Cara Kerja Realtime PCR untuk menentukan profil ekspresi mRNA gen target.

Proses gen spesifik oligonukleotida primer untuk GADPH sebagai housekeeping gene (internal
control)
Mendeteksi gen m RNA IL17A dengan menggunakan primer spesifik forward dan Reverse
Protokol PCR: dilakukan penggandaan DNA dengan siklus 940C selama 3 menit, Siklus diulang
38 kali dengan 54oC (30 detik). Mendeteksi gen GAPDH dengan menggunakan Forward / sense
primer: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC ; protocol PCR: 94oC (10 menit); 32 siklus 54oC (30
detik). Dan reverse/antisense primer: CAATAGTGATGACCTGGCC GT sesuai dengan protocol
Tomomi Yajima.
QRT-PCR menggunakan Green QRT-PCR master mix kit, satu tahap. Protocol ini dioptimalkan
untuk instrument Mx4000, protocol disesuaikan menggunakan intrumen dengan mengubah
pengenceran pewarna berdasarkan petunjuk manual dan mengikuti instrument pabrik yang
direkomendasikan untuk program siklus RT-PCR.
Refrensi pewarna pasif dimasukkan dala reaksi, diencerkan 1 : 500. Larutan yang mengandung
pewarna dijauhkan dari cahaya. Mengencerkan 2 x SYBR Green QRT-PCR master mix dan
disimpan di atas es. Mengikuti pencairan awal master mix, bagian yang tidak digunakan disimpan
pada 4oC dengan catatan, menghindari siklus beku-cair yang berulang.
Reaksi percobaan disiapkan dengan menambahkan komponen-komponen berikut. Menyiapkan
campuran reagen untuk reaksi menggunakan beberapa komponen seperti dibawah ini.
Campuran reagen dengan mengambil volume akhir 25µl (termasuk RNA percobaan) 12,5 µl dari
2 x SYBR Green QRT PCR master mix ditambah x µl dari primer awal (konsentrasi dioptimalkan)
ditambah lagi Nuklease – bebas PCR – tingkat H2 x µl primer akhir (konsentrasi dioptimalkan)
dan juga 0,375 µl larutan pewarna referens dari tahap 1 (opsional) serta 1,0 µl dari RT/Rnase
campuran enzim blok dengan 50 µl total volume reaksi juga dapat digunakan. Reaksi dicampur
secara perlahan agar tidak terbentuk gelembung (tidak dirotasi), kemudian distribusikan campuran
ke tabung reaksi percobaan dengan menambahkan x µl RNA percobaan pada setiap tabung reaksi.
Reaksi dicampur secara perlahan agar tidak terbentuk gelembung (tidak dirotasi). Reaksi
disentrifuse dengan singkat dan reaksi ditempatkan dalam instrument dan program PCR siap
dijalankan dengan menggunakan mesin Realtime PCR (CFX Connect System, Biorad
Laboratories, Real Time PCR 96 well 0.1 ml, USA)
Protocol PCR
1. PCR mix preparation
Reagents Concentration Volume 1 test Volume tests End-
(µl) (µl) concentration
MQ Baker 14.61
Reaction Buffer 150 mM Tris- 2.5 15 mM Tris-
(10) HCl pH 8,0, 500 HCl pH 8,0, 50
mM KCl, 0,1% mM KCl, 0,01%
(v/v) Tween 20 (v/v) Tween 20
dNTP-mix 25mM per 0.24 0,2 mM per
dNTP dNTP
Primer For 20 µM 0.3 0.2 µM
Primer Rev 20 µM 0.3 0.2 µM
MgCl2 25 µM 1,8 1,5 µM
Tag DNA 5 U/ µl 0.25 1,25 U
polymerase
Template DNA 5,0
Total 25,0

2. Amplification
a. Put the PCR tubes in the PCR machine and close the lid
b. Set the PCR machine to perform the following run:
Program AB Biosystem (duration about 2 hours):
 10 min at 950C
 35 cycles of:
o 30 sec. at 96 oC
o 30 sec. at 56 oC
o 1 min. at 70 oC
 1 min. at 72oC
 END
c. If the program is completed, open the PCR machine and take out the tubes
d. Move the tubes and store them at -20oC.