Epigenetika

Epigenetika
Sadržaj
1. Regulacija genske aktivnosti
2. Kromatin i transkripcija

3. Molekularni mehanizmi epigenetike

 3.1. Metilacija DNA
 3.2. Modifikacije histona – “Histonski kod”
 3.3. RNA interferencija

4. Epigenetski efekti u ljudi

 4.1. Blizanci
 4.2. Barrovo tijelo
 4.3. Genomski utisak (imprinting)
 4.4. Rak
 4.5. Prehrana i epigenom
 4.5. Ostali primjeri
 Epigenetika – definicija i značaj
Epi’genetika - ‘na ’ ili ‘iznad’ , dodatni sloj genetičkih informacija, dodatni molekularni kod

Proučava nasljedne promjene u ekspresiji gena i fenotipa, izazvanih molekularnim mehanizmima koji
se događaju bez promjena u DNA sekvenci

Područje genetike koje se bavi utjecajem okolišnih čimbenika na genetsku strukturu

Proučava transgeneracijski učinak kojim se utjecaj okolišnih čimbenika prenosi i na sljedeće

generacije

Geni ili okoliš

 1. Regulacija genske aktivnosti
 Ekspresija prokariotskih i eukariotskih gena primarno je kontrolirana na razini
inicijacije transkripcije.

Specifičnosti transkripcije u eukariota:

Više RNA polimeraza (prokarioti imaju
samo jednu)
Eukariotske RNA polimeraze ne vežu se
direktno na promotore nego trebaju
interakciju s nizom dodatnih proteina
(transkripcijskih faktora, aktivatora,
represora)
Eukariotska DNA pakirana je u kromatin
koji ograničava raspoloživost DNA kao
kalupa za transkripciju.
2. Kromatin i transkripcija

Struktura nukleosoma

Nukleosom - temeljna strukturna jedinica kromatina.

Sastoji se od:
146 pb DNA omotanih oko oktamerne histonske
jezgre
Oktamerna histonska jezgra građena od po dvije
molekule svakog histonskog proteina H2A, H2B, H3 i
H4, te jedne molekule histona H1 vezanog van
nukleosomske jezgre
60-80 pb – “linker” DNA (spojna regija dvaju
nukleosoma)
 2. Kromatin i transkripcija
 Transkripcija se događa u interfazi
 Aktivni geni, koji se transkribiraju, smješteni su u u relativno dekondenziranom
eukromatinu (30 nm kromatinsko vlakno)
 Neaktivni geni, koji se obično ne transkribiraju, nalaze se u kondenziranom
heterokromatinu
 3. Molekularni mehanizmi epigenetike

1. Metilacija DNA – dodatak metilne

skupine na citozine u CpG otocima

2. Modifikacije histona - Histonski kod - Transkripcijska

dodatci različitih molekula na histone – kontrola

može poticati ili sprječavati transkripciju

gena

3. RNA interferencija - reguliranje

Post-transkripcijska
transkripcije nekodirajućim RNA kontrola
molekulama

http://www.youtube.com/watch?v=nygyUMO
DV7Y
 3.1. Metilacija DNA
 Citozinske baze modificiraju se dodatkom metilne skupine na C5’ – nastaje 5-metil-citozin
 Metiliraju se specifično citozini koji prethode gvaninima u lancu DNA (CpG dinukleotidi, CpG
otoci)
 Veliki broj metiliranih CpG dinukleotida u blizini promotora uzrokuje smanjenu
transkripcijsku aktivnost.
 3.1. Metilacija DNA

‘Utišavanje’ gena metilacijom DNA

Na metilirane CpG dinukleotide vezuju se transkripcijski represori i djeluju u kompleksu

s histonskim deacetilazama – rezultat blokada transkripcije i inaktivan kromatin

Stalno aktivni geni (npr. ‘housekeeping genes’) nemaju metilaciju CpG dinukleotida u
blizini promotora
Metilacija ne sprječava replikaciju

Zanimljivost: Vinska mušica nema metilaciju citozina!

U somatskim stanicama kromosomi (DNA)
zadržavaju roditeljski metilacijski obrazac

DNA metiltransferaza I (Dnmt1) – aktivna je na

hemimetiliranoj DNA – održava obrazac metilacije kroz
stanične diobe
Metilacija DNA događa se poslije replikacije

 Metilacija može biti i de novo: izvode je druge DNA

metilfransferaze (Dnmt3a, Dnmt3b) koje nemaju afinitet za
hemimetiliranu DNA
 Gametogeneza, oplodnja, embrionalni razvoj
 Tijekom gametogeneze de novo metilacija u spolnim stanicama, mijenja se i dodaje epigenetska
informacija ovisno o spolu jedinke.
 Nakon fertilizacije oocite i nastanka zigote, njezin kombinirani genom podvrgnut je demetilaciji i
ponovnoj metilaciji (osim imprintanih gena).
 Do stadija blastule, metilacija embrionskih stanica je kompletna.
 U spolnim zametnim stanicama embrija ponavlja se demetilacija i metilacija , ovisno o njegovu spolu

Primordial germ cells

(PGCs)
 3.2. Modifikacije histona - Histonski kod
 Histoni imaju:
 Domenu smatanja (srž) i
interakcija s drugim histonima
 Domenu repa na N-kraju koja strši
izvan nukleosoma i bogata je a.k.
lizinom (K)

 Na histonske repove mogu se

kovalentno vezivati različite skupine
koje histon čine aktivnim
(dekondenziranim) ili neaktivnim
(kondenziranim)

 Kombinacija specifičnih histonskih modifikacija tvori tzv. “histonski kod” koji regulira
gensku ekspresiju pridruživanjem drugih regulatornih proteina na kromatinski kalup
 Histonski kod – acetiliranje lizina

Acetiliranje lizina na histonskim N – krajevima smanjuje njihov ukupni pozitivni naboj – slabi
povezivanje s DNA - tipično je za transkripcijski aktivan kromatin
Histonske acetil-transferaze (HAT) - enzimi odgovorne za acetilaciju histona i združuju se s aktivatorima
transkripcije
Histonske deacetilaze (HDAC) - odgovorne za deacetilaciju histona i povezuju se s represorima
transkripcije.
 Acetilacijom histona remodelira se kromatin

Acetilacija histona – remodeliranje kromatina –

TATA sekvenca u promotoru postaje dostupna
transkripcijskim faktorima i transkripcija je
omogućena
 Ostale kovalentne modifikacije histona

Osim acetiliranjem lizina (K), histoni se modificiraju još i:

 Fosforiliranjem serina (S)
 Metiliranjem lizina (K) i arginina (R)
 Dodatkom ubikvitina na lizine (K)
Epigenetski histonski kod zajedno s metilacijom DNA
odlučuje o genskoj ekspresiji

Modifikacije histonskih ‘repova’

 3. RNA interferencija

 RNA interferencija: post-transkripcijsko

utišavanje gena
 Kratke dvolančane RNA izazivaju degradaciju
homologne mRNA – utišavanje gena

 Anrew Fire i Craig Mello 2006. Nobelova nagrada

 Pitanje: Otkud dvolančane RNA (dsRNA) u

eukariotskoj stanici?

 Odgovor:
 Gen unc22 kodira za protein miofilament
 Endogena - rezultat dvosmjerne transkripcije
u crva C. elegans.
i/ili transkripcije obrnuto ponovljenih
 Smanjenje tog proteina izaziva
sljedova abnormalno pokretanje crva.
 Egzogena – virusna dvolančana RNA
 Samo je injekcijama dvolančane RNA
postignut efekt redukcije unc22 proteina.
 RNA interferencija – nastanak dvolančanih RNA

Dvosmjerna transkripcija Transkripcija obrnuto ponovljenih

(oko 8% gena) sljedova

Dicer Dicer

siRNAs siRNAs

Dugačku dvolančanu RNA (drRNA i shRNA) kida enzim DICER na 21-22 nukleotida
dugačke siRNA (‘small interfering RNA’)
 Mehanizam RNA interferencije

 Enzim DICER kida dugačku dvolančanu RNA na 21-22 nukleotida duge siRNA (‘small
interfering RNA’)
 siRNA povezuju se RISC kompleksom (‘RNA induced silencing complex’)
 Razmotavanje dvolančane RNA i stvaranje jednolančanih
 Hibridizacija siRNA-RISC kompleksa s homolognom mRNA
 Ribonukleaza iz RISC kompleksa cijepa mRNA
http://www.youtube.com/watch?v=gZZyxVP02UU&feature=relate
d
Epigenetski efekti
 Jedan genom može generirati više ‘epigenoma’

Diferencijalna ekspresija gena omogućava da različiti fenotipovi mogu nastati iz istog

genotipa
 1. Razlike između monozigotnih blizanaca

Monozigotni blizanci:
 Identičan genom
 Epigenom vrlo sličan tijekom prvih godina života
 Tijekom kasnijih godina povećanje razlika u epigenomu
 Stariji monozigotni blizanci – značajne razlike u njihovom ukupnom sadržaju i
genomskoj distribuciji 5metilcitozina i histonske acetilacije
Različite predispozicije prema bolestima
 2. Barrovo tijelo – inaktivirani X kromosom u žena

 Molekularni mehanizam: RNA interferencija i metilacija DNA

 Događa se na stadiju ženskog embrija od 100-ak stanica (12-ti
dan)

 XIC (X inactivation center) – mjesto odakle počinje

inaktivacija X kromosoma u blizini centromere, sadrži 12 gena,
najvažniji gen XIST

 XIST (X inactive specific transcripts) – cis aktivan, na

inaktiviranom X kromosmu u normalnih žena i ženki
placentarnih sisavaca

 Produkti XIST gena - duge nekodirajuće RNA (lncRNA) (17 kb),

koje ostaju vezane duž cijelog X kromosoma

 Dodatno, DNA metilacija događa se na gotovo svim CpG

otocima na X kromosomu

Kromosomi ženke miša. Inaktivni X

kromosom obložen je s Xist RNA
(crveno).
 Tijelo ženki sisavaca – mozaik stanica s nasumično inaktiviranim X
kromosomima

 Kaliko mačka – heterozigot za X-vezane alele

O/o
 O (za narančastu boju krzna)
 o (za crnu boju krzna).
 Crni i narančasti sektori posljedica su
inaktivacije X – kromosoma u Oo
heterozigotnih ženki.
 Carbon Copy ‘CC’ – prva klonirana mačka, 2002. god.

Carbon Copy – klon, mladunac i odrasla jedinka

Rainbow - majka

 Carbon Copy je nastala iz jajne stanice kojoj je izvađena haploidna jezgra, te je ubačena diploidna
(somatska) jezgra iz Rainbow.
 Stanica (jezgra) iz koje je klonirana Carbon Copy imala je jedan X inaktiviran, ali je embrionalni razvoj
reaktivirao oba X kromosoma, nakon čega se dogodila nova nasumična inaktivacija X kromosoma.
 Rezultat je potpuno drugačija boja krzna iako su dvije jedinke genetički identične.

http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_animals_t
hat_have_been_cloned#Goat
 3. Genomski utisak (“genomic imprinting”)

“Parental imprinting” – roditeljsko usađivanje,

genomski utisak – aktivnost gena ovisi od kojeg roditelja
dolazi
Suprotno Mendelovim zakonima, gen “pamti” dolazi li
od oca ili majke!!!!!!!!!
Evolucijski paradoks - Oblik monoalelizma – samo
jedan alel je aktivan, drugi se inaktivira
Tridesetak gena opisanih gena u miša i čovjeka
nasljeđuju se tim modelom
Mehanizam inaktivacije – metilacija citozina i
histonske modifikacije
Primjeri 1: gen H19 specifično se metilira tijekom
spermatogeneze, pa spermiji imaju metilirani (neaktivni)
H19, a jajne stanice imaju nemetilirani, aktivni majčin
alel
 Bolesti povezane s genomskim utiskom

Javljaju se u slučajevima:
 Delecije nemetiliranog gena
 Metilacija prisutnog gena

Uočene obitelji s Angelmanovim i Prader-Willievim

sindromoma

Prader-Williev sindrom – mentalna retardacija,

pretilost, hipotonija mišića, nerazvijene gonade,
sitnih šaka i stopala

Angelmanov sindrom - „djeca lutke“, mentalna

retardacija, mršava, hiperaktivna, epilepsija,
tremor,pate od nesanice, stalno se smješe, pokreću
se trzajima kao lutke
 Willie-Praderov i Angelmanov sindrom – rezultat
delecije na kromosomu 15 i genomskog imprintinga

Angelman Syndrome
Prader-Willi Syndrome
Majčin kromosom 15 ima deleciju, a očev
Očev kromosom 15 ima deleciju, a majčin
kromosom sadrži metilirane, neaktivne
kromosom sadrži metilirane, neaktivne gene
gene
 4. Rak i epigenetika
 U normalnom tkivu, metilacija lokalizirana na kodirajuću regiju (egzone), siromašne CpG, a promotor
nemetiliran unatoč mnoštvu CpG otoka

 U tumorskim tkivima – ‘metilacijski debalans’ –

 Hipometilacija genoma - kromosomske nestabilnosti i povećane stopa mutacija
 Hipermetilacija se javlja lokalno, često u promotorima.
 DNA metiltransferaze – pojačana ekspresija
 Tumor supresor geni često hipermetilirani, a onkogeni hipometilirani.
 Metilacijski status nekih gena - mogući marker za tumorigenezu – npr. GSTP1 – za rak prostate
5. Nutrigenomika – znanost o utjecaju prehrane na epigenom
Izloženost bisfenolu-A (BPA) može promijeniti fenotip potomaka mijenjajući metilaciju
njihovih epigenoma; učinak koji se može suzbiti dodatcima majčinoj prehrani
 Razlike između pčele radilice i matice uzrokovane su različitom
prehranom

 Radilice i matica su genetski identične, ali matica je mnogo veća i drugačija

 Matična mliječ - složena tvar bogata proteinima, koju izlučuju žlijezde na glavama pčela radilica.
 Ličinke od kojih će nastati matice hrane se čitav život velikim količinama matične mliječi. Razvit će im
se veliki jajnici, abdomen za smještaj jaja, posebno ponašanje.

Mehanizam
 Matična mliječ utišava ključni gen, Dnmt3, koji kodira enzim važan za utišavanje gena.
 Kad Dnmt3 je aktivan u ličinki, geni matice epigenetski su utišani, a ličinke se razvijaju u radilice.
 Ali, kad matična mliječ utiša gen Dnmt3, određeni geni će se aktivirati i te ličinke pretvoriti u matice.
 Dobre i loše mame štakorice (‘Maternal licking and grooming’)

 Razlike u majčinskoj skrbi (taktilnoj stimulaciji) tijekom prvih 6 dana života u štakora uzrokuju različite
obrasce metilacija u promotorskim regijama nekih gena.
 Primjerice, gen za receptor glukokortikoida (GR) u hipotalamusu.

Povećana
ekspresija
transkripcijskog
faktora, NGF1-A,
(nerve growth
factor 1-A), koji se
veže na promotor
gena GR
(glukokortikoidnog
receptora) u
hipotalamusu i
stimulira njegovu
transkripciju
 Još neki zanimljivi primjeri epigenetike

Dutch Famine – Nizozemska glad

 1944./1945., nizozemske obitelji izolirane zbog rata/zime, kalorijski unos cca. => 500-600
cal/dan (kruh, krumpir) kroz više mjeseci.
 Izloženost gladi imala utjecaja na razdoblje prije i nakon začeća, te rezultirala u povećanoj
učestalosti mentalno/metaboličkih poremećaja u potomaka.
 Moguće smetnje u epigenetskom reprogramiranje tijekom embriogeneza/gametogeneze.
 Dokazi za promjene u DNA metilaciji malog broja imprintanih gena.
 Sljedeće generacije čini se da opet imaju normalno potomstvo.
Epigenetske promjene mogu se prenositi kroz više generacija –
Neolamarkizam?
Epigenetske promjene su reverzibilne