Identifikasi mikroskopis akurat dari spermatozoa manusia adalah penting dalam kasus-kasus

kekerasan seksual. Penelitian ini membandingkan hasil pemeriksaan dengan (1) metode fluorescent
microscopy, SPERM HY-LITERTM, dan (2) metode Baecchi untuk identifikasi spermatozoa manusia.
Dalam 35 sampel forensik tipe buatan, 45,7% spermatozoa diidentifikasi dengan SPERM HY-
LITERTM di Kopenhagen, 54,3% di laboratorium dari produsen SPERM HY-LITERTM, dan 40,0%
dari sampel dengan metode pewarnaan Baecchi. Ketika perbedaan terjadi antara dua metode, itu
secara signifikan lebih sering bahwa SPERM HYLITERTM mendeteksi spermatozoa ketika metode
Baecchi tidak (ts = 6.567, df = 1, P = 0.048). Hal ini juga terlihat pada sampel terpilih yang
dikompromikan atau terdegradasi dan dalam sampel ajudikatif terpilih. Reaksi negatif
spermatozoaditemukan padaspermatozoa yang berasal dari anjing, kuda, babi dan banteng dengan
SPERM HY-LITERTM, sedangkan metode Baecchi tidak selektif. Data dari sampel uji kerja forensik
di Kopenhagen dari dua tahun (2008 dan 2009) disajikan. Sampel dari 2008 diselidiki menggunakan
metode Baecchi, sedangkan yang dari 2009 diselidiki menggunakan SPERM HY-LITERTM. Frekuensi
positif hasilnya serupa antara dua metode selama dua tahun (27,9% dan 32,1% masing-masing).
Analisis aktivitas asam fosfatase (ACP) untuk hasil positif yang diperoleh selama dua tahun ini tidak
mendukung penggunaan hasil ACP negatif sebagai prescreen untuk analisis mikroskopis untuk
spermatozoa.

Pendahuluan

Identifikasi spermatozoa dan cairan mani dalam tindakan kejahatan seksual

adalah aspek penting dari penyelidikan genetik forensik. Beberapa konstituen kimia dan seluler dari
cairan mani sering digunakan dalam identifikasi cairan mani setelah berhubungan seksual pada kasus
kejahatan seksual. Misalnya, prostatic acid phosphatase (ACP), zinc, antigen spesifik prostat (PSA),
seminogelin dan MHS-5 [1-7] sering digunakan sebagai skrining dan / atau tes dugaan untuk
menentukan lokasi atau keberadaan cairan mani pada berbagai substrat. Selain itu, mereka juga
berguna dalam kasus di mana pelaku dengan oligospermatic atau azoospermatic, yaitu keadaan
dimana sedikit atau tidak ada spermatozoa yang dapat ditemukan [8,9]. Meskipun ada kemajuan
signifikan dalam menguji prosedur dan metodologi, tes ini masih kurang spesifisitas dan kekakuan
yang diperlukan untuk secara akurat menggambarkan mereka sebagai tes konfirmasi. Motif pengikat
umum di antara primata yang lebih tinggi dan spesies mamalia lainnya telah dilaporkan, lebih banyak
menggambarkan tes-tes ini sebagai alat skrining presumtif.

Identifikasi spermatozoa positif dalam kasus kekerasan seksual merupakan langkah penting dalam
menentukan strategi investigasi untuk analis laboratorium. Selain itu, dalam banyak kasus, identifikasi
spermatozoa memiliki dampak penting pada hasil suatu kasus. Oleh karena itu, laboratorium genetika
forensik mencurahkan banyak waktu, upaya dan sumber daya untuk mencari spermatozoa. Sampai
saat ini, pencarian spermatozoa telah dilakukan dengan analisis mikroskopis menggunakan pewarnaan
histologis tradisional seperti metode pewarnaan Baecchi dengan asam fuchsin dan metil biru,
selanjutnya disebut metode Baecchi, Kernechtrot-Picroindigocarmine (KPIC) dan Hematoxylin-eosin
(H & E) [11- 16]. Metode ini didasarkan pada identifikasi struktur morfologi dan pola pewarnaan
spermatozoa (Gambar 1). Namun, metode pewarnaan tradisional kurang spesifisitas dan sensitivitas,
membutuhkan pelatihan analis secara khusus untuk mencapai kemampuan yang diperlukan untuk
melakukan pemeriksaan mikroskopis pada bukti kekerasan seksual. Identifikasi spermatozoa manusia
dalam sampel dengan jumlah sperma rendah, kepadatan sel epitel yang tinggi, campuran sel dan
mikroorganisme dari sampel rektal, degradasi sel sperma dengan pelepasan ekor dari kepala, dll.
Dapat menjadi sangat sulit, sering mengakibatkan hasil negatif dan / atau tidak meyakinkan. Lebih
lanjut, pemeriksaan mungkin sangat memakan waktu. Mengingat keterbatasan pemeriksaan
mikroskopis sampel diwarnai dengan pengecatan histologis yang biasa, peningkatan spesifisitas dan
efektivitas metode untuk mengidentifikasi spermatozoa manusia sebagai bukti kekerasan seksual akan
sangat menguntungkan.

SPERM HY-LITERTM dikembangkan dan divalidasi untuk analisis mikroskopik spermatozoa

manusia dari bukti kekerasan seksual [17]. Spesifisitas metode ini diperoleh melalui Alexa 488
fluorescently (green flourescein isothiocyanate - FITC) antibodi monoklonal, yang secara khusus
menargetkan antigen pada membran nuklear sel sperma. Dalam hubungannya dengan tag Alexa 488,
pengecatan nuklear biru, 40,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), juga dimasukkan sebagai bagian dari
pewarnaan (Gbr. 2). Akibatnya, semua sel yang mengandung inti kaya DNA dapat divisualisasikan
melalui penggunaan selektif dari filter fluorescent yang kompatibel dengan DAPI. Hal ini
memungkinkan untuk memvisualisasikan berbagai sel tanpa perlu selektif degradasi sel epitel / vagina
dengan pengobatan proteinase K sebelum analisis mikroskopik. Karena fluoresensi yang kuat,
sedikitnya satu sel sperma dapat diidentifikasi di antara sampel epitel vagina yang padat yang
merupakan sel-sel yang umum ditemukan dalam jenis penyerangan seksual tipe swabs.

Meskipun keuntungan dari mikroskopi fluorescent untuk mengidentifikasi komponen seluler secara
luas diakui oleh komunitas ilmiah, penerapannya dalam ilmu forensik telah dibatasi hingga saat ini.
Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan keberhasilan
mengidentifikasi spermatozoa manusia dengan metode fluorescent SPERM HY-LITERTM dengan
metode Baecchi yang merupakan penyelidikan histologis tradisional yang digunakan di banyak
laboratorium. Di sini, kami menyajikan hasil studi validasi internal kami yang dilakukan di Bagian
Genetika Forensik, Departemen Kedokteran Forensik, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas
Kopenhagen, Denmark.
2. Bahan dan metode

2.1. Prosedur pengumpulan sampel untuk studi validasi awal

Koleksi sampel dari korban kekerasan seksual dilakukan di Bagian Genetika Forensik, Universitas
Kopenhagen, Denmark. Sumber sampel dipisahkan ke dalam dua kategori berbeda: (1) sukarelawan
dari Bagian Genetika Forensik yang digunakan untuk mengembangkan sampel tipe forensik, dan (2)
kasus kekerasan seksual yang diputuskan. Sampel biologis (buccal, vaginal, penis, rectal, dan / atau
epithelial swab) dikumpulkan menggunakan penyeka kapas berujung kapas, bebas DNA, dari 6
sukarelawan tanpa riwayat (dalam > dua minggu) aktivitas seksual yang tidak terlindungi. Semua
sumber sampel biologis dan / atau kontrol substrat diskrining dengan mikroskop untuk melihat adanya
spermatozoa manusia sebelum penelitian. Sebanyak 9 sampel jenis kekerasan seksual dikumpulkan
oleh ahli patologi forensik dari empat relawan. Waktu yang berlalu antara penyerangan dan
pengumpulan sampel berkisar antara 4 hingga 72 jam. Sampel duplikat menggunakan penyeka kapas
steril bebas DNA dikumpulkan dari berbagai daerah anatomis (buccal, introitus vagina, forniks vagina
posterior, rektum, dan payudara), berlabel, dan disimpan secara terpisah untuk pengujian independen.

2.2. Prosedur pengumpulan sampel untuk studi kohort

Tabel 1 menunjukkan jenis sampel yang dianalisis. Semua sampel dari kasus kekerasan seksual pada
tahun 2008 secara mikroskopis diperiksa dengan metode Baecchi dan diskrining untuk ACP. Semua
sampel dari kasus kekerasan seksual pada tahun 2009 secara mikroskopis diperiksa dengan metode
SPERM HY-LITERTM dan disaring untuk ACP.

2.3. Prosedur persiapan sampel

Semua sampel simulasi forensik disiapkan dalam rangkap dua. Sampel disiapkan dengan
menggunakan penyeka steril dan / atau berbagai substrat (katun, denim, kertas tisu, linen putih, dll.).
Untuk menguji efek kontaminan eksternal dan degradasi seluler, beberapa set sampel juga mengalami
perlakuan kimia dan / atau lingkungan (10% pemutih, deterjen (pemutih), tanah, beton, lingkungan
hangat / lembab di 37 8C, kondom lateks (nonoxynol-9 dilumasi), cairan tubuh dari berbagai sumber,
dll.). Setiap sampel diinokulasi dengan jumlah sperma yang diketahui mulai dari ≤10 hingga ≤50
sperma dan dibiarkan kering di udara pada suhu kamar (kecuali sampel mengalami perlakuan
lingkungan / kimia lebih lanjut). Sampel yang mengandung spermatozoa non-manusia juga dianalisis
untuk menentukan perbedaan morfologi dan spesifisitas masing-masing metode pewarnaan. Sampel
dianalisis baik sebagai sumber tunggal dan campuran (manusia / non-manusia sperma / sel bukal)
sampel sumber. Untuk mencapai sampel jumlah salinan rendah, beberapa pengenceran serial air mani
manusia dalam fosfat buffered saline (PBS) disiapkan. Sebanyak 100 ml sampel semen yang
diencerkan secara serial mulai dari 1 x 101 sampai 1 x 104 spermatozoa / ml dipanaskan pada slide
yang dilapisi Poly-L-Lysine, diwarnai dengan pewarnaan Baecchi dan dihitung secara mikroskopis
untuk mencapai standar konsentrasi encer yang diketahui secara serial. Sampel dibagi menjadi
berbagai kategori tergantung pada sumber sampel, jenis, dan kesulitan analisis (Tabel 2). Dalam
semua kasus, setiap sampel diberi pengidentifikasi alfanumerik unik dan acak selama masa penelitian.
Pengidentifikasi unik memastikan anonimitas lengkap individu yang dikenal dan menghilangkan bias
potensial berdasarkan contoh sumber / ID yang diketahui. Semua prosedur untuk menguji dan
penelitian eksperimental yang diterapkan pada sampel manusia dilakukan sesuai dengan prosedur
operasi standar yang digunakan untuk kerja forensik terakreditasi oleh Bagian Genetika Forensik,
perjanjian dengan Kementerian Kehakiman Denmark mengenai pengembangan metode baru untuk
materi kerja kasus genetik forensik, dan persetujuan oleh Denmark etis komite (KF-01-037 / 03 dan
H-1-2011-081).

2.4. Ekstraksi sampel dan pewarnaan

Ekstraksi bahan biologis dari penyeka / noda dari simulasi dan / atau kasus kekerasan seksual
dilakukan sesuai dengan prosedur operasi standar laboratorium serologi. Singkatnya, sepotong kecil
(sekitar 0,5-1 cm2 sepotong kain, atau 25% dari kapas) bahan sampling (kapas, kain, dll.)
Ditempatkan dalam 500 ml air deionisasi ganda (ddH2O) dan disinari. selama 30 menit dalam tabung
Eppendorf 1,5 ml. Puing-puing seluler yang tersuspensi dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml baru
dan dilas dengan sentrifugasi. Sebanyak 400 ml supernatan dikeluarkan dan peletnya diresuspensi
dalam 100 ml ddH2O yang tersisa. Dua aliquot dari 50 ml dari masing-masing sampel kemudian
dipindahkan ke jendela sampel dari slide mikroskop berlabel. Untuk konsistensi, baik sampel
pengecatan Baecchi dan SPERM HY-LITERTM dianalisis pada slide mikroskop hidrofobik bertopeng
dengan mikroskop 11 mm (Bagian Nomor 9111-25, IFI, Hillside, IL).

Sampel diwarnai dengan pengecatan Baecchi sesuai dengan prosedur operasi standar dari
laboratorium serologi. Singkatnya, 50 ml ekstrak sel di aliquoted ke slide mikroskop hidrofobik
bertopeng 11mm melingkar. Sampel panas tetap pada 37 8C sampai kering dan difiksasi dengan
etanol 96%. Ekstrak sel yang telah terfiksasi diwarnai selama 1 menit menggunakan 2-3 tetes
pewarna Baecchi (2,5 ml 1% metil biru, 7,5 ml 1% asam fuchsin, 2,7 ml HCl 12 M, 87,3 ml ddH2O).
pewarnaan berlebih telah dihilangkan dengan bilasan aliran lembut etanol 96% dan pengeringan udara
sebelum fiksasi akhir dengan Permount mounting medium dan cover slip (Fisher Scientific, nomor
katalog SP15-100 dan 12-544A).

Prosedur pewarnaan untuk SPERM HY-LITERTM (Nomor Bagian 7250, IFI, Hillside, IL) diikuti
sesuai dengan protokol yang disarankan produsen (lihat SPERM HY-LITER PLUSTM Staining
Protocol). Singkatnya, 50 µl ekstrak sel di aliquoted ke slide mikroskop tunggal hidrofobik-masked
11 mm melingkar. Sampel dikeringkan pada 37 8C dan difiksasi dengan 96% etanol. Slides diwarnai
menggunakan: 2 tetes Fixative (white cap) - inkubasi 10 - cuci dengan 1X wash buffer - tambahkan 2
tetes larutan Preparasi Sampel (yellow cap) dengan 2 µl 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) (10 µl untuk
sampel rektal) - inkubasi 30 menit - cuci dengan 1X Wash Buffer - tambahkan 2 tetes larutan
Blocking (red cap) - inkubasikan 30 menit - cuci dengan 1x wash buffer - tambahkan 2 tetes larutan
Sperm Head Stain (green cap) - inkubasikan 30 menit - cuci dengan 1 x wash buffer. Sampel
dikeringkan dengan udara selama 30 menit sebelum fiksasi akhir dengan 1 tetes media pemasangan
(blue cap) dan selubung penutup. Sampel pengecatan SPERM HY-LITERTM disimpan dalam kotak
penyimpanan gelap sampai dilakukan analisis.

2.5. Pemeriksaan mikroskopis, pencitraan data dan penyimpanan

Analisis mikroskopis dari sampel serangan seksual (Baecchi's dan SPERM HY-LITERTM)
dilakukan oleh dua analis dari Bagian for Forensic Genetics menggunakan Leica DM6000B neon /
transmisi cahaya mikroskop (Leica Microsystems, Jerman). Set sampel lengkap pertama kali
dianalisis dengan metode Baecchi dan mikroskop transmisi cahaya di bawah 100-400x pembesaran.
Semua hasil dan gambar digital slide positif / negatif dicatat sesuai dengan prosedur operasi standar
dari Bagian untuk Genetika Forensik. Slide pengecatan SPERM HYLITERTM dianalisis dengan
mikroskop fluoresen di bawah 100-400x pembesaran menggunakan filter FITC dan DAPI [17]. Setiap
slide dipindai dari sisi ke sisi, dan gambar digital slide positif / negatif diambil dan disimpan untuk
analisis lebih lanjut. Semua analisis mikroskopis pada sampel forensik-tipe di Bagian Genetika
Forensik dilakukan secara berurutan tanpa pengetahuan sebelumnya tentang sumber sampel, konten
dan / atau hasil. Satu set duplikat sampel dianalisis secara mikroskopis oleh anggota staf di Forensik
Independen, Hillside, IL. Hasil dari kedua laboratorium dijaga kerahasiaannya sampai perbandingan
akhir atau hasil penelitian.

2.6.Pemeriksaan aktivitas asam fosfatase (ACP)

Modifikasi uji Huggins dan Talalay (1945) digunakan [18]. Tes ini didasarkan pada natrium
fenolftalein fosfat yang tidak berwarna sebagai substrat yang dipecah menjadi fenolftalein yang
menghasilkan kemerahan pada pH basa. Investigasi dilakukan dengan menerapkan kertas saring yang
dijenuhkan dengan buffer substrat indikator ke objek selama 2 menit dan penyemprotan dengan buffer
alkalin dan menentukan warna kertas saring.
3.Hasil
3.1. Analisis mikroskopis dari simulasi jenis sampel forensik Gambar. 1 dan 2 menunjukkan hasil
representatif yang diperoleh dengan metode Baecchi dan SPERM HY-LITERTM. Swab kontrol negatif
dari enam sukarelawan ditemukan negatif adanya spermatozoa manusia dengan kedua metode
pewarnaan. Intimate swab digunakan untuk mengembangkan satu set sampel komprehensif kontrol
negatif (5 sampel), jumlah sperma rendah, yaitu 10 spermatozoa, jumlah standar, yaitu ≤50
spermatozoa, dan jenis lain yang rutin / sampel forensik yang mengandung jumlah air mani yang
bervariasi ( Total 35 sampel). Tabel 2 menunjukkan hasil pemeriksaan mikroskopis dari 35 simulasi
forensik-jenis sampel dengan metode Baecchi dan SPERM HY-LITERTM dilakukan di Kopenhagen
dan Illinois. Seluruh spermatozoa dan spermatozoa dikarakterisasi oleh ukuran, bentuk morfologi, dan
pewarnaan sel (akrosom, membran plasma, nukleus, ekor, dll.). Sistem penilaian biner (‘‘ + ’) satu
atau lebih sel sperma dikonfirmasi (dengan atau tanpa kepala),‘ ‘-’ ’ tidak ada sel sperma yang
dikonfirmasi) digunakan dalam penilaian setiap sampel. Tidak ada upaya dilakukan untuk mengukur
jumlah sperma yang diamati pada sampel yang berbeda karena ini tidak biasanya dilakukan untuk
sampel forensik yang sebenarnya. Sel sperma diidentifikasi pada 40,0% dari sampel dengan metode
Baecchi, 45,7% dengan SPERM HY-LITERTM di Kopenhagen dan 54,3% dengan SPERM HY-
LITERTM di Illinois. Tidak termasuk kontrol negatif, ada enam perbedaan antara hasil yang
diperoleh dengan metode Baecchi dan SPERM HY-LITERTM di Kopenhagen dan 11 perbedaan
antara metode Baecchi dan SPERM HY-LITERTM di Illinois, dan perbedaannya tidak berkorelasi
dengan kuantitas sperma. Kedua perbandingan ini bereplikasi karena sampel yang sama dianalisis di
Kopenhagen dan di Illinois. Jika perbedaan acak sehubungan dengan pendeteksian, maka orang akan
berharap setengah dari perbedaan berada di arah +/- (deteksi dengan metode Baecchi dan tidak ada
deteksi menggunakan SPERM HY-LITERTM) dan separuh perbedaan berada di arah +/- (tidak ada
deteksi oleh metode Baecchi dan deteksi positif menggunakan SPERM HY-LITERTM). Hasil pada
Tabel 2 menunjukkan bahwa perbedaan didominasi oleh arah +/- (4/6 untuk perbandingan yang
dilakukan di Kopenhagen dan 8/11 untuk perbandingan yang dilakukan di Illinois). Uji t satu-arah
dari rata-rata dua ulangan (rata-rata +/- = 0,697) versus nilai yang diharapkan 0,500 dilakukan. Uji
satu sisi digunakan karena tingkat keberhasilan keseluruhan lebih tinggi menggunakan SPERM HY-
LITERTM (Tabel 2), jadi kami secara khusus tertarik untuk menguji apakah metode itu lebih efektif
daripada metode Baecchi. Hasil mendukung anggapan bahwa, ketika perbedaan antara dua teknik
terjadi, perbedaannya lebih sering bahwa SPERM HY-LITERTM mendeteksi spermatozoa ketika
metode Baecchi tidak (ts = 6.567, df = 1, P = 0.048).

3.2. Spesifisitas pemeriksaan SPERM HY-LITERTM disimulasikan pada sampel forensik

Tabel 3 menunjukkan hasil dari 10 sampel yang berisi sel epitel vagina manusia tercampur dengan
sperma manusia atau sperma hewan dan dianalisis dengan metode Baecchi dan SPERM
HYLITERTM. Metode Baecchi menunjukkan hasil positif setiap kali terdapat sperma terlepas dari
kontributor spesies. Dalam semua kasus, SPERM HY-LITERTM mengidentifikasi dengan benar
kehadiran spermatozoa manusia dan negatif ketika satu-satunya spermatozoa yang ada berasal dari
sumber bukan manusia. Dengan demikian, metode Baecchi tidak spesifik sedangkan SPERM HY-
LITERTM berhasil membedakan antara spermatozoa manusia dan nonmanusia.

3.3. Perbandingan SPERM HY-LITERTM dan metode Baecchi pada sampel kekerasan seksual yang
dipilih
Tabel 4 menunjukkan bahwa dalam 9 sampel yang diambil dari kasus kekerasan seksual yang diadili,
spermatozoa diidentifikasi Baecchi di 44,4% dari sampel sedangkan metode SPERM HY-LITERTM
positif di 55,6% (Kopenhagen) dan 66,7% (Illinois) dari sampel, masing-masing. Ukuran sampel yang
kecil tidak memungkinkan analisis statistik. Namun, ketiga perbedaan antara metode Baecchi dan
salah satu ulangan menggunakan metode SPERM HY-LITERTM berada di arah +/-. Yaitu, sampel di
mana SPERM HY-LITERTM mengidentifikasi beberapa spermatozoa sedangkan tidak ada sel
sperma yang dapat ditunjukkan dengan metode Baecchi.

Berfokus pada sampel yang diuji (sampel rektal atau terdegradasi pada Tabel 2 dan 4), kami kembali
melihat perbedaan antara metode Baecchi dan dua ulangan SPERM HY-LITERTM. Ada 7
perbedaan antara metode Baecchi dan Kopenhagen atau replikasi Illinois. Dari jumlah ini, 3 dari 4
perbedaan untuk sampel yang dilakukan di Kopenhagen dan 2 dari 3 perbedaan untuk sampel yang
dilakukan di Illinois berada di arah +/- (deteksi positif menggunakan SPERM HY-LITERTM ketika
tidak ada spermatozoa yang dideteksi dengan metode Baecchi). Menggunakan tes dan asumsi yang
sama seperti dalam Bagian 2.1 di atas, kami secara statistik menguji hipotesis bahwa metode SPERM
HYLITERTM lebih efektif dalam mendeteksi spermatozoa di sampel terdegradasi atau kompromais
ini. Rata-rata +/- proporsi untuk dua sampel adalah 0,710 dan ini telah diuji dengan proporsi 0,500
yang diperkirakan diharapkan jika perbedaan secara acak. Hasilnya sugestif tetapi tidak signifikan
secara statistik pada tingkat 0,05 (ts = 5,250, df = 1, P = 0,06) .3,3. Perbandingan SPERM HY-
LITERTM dan metode Baecchi dalam sampel kekerasan seksual yang dipilih Tabel 4 menunjukkan
bahwa dalam 9 sampel yang diambil dari kasus kekerasan seksual yang diputuskan, spermatozoa
diidentifikasi Baecchi di 44,4% dari sampel sedangkan metode SPERM HY-LITERTM positif di 55,6
% (Copenhagen) dan 66,7% (Illinois) dari sampel, masing-masing. Ukuran sampel yang kecil tidak
memungkinkan analisis statistik. Namun, ketiga perbedaan antara metode Baecchi dan salah satu
ulangan menggunakan metode SPERM HY-LITERTM berada di arah +/-. Yaitu, sampel di mana
SPERM HY-LITERTM mengidentifikasi beberapa spermatozoa sedangkan tidak ada sel sperma yang
dapat ditunjukkan dengan metode Baecchi.

3.4. Evaluasi metode dalam pekerjaan rutin forensik

Hasil yang diperoleh di Kopenhagen tahun 2008 dengan metode Baecchi dibandingkan dengan yang
diperoleh pada tahun 2009 dengan tes SPERM HY-LITERTM. Tidak ada perbedaan dalam strategi,
dll., Kecuali perubahan dari metode Baecchi menjadi SPERM HY-LITERTM. Adanya atau tidak
adanya spermatozoa terdeteksi dengan dua metode dibandingkan pada Tabel 5 bersama dengan
tingkat keberhasilan mengembangkan profil STR laki-laki untuk sampel menunjukkan positif untuk
spermatozoa. Spermatozoa dideteksi dengan metode Baecchi pada 27,9% sampel dan 32,1% sampel
dengan SPERM HY-LITERTM. Namun, persentase ini tidak dapat dibandingkan secara langsung
karena persentase sebenarnya dari sampel yang mengandung spermatozoa selama dua tahun tidak
diketahui dan metode yang berbeda digunakan pada tahun yang berbeda. Tingkat keberhasilan
memperoleh profil DNA STR laki-laki setelah ekstraksi diferensial setelah hasil mikroskopi positif
adalah 82,7% dengan metode Baecchi dan 87,3% dengan metode SPERM HY-LITERTM. Analisis
kontingensi Chi Square hasil positif / negatif versus metode Baecchi / SPERM HY-LITERTM
dilakukan. Hipotesis yang diuji di sini adalah apakah probabilitas berhasil mendapatkan profil STR
DNA laki-laki tidak bergantung pada metode. Meskipun tingkat keberhasilan dalam memperoleh
profil DNA STR laki-laki lebih tinggi dengan SPERM HY-LITERTM, perbedaannya tidak signifikan
pada tingkat 0,05 (X2 = 3,014, df = 1, P = 0,083).

3,5. Korelasi antara reaksi asam fosfatase dan demonstrasi spermatozoa dalam kerja kasus forensik
rutin
Aktivitas asam fosfatase ditunjukkan pada 21,2% dari sampel 2008 dan 24,1% dari sampel 2009
(Tabel 5). Dari sampel yang positif untuk spermatozoa dengan metode Baecchi dan SPERM HY-
LITERTM, 61,8% dan 59,6%, masing-masing, positif untuk ACP. Uji kontingensi Chi square hasil
positif / negatif untuk metode ACP versus tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (X2 = 0,339,
df = 1, P = 0,561).
4. Diskusi
Identifikasi spermatozoa sangat penting dalam sebagian besar kasus kekerasan seksual. Beberapa
metode digunakan untuk mengidentifikasi spermatozoa, termasuk pemeriksaan mikroskopis dari
persiapan yang diwarnai dengan misalnya. Metode Baecchi. Metode pewarnaan histologis dapat
diandalkan untuk identifikasi spermatozoa ketika slide diteliti oleh peneliti yang berpengalaman,
tetapi prosesnya memakan waktu dan kesalahan rawan untuk peneliti yang tidak berpengalaman.
Dengan metode Baecchi, kepala dan ekor spermatozoa berwarna merah terang. Secara morfologis,
pola pewarnaan kepala sperma dicirikan oleh pewarnaan dua-nada dari akrosom (lihat Gambar 1).
Ujung cahaya semakin gelap menuju centriole, di mana ekornya terhubung ke kepala. Berdasarkan
ukuran spermatozoa manusia yang diketahui (kira-kira 7 µm x 5 µm, 50 µm termasuk ekor) dan
pewarnaan morfologis, seorang analis terlatih dapat menentukan keberadaan spermatozoa manusia
dari kumpulan bahan biologis campuran. Namun, karena adanya beberapa spesies ragi dan / atau
mikroorganisme, elemen ‘‘ sperma ’dapat salah dinilai terutama pada penyeka vagina dan dubur.
Tingkat keberhasilan identifikasi spermatozoa sampel tiruan sedikit lebih baik di Kopenhagen dan
Illinois dengan metode SPERM HY-LITERTM dibandingkan dengan metode Baecchi (Tabel 2).
Lebih penting lagi, ketika perbedaan terjadi antara metode Baecchi dan SPERM HY-LITERTM,
mereka didominasi bahwa SPERM HY-LITERTM menghasilkan hasil positif ketika tidak ada
spermatozoa yang dideteksi oleh metode Baecchi, dan tren ini secara statistik signifikan (ts = 6.567,
df = 1, P = 0,048). Meskipun tidak secara statistik luar biasa, itu memberikan dukungan untuk
pernyataan bahwa SPERM HY-LITERTM lebih efektif dalam mendeteksi spermatozoa dalam
eksperimen ini daripada metode Baecchi.

Pemeriksaan buatan, relevan secara forensik, sampel 'tiruan' menunjukkan bahwa SPERM HY-
LITERTM dapat membedakan antara (1) manusia dan (2) anjing, kuda, babi atau spermatozoa
banteng (Tabel 3). Ini dapat, secara teori, juga dapat dicapai dengan metode Baecchi oleh penyelidik
terlatih - tetapi itu tidak berhasil di laboratorium kami (Tabel 3). Miller dkk. [17] menunjukkan bahwa
antibodi SPERM HY-LITERTM tidak bereaksi dengan air mani dari spesies umum atau dengan
jaringan manusia lainnya yang mungkin ditemukan dalam bukti kekerasan seksual. Hasil ini
mendukung pendapat bahwa SPERM HY-LITERTM menunjukkan spesifitas lebih tinggi daripada
metode Baecchi. Perlu dicatat bahwa, jika perlu untuk membedakan antara spermatozoa manusia dan
non-manusia dalam penyelidikan, teknik selain SPERM HY-LITERTM harus digunakan.

Hasil pemeriksaan sejumlah kecil kasus kekerasan seksual yang terpilih (Tabel 4) konsisten dengan
data yang disajikan pada Tabel 2, karena semua perbedaan antara kedua metode tersebut adalah
spermatozoa dapat dideteksi oleh SPERM HYLITERTM dalam sampel yang menunjukkan negatif.
hasil dengan teknik Baecchi. Dalam beberapa sampel, keberadaan sel vagina, dubur, dan / atau epitel
berlebihan membuat analisis mikroskopis dengan metode Baecchi sulit dan memakan waktu.
Perbandingan antara hasil yang diperoleh dalam periode satu tahun (2009) dengan metode SPERM
HY-LITERTM dan tahun sebelumnya (2008) dengan metode Baecchi menunjukkan bahwa tingkat
hasil positif dari metode SPERM HY-LITERTM sedikit lebih tinggi dari Baecchi's metode (32,1%
berbanding 27,9%). Seperti yang disebutkan sebelumnya, bagaimanapun, kedua nilai ini tidak dapat
dibandingkan secara statistik. Identifikasi spermatozoa dikaitkan dengan tingkat keberhasilan profil
autosomal STR yang sedikit lebih tinggi (SEfiler Plus) dengan sampel positif SPERM HYLITER
(87,3% dari kasus) daripada yang diperoleh dengan sampel yang positif dengan metode Baecchi
(82,7%, P = 0,083), tetapi hasil ini tidak signifikan secara statistik.

SPERM HY-LITERTM juga tampaknya memfasilitasi identifikasi spermatozoa dalam sampel yang
menantang. Sampel yang terdegradasi dan dikompromikan, mis. dari Tabel 2 dan 4, mudah diperiksa
dan hasilnya lebih sering bahwa metode SPERM HYLITERTM mendeteksi sperma ketika metode
Baecchi tidak. Sekali lagi, probabilitas marjinal dari uji statistik (ts = 5,250, df = 1, P = 0,06) adalah
sugestif tetapi tidak signifikan pada tingkat 0,05, dan eksperimen lebih lanjut diperlukan sebelum
kesimpulan definitif dapat dibuat. Bahan biologis dari jenis-jenis sampel ini sering dikaitkan dengan
flora ragi dan bakteri yang berlimpah yang mungkin menjadi tantangan bagi para peneliti yang kurang
berpengalaman ketika metode Baecchi digunakan.

Penggunaan selektif dari filter FITC dan DAPI meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas metode
SPERM HY-LITERTM sementara menunjukkan kemampuan untuk membedakan spermatozoa
bernoda dan sel-sel lain seperti sel vagina, bakteri, ragi, dll. Pengikatan antibodi fluorophore-
terkonjugasi non spesifik adalah tidak diamati dan rasio signal-to noise yang menguntungkan
membuatnya mudah untuk membedakan spermatozoa dalam kasus-kasus rutin.

Perbandingan antara hasil mikroskopik dan aktivitas ACP menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas
yang terbatas dari pengujian ACP. Hanya sekitar 60% dari sampel yang ditunjukkan pada Tabel 5
yang positif dengan metode baik juga positif untuk ACP, dan tidak ada hubungan yang signifikan
antara ACP +/- hasil dan metode (X2 = 0,339, df = 1, P = 0,561. Namun, aktivitas asam fosfatase
menurun pada sampel vagina dari waktu ke waktu [16] dan tes ACP umumnya tidak dapat diandalkan
lebih dari 48 jam. Sampel kekerasan seksual yang dinyatakan dalam Tabel 5 dikumpulkan selama
rentang waktu dan termasuk sampel yang dikumpulkan jauh di luar 48 jam setelah dugaan
penyerangan, ACP secara tradisional telah digunakan sebagai alat skrining untuk menentukan lokasi
atau keberadaan cairan mani pada item yang lebih besar dan swab yang intim dari kasus kekerasan
seksual sebelum analisis mikroskopik [7,19-22] .Memberikan hasil dari set sampel ini, tidak akan
disarankan untuk menggunakan hasil skrining ACP negatif sebagai '' titik berhenti '' dalam
penyelidikan penyerangan seksual, karena sekitar 40% dari tes ACP kami negatif meskipun
spermatozoa adalah pra Menyadari bahwa metode skrining yang lebih sensitif untuk cairan mani ada,
seperti tes untuk antigen spesifik prostat (PSA), kami telah mengambil ini menjadi pertimbangan dan
menggantikan tes komersial untuk PSA untuk penyelidikan ACP dari penyeka vagina dan item yang
dipilih, sementara kami masih menggunakan pengujian untuk ACP dari tekstil yang lebih besar, dll.

Departemen kami telah menggunakan metode Baecchi selama bertahun-tahun. Namun, metode
SPERM HY-LITERTM jelas menawarkan keuntungan karena pewarnaan spesifik spermatozoa. Oleh
karena itu, kami telah memutuskan untuk memperkenalkan metode SPERM HY-LITERTM dalam
pemeriksaan rutin bukti pelecehan seksual

5. Kesimpulan

Hasil validasi internal kit SPERM HYLITERTM untuk identifikasi mikroskopis sperma manusia
menunjukkan bahwa SPERM HY-LITERTM secara umum lebih efektif daripada pewarnaan
histologis tradisional dengan metode Baecchi. SPERM HY-LITERTM juga terbukti spesifik untuk
spermatozoa manusia sedangkan metode Baecchi tidak membedakan antara kontributor sperma
manusia dan non-manusia. Kekhususan dan efektivitas SPERM HY-LITERTM yang lebih tinggi
memungkinkan untuk penyaringan visual yang lebih cepat dan lebih handal dari bahan bukti untuk
spermatozoa.

Ucapan terima kasih

Pekerjaan ini dibiayai oleh Bagian Genetika Forensik, Departemen Kedokteran Forensik, Fakultas
Kesehatan dan Ilmu Kedokteran, Universitas Kopenhagen. Kami berterima kasih kepada Dr. Nikolaj
Friis Hansen atas bantuannya dalam koleksi sampel, donor sampel, Ms. Helle Byrgesen, Ms. Rikke
Larsen, Susanne Solstad, dan Ms. Marisa Fahrner untuk bantuan teknis.