PRACTICA 6

TÉCNICAS DE TINCION

RESUMEN / PALABRAS CLAVE

1. OBJETIVOS
 Observar en el microscopio diferentes cultivos aplicando tinción.
 Aplicar diferentes técnicas de tinción.
 Determinar el tipo de microorganismos observados.
2. TEORÍA
2.1.Tinción.
Proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de
colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algún tratamiento previo.
(Santambrosio, E,. 2009. p.2)

2.2.Frotis
Es la extensión de una muestra o cultivo sobre un portaobjetos con el objeto de separar lo
más posible los microorganismos, para su análisis. Se fija al aire con calor o algún líquido
especial, para evitar que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados, se somete
a tinciones y generalmente se protege con un cubreobjetos, lo que permite su estudio
mediante un microscopio. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias
queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.
(Olivas, E,. 2012. p.10)

2.3.Tipos de tinción.
Se puede clasificar según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y
según los colorantes que empleemos durante el proceso
 Tinción Simple
Utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la
misma tonalidad, El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos
 Tinción Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en
función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución
química.
 Tinción de Gram:
Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol,
safranina 30 seg)

 Tinción Ácido Resistente:

Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido
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En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color
rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el
color azul.
 Tinción de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materiales núcleos de la células.
 Tinción de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
 Tinción de Cápsula:
Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados creando
resistencia.
 Tinción de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.
(Castillo, J.- 2010. p.23)

2.4.Tinción Gram
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844. Es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.
Su utilidad hace referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos). Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al
organismo así como para prevenir la lisis osmótica, confiere rigidez es el peptidoglicano. La
pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente 80%-90% de la pared es
peptidoglicano.(López, L,. y Hernández, M,. marzo 2014. p. 20).

3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipos
 Lámpara de alcohol
 Microscopio
 Porta y Cubre objetos.

3.2. Sustancias y reactivos

 Cultivos.
 Agua destilada
 Tinta china
 Alcohol Cetona
 Lugol
 Azul de metileno
 Cristal violeta
 Safranina
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 Fucsina Fenica
 Alcohol-Acido
 HCl

3.3. Procedimiento
3.3.1. Tinción negativa.
3.3.2. Se coloca en el portaobjetos una pequeña gota de tinta china, esta no debe sobrepasar
los 4 milímetros.
3.3.3. Se coloca el inóculo sobre la gota de tinta china.
3.3.4. Con otra placa de vidrio se realiza el frotis
3.3.5. Observar al microscopio.
3.3.6. Tinción simple.
3.3.7. Dependiendo del tipo de cultivo (sólido o líquido) se coloca los microorganismos en
la placa de observación.
3.3.8. Para medios líquidos
3.3.9. Se agita el tubo de muestra.
3.3.10. Se retira el tapon y se esteriliza con la lámpara de alcohol la boca del tubo al igual
que el asa de inoculación.
3.3.11. Se toma la muestra y se coloca en la placa delimitando un círculo en la mitad.
3.3.12. Para medios sólidos
3.3.13. Colocar una gota de agua en un extremo del portaobjetos
3.3.14. Con el asa bacteriológica estéril, tomar una pequeña cantidad de cultivo emulsionar y
extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2, dejar secar al aire.
3.3.15. Una vez colocados los microorganismos se procede a colocar el tinte.
3.3.16. Se coloca el tinte (azul de metileno) por 1 minuto.
3.3.17. Se lava con agua el tinte, y el remanente en la placa se quita con cuidado con papel
absorbente.
3.3.18. Se observa al microscopio.
3.3.19. Tinción Gram
3.3.20. Se realiza el paso 3.3.10. dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.3.21. Se cubre la muestra con violeta de genciana o cristal violeta por 10 segundos.
3.3.22. Lavar por con agua destilada, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir para
eliminar el exceso de agua.
3.3.23. Se coloca la solución de yodo. (Gram´s Iodine). 10 segundos
3.3.24. Lavar por con agua destilada, remover el exceso de agua
3.3.25. Decolorar alcohol cetona 70% /30% por 5 segundos.
3.3.26. Lavar con agua
3.3.27. Cubrir con Safranina durante 10 segundos.
3.3.28. Lavar con agua remover el exceso de agua usando papel absorbente.
3.3.29. Dejar secar al aire
3.3.30. Observar al microscopio
3.3.31. Tinción Ácido resistente.
3.3.32. Se realiza el paso 3.3.10. dependiendo si el medio es sólido o líquido.
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3.3.33. Colocar Fucsina fenica por 10 segundos, luego colocar al calor del mechero hasta
que se note la presencia de vapores blancos
3.3.34. Dejar reposar por 10 minutos.
3.3.35. Lavar con Alcohol ácido.
3.3.36. Colocar Azul de metileno.
3.3.37. Lavar con agua destilada.
3.3.38. Fijar y observar en 40x y 100x con aceite de inmersión.

4.1 Datos Experimentales.

Tabla 4.1-1
Observaciones de técnicas de Tinción
Técnica de Tinción Observaciones
Tinción Negativa - La muestra tomo una coloración negra debido al colorante
utilizado que en este caso fue tinta china
Tinción Simple - La muestra tomo una coloración azulada debido al
colorante utilizado que en este caso fue azul de metileno

Tinción Gram - En la muestra predomina la coloración violeta oscura.

Tinción Capsular - En la muestra predomina la coloración azul, y en

pequeñas secciones presenta un color fucsia.

4. RESULTADOS.
Tabla 4.1-1
Observaciones en el microscopio (Tamara Guevara)
Técnica de Tinción Observaciones
Tinción Negativa - Se observa microorganismos de forma redonda que
corresponden a los cocos de color transparente y el fondo
de la muestra toma una coloración oscura.
Tinción Simple - Se observa la presencia de microorganismos con forma
redondeada que corresponden a cocos, presentan una
coloración azul clara.
Tinción Gram - En la muestra se evidencia la presencia de bacilos y
cocos, que presentan una coloración rojiza por lo que
corresponden a los gram negativos.
Tinción Capsular - Se observa los microorganismos con morfología de
esporas y cocos con una coloración fucsia intenso que
corresponden a células de ácido resistentes positivas.

Tabla 4.1-2
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Observaciones en el microscopio
(Doménica Pazmiño)
Técnica de Tinción Observación.
Tinción Negativa La tinta china se aprecia en la forma de fondo negro en
la superficie de la placa, los microorganismos se
muestran de color lechoso y transparente, con un tono
blanco y ligeramente gris. La tinta china no alcanza a
teñir los microorganismos, se distingue presencia de
cápsulas en las células microbianas.
Tinción Simple Se observa los microorganismos teñidos de azul oscuro
por efecto del azul de metileno como puntos y cúmulos
de formas irregulares diseminados en la superficie de la
placa.
Tinción Gram El fondo de la placa es de color rosa claro, ligeramente
anaranjado. Diseminadas en la superficie se aprecia
figuras puntiformes e irregulares de color rosa, lo cual
indica la presencia de bacterias Gram negativo.
Tinción Capsular Se observa sobre un fondo anaranjado tenue figuras
irregulares y algunas fusiformes, todas de color violeta,
lo cual indica que la muestra no contenía bacterias ácido
resistentes.
Fuente: Centro de Biología, Universidad Central del Ecuador. (2018)

Tabla 4.1-2
Observaciones en el microscopio (Daniela Paredes)
Técnica de Tinción Observación.
Tinción Negativa Se observó grupos formados no tan grandes de un color
ligeramente blanquecino, de forma redonda de un color
negro de fondo debido a la tinta china, con espacios
entre grupos.
Tinción Simple Pudimos observar colonias formadas, agrupadas de color
azul oscuro debido al azul de metileno, de forma
redonda, de tamaño pequeño.
Tinción Gram Se pudo observar un color fucsia, con forma alargada y
redonda, no tan agrupada, por lo cual podemos decir que
son bacterias Gram negativas.
Tinción Capsular Se observar, como algo que le rodea de color blanco y
puntos como morado, de forma un poco amorfa no se
puede visualizar de manera correcta.

5. DISCUSIÓN
El método utilizado para la experimentación es cualitativo y fue adecuado para la
consecución de los objetivos planteados para la práctica. Los distintos procedimientos,
para tinción negativa, simple, gram y capsular, permiten distinguir microorganismos en
las placas por medio del efecto del contraste que produce determinada coloración. A la
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vez, distintos colorantes ejercen distintos efectos sobre las muestras, según sea la
naturaleza de estas para la identificación o clasificación de los microorganismos
presentes. En la tinción simple se utiliza un colorante solamente, el azul de metileno, por
lo que las estructuras celulares tienden a teñirse de color azul oscuro y se presentan en
forma de conglomeraciones al mayor aumento del microscopio. La tinción negativa
presenta una característica que se contrapone a las demás tinciones, pues es el espacio
libre de microorganismos el que se tiñe, y los microorganismos quedan libres de
coloración, o muy tenuemente opacados por esta, por lo que la luz del microscopio las
traspasa lo que permite diferenciar las conglomeraciones de microorganismos. La tinción
Gram permitió diferenciar las estructuras correspondientes a microorganismos de tipo
Gram negativo presentes en la muestra, de las Gram positivas; como se indica en la tabla
de resultados 4.1-1, se observó figuras de color rosa principalmente. La tinción ácido
resistente permitió la distinción de los microorganismos que son resistentes a la tinción
Gram, no se observó en la muestra microorganismos de este tipo. Se dio errores de tipo
aleatorio a lo largo de la práctica, entre ellos están los referentes a la tinción negativa, que
tuvo que repetirse debido a una fijación deficiente del colorante que impidió la
visualización de estructuras en el espacio ocupado por la tinta en primer término. Además
debido a la limitación del tiempo del cual se dispuso para la preparación de todas las
placas y su observación en el microscopio, no se puede asegurar que la muestra de la
tinción capsular no contuviese en efecto, bacterias ácido resistentes, pues la observación
no fue tan minuciosa como se hubiera deseado. Para prácticas futuras se recomienda
ceder más tiempo a la parte experimental por medio de la agilización de la parte
explicativa de la práctica, así se dispondrá de mejor manera de las placas y se podrá
observar con mayor cuidado los resultados en el microscopio.

6. CONCLUSIONES
6.1. Las técnicas de tinción sirven para clasificar a los microorganismos por su morfología
principalmente, y dependiendo de las características que necesitemos conocer sobre
éstos se pueden aplicar diferentes técnicas, en los cuales se utilizan determinados
colorantes que deben ser puestos en exceso durante un determinado tiempo; siguiendo
las indicaciones del método a utilizar para posterior observar las muestras en el
microscopio y así ir clasificándolos.
El método de tinción gram se caracteriza porque el microorganismo en su pared celular
posee péptido glicano y según la proporción que posea se va a colorear de violeta o rojo
correspondiendo a gram positivas o gram negativas respectivamente como se pudo
observar en la práctica.
Las técnicas más sencillas de realizar es la tinción simple y la tinción negativa, ya que
con éstos métodos solo se observa en el microscopio la morfología que presenta la
muestra como puede ser cocos, esporas o bacilos. (Tamara Guevara)
6.2. En la tinción negativa, los microorganismos no se tiñen con la tinta china debido a que
esta es un tinte de carácter ácido, conteniendo un ión cromóforo negativo sin afinidad
por las estructuras de los microorganismos presentes en la muestra; esto se contrapone a
lo observado en la tinción simple, donde los microorganismos que se tiñen por el
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colorante azul de metileno tienen afinidad por el ion cromóforo positivo del azul de
metileno. (Doménica Pazmiño)
6.3. Existen diferentes tipos de tinción, cada una tiene un objetivo específico y depende de lo
que se quiere analizar como su morfología, se debe tener en cuenta también que
microrganismo se va a trabajar ya que la tinción Gram es únicamente para bacterias. Es
una que es una tinción diferencial, que facilita la diferencia entre una bacteria Gram
positivas o Gran negativas, debido que la pared bacteriana de peptidoglucano es muy
importante en este caso ya que mediante esta se puede diferenciar al momento de teñir,
en nuestro caso se puedo observar una bacteria Gram negativa de color fucsia. Es
indispensable realizar correctamente el frotis y posterior fijación, coloración,
decoloración, lavado, coloración de contraste, y posteriormente observar en el
microscopio ya que depende de estos pasos para obtener un resultado adecuado. En el
caso de la tinción capsular no se fijó de manera correcta por lo que no se pudo apreciar
de manera adecuada. (Daniela Paredes).
7. CUESTIONARIO.
7.1.¿Cuál es la aplicación de las preparaciones en fresco?
7.2.¿Qué grupos microbianos se observan con las preparaciones en fresco?
7.3.¿Por qué se fija una muestra? ¿Cuándo se lo hace con calor y cuando sin calor?
7.4.¿Cómo están constituidos los colorantes?
7.5.¿Qué es una tinción diferencial?
7.6.¿Cuál es la diferencia entre tinción Gram y tinción Ziehl Neelsen y cuál es su
importancia?
La tinción Ziehl Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada
para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes. Estas bacterias tienen paredes
celulares que contienen ácidos grasos de cadena larga lo que les confiere la propiedad de ser
resistentes a la decoloración alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Se
requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras.
La tinción Gram un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la
visualización de bacterias, se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular
bacteriana. Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana, si la
pared está dañada se vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la
retención o el escape del colorante.

7.7.De qué color se observan las bacterias ácido alcohol resistentes, indique la causa.
Propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica
(rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor. La alta concentración de
ácido micolico en la pared celular es la causante de ser de este tipo, de la baja absorción y
alta retención de la tinción (fucsina). La técnica de tinción de Ziehl-Neelsen, donde la
bacteria queda teñida en rojo y se agrega una tinción de contraste de nombre azul de
metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria.
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7.8.¿Qué tienen en común y en que se diferencian las paredes celulares de las Gram + y
Gram? Cite un ejemplo de cada uno de los grupos.
Gram Positivas Gran Negativas
No tienen espacio periplasmatico Espacio periplasmático: espacio entre la
superficie externa de la membrana
citoplasmática y la interna de la membrana
externa.
Poseen una pared celular interna y una Poseen una pared celular más compleja:
pared de peptidoglucano. Pared celular interna
Pared de peptidoglucano
Bicapa lipídica externa

No tiene membrana externa Membrana externa: forma un saco rígido

En la tinción de Gram, retienen la tinción
azul
alrededor de la bacteria, mantiene
estructura y es barrera impermeable a
macromoléculas,
Quedan decoloradas.

Conservan el complejo yodo colorante Pierden el complejo yodo colorante

Son esporulantes y no esporulantes, como
Streptococcus, Cisteria, Frankia
Staphylococcus aureus. Responsable de
abscesos, dermatitis, infecciones
localizadas y posibles gastroenteritis.
Pueden ser anaerobios o aerobios
Salmonella typhi. Bacteria responsable de
la enfermedad conocida como fiebre
tifoidea, suele transmitirse por vía fecal-
oral: contaminación de aguas, mala
disposición de excretas o higiene
defectuosa.

8.- Bibliografía
8.1.-Santambrosio, E,. (2009). Tinción y observación de microorganismos. Universidad
Tecnología Nacional.
8.2.- Olivas, E,. (2012). Manual de Practicas. Laboratorio de Microbiología. Best. Publ. Co.
California.
8.3.- Castillo, J.- 2010. Las Tinciones en el laboratorio de Microbiología. Vol.3
Investigación en Discapacidad.
8.4.- López, L,. y Hernández, M,. (Marzo 2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de
microbiología. Obtenido de http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

8. ANEXOS
8.1.Diagrama del equipo.
8.2.Reporte fotográfico de las observaciones realizadas.
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