Práctica No.

3
Preparación de medios de cultivo

Objetivo: Diferenciar y preparar los medios de cultivo de acuerdo a su función para

el crecimiento microbiano.

Introducción.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Tipos de medios de cultivo

Por su estado:

a. Medios líquidos: llevan disueltos los nutrientes principales

b. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido
acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se
usa a una concentración del 1,5%.
c. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.

Por su composición:

a. Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,

fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros
elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella
abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
b. Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan
ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto
de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con
exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
Por su función

a. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con

aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición
de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
b. Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento
específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es
de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una
población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es
selectivo para autotrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento
de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo
crecerán los que usen maltosa.
c. Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de
microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de
crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de
no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
d. Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo
ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las
células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen
ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en
los medios de mantenimiento.

Preparación en tubo inclinado:

Material:

Estría en placa
Materiales:
 Medios EMB y Sal y Manitol
 2 matraces de 250 ml con tapón de algodón y gorro para esterilizar (Agar
EMB y Sal y Manitol)
 6 cajas Petri
 Mechero fisher

Dilución y vaciado en placa

Materiales:
 Agua peptonada al 1%
 Agar PDA y Agar Nutritivo (Se preparan hasta la siguiente sesión)
 1 frasco de dilución
 1 pipeta de 10 ml
 3 pipetas de 1.0 ml
 2 tubos con tapón de rosca
 2 matraces 250 ml con tapón p/esterilizar
 6 Cajas petri
  espátula
 perilla microbiológica
 gradilla
Descripción de la práctica: Sesión 1

1. Pesar el medio de cultivo a preparar EMB y Sal y Manitol en los matraces de

250 ml de acuerdo a las instrucciones de la etiqueta (60 ml de cada uno),
agregar la cantidad de agua requerida y disolver parcialmente.
2. Preparar solución de agua peptonada al 1% + 8.5 g de NaCl/L (110 ml por
equipo)
3. Vaciar 90 ml de esta solución a cada frasco de dilución y 9 ml a cada tubo de
ensaye con tapón de rosca (2) no tapando completamente el tubo.
4. Colocar en autoclave los medios y la solución de agua peptonada para
esterilizar (revisar indicaciones en etiqueta de cada medio de cultivo)
5. Cumplido el ciclo de esterilización, esperar a que baje la presión antes de abrir
nunca agregar agua para enfriar rápidamente.
6. Vaciar el medio a tres cajas Petri, aproximadamente 20 ml por caja, esperar a
que solidifique antes de invertir para incubar.
7. Realizar la prueba de esterilidad a una o dos cajas de cada medio preparado,
incubando a 37 °C por 24 hs.
8. Anotar observaciones. Dejar el material estéril para utilizar la siguiente sesión.
9. Esterilizar pipetas que se ocuparán la siguiente sesión si es necesario

Análisis y discusión de resultados:

Conclusiones:
Cuestionario:

1. ¿Qué variables deben ser considerados para la preparación de los medios de

cultivo?

2. Describa las necesidades nutritivas que requieren: bacterias, hongos y algas

3. ¿Qué medio de cultivo requiere para la pregunta anterior?

Actividades de síntesis:

 Elaborar un resumen que describa las características, usos, ventajas y

desventajas de los medios de cultivo
 Describir la función de los indicadores en los medios de cultivo

Referencias bibliográficas:

1. Atlas, R. M. 1977. Handbook of Microbiological media. 2ª Ed. Boca ratón, Fla:

CRC Press.
2. Bridson, E. Y. 1990. Media in Microbio0logy. Rev. Med. Microbiol. 1: 1 – 9.
3. Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:
Butterwortths.
4. Difco Laboratorios. 1984. Difco Manual of the dehydrated Culture Media and
Reagents for Microbiology. 10th Ed. Detroit: Disfo.
5. Murray, R. K. Granner, D. K. y Rodwell, V. W. 2007. Harper. Bioquímica
Ilustrada. 17ª ed. Ed. Manual Moderno.
6. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4ª ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España,. Pp. 729-733.
 Práctica No. 4
Aislamiento de microorganismos en cultivo puro

Objetivo: Seleccionar técnicas específicas para aislar un microorganismo puro.

Introducción:

Un cultivo puro o axénico es aquel formado por células provenientes de una sola
inicial y por tanto perteneciente a la misma especie y cepa. Es una situación artificial
ya que en la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones
mixtas y heterogéneas. Es un artificio obligado para estudiar cada especie y cepa
de microorganismo en particular.

1.- Métodos para aislar cultivos puros

Técnica de siembra por estrías en placa.

Técnica de vertido en placa.
Técnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en diseñar condiciones de
cultivo que favorezcan específicamente al microorganismo que queremos aislar y
que se encuentra en pequeñas cantidades.

Técnica de las diluciones en serie: se utiliza para microorganismos cuya

proporción es mayoritaria dentro de la población mixta.

Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un micromanipulador.

Morfología colonial

La morfología bacteriana macroscópica, se basa en las características de

crecimiento de las colonias en un medio de cultivo determinado.

a. En medios sólidos en placas (con agar)

 Tamaño: mm
 Cromogénesis: color del pigmento
 Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, huso
 Elevación: lisa, elevada, convexa, pulvinada, abonetada
 Borde: entero, ondulado, lobado, recortado, filamentoso, rizado.
 Superficie: lisa o rugosa.
 Luz reflejada: brillante, mate.
 Luz transmitida: opaca, translucida o transparente
 Consistencia: suave (mucoide o friable) o dura.

b. En medios sólidos en tubos, agar inclinado

 Forma: filiforme, equinulada, esparcida, globulada, difusa, plumosa,

arborescente, rizoide.

c. En medios sólidos, agar (siembra por picadura)

 Forma: filiforme, equinulada, globulada, papilada, vellosa, plumosa,

arborescente.

d. En gelatina
  Siembra por picadura: filiforme, burbujeante, papilada, vellosa,
arborescente.
 Licuación de la gelatina: crateriforme, napiforme, cónica, en forma de saco,
estratiforme.

e. En medios líquidos (sin agar)

 Cantidad de crecimiento: ausente, escaso, moderado, abundante.

 Distribución del crecimiento: floculento, anillado, presencia de velo,
membranoso, granular, viscoso.

Material:

Se va a utilizar el material esterilizado previamente

 Cepas: E. coli y S aureus
 Medios agar sólido EMB y Sal y Manitol
 Medios líquidos recién preparados Agar PDA y Agar Nutritivo
 Licuadora con aspas y recipiente estéril
 Gradilla, perilla microbiológica

Muestras:

Alimento para analizar (de preferencia líquido) Si es sólido, esterilizar

previamente asas de la licuadora y vaso.

Procedimiento de la práctica:

1. A 90 ml de solución salina estéril añadir 10 gramos o 10 ml de muestra

y agitar 10 por seg. (dilución 10-1)
2. Transferir 1.0ml de esta dilución a un tubo con 9.0 ml de sol. salina
(dilución 10-2) y agitar de la misma manera, continuar con los
siguientes tubos hasta obtener una dilución 10-3 ver figura.
 3. Utilizando las mismas pipetas vaciar el volumen indicado a las cajas
Petri para preparar por el método de dilución y vaciado en placa.

Método de dilución y vaciado en placa. (sesión 2)

1. Aislamiento de bacterias.

a) De las 2 últimas diluciones transferir 1ml a una caja petri estéril (realizar por
duplicado)
b) Agregar Agar Nutritivo a temperatura aproximada de 45° C (20 ml aprox.) y
mezclar lentamente por rotación.
c) Dejar melificar e incubar a 37° C durante 24 hrs.

2. Aislamiento de hongos.

a) De las 2 ultimas diluciones transferir por duplicado 1.0 ml a cajas Petri

estériles
b) Agregar medio de Sabouraud o Papa Dextrosa Agar (PDA) fundido y
mezclar por rotación lentamente.
c) Dejar melificar e incubar a 28° C durante 48 a 72 hrs.

3. Método de estría cruzada empleando medios de cultivo selectivo y

diferencial.

a) Tomar una asada de la muestra original y descargar la asa en una de las

orillas de las placas de los medios de cultivo preparados.
b) Esterilizar la asa al rojo de la flama del mechero.
c) Enfriar la asa y hacer otra serie de estrías
d) Esterilizar nuevamente la asa y dejarla enfriar
e) Realizar la misma técnica realizado de 4 series de estrías
f) Incubar las placas a 37° C/ 24 hrs.

Evaluación:

Examen escrito sobre la temática de la práctica

Reporte de la práctica
Habilidades durante el desarrollo de la práctica
Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3
(bacterias) (bacterias) (hongos)
Tamaño
Color
Forma
Elevación
 Superficie
Aspecto
Bordes
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia

Análisis y discusión de resultados:

Conclusiones y sugerencias:
Cuestionario:

1. ¿Cuál de los dos métodos utilizados en la práctica es cuantitativo?

2. ¿Cual es la razón del por qué se aíslan los microorganismos en cultivo puro?

3. Describe el fundamento del medio de cultivo para aislar S. Aureus

4. Describe el fundamento del medio de cultivo para aislar E. coli

5. ¿Qué precauciones debe tomar al momento de realizar las diluciones para

evitar errores?

Actividades de síntesis:

 Elaborar un mapa mental de las técnicas de aislamiento de

microorganismos
 Describir las ventajas y desventajas de las técnicas de aislamiento
Referencias bibliográficas:

1. Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.
2. Gottschall, J. C. Harder, W. and Prins, R. A. 1992. Principles of enrichment,
Isolation, Cultivation and Preservation of Bacteria. In Prokariotes. 2th. Ed. A.
Balows et al. Editores. New York. Spriger - Verlang.
3. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4ª ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España,. Pp. 729-733.