Genski polimorfizmi i

poligenske bolesti
 Poligenske bolesti

Genetička fenotip
osnova
(više parova gena)

Faktori sredine
Genetički-DNK polimorfizam

Varijacije u naslednoj osnovi čoveka

Humani genom:
3x109 parova svaki 1000. nukleotid
nukleotida je polimorfan

Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK

koje se sreću u populaciji zdravih ljudi

f alela > 1%, hetrozigoti > 2%

predispozicija za bolest ???
Tipovi DNK polimorfizma

Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP)

AAGGT C ili T GTTC

Različiti broj uzastopnih

(CA)25 = ALEL 5
ponovaka (VNTR) (CA)20 = ALEL 4
(CA)15 = ALEL 3
(CA)10 = ALEL 2
(CA)5 = ALEL 1

Deleciono/insercione varijante
Studije asocijacije

Udruženost genskih polimorfizama sa

nekom od poligenskih bolesti.
Sklonost tj.
podložnost!
Pristupi u izučavanju genetičke
osnove ateroskleroze

Studije asocijacije
Učestalost polimorfizma:

bolesni : zdravi

Geni
kandidati

Čitav
genom
Studije asocijacije
NAŠA ISKUSTVA

Trombofilija
Plućna embolija
Ateroskleroza
Aneurizma abdominalne aorte
Thrombofilija

Sklonost ka razvoju tromboze
 ponovljena
 porodična
 neuobičajena
lokalizacija i/ili životna
dob

Kliničke manifestacije

Venska tromboembolijska bolest

Ponovljeni spontani pobačaji
…trombofilija

Koagulaciona kaskada, prokoagulantni i antikoagulantni proteini

Genski polimorfizmi i trombofilija

Faktor V Leiden
Institut za

protrombin 20210 kardiovaskularne bolesti

MTHFR 677
Institut za hematologiju,
KCS
 faktor V Leiden
FV Leiden

X
faktor V Leiden varijanta uzrokuje
APC rezistenciju

APC ne prepoznaje
Glavno mesto “sečenja”
faktora V

Aktivacija protrombina
se nekontrolisano nastavlja

Normalan faktor V: APC se vezuje

za faktor V i seče ga na dva inaktivna
fragmenta (faktor Vi)
 …faktor V Leiden
f FVL alela :

1691 G>A
4-5% u beloj populaciji

Arg506Gln
ODSUTAN u domorodačkim populacijama
Azije, Afrike, Amerike, Australije

Potiče od jednog
belog pretka,
21-34 000 god.
 …faktor V Leiden

Relativni rizik za vensku
2.3 za
OR= trombozu heterozigote
15.6 •Žene koje uzimaju OC ili HRT

•Postoperativna VTE nakon

elektivnih orhopedskih operacija

•Pobačaji; preeklampsija;
abrupcija placente;
intrauterini zastoj rasta ploda Homozigotni nosioci

(The Thrombosis: Risk and Economic

Assessment of trombofilija
Screening (TREATS) study, 2006)
34x Veći rizik za
VTE u trudnoći
 Protrombin 20210

20210 G>A, 3’ UTR

nivo protrombina

f 20210A alela:

•1-4% u evropskoj populaciji;

1,5% u V. Britaniji
•REDAK u Aziji i Africi

Zajednički beli
predak!
 …Protrombin 20210

3 – 5x

Rizik za vensku trombozu povećan

•Oralni kontraceptivi
•Velike ortopedske operacije

•Pobačaji; preeklampsija;
abrupcija placente;
intrauterini zastoj rasta ploda

(TREATS study, 2006)

FV Leiden i protrombin 20210

Faktor trombofilije Relativni rizik za VTE

Faktor V Leiden 2-10

Protrombin G20210A 2-6

Faktor V Leiden i protrombin

20.0
G20210A (“dvostruki heterozigot”)

(Cleve Clin J Med., 2000)

MTHFR polimorfizam i
hiperhomocisteinemija

Tetrahidro-folat metionin

5,10 metilen-
tetrahidrofolat CH3

MTHFR
MTHFR

5-metil-
tetrahidrofolat homocistein
homocistein
CBS
Polimorfizam MTHFR gena
C677T (Ala222Val)

Kodon GCT Kodon GTT

Alanin valin

Zamena u katalitičkom domenu enzima

Termolabilna forma enzima, disocijacija dimera

Mogući genotipovi:

C/C normalan homozigot

C/T heterozigot

T/T homozigot za mutaciju: 5-20% u o.p.
 Polimorfizam MTHFR gena
C677T

Različita frekvenca alela T

crna rasa < bela rasa < žuta rasa (efekat
osnivača ?!)

Evropa: 0,24-0,4

Afrika: 0,065
Australija: 0,047
J. Amerika: 0,19
Detekcija polimorfizma
MTHFR C677T

Digestija PCR produkata
C 198 bp

T
175+23 bp
HinfI

Gel-elektroforeza
CC CT TT
 MTHFR i
plućna embolija

H-Hcy je mogući faktor

rizika za duboku vensku
trombozu (DVT), i njenu
komplikaciju – plućnu
emboliju (PE).

uloga MTHFR C677T

polimorfizma

Rezultati studija asocijacije

MTHFR 677TTgenotypa i DVT: sumarni
OR=1.29 (1.08-1.54). Wald, Law and Morris, 2007
Rezultati: frekvenca MTHFR 677 genotipova

%
50
45
40
35
30
CC
25 p>0,05 CT
20
TT
15
10 OR=0,77

5
0
PE C
Frekvenca MTHFR 677 genotipova se ne razlikuje značajno
kod pacijenata sa PE i kontrole.
 Rezultati: MTHFR 677 genotip i tpHcy

tHcy 16
µmol/l svi = 15.19 µmol/l
15.5
CC = 15.26 µmol/l
15
CT = 15.41 µmol/l
p > 0,05
14.5
TT = 14.07 µmol/l
14

13.5 Srednja vrednost pHcy kod pacijenata sa PE

u odnosu na MTHFR 677 genotip.
13
CC CT TT
Rezultati: MTHFR 677 genotip i
tpHcy

broj
pacijenata
35
30 41.2%
25
33.3% 46.7%
20 h-Hcy
15 50%
Norm.
10
5
0
all
svi CC CT TT

Prevalenca h-Hcy kod pacijena sa PE u odnosu na

MTHFR 677 genotip.
Dijabetes melitus

Tip I DM:

Udruženost sa HLA DR3 i DR4

HLA DR haplotip:

Asp na poziciji 57 u DQ lancu
Zaštićeni od DM I

Oboleli: 90% homozigoti za DQ bez Asp!

Još >13 lokusa!!!

VNTR u promotoru gena za insulin...
Alzheimer-ova demencija
Apo E polimorfizam
Receptor vezujući Domen za asocijaciju
domen sa lipidima
112 158 299

191
Cys Cys
E2

Cys Arg
E3

Arg Arg
E4
 Alzheimer-ova demencija

ApoE polimorfizam

ε4 alel PREDISPOZICIJA!

ranije obolevanje (ε4/εε4, ε4/εε3) !

50-75% heterozig. NE OBOLEVA!

drugi geni, faktori sredine...

SAD Japan
genotip AD Kontr. AD Kontr.
ε4/εε4, ε4/εε3, ε4/εε2 64% 31% 47% 17%
ε3/εε3, ε2/εε3, ε2/εε2 36% 69% 53% 83%
gen polimorfizam lipidni parametri

metabolizam lipida a
APOE kodoni (112 i 158) UH, LDL, apoB
APOB Thr7Ile LDL, apoB t
APOC3 -482C/T, -455T/C, TG
3206T/G, 3175C/G, TG
e
CETP
1100C/T
Ile405Val
TG, apoC-III
HDL, apoA-I, CETP
r
PON Gln192Arg PON aktivnost o
LPL Ser447Ter TG, HDL
s
sistem renin- k
angiotenzin 1166A/C -
AT1R Met235Thr TG, UH l
AGT Ins/Del LDL e
ACE
agregacija
r
trombocita GpIIIa p1A1/A2 TG, VLDL-TG o
GpIIIa -455G/A UH, HDL, LDL, TG
fibrinogen z
metabol.
homocisteina 677C/T UH, TG
a
MTHFR

adhezija molekula
SELE 98G/T LDL
 Polimorfizam gena za ACE
egzon 16 egzon 17

Del
varijanta
+287 bp
Ins

DD genotip povezan sa: KM, infarktom miokarda,

hipertenzijom… ???
Problemi kod studija
asocijacije

Nekonzistentnost rezultata usled:

Različite brojnosti ispitivanih populacija

Geografskih/etničkih specifičnosti

Razlika između polova

Sadejstva gen-gen i gen-sredina

Perspektive

Korelacija sa kliničkim i biohemijskim pokazateljima?

Interakcija

gen gen?

gen faktori sredine?

Studije asocijacije u čitavom genomu

Primena DNK analiza u
identifikaciji osoba
 DNK otisak – identifikacija osoba

osoba A
DNK fingerprint, otisak, profil:
Kombinacija VNTR polimorfizama
karakteristična za osobu.

osoba B

VNTR=
various number of tandem repeats,
različiti broj uzastopnih ponovaka osoba C

3 para hromozoma
 DNK otisak – identifikacija osoba

osoba A
DNK fingerprint, otisak, profil:
Kombinacija VNTR polimorfizama
karakteristična za osobu.

osoba B

VNTR=
various number of tandem repeats,
različiti broj uzastopnih ponovaka osoba C

3 para hromozoma
DNK otisak – identifikacija osoba
DNK otisak – identifikacija osoba
Farmakogenetika
Farmakogenetika

Razvoj lekova i izbor terapije na bazi
genetičkih – DNK varijacija

30% osoba ne reaguje na Th statinima

35% // β blokatorima

50% // tricikličnim
antidepresivima
Farmakogenetika

SAD:

2 miliona hospitalizacija godišnje zbog
reakcija na lekove

>100. hiljada ljudi umre
Farmakogenetika

Uticaj polimorfizma:

Na metabolizam leka

Enzimi...

Na strukturu ciljnog proteina

Receptor, enzim...
Farmakogenetika

Gen: CYP2D6

Superfamilija citohrom P450

Protein: debrisokin hidroksilaza

Polimorfizam:
Utiče na metabolizam >25% lekova

β-blokatori, neuroleptici, tricikl.
antidepresivi
Farmakogenetika

Azatioprin i merkaptopurin (ALL)

Teška mijelosupresija zbog deficita

tiopurin metiltransferaze

Dati 1/10 doze!!!

Postoji DNK test!
Farmakogenetika

5-fluouracil (Ca dojke)

Teška neurotoksičnost zbog deficita
dihidropirimidin dehidrogenaze

Takrin (Alzheimer)

Reguju osobe koje nemaju ε4 alel za
ApoE!
 Farmakogenetika
gen Enzim/meta lek Klin. značaj

CYP2D6 Citohrom P450 2D6 kodein Homozigoti ne reaguju

na kodein

CYP2C9 Citohrom P450 2C9 varfarin Heterozigoti – niže doze

NAT2 N-acetil transf. 2 izonijazid Homozig. “spori

acetilatori” - toksičan

ADRB2 β-adrener. receptor albuterol Homozigoti – pogoršanje

KCNE2 K-kanal claritromicin Heterozigoti – podložni

opasnim aritmijala (LQT)

SUR1 sulfonilurea rec. 1 sulfonilurea Heterozigoti – smanjena

senzitivnost na sekreciju
insulina stimulisanu
sulfonilureom
Genska terapija
 Genska terapija

Def.: tretman (lečenje) bolesti unošenjem
genetičkog materijala (DNK ili RNK)

Vektori:

Virusi (retro, adeno, herpes)

Ne-viralni (npr. lipozomi, genski pištolj )

Tipovi genske terapije:

Somatska

Genska terapija germinativnih ćelija
 Strategije genske terapije

POJAČAVANJE
DELOVANJA GENA
(GENE AUGMENTATION - ciljna ćelija

vektor jedro
GAT):
DNK (gen)

Uvodjenje dodatne

kopije gena da bi se
obezbedio produkt

CILJANO UBIJANJE
SPECIFIČNIH ĆELIJA:

Kod maligniteta
 Strategije genske terapije
Antisens strategija
1. gen sa mutacijom
i njegova RNK
2. antisens RNK
3. aktivira se meha-
nizam koji ubija ćeliju
Terapija ribozimima
1. gen sa mutacijom
i njegova RNK
2. ribozim
(“molekularne makaze”)
3. iseca se oštećeni
deo RNK

CILJNA INHIBICIJA
GENSKE EKSPRESIJE:

Kod maligniteta,
infektivnih bolesti
(postoji nov ili
neadekvatan genski
produkt)

Na nivou: DNK
RNK
proteina

POPRAVKA CILJNE
MUTACIJE:

Na nivou DNK ili RNK

Kod dominantno-
negativnih mutacija
Tehnologija klasične genske terapije
klonirani gen

(normalan
alel,
odsutan
ugradnja normalnog
u ćelijama
alelau retrovirus
bolesnika)

nukleinska kiselina virusa

retrovirus inficira
retrovirus ćelije kosne srži bolesnika
koje su izdvojene
i kultivisane

virusna DNK koja

nosi normalan alel
ugradjuje se u hromozom

ćelija
kosne
srži
bolesnika

povratak ćelija
bolesniku k.
srž
Tehnologija klasične genske terapije

PRENOS (TRANSFER) kloniranog gena:

Ex vivo: kultura tkiva (SELEKCIJA !!!)

In vivo: preko vektora (EFIKASNOST ?)

Problem VELIČINE GENA

Mini-geni (cDNK)

Odnos unetog gena i nasledne osnove

domaćina:

Integracija u genom

Ne-integrisana forma (epizom)
In vivo genska terapija
Injekcija
u tkivo
Rekombinovani
DNK u virus
lipozomu

Biolistički genski pištolj

Sistemska
infuzija

Plazmidna DNK
Ex vivo genska terapija

Kultura ćelija Matične ćelije

Odnos unetog gena i nasledne
osnove domaćina

Gen se integriše:
Gen se ne integriše:

Stabilna ekspresija
Kratkotrajna ekspresija

Slučajna ugradnja
 Vektori kod genske terapije
VIRUSI: Efikasnost Integr. Ex vivo In vivo
transfera
retro da ?
+
adeno ne
+- +
HSV ne
+- +
da ?
adeno-assoc. +
ENDOCITOZA ne
POMOĆU RECEPTORA - +
LIPOZOMI ne
+- +
Vektori kod genske terapije
lipozom

lipozom

adeno-virus
DNK koja
se prenosi

gen za th genski
+promotor

geni za prenos
pištolj
metalne čestice
Protokoli za
gensku terapiju kod ljudi
Infektivne bol. (SIDA)
12%

Monogenske bol.
(CF, SCID, DMD)
17%

Kancer
69%
Kriterijumi izbora bolesti
za gensku terapiju
 Identifikovan gen
 Ne postoji drugi efikasan način lečenja
 Zahvaćen (prvenstveno) jedan organ
 Postoji “terapijski prozor” u razvoju bolesti
 Postoji animalni model i uspeh terapije na
humanim ćelijama in vitro
 Sigurna procedura
Rizici genske terapije
• Razvoj virusne infekcije kod viralnih
vektora:
• Npr.: smrtni slučaj kod lečenja deficita OTK
rekombinovanim adeno virusom (1999.)
• Integrisani gen dovodi do:
• razvoja maligniteta:
• Aktivacija protoonkogena:
Npr.: LMO2 kod bolesnika sa X-SCID
• Inaktivacija tumor supresorskih gena
• gubitka funkcije važnog ćelijskog gena
Primeri razvoja genske terapije

Deficit adenozin-
deaminaze (SCID):

Transplantacija kosne
srži

Nadoknada enzima
(animalni,+PEG)

Genska terapija

T limfociti iz krvi
(1990.)

Stem ćelije iz
pupčane vrpce
(1993.)

ćelije iz kosne srži
Rhys Evans, SCID
(2000.)
Primeri razvoja genske terapije

Hemofilija A:

Nadoknada faktora
koagulacije:

Humani

Rekombinantni

(1990.)

Genska terapija

Virusni vektor unet
in vivo, i.v. (1999.)

Virusni vektor unet
u kulturu
fibroblasta kože
trbušni zid (2001.)
 DMD/BMD

GEN

PROTEIN
 DMD/BMD
dis tro fin

dis tro fin dis tro fin

dis tro fin dis ofi n dis fin

normalno DMD BMD

Mdx miš – model DMD
Strategije genske th DMD

Transfer funkcionalnog gena

Mini-, mikro- gen

Regulacija ekspresije mutiranog gena

Himerni oligonukleotidi

Antisens oligonukleotidi

Th gentamicinom (modifikacija STOP kodona)

Drugi pristupi:

Mioblasti

Matične ćelije
JCT van Deutekom & G-J B. van Ommen, 2003.

Povećanje ekspresije utrofina
 Genska th DMD –
transfer funkcionalnog gena
delovanje/efek perspektiv
strategija prednosti nedostaci
at a
Adenoviralni Imunski odgovor,
vektor
Visok nivo
transdukcije u
infekcija, ++
ograničeno
regener. mišiću,
trajanje
ekspresija
Herpes simpleks ekspresije,
vektor Transfer cDNK za
potpuno
funkcionalnog
zavisi od +
dys. pune stepena zrelosti
dys.
dužine mišića

Sintetski, Veliki molekuli,

neinfektivan potreban
Plazmidni vektor
vektor, sigurna efikasan metod ++
procedura transfekcije

Visok nivo
Transfer cDNK za Dys. nije pune
transdukcije u
recAAV vektori mini- ili
mikro- dys.
mišiću, ne
dužine, složen
sistem
+++
patogeni vektor
 cDNK za distrofin, mini- i mikro- gen
DISTROFIN cDNK 11kb

MINI-DISTROFIN
del.H2-R18 cDNK 6,3kb

MIKRO-DISTROFIN
del.ABD,R3-18,CT cDNK 3,8kb

MIKRO-DISTROFIN
del.R4-23,CT cDNK 3,6kb

MIKRO-DISTROFIN
del.R3,R4-21,CT cDNK 3,9kb
Transfer mini-gena

 37 god., blaga forma BMD,

pokretan
DMD BMD
delecija egz. 17-48
(46% kodir. regiona)

Normalno DMD BMD

cDNK za mini-gen *
 Unos “ogoljene” DNK
a b

c d

Dijafragma mdx miša: a – bez th, c - 3 dana i d – 7 dana polse

iv administracije; b – zdrava kontrola
F Lui i sar., 2001.
 Genska th DMD – regulacija ekspresije
mutiranog gena
delovanje/efek perspektiv
strategija prednosti nedostaci
at a
Popravka
Himerni oligo- Kumulativan, stalan Niska efikasnost in
nukleotidi
mutacija u
DNK
efekat vivo +
Sintetski mali
Ponovljene
molekuli, relt.
Modifikacija aplikacije,
Antisens oligo- sigurna
nukleotidi
splajsovanja
pre-iRNK
procedura,
oligonukl.
specifični za
+++
restituišu se sve
mutaciju
izoforme dys.

Prepoznavanje
Supresija Slaba
STOP kodona konvencionalni lek
prevremenog
STOP kodona
u iRNK, na (gentamicin)
reproducibilnost
, sporedni efekti
+
ribozomima
“Preskakanje” egzona
(exon skipping)
“OUT-OF-FRAME” DELECIJA

“IN-FRAME” DELECIJA
“Preskakanje” egzona
(exon skipping)
DNK

RNK

G* AAAAAA obrada

translacija
protein
“Preskakanje” egzona
(exon skipping)

DNK sa del. egzona 50

iRNK “out of frame”

distrofin nema sinteze distrofina

“Preskakanje” egzona
(exon skipping) (K Foster i sar., 2006.)

Antisense oligonukleotid
maskira “out-of-frame” egzon

iRNK bez egzona 50 i 51 =

ponovo uspostavljen okvir čitanja

distrofin Skraćen ali funkcionalan protein

“Preskakanje” egzona
(exon skipping)

2001-2003 – in vivo

2005-2006 – sistemska administracija

96% ekspresije u skletnim mm.

58% ekspresije u srčanom m.
“Preskakanje” egzona
(exon skipping)

PRO051, Holandija: 4 dečaka, m. tibialis anterior (van Deutekom i sar.,

2007)
sistemski unos, subkutano, 5 i 13 nedelja

AVI-4658, Velika Britanija: m. extensor digitorum brevis

(F. Muntoni & K. Bushby, 2008.)

sistemski unos, 12 nedelja

 “Preskakanje” egzona
(exon skipping)

Preparati

PRO051
za egzon 51, 13% DMD populacije

AVI-4658

koktel anti-sens oligonukleotida za egzone 45-55, 63%
DMD populacije

problemi

Efikasnost Efikasnost
unosa dejstva
“Preskakanje” egzona
(exon skipping)

3-35% 30-60%
normalnog normalnog
nivoa nivoa
dys dys

Sadašnji rezultati Željeni rezultati

Supresija prevremenog STOP
kodona
DNK

RNK

G* AAAAAA obrada

translacija
protein
Supresija prevremenog STOP
kodona
DNK

RNK

G* AAAAAA obrada

translacija
protein
Supresija prevremenog STOP
kodona

Gentamicin

PTC124

Kod point mutacija (5-13% bolesnika)

Na ribozomima,koriguje se samo
PREVREMENI STOP kodon
Distrofin pune dužine, samo 1ak promenjena!!!!
Supresija prevremenog STOP
kodona

Na animalnim modelima

Klinički trajali

Dobra iskustva: 35-60%

normalnog
nivoa
dys
 Genska th DMD – drugi pristupi
delovanje/efek perspektiv
strategija prednosti nedostaci
at a

Neinfektivno, relet.
Transplantacija
mioblasta
sigurna
procedura
+
Unos ćelija koje Niska efikasnost,
produkuju potrebna
dys. imunosupresija
Konvencionalna,
Th matičnim
ćelijama
relt. sigurna
procedura
++
Sintetski mali Još uvek nije
Povećana
Nadoknada dys. molekuli, relat. identifikovan
ekspresija
utrofina
utrofinom sigurna specifični ++
procedura kompleks
 Terapija matičnim ćelijama

Zigot: totipotentan

Matične ćelije: pluripotentne

Diferencirane ćelije:
unipotentne
• razlikuju se po obliku,
građi i funkciji
 Pluripotentne matične ćelije
Totipotentna
ćelija

Pluripotentna
matična ćelija

Matične ćel. hematopoeze Druge matične

ćelije
Specijalizovane Eritroc. Tromboc. Leukoc.
ćelije
 Th matičnim ćelijama

Th progenitorskim ćelijama kod mdx miša. (Jankowski et al., 2008)

Embrionalne matične ćelije

kloniranje pluripotentnih matičnih (stem) ćelija

u cilju lečenja
 Dr Duško Ilić,
lekar i molekularni biolog
1964. god., Leskovac
1960. god., Vukovar
Hvala na pažnji!