Influência de factores

ambientais no crescimento
microbiano
 Água e actividade aquosa (aw)
• Cerca de 80% da massa total bacteriana é água.

• Devido à permeabilidade selectiva da membrana citoplasmática os

microrganismos podem ser afectados por alterações na concentração
osmótica dos seus habitats.

• A actividade aquosa (aw = p/p0 , em que p é a pressão de vapor da

água numa solução e p0 é a pressão de vapor da água pura à
mesma temperatura) é uma medida da quantidade de água disponível
num habitat de um microrganismo para sua utilização. O seu valor
máximo é 1 (100%) e decresce à medida que a pressão osmótica
sobe por dissolução de solutos (açúcar, sal, etc, no caso de se
tratar de alimentos).

• Em geral, os microrganismos requerem aw próximos de 1 para se

multiplicarem. Contudo, os microrganismos exibem diferente
capacidade para se adaptarem a habitats com baixa actividade aquosa.
Por exemplo, algumas bactérias halofílicas e fungos xerofílicos
podem multiplicar-se com aw da ordem dos 0,7.
Actividade aquosa (aw) de algumas substâncias e crescimento de
microrganismos em função da actividade aquosa

Actividade Exemplos de microrganismos que

Material
aquosa (aw) crescem
Caulobacter
1.000 Água pura
Spirillum
Streptococcus
0.995 Sangue humano
Escherichia
Pseudomonas
0.980 Água do mar
Vibrio
0.950 Pão A maioria dos bacilos Gram positivos
0.900 Geleia, presunto Cocos Gram positivos
0.850 Salame Saccharomyces rouxii
Bolo de fruta, Saccharomyces bailii
0.800
doces Penicillium
Lago salgado, Halobacterium
0.750
peixe salgado Halococcus
Cereais,
Xeromyces bisporus; outros fungos
0.700 rebuçados, fruta
xerofílicos
seca
 Vida bacteriana em meios com
elevado aw

• As bactérias vivem, em geral, em meios

com elevada actividade aquosa (meios
hipotónicos, p>p0) em que a água entra na
célula e poderia levar à lise osmótica se
não existisse uma parede celular rígida.
• Para que não ocorra choque osmótico por
excesso de diluição do citoplasma
bacteriano, a bactéria pode excretar
activamente a água através das
aquaporinas.
 Vida bacteriana em meios com
baixo aw
• Em habitats com baixa actividade aquosa (meios
hipertónicos, p<p0), o microrganismo deve manter uma
alta concentração interna de solutos que retenham a água,
senão a saída excessiva de água levaria à plasmólise e
paragem do crescimento.
• Para evitar a saída de água, os microrganismos que vivem
em habitats hipertónicos mantém a concentração
osmótica do protoplasma sempre acima da
concentração osmótica do seu meio ambiente
recorrendo aos solutos compatíveis.
• Os solutos compatíveis são substâncias que permitem o
crescimento e metabolismo celular mesmo em
concentrações intracelulares elevadas.
Actividade aquosa e solutos compatíveis

Principais solutos Actividade aquosa (aw)

Microrganismo acumulados mínima para o
crescimento
Glicina betaína, prolina,
Eubactérias não fototróficas 0.97-0.90
glutamato
Cianobactérias de água fresca Sucrose, trealose 0.98

Cianobactérias de água do mar α-glucosilglicerol 0.92

Manitol, prolina,
Algas marinhas glicosidos, propionato de 0.92
dimetilsulfónio
Cianobactérias de lagos salgados Glicina betaína 0.90-0.75
Eubactérias halofílicas anoxigénicas
fototróficas Glicina betaína, ectoína,
0.90-0.75
(Ectothiorhodospira/Halorhodospira e trealose
Rhodospirillum sp.
Archaea halofílicas extremas (ex.
Halobacterium) e algumas Eubactérias (ex. KCl 0.75
Haloanaerobium)
Dunaliella (algas verdes halofílicas) Glicerol 0.75
Leveduras xerofílicas Glicerol 0.83-0.62
Fungos filamentosos xerofílicos Glicerol 0.72-0.61
A actividade aquosa aw é importante para a produção e
conservação de alimentos

• Produção:
Conhecer a aw dos diferentes constituintes de um
alimento é fundamental para impedir a alteração da
estrutura e consistência de um alimento devido à
migração da água de um produto com maior aw para
outro com menor aw.
• Conservação:
Ter em consideração a aw dos diferentes constituintes
de um alimento é fundamental para manter o seu
valor abaixo de um certo nível e assim prevenir o
crescimento de fungos e bactérias e conseguir
aumentar o tempo de conservação do alimento
 Organismos osmotolerantes
• Os organismos osmotolerantes são
capazes de acumular solutos compatíveis e
podem crescer em habitats com aw ou
concentração osmótica variável.

• Um exemplo de bactéria osmotolerante e

patogénica é o Staphylococcus aureus que
pode viver na presença de cloreto de
sódio a 30% (meio de Chapman tem 7,5% de NaCl).
 Bactérias halófilas
• São bactérias que requerem concentrações muito elevadas
de cloreto de sódio para crescer (2.8 - 6.2M, o que
corresponde à saturação).
• Um exemplo é o Halobacterium que pertence às Archaea.
Ao contrário das bactérias osmotolerantes, estas bactérias
adaptaram-se a este tipo de ambientes modificando a
estrutura das suas proteínas e membranas.
• Estas bactérias acumulam grandes quantidades de
cloreto de potássio para que o seu protoplasma fique
hipertónico com o meio ambiente (4-7M).
• A actividade e estabilidade das enzimas e proteínas
destas bactérias requerem estes níveis elevados de
potássio. A membrana citoplasmática e parede celular
requerem altos níveis de Na+ para que se estabilizem e não
se desintegrem.
 pH
• Devido à impermeabilidade da membrana citoplasmática a protões, o
pH interno dos microrganismos é próximo da neutralidade. Contudo, os
microrganismos podem crescer em meios com pH muito variável.

Os microrganismos acidófilos exibem crescimento óptimo a pH 1.0 - 5.5;

os microrganismos neutrófilos exibem crescimento óptimo a pH 5.5- 8.0;

os microrganismos alcalófilos exibem crescimento óptimo a pH 8.5 - 11.5.

• Os microrganismos podem alterar o pH do seu habitat pela produção

de produtos de degradação ácidos ou básicos.
– É o caso dos microrganismos fermentativos que formam ácidos orgânicos por
fermentação de carbohidratos.
– É também o caso do Thiobacillus sp., um quimiolitotrófico que oxida enxofre reduzido a
ácido sulfúrico. Outros microrganismos originam amónia através da degradação de
aminoácidos aumentando o pH.
• Para impedir a inibição do crescimento bacteriano in vitro devido a
grandes alterações de pH, os meios de cultura são adicionados de
tampões, normalmente tampões fosfato.
 Temperatura
• Os microrganismos são normalmente poiquilotérmicos, ou seja, a sua
temperatura reflecte a do seu meio ambiente.
• A sensibilidade de reacções enzimáticas é um dos principais factores influenciados
pela temperatura de crescimento dos microrganismos. Quando a temperatura é
baixa, um aumento da temperatura aumenta a taxa de crescimento uma vez
que as reacções enzimáticas duplicam de velocidade por cada 10ºC de
aumento de temperatura. Assim o metabolismo microbiano aumenta e o
microrganismo cresce mais depressa. A partir de certa altura o aumento de
temperatura diminui o crescimento e torna-se letal. Isto deve-se à desnaturação de
enzimas e proteínas em geral. Adicionalmente, as membranas desintegram-se
devido à fusão lipídica.

• Espécies estenotérmicas suportam e crescem em gamas de temperaturas

apertadas (ex. N. gonorrhoeae).
• Espécies euritérmicas suportam e crescem em gamas variadas de temperaturas ,
que podem ir até 30ºC de diferença (ex. Enterococcus faecallis).

• Os procariotas podem crescer em temperaturas superiores aos eucariotas.

 Temperaturas máximas de
crescimento de microrganismos
Grupo Temperaturas limite (oC)
Microrganismos eucarióticos
Protozoários 56
Algas 55-60
Fungos 60-62
Microrganismos procarióticos
•Eubactérias
Cianobactérias 70-74
Bactérias fototróficas 70-73
anoxigénicas
Bactérias quimiorganotróficas 90
•Archaea
Hipertermófilos metanogénios 110
Hipertermófilos dependentes do 113
enxofre
 Microrganismos psicrófilos

• A sua temperatura máxima de crescimento é de

20ºC, a óptima é de ≤ 15ºC e podem crescer a
0ºC. Exemplos: Pseudomonas, Listeria e
Flavobactérias.

– As enzimas e proteínas destes microrganismos

funcionam bem a baixas temperaturas. As
membranas têm altos níveis de ácidos gordos
insaturados ficando mais fluidas a baixas
temperaturas.
 Microrganismos mesófilos

• A temperatura máxima de crescimento dos

mesófilos é de 45ºC, a óptima é de ≈
20/45ºC e a mínima é de 15/20ºC.

• Quase todas as bactérias humanas estão

nesta categoria.
 Microrganismos termófilos e
hipertermófilos
• A temperatura máxima de crescimento dos termófilos e
hipertermófilos é de >100 ºC, a óptima é de 55/65ºC e a
mínima é de 45ºC.

• As suas enzimas e proteínas são estáveis a estas

temperaturas; as suas membranas têm teor elevado de
lípidos saturados com pontos de fusão mais altos.

• A partir das bactérias termófilas são obtidas enzimas com

grande interesse biotecnológico, nomeadamente, a Taq
ADN polimerase (obtida da Thermus aquaticus) e Pfu
ADN polimerase (obtida da Pirococcus furiosus)
utilizadas na reacção de amplificação enzimática em
cadeia (PCR).
Principais grupos de procariotas termófilos e
hipertermófilos
Género Gama de temperaturas
(oC)
Eubactérias
Fototróficas
Cianobatérias 55-70
Bactérias púrpuras 45-60
Bactérias verdes 40-73
Gram positivo
Bacillus sp. 50-70
Clostridium sp. 50-75
Bactérias ácido láctico 50-65
Actinomicetes 55-75
Outras
Thiobacillus sp. 50-60
Espiroquetas 54
Desulfomaculatum sp. 37-55
Aeróbios Gram negativo 50-75
Anaeróbios Gram negativo 50-75
Influência da concentração de
oxigénio no crescimento
microbiano
 Microrganismos aeróbios
• Crescem na presença de oxigénio atmosférico
(20% O2).
• Quase todos os organismos eucariotas são
aeróbios.
• O O2 é usado :
– Como aceitador final de electrões na cadeia
transportadora de electrões durante a respiração
aeróbia.
– Na síntese de esteroides e ácidos gordos insaturados.
 Microrganismos aeróbios
• Podem ser:

Aeróbios estritos - Só executam metabolismo oxidativo
na presença de oxigénio que funciona como aceitador
final de electrões na cadeia de transporte de electrões.
Exemplos: Aeromonas, Neisseria e Pseudomonas.

Microaerófilos - são lesados pelo nível normal de

oxigénio atmosférico requerendo apenas cerca de 2-10%
de O2 para crescer.
Exemplos: Helicobacter pylori e Campilobacter jejuni.
 Microrganismos anaeróbios

• Crescem na ausência de oxigénio.

• Podem ser:

Facultativos - não requerem O2 para crescer (mas
crescem melhor na sua presença). Ex. enterobactérias e
estafilococos.

Aerotolerantes - crescem igualmente na presença ou
ausência de oxigénio. Não usam o oxigénio, ignoram-no.
Ex. Enterococcus faecalis.

Estritos - morrem na presença de oxigénio. Exs:
Bacteroides, Fusobacterium, Methanococcus,
Clostridium, Pirococcus.
• Os microrganismos aerotolerantes e anaeróbios
estritos obtêm energia somente pela fermentação
ou respiração anaeróbia.
 Mecanismos de acção do
oxigénio

Redução do oxigénio para formar compostos tóxicos:

• O2 + e- → O2- (radical superóxido)

• O2- + e- + 2H+ → H2O2
• H2O2 + e- + H + → H2O + OH- (radical hidróxilo)

Estes compostos são agentes oxidantes poderosos e

destroem rapidamente constituintes celulares.
 Enzimas que catalisam a destruição do radical
superóxido e do peróxido de hidrogénio
Superóxido
dismutase
• 2O2- + 2H+ → O2 + H2O2

Catalase
• 2H2O2 → 2H2O + O2
teste da catalase.mov

Os microrganismos aeróbios estritos e anaeróbios facultativos contêm catalase e

superóxido dismutase.
Os microrganismos aerotolerantes podem não ter a catalase mas têm sempre a
superóxido dismutase (SOD) e peroxidase.
Os anaeróbios estritos não têm ambas as enzimas e por isso não toleram o oxigénio.
Poderão, contudo, possuir a superóxido redutase (SOR).

Superóxido
redutase
• 2H2O2 → 2H2O (ex. Pirococcus furiosus)
 Influência das radiações
electromagnéticas no crescimento
microbiano
Espectro electromagnético de radiações

Raios gama
Ondas de rádio
Raios X
Ultravioletas Infravermelhos
Visível

10-4 10-2 1.0 102 103 104 106 108

Infravermelhos
Vermelho
Vermelho
Laranja
Laranja
Amarelo
Amarelo
Verde
Verde
Azul Azul
Ultravioletas Violeta
Violeta

200 300 400 500 600 700 800 900

Comprimento de onda (nm)
 Raios X e raios gama (γ):
• Raios X - produzidos artificialmente
• Raios γ - emitidos durante o decaimento de
radioisótopos
– Estas radiações podem produzir mutações, quando em baixa
quantidade, ou ser directamente letais, quando em alta
quantidade.

Mecanismos de acção:

Quebra de pontes de hidrogénio

Oxidação de ligações duplas

Destruição de estruturas cíclicas

Polimerização de algumas moléculas

A causa de morte deve-se sobretudo a alterações do DNA.

 Deinococcus radiodurans R1
• É uma bactéria poliextremófila porque pode suportar muitas
condições extremas de vida incluindo as radiações, stress oxidativo,
dissecação e falta de nutrientes.
• O genoma completo do Deinococcus radiodurans R1 possui
3284156 pares bases e é composto por:
– dois cromossomas (com 2648638 e 412348 pares de bases),
– um megaplasmídio (177466 pares de bases)
– um pequeno plasmídio (45704 pares de bases)

•Pensa-se que é um bom

modelo dos organismos
capazes de viver em
Marte.
Taxonomia do Deinococcus
radiodurans R1

Reino: Bacteria

Intermediate Rank 1: Deinococcus-Thermus

Intermediate Rank 2: Deinococci

Intermediate Rank 3: Deinococcales

Intermediate Rank 4: Deinococcaceae

Género: Deinococcus

Espécie: radiodurans

Estirpe: R1
Características culturais e morfológicas do
Deinococcus radiodurans

Crescimento em tetradas Crescimento em agar nutritivo

 Espectro de radiação ultravioleta

Espectro de radiação ultravioleta

1

Eficácia germicida
relativa
0
100 184.9 200 264 280 300 400

Vitamina D
Gama de Gama Gama

Gama
Luz
Raios-X formação germicida bronzeadora visível
do ozono

Comprimento de onda (nm)

 Radiação ultravioleta
• A radiação ultravioleta também é de alta energia e mata
organismos e microrganismos.
• O efeito mais letal dos raios UV é a 264 nm, o
comprimento de onda mais eficientemente absorvido pelo
DNA.
• Mecanismos de acção:
Formação de dímeros de timidina localizados na mesma
cadeia de forma adjacente, impedindo assim a replicação
do DNA.
• A bactéria pode reparar os dímeros por dois processos:
– Foto-reactivação: por intermédio da enzima fotoliase e luz de λ
360 nm retiram-se os dímeros.
– Reactivação no escuro: um fragmento de ADN é retirado,
contendo os dímeros de timidina, na ausência de luz.
 Mecanismo de reparação de dímeros de timina
pela fotoliase

(A) Reparação do ADN por transferência de electrões entre radicais mediada pela
fotoliase e seu co-factor flavina (FADH). São apresentadas as principais reacções
catalíticas, a separação de cargas (k1) e libertação dos aneis (k2).
(B) A reparação dos dímeros de timina pela fotoliase é observada por iluminação da
mistura de reacção com luz de 360 nm. A formação do monómero de timina é
detectada pelo aumento da absorção a 265 nm.

Ya-Ting Kao, Chaitanya Saxena, Lijuan Wang, Aziz Sancar, and Dongping Zhong. Direct observation of thymine dimer repair in DNA by
photolyase. Proceedings from the National Academy of Sciences, USA November 8, 2005 vol. 102: 16128–16132
Radiações UV de maior comprimento de
onda também podem ser microbicidas

• Radiações U.V. de comprimento de onda

325 nm e 400 nm podem provocar a
ruptura dos anéis cíclicos de triptofano e
gerar produtos tóxicos que, juntamente
com a própria radiação, são suficientes
para provocar ruptura no ADN.
 Efeito microbicida da luz visível
• A luz visível quando em grandes quantidades pode ser nociva para os
microrganismos.
• Pigmentos como a clorofila, citocromos e flavinas podem absorver energia
luminosa e actuar como fotosensibilizadores excitados. Estas substâncias
transferem energia para o O2 originando moléculas de oxigénio (1 O2):

luz
P → P (activado)
P (activado) + O2 → P + 1O2

• Estas moléculas (1 O2) são agentes oxidantes que destroem a célula – foto-
oxidação.
• As bactérias e outros microrganismos protegem-se da foto-oxidação pelo uso
de pigmentos carotenoides. Estes pigmentos absorvem a energia dos 1O2
passando esta molécula à forma não excitada de O2.
 Prémio Nobel da Química de 2015 atribuído a Tomas Lindhal pela
descoberta de um mecanismo de reparação de ADN (base excision
repair) nos anos 1970
Prémio Nobel da Química de 2015 atribuído a Paul Modrich que mostrou
como as células corrigem erros durante a replicação do ADN que
antecede a divisão celular (mecanismo de mismatch repair)
 Prémio Nobel da Química de 2015 atribuído a Aziz Sancar por ter
descoberto o mecanismo de reparação do ADN das lesões induzidas
pelas radiações UV (dímeros de timinas)
 Pressão
• A maior parte dos organismos vive com
uma pressão de 1 atmosfera. No fundo do
mar oceano (profundidade de ≥1000m) a
pressão hidrostática pode atingir 600 a
1100 atmosferas.Assim temos:
• Bactérias barotolerantes – resistem a
pressões bastante altas.
• Bactérias barofílicas – precisam de
pressões elevadas para crescer ( ≥400 –
500 atmosferas). Ex. M. jannaschii.
 Methanococcus jannaschii
• Foi originalmente isolado de um sedimento colhido do fundo
do mar a 2600 m de profundidade numa chaminé fumegante
localizada no oceano Pacífico.
• Cresce a pressões de > 200 atm.
• Cresce à temperatura óptima de 85ºC
• É uma bactéria anaeróbia estrita e produz metano
• Primeiro genoma completo de um Archaea e primeira
oportunidade de comparar genomas e vias bioquímicas entre
os três domínios da vida.
• O M. jannaschii representa ainda o primeiro genoma
completo de um organismo autotrófico (usa C02 como fonte
de carbono).
• A sua sequência genómica fornece indicações valiosas sobre
as bases genéticas para a capacidade de sintetizar de novo
todos os elementos necessários para a vida celular a
partir de constituintes inorgânicos.
 Genoma do Methanococcus jannaschii

O seu genoma consiste em três elementos
distintos:

um grande cromossoma circular com
1,664,970 pb e 1682 ORFs potenciais;

um grande elemento extracromossomal
(ECE) com 58407 pb e 44 ORFs;

um pequeno ECE circular com 16550 pb
e12 ORFs potenciais.

Os genes anabólicos do M. jannaschii
revelam semelhanças com as Eubacteria.
As Eubacteria e Archaea também
partilham características estruturais e
organizacionais dos seus genomas (circulares) e
dos seus genes (organizados em operões).

Em contraste, os sistemas de informação-
prcessamento e secreção da célula do M.
jannaschii são mais semelhantes aos dos
Eukaryotes.