JURNAL AGROTEKNOS Juli 2012

Vol.2. No.2. hal. 69-76

ISSN: 2087-7706

PENGEMBANGAN BIOSENSOR ELEKTROKIMIA BERBASIS ENZIM

ASETILKOLINESTERASE UNTUK ANALISIS RESIDU PESTISIDA PADA
PRODUK PERTANIAN

Electerochemical Biocensor Development Based On The

Acetylcholinesterase Enzyme To Analyze of Pesticide Recidue on
Agriculture Products
MASHUNI
Department of Chemistry , Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Haluoleo University (UNHALU),
Kendari, Sulawesi Tenggara, 93231

ABSTRACT
Pesticide is one of dangerous chemical compounds in environment. Its existence has
spread so it can cause negative effect for human. Pesticide compound is toxic in for nervous
system so that a quick detection system is needed to protect human’s health and as a control
for agricultural product. Therefore, we conducted a research of electrochemical biosensors
development based on enzyme acetylcholinesterase in electrode to analyze pesticide
residue so that a more superior and reliable biosensors can be obtained for pesticide
residue analysis in foodstuff samples, especially for agricultural product. Residue analysis of
carbamate and organophosphate in foodstuff sample requires a sensitive, selective, cheap-
and-easy-operated, and quick-analyzed tools. A new research has been designed in making
of biosensors electrode by using immobilization method of enzyme acetylcholinesterase
(AChE) with the supporting materials of Acetate Selulose (AS) and Glutaraldehid (GA) in
biosensor electrode connected with electrochemical transducer. Designed biosensors were
characterized, including Nernst factor, the detection limit, response time, and period of use.
Next, biosensors were tested in sample of vegetables and fruits. Expected result was a
biosensor prototype with better work than pesticide determination with instrument of Gas
Chromatography (GC) and High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Biosensor
development offers low cost, accurate, quick analysis time, and sensitive to detect pesticide
residue.
Keywords: : Pesticide, Biosensor, Electrochemical, Enzim, Sensitive

1PENDAHULUAN pertanian setinggi-tingginya melalui

Perkembangan penemuan baru dibidang
kimia, terutama pestisida di tahun 1940 an
selain menimbulkan dampak positif, terutama
dibidang pertanian yang ditandai dengan
meningkatnya produksi pertanian, juga
menimbulkan dampak negatif bagi makhluk
hidup. Penggunaan pestisida sangat luas
antara lain pada bidang kesehatan, pertanian
dan kehutanan. Setelah perang dunia II,
pestisida banyak digunakan dibidang
pertanian yaitu dalam program green
revolution yang bertujuan meningkatkan hasil
*)Corrresponding author:
E-Mail address: mashuni2696@yahoo.com
manipulasi genetik, peningkatan penggunaan
air dan pupuk serta pengendalian hama
dengan pestisida. Salah satu kelemahan
penggunaan pestisida adalah matinya spesies
non target, sehingga dapat merusak suatu
ekosistem dan pemulihannya memerlukan
waktu yang lama (Buchari et al., 1999).
Pestisida merupakan salah satu senyawa
kimia berbahaya di lingkungan, yang paling
besar jumlahnya terutama dalam tanah, air,
atmosfer dan produk pertanian.
Keberadaannya begitu meluas di lingkungan
dan dapat menimbulkan polusi. World Health
Organisation (WHO) dan program lingkungan
Perserikatan Bangsa Bangsa memperkirakan
Vol. 2 No.2, 2012
ada 3 juta orang yang bekerja pada sektor
pertanian di negara-negara berkembang
terkena racun pestisida dan 18.000 orang
diantaranya meninggal setiap tahunnya
(Sarjan, 2009).
Dalam beberapa dekade terakhir
pemakaian pestisida didominasi oleh dua jenis
insektisida yaitu senyawa karbamat dan
organofosfat. Kedua senyawa tersebut banyak
digunakan pada pengolahan pertanian karena
kestabilannya yang rendah di lingkungan
dibandingkan dengan senyawa organoklorin
(Skadal et al., 1997; Pogacnik dan Franko,
2003).
Toksisitas pestisida karbamat dan
organofosfat terhadap manusia dan hewan
disebabkan oleh kemampuannya menghambat
kelompok enzim hidrolase yang disebut
esterase. Enzim asetilkolinesterase (AChE)
sangat penting untuk sistem saraf pusat pada
manusia dan serangga (Prieto-Simon et al.,
2006).
Untuk kepentingan kesehatan dan
lingkungan, pada umumnya negara-negara di
dunia telah mengontrol penggunaan pestisida
pada bidang pertanian. Beberapa organisasi
mengatur batas maksimum residu pestisida
pada konsumsi air minum dan pangan bagi
manusia dan hewan. Beberapa diantaranya
adalah the Food and Agricultural Organisation
(FAO), the World Health Organisation (WHO),
the European Community (EU). Salah satu
kebijakan yang dikeluarkan oleh the EU adalah
memonitor batas konsentrasi total pestisida
yang diperbolehkan tidak melebihi 0,5 µg/L
(Prieto-Simon et al., 2006).
Analisis pestisida yang sudah sering
dilakukan adalah dengan kromatografi gas
(GC) atau kromatografi cair tekanan tinggi
(HPLC). Environmental Protection Agency
(EPA) telah melakukan analisis kandungan
beberapa residu pestisida karbamat
(karbofuran dan karbaril) dengan HPLC pada
air dan makanan. Limit deteksi masing-masing
senyawa karbamat tersebut adalah 2,0 ppb
dan 1,5 ppb (Velasco-Garcia et al., 2003;
Mehrvar dan Abdi, 2004)
Sekarang ini sedang dikembangkan analisis
pestisida dengan biosensor. Analisis pestisida
dengan biosensor dapat menghasilkan respon
yang cepat, selektif, sensitif dan sederhana
(Velasco-Garcia et al., 2003; Mehrvar dan
Abdi, 2004)
Pengembangan Biosensor Elektrokimia 107
Biosensor adalah peralatan analitik yang
merupakan penggabungan antara komponen
biologi (enzim) dan transduser fisika untuk
mendeteksi suatu senyawa target. Enzim yang
digunakan adalah yang dapat bereaksi secara
selektif dengan substrat. Biosensor memiliki
sensitivitas dan selektivitas yang tinggi,
kecepatan respon, pengoperasiannya yang
mudah, maka biosensor menjadi suatu
peralatan penting untuk mendeteksi
komponen kimia dan biologi, obat-obatan,
makanan dan monitoring lingkungan
(Baeumner, 2003; Amine et al., 2006; Renedo
et al., 2007; Tudorrache dan Bala, 2007).
Dalam penelitian ini akan didesain
prototipe biosensor elektrokimia untuk
analisis senyawa pestisida golongan karbamat.
Oleh karena membran elektroda merupakan
tempat timbulnya potensial atau arus yang
dihasilkan oleh reaksi yang dikatalisis oleh
enzim yang terdapat pada membran elektroda
dengan larutan yang dianalisis maka
parameter membran elektroda sangat
menentukan kinerja dari biosensor. Desain
biosensor pestisida menggunakan membran
enzim asetilkolinesterase (AChE) dan kolin
oksidase (ChO) yang diimmobilisasikan
dengan bahan pendukung selulosa asetat (SA)
dan glutaraldehid (GA).
BAHAN DAN METODE
Bahan yang digunakan adalah kawat perak,
KCl, kawat tembaga, kawat platina, kawat
timah, enzim asetilkolinesterase (AChE),
enzim kolin oksidase (ChOx), Selulosa Asetat
(SA), Glutaraldehid (GA), asetilkolin klorida,
pestisida karbamat (karbofuran),
NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.12H2O, aseton, etanol,
aquades, parafilm, sedangkan
Preparasi sampel sayur dan buah.
Sampel sayur dan buah masing-masing
sebanyak 10 gram diblender dengan 50 ml
metanol selama 2 menit atau sampai
terbentuk bubur yang homogen. Setelah itu
sampel disaring kemudian ampasnya dibilas
dua kali dengan etanol masing-masing
sebanyak 10 ml. Filtrat dikumpulkan,
selanjutnya dievaporasi sampai volumenya
kurang lebih 20 ml. Evaporasi dilakukan
dalam bath pada suhu 50 oC.
Pembuatan larutan standar. Penyiapan
larutan NaH2PO4. H2O 0,2 M (larutan A) dan
larutan Na2HPO4. 12H2O 0,2 M (larutan B).
108 MASHUNI
Selanjutnya dari larutan A dan larutan B
dibuat masing-masing larutan buffer fosfat pH
8,0. Larutan standar substrat asetilkolin
klorida dibuat dalam pelarut buffer fosfat pH
8,0 pada konsentrasi 1 x 10-3 M - 1 x 10-9 M.
Selanjutnya larutan standar pestisida
karbofuran 1 x 10-1 M disiapkan dengan
menimbang secara teliti karbofuran kemudian
dilarutkan dengan etanol dalam labu ukur
100 ml diencerkan sampai tanda batas.
Terhadap larutan ini kemudian dilakukan
pengenceran sampai konsentrasi 1 x 10-2 M -
1 x 10-9 M. Penyiapan larutan KCl 0,1 M,
dilakukan dengan melarutkan 0,7445 gram
KCl ke dalam aquades pada labu ukur 100 ml
selanjutnya diencerkan dengan aquades
hingga tanda batas.
Pembuatan larutan enzim AChE dan
ChO. Enzim AChE dari Electrophorus
electricus Sigma 1,17 mg dengan aktivitas
425,94 unit per mg padatan dilarutkan dalam
pelarut 9,0 ml buffer fosfat pH 8,0 dan 1 ml
KCl 0,1 M. Enzim ChOx dari Alcaligenes sp
lyophilized Sigma sebanyak 3,3 mg dengan
aktivitas 15 unit per mg padatan dilarutkan
dalam pelarut 9,0 ml buffer fosfat pH 8,0 dan
1 ml KCl 0,1 M.
Pembuatan selulosa asetat 5%, 10%,
15% dan glutaraldehid 15%. Selulosa
Asetat (SA) 5%, 10% dan 15% dibuat dengan
menimbang masing-masing 0,5 gram, 1,0 gram
dan 1,5 gram SA. Selanjutnya masing-masing
SA dilarutkan dengan aseton 10 ml. Larutan
Glutaraldehid (GA) 15% yang digunakan pada
penelitian ini adalah produksi Aldrich Sigma
dari larutan ini dibuat pengenceran sehingga
didapatkan 15%.
Pembuatan membran Biosensor.
Membran dibuat dari enzim
asetilkolinesterase (AChE) dan kolin oksidase
(ChOx) yang diimmobilisasikan pada bahan
pendukung selulosa asetat (SA) dan
glutaraldehid (GA) dengan komposisi seperti
pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi biosensor pestisida
Komposisi Membran
Selulosa Glutaralde AChE ChO
Asetat (SA) hid (GA) (IU/ml) (IU/ml)
5% 15 %
49,83
10 % 15 % 4,95
03
15 % 15 %
Disain elektroda biosensor tipe kawat
terlapis. Badan elektroda dibuat dari kawat
J. AGROTEKNOS
tembaga panjang 7 cm dengan diameter 1 cm
disambungkan dengan kawat platina (Pt)
panjang 2,0 cm berdiameter 0,4 mm kemudian
dipatri menggunakan kawat timah.
Selanjutnya dimasukkan ke dalam tip biru
dengan posisi kawat platina (Pt) menonjol
keluar 1,5 cm digunakan sebagai badan
elektroda. Pada masing-masing badan
elektroda dililitkan plastik parafilm sebagai
perekat kawat Cu dan kawat Pt. Bagian ujung
elektroda yaitu kawat Pt dicelupkan dalam
larutan homogen selulosa asetat. Setelah
lapisan selulosa asetat terbentuk, elektroda
dibilas dengan aquades sebanyak tiga kali.
Selanjutnya pada bagian kawat Pt yang telah
dilapisi membran selulosa asetat dicelupkan
dalam larutan glutaraldehid selama enam jam
setelah itu elektroda dibilas buffer fosfat pH
8,0 maka terbentuk elektroda membran (Em),
selanjutnya Em dicelupkan dalam buffer
fosfat pH 8,0 yang mengandung enzim
asetilkolinesterase dan enzim kolin oksidase
selama 48 jam. Elektroda membran (Em) yang
belum digunakan tetap dicelupkan ke dalam
buffer fosfat pH 8,0 pada temperatur 4 0C.
Pengukuran Batas Deteksi Biosensor
Pestisida. engukuran potensial substrat
Asetilkolin klorida dengan inhibitor pestisida
karbofuran dengan cara elektroda biosensor
yang telah dibuat sebelum dipakai terlebih
dahulu dicelupkan dalam larutan buffer fosfat
pH 8,0 kemudian elektroda biosensor
digunakan untuk mengukur potensial substrat
asetilkolin klorida dengan konsentrasi 10-3 M
yang telah ditambahkan larutan karbofuran
dengan konsentrasi bervariasi dari 10-3 – 10-9
M. Pengukuran respon biosensor seperti
Gambar 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini menggunakan transduser
elektrokimia dengan metode potensiometrik.
Analisis pada metode potensiometrik,
kesetimbangan lokal terjadi pada antarmuka
sensor. Potensial elektroda dan potensial
membran diukur, selanjutnya informasi
tentang suatu sampel didapatkan dari
perbedaan potensial antara dua elektroda.
Elektroda biosensor dibuat dari kawat
platina (Pt) yang dilapisi membran selulosa
asetat (SA) sebagai bahan pendukung,
membran ini memiliki kestabilan yang baik
terhadap berbagai macam zat kimia, dan
Vol. 2 No.2, 2012 Pengembangan Biosensor Elektrokimia 109

glutaraldehid (GA) yang berfungsi sebagai pendukung.

pengikat antara enzim dengan bahan

Gambar 1. Desain pengukuran respon biosensor

Enzim yang diimmobilisasikan pada 400

membran elektroda biosensor adalah 350

asetilkolinesterse (AChE) dan enzim kolin 300

y = 0.9x + 265.23
oksidase (ChO). Enzim yang paling banyak 250 R2 = 0.8322

digunakan untuk mendeteksi senyawa

mV

200

pestisida adalah enzim kolinesterase. Hasil 150

y = -32.24x + 13.74
desain biosensor diuji responnya dengan 100 R2 = 0.8453

potensiometer. 50

Metode analisis yang spesifik bagi 0

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
penentuan kuantitatif suatu unsur atau log [karbofuran]
molekul dalam jumlah renik pada suatu
sampel selalu dihadapkan pada limit deteksi Gambar 2 Limit deteksi biosensor untuk komposisi
yang dinyatakan dengan suatu konsentrasi membran SA 5%, GA 15% pada
terendah dari suatu zat yang dapat ditentukan. konsentrasi substrat 10-3 M (A)
Penentuan limit deteksi suatu elektroda dapat
dilakukan dengan membuat garis singgung 350

pada fungsi linier yang Nernstian dan non 300

Nernstian. Titik potong kedua garis 250 y = 1.1x + 253.83

R2 = 0.784
diekstrapolasikan ke sumbu x sehingga dapat 200
mV

diperoleh konsentrasi limit deteksi. Hasil 150

penentuan limit deteksi elektroda biosensor

y = -32.43x - 5.46
100 R2 = 0.9307

yang telah didisain dapat dilihat pada Gambar 50

2 sampai gambar 4. 0

Dari hasil ekstrapolasi terhadap sumbu x -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

yaitu – log [karbofuran] diperoleh limit log [karbofuran]

deteksi biosensor dengan komposisi membran

SA 5%, GA 15% adalah 10-7,5 M (≈ 0,00221 Gambar 3. Limit deteksi biosensor untuk
komposisi membran SA 10%, GA 15%
ppm atau 2,2 ppb. Limit deteksi biosensor pada konsentrasi substrat 10-3 M (B)
dengan komposisi membran SA 10%, GA 15%
adalah 10-7,8 M (≈ 0,00221 ppm) dan limit
deteksi biosensor dengan komposisi membran
SA 15%, GA 15% adalah 10-7,2 M (≈ 0,0221
ppm).
110 MASHUNI J. AGROTEKNOS

300 Tabel 2 Hasil Kinerja Biosensor

250 Komposisi Kinerja
200
y = 0.25x + 213.22 Tipe Membran Biosensor
R2 = 0.9868
Membran GA SA Limit Deteksi
mV

150
(LD)
100 y = -20.21x + 61.98
R2 = 0.8565
A 5% 10-7,5 M
50 B 15% 10% 10-7,8 M
0 C 15% 10-7,2 M
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

log [karbofuran]
SIMPULAN
Gambar 4. Limit deteksi biosensor untuk
Kinerja biosensor yang telah dianalisis
komposisi membran SA 15%, GA 15%
pada konsentrasi substrat 10-3 M (C)
dengan alat Potensiometer menunjukkan
bahwa untuk komposisi membran SA 5% dan
Pada Gambar 2 – 4 hasil ekstrapolasi GA 15% diperoleh limit deteksi 10-7,5 M, untuk
terhadap sumbu x -yaitu – log [karbofuran] SA 10% dan GA 15% diperoleh limit deteksi
diperoleh limit deteksi biosensor 10-7,2 - 10- 10-7,8 M, untuk SA 15% dan GA 15% diperoleh
7,8 M (≈ 0,0221 - 0,00221 ppm). Limit deteksi
limit deteksi 10-7,2 M. Limit deteksi 10-7,8 M
terendah didapatkan dari komposisi membran tersebut sebanding dengan 0,0022 ppm atau
elektroda dengan bahan pendukung selulosa 2,2 ppb. Kemampuan unjuk kerja biosensor
asetat 15% dibandingkan limit deteksi hasil meliputi spesicisitas yang tinggi dan
disain biosensor lainnya. Hal ini disebabkan sensitivitas, kecepatan respon, biaya yang
karena zat pendukung membran yaitu SA relatif murah, peralatan yang relatif kompak,
konsentrasinya lebih tinggi dari komposisi dan pengoperasian peralatan yang mudah dan
membran lainnya yaitu 15%. Tingginya aman, maka biosensor menjadi suatu
konsentrasi selulosa asetat menyebabkan peralatan yang penting untuk mendeteksi
lapisan pori-pori membran semakin mampat komponen biologi dan kimia pada bidang
sehingga kesetimbangan terganggu kesehatan, pangan dan monitoring
menyebabkan limit deteksi biosensor lingkungan. Sementara itu gabungan
menurun. Immobilisasi enzim AChE dan ChO transduser elektrokimia dengan suatu enzim
pada bahan pendukung selulosa asetat dan sebagai komponen biologi menyebabkan
glutaraldehid dapat dilakukan dalam penggunaannya menjadi luas. Sebagaimana
pembuatan membran biosensor pestisida. alat ukur instrumen lain seperti GC dan HPLC
Membran selulosa asetat memiliki kestabilan yang mempunyai limit deteksi karbamat
yang baik terhadap berbagai macam zat kimia, sebesar 2 ppb, maka biosensor hasil disain
mempunyai kekuatan mekanik yang baik dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
sehingga tahan tehadap tekanan tinggi dan pestisida dengan lebih efisien karena dapat
selektif sehingga dapat menahan materi yang dibawa ke lapangan.
sangat kecil. Biosensor yang didasarkan pada
prinsip inhibisi enzim dapat digunakan secara UCAPAN TERIMA KASIH
luas untuk mendeteksi suatu analit seperti
komponen pestisida dan logam berat. Ucapan terima kasih disampaikan kepada
Pemilihan sistem enzim/analit didasarkan Dit. P2M-Ditjen DIKTI atas pembiayaan
pada kenyataan bahwa analit toksik ini penelitian ini melalui Hibah Penelitian
menghambat fungsi normal enzim. Pada Strategis Nasional pada tahun anggaran 2009
umumnya, pengembangan sistem biosensing – 2010.
ini mengandalkan pengukuran kuantitatif
pada aktivitas enzim sebelum dan sesudah DAFTAR PUSAKA
direaksikan atau dikontakkan dengan suatu Amine, A., Mohammadi, H., Bourais, I. and Palleschi,
analit target. Limit deteksi secara lengkap G. 2006. Enzyme Inhibition-Based Biosensors
untuk masing masing komposisi membran for Food Safety and Environmental Monitoring.
biosensor dapat dilihat pada Tabel 2. Biosensors and Bioelectronics. 21 : 1405 – 1423.
Vol. 2 No.2, 2012 Pengaruh Bahan Organik Dan Pupuk Kalium 111
Baeumner, A. 2003. Biosensor for Environmental
Poltatants and Food Contaminants. Anal
Bioanal Chem. 377 : 434 – 445.
Buchari, Arka, I., Putra, K.G.D., Dewi, I.G.A.K. 1999.
Kimia Lingkungan. FMIPA. Univ. Udayana. Bali.
Mehrvar, M. and Abdi, M. 2004. Recent
Developments, Charachteristics and Potential
Applications of Electrochemical Biosensors.
Analytical Science. 20 : 1113 – 1126.
Pogacnik, L., Franko, M. 2003. Detection of
Organophosphate and Carbamate Pesticides in
Vegetable Samples by a Photothermal
Biosensor. Biosnsors and Bioelekctronics. 18 :
109.
Prieto-Simon, B., Campas, M., Andreescu, S. and
Marty, J. 2006. Trends in Flow-based Biosensing
Syatems for Pesticide Assessment. Sensors. 6 :
1161 – 1186.
Renedo, O.D., Alonso-Limillo, M.A. and Martinez,
M.J. 2007. Recent Developments in the Field of
Screen-Printed Electrodes and their Related
Applications. Talanta. 73 : 202 – 219.
Sarjan, M. 2009. Perlindungan Tanaman dari
Serangan Hama Melalui Pendekatan Teknologi
Non-Kimiawi Sintetis. Makalah disajikan dalam
Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar dalam
Hama Tumbuhan Fakultas Pertanian
Universitas Mataram, Mataram 12 Pebruari
2009.
Skadal, P., Nunes, G.S., Yamanaka, H., Ribeno, M.L.
1997. Detection of Carbamate Pesticides in
Vegetable Samples Using Cholinesterse-based
Biosensors. Electroanalysis. 9 :1083-1087.
Tudorache, M. and Bala, C. 2007. Biosensors Based
on Screen-Printing Technology, and their
Applications in Environmental and Food
Analysis. Anal Bioanal Chem. 388 : 565 – 578.
Velasco-Garcia, M.N. and Mottram, T. 2003.
Biosensors Technology Addressing Agricultural
Problems. Automation and Emerging
Technologies. 84 (1) : 1 – 12.