita la hidr6lisis con los otros polisacéridos usando condiciones apropiadas.178 —_Bloquimica practice EXPERIMENTO 6.16 Hidrdlisis enzimdtica del glicégeno por a y B amilasas Fundamento Laa-amilasa cataliza la hidrélisis especifica de los enlaces glicosidicos a 1-4 en el glicégeno, pero no acttia sobre los enlaces 6 de la celulosa. Los enlaces 1-6 no son afectados; tampoco lo son los enlaces «1-4 que ligan las unida- des de glucosa en la maltosa. La hidrélisis no se hace en sitios especificos y se obtienen por lo tanto una serie de intermediarios diferentes. El producto final es principalmente maltosa con un poco de glucosa y maltotriosa. A medida que procede la hidrélisis se puede seguir el incremento en el numero de los grupos terminales reductores, usando el reactivo de dinitrosalicilato y se pueden identificar cromatograficamente los productos finales. La B-amilasa de plantas superiores cataliza la hidr6lisis.de los enlaces «1-4 para dar maltosa, pero es una exoamilasa y por lo tanto rompe las unidades de maltosa a partir del extremo no reductor de la cadena. Cuando se llega a un punto de ramificaci6n, la digestién se suspende dando una dextrina limite. Se da a la enzima el nombre de f-amilasa porque el producto inicial es B-mal- tosa el cual origina més tarde una mezcla equilibrada de a y B-maltosa. Al igual que con la «-amilasa, la extensién y el progreso de la hidrélisis puede se- guirse por determinacién de la cantidad de aztcares reductores producidos. Materiales 100 1. a-amilasa extraida de la saliva y B-amilasa de las - plantas. Preparacién de glicégeno de higado de rata. 1g Amortiguador de fosfato (0.1 mol/1, pH 6.7). Contiene 11 cloruro de sodio 0.05 mol/l). Reactivo de dinitrosalicilato (experimento 9.9). 21 Bafios de agua a 37°C. 25 oN oe Método En una serie de 7 tubos disuelva 50 mg de glicégeno en 10 ml de amortiguador salino (3) y pipetee 1 ml. A cada tubo afiada 3 ml de saliva diluida aproxima- damente.1 a 100 con agua, e incube los tubos a 37°C por 1 hora. A intervalos adecuados remueva 1 tubo, agregue 1 ml de agua y pare la reaccién agregando 1 ml del reactivo de dinitrosalicilato. Agregue 6 ml de c-amilasa a 2 ml de glicégeno e incube por 1 h a 37°C. Desalinice la muestra usando una resina de lecho mixto y utilice el sobrena- dante para cromatografia. Repita el experimento anterior con una preparacién convenientemente diluida de 6-amilasa en vez de saliva y determine la cantidad de aztcares reductores liberados. Compare la cantidad de maltosa liberada con la obtenida cuando se usa a-amilasa y calcule el porcentaje de glicégeno degra- dado por la B-amilasa (a-1,4-glucan maltohidrolasa 3.2.1.2.).Carbohidratos 179 EXPERIMENTO 6.17 Identificacién cromatografica de los productos de la hidrélisis dcida y enzimatica del glicégeno Identifique los productos de la hidrélisis usando cromatografia descendente de papel o de capa delgada (experimentos 3.10 y 3.12). Corra paralelamente muestras de los azticares que pueden estar presentes. EXPERIMENTO 6.18 Ruptura del glicégeno y produccién de glucosa-1-fosfato por la fosforilasa muscular Fundamento El glicégeno est presente en cantidades apreciables en el higado y en el musculo de los animales bien nutridos. Entre las comidas, este carbohidrato de reserva es degradado para producir energia. La primera etapa en el me- tabolismo del glicégeno es la ruptura de la molécula por la fosforilasa. Esta enzima cataliza la remocién de unidades de glucosa de la parte lineal de la molécula y la formacién de la glucosa-1-fosfato (G-1-P) a partir de fosfato inorganico. fostorilasa : (glucosa),, +P; ————-—> _(glucosa),_, + glucosa-1-fosfato. La ruptira del enlace glicosidico con introduccién de los elementos del agua se conoce como hidrélisis, mientras que la ruptura por fosfato se denomina fosforélisis; de aqui el nombre de la enzima fosforilasa. La reaccion es facilmente reversible, pero en vivo la concentracién de fosfato inorganico es tal que el equilibrio favorece la degradacién en vez de la sintesis. La mezela de reaccién contiene cisteina para mantener los grupos tiol (— SH) de la molécula proteica de enzima en la forma reducida, mientras que el cloruro presente inhibe la fosfoglucomutasa que en otra forma catalizaria la conversién de G-1-P a G-6-P. El AMP se afiade para obtener la maxima actividad enzimética, ya que la fosforilasa existe en dos formas: a y b y la forma b es activa tnicamente en presencia de AMP. El G-1-P producido es aislado como sal de bario y, siendo un hemiacetal, es hidrolizado fécilmente por acido diluido (H,SO, 0.5 mol/1) dando glucosa y fosfato. La reaccién se completa practicamente en 10min a 100° Cy estose usa para verificar la estequiometria de los productos. Materiales 100 1. Fosforilasa de glicégeno. 25 ml 2. Amortiguador de 8 -glicerofosfato de sodio (10 mmol/l 500 ml pH 6.8 que contiene cisteina 3 mmol/l y NaF 0.1 mol/I). 3. Gliedgeno (1.6% p/v en amortiguador de fosfato que 500 ml contiene 0.26 mol/l, pH 6.8; cisteina 6 mmol/] AMP 2 mol/1 y NaF 0.2 mol/l). 4. Amilasa. 100 ml180 Bloquimica practice , 5. Acetato de bario (200 g/l). 250 ml 6. Indicador rojo de fenol (10 g/l en etanol acuoso). 50 ml 7, Hidréxido de sodio (1 mol/!). 500 ml 8. Acido sulfarico (2 mol/l). 500 ml 9. Etanol absoluto. 11 10. Reactivo para la estimacién de fosfato (experimento 4.3). i 11. Bafios de agua hirviendo. 50 12. Bafios de agua a 37° C. 20 13, Probetas (25 ml). 50 14. Hielo molido. = 15, Reactivos para la determinacién de azticares reductores - (experimento 6.13). 16. Glucosa-1-fosfato (10 mmol/1). 100 ml 17. Glucosa-6-fosfato (10 mmol/1). 100 ml Método Incubacién. En un tubo de ensayo mezcle 5 ml de amortiguador B-glicero- fosfato con 5 ml de la solucién de glicégeno y equilibre a 37° C durante 10 min. Inicie la reacci6n afiadiendo 0.2 ml de fosforilasa convenientemente diluida en amortiguador f-glicerofosfato. Incube durante 30 minutos a 37° C y pare la reaccién colocando el tubo en un bafio de agua hirviendo durante 2 min. Aislamiento. Enfrie el tubo bajo agua corriente y remueva el exceso de glicdgeno afiadiendo 1 ml de solucién de amilasa y dejéndolo a temperatura ambiente por 30 minutos. Después de la incubaci6n con amilasa, afiada 2ml de la solucién de acetato de bario y dos gotas de indicador rojo de fenol seguido por NaOH 1 mol/l afiadido gota a gota hasta obtener una coloracién rosada. Mezcle de nuevo vigorosamente y remueva el precipitado de fosfato de bario centrifugando a velocidad maxima en una centrifuga de mesa. Remueva cuidadosamente el sobrenadante, mida el volumen y coléquelo en un erlenmeyer; agregue 3 veces el volumen de alcohol absoluto, mezcle bien y deje reposar por 30 minutos en hielo. El precipitado formado bajo estas condiciones es la sal de bario de la glucosa-1-fosfato. Decante el sobrenadante y centrifugue la suspensién durante 10 minutos a velocidad maxima en la centrifuga de mesa. Remueva el sobrenadante y deje secar el precipitado invirtiendo los tubos sobre papel de filtro. Repita el procedimiento de precipitacién después de afiadir 4 ml de agua al aztcar- fosfato precipitado. Estequiometria. Disuelva la sal de bario en 5 ml de agua y pipetee 2 mlen un tubo de ensayo que contenga 2 ml de H,SO, 1 mol/I. Mezcle vigorosamente y coloque en un bafio de agua hirviendo durante 10 min. Enfrie bajo agua corriente, agregue luego 2 ml de NaOH 2 mol/I para neutralizar la reaccién; centrifugue y ensaye el sobrenadante para aziicares reductores y fosfato usando los métodos que se dan en el libro. Pipetee otros 2ml dela muestra delCarbohidratos 181 éster de fosfato en 2 ml de H,SO,, pero esta vez agregue NaOH inmediata- mente después y no coloque los tubos en el bafio de agua hirviendo. En este control no hidrolizado se hace también la prueba para fosfatos y aziicares reductores. Calcule la produccién de G-1-P mediante la determinacién de aziicar y fosfato, suponiendo que se ha efectuado la hidrélisis completa. Compare los resultados con los obtenidos después de la hidrélisis cida de una solucién de glucosa-l-fosfato 1 mmol/l y de una solucién patron de glucosa-6-fosfato diluida 10 mmol/l. Bibliogratia Guthrie, R. D., Introduction to Carbohydrate Chemistry, 4a ed. Oxford Clarendon Press, 1974. Pigman, W. y Horten, D., The Carbohydrates, 2a ed. Nueva York, Academic Press, Vol. 1A, 1972, Vols 2A y 2B, 1970. Whelan, W. J., Biochemistry of Carbohydrates, Londres, Butterworth y University Park, University Park Press, 1975. Whistler, R. L. Methods in Carbohydrate Chemistry, Nueva York, Academic Press, Vols 1-6, 1962-71.