Universidad de Guayaquil

Facultad de Ingeniería Química

Carrera de Ingeniería Química

Materia:
Laboratorio de Microbiología

Docente:
Ing. Wilfrido Terán

Estudiante:
María Cristina Morales Bustamante

Curso:
Cuarto Semestre Paralelo “1” “A”

Tema:
Práctica #1 Segundo Parcial
Ensayo de DPPH

Ciclo II
2017-2018
 I) OBJETIVO:

Determinar la capacidad antioxidante de diferentes sustancias por medio de una práctica

experimental con el fin de conocer el porcentaje de inhibición.

II) INTRODUCCIÓN TEÓRICA:

DPPH es una abreviatura par aun químico orgánico el 2,2 – di fenil -1 –picrilhidrazilo.
Es un polvo de color oscuro cristalino compuesto de moléculas de radicales libres
estables. DPPH tiene dos aplicaciones mayoritarias, en investigación de laboratorio: sirve
para monitorear las reacciones químicas que poseen radicales libres, más notablemente
en ensayos de antioxidantes y otra es como estándar para la posición y la intensidad de
señales paramagnéticas de resonancia.

PROPIEDADES Y APLICACIONES

DPPH tiene algunas formas cristalinas que difieren por un enrejado de simetría y punto
de derretimiento. El polvo comercial es una mezcla de fases que se derrite a 130 ᵒ c. DPPH
– I (p.d 106 ᵒ c).

DPPH es un buen conocido radical y un recolector trampa de otros radicales.

Entonces. La reducción de una reacción química cuando se adiciona el DPPH es usada

como indicador de la naturaleza de los radicales de esa reacción. Debido a una fuerte
absorción centrada a unos 520 nm, el radical DPPH tiene un color violeta oscuro en
solución y se decolora o se torna amarillo claro cuando se neutraliza. Esta propiedad le
permite el monitoreo visual de la reacción. Y el número inicial de radicales puede ser
medido desde el cambio de la absorción óptica a 520 nm o en una señal EPR (electrón
paramagnetic resonance por sus siglas en inglés) del DPPH.

Debido a que el DPPH es un eficiente recolector de radicales, también es un fuerte

inhibidor de radicales mediante polimerización.

Inhibición de la cadena del polímero R por DPPH

Como un estable y bien caracterizado radial, DPPH es un tradicional y talvez el más

popular estándar en su posición y la intensidad de su resonancia del electrón
paramagnético el número de radicales para una preparación fresca puede ser determinada
por longitud de onda y del factor de separación de EPR para DPPH esta calibrado a gt =
2.0036. La señal del DPPH es conveniente por lo que es normalmente concentrado en una
línea simple, cuya intensidad aumenta linealmente con la raíz cuadrada del rango de las
microondas. La naturaleza de dilución del radical DPPH (uno desemparejado en giro por
41 átomos) resulta en una relativamente pequeño ancho de línea (1.5 – 4.7 Gauss). El
ancho de línea puede sin embargo aumentar si moléculas solventes se mantienen en el
cristal y si mediciones son realizadas con una disposición de alta frecuencia de EPR (200
GHz), donde la ligera g-anisotropía de DPPH se vuelve detectable

Determinar la capacidad antioxidante de una fruta, de diferentes partes, entre ellas:

Pulpa
Semilla
Cascara

III) MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivos. -
Solución de DPPH 0.1 mili molar (0.0198 g de DPPH / 500 ml de alcohol
metílico)
Alcohol metílico
Muestra
Materiales.-
Matraz aforado de 10 ml (Volumétrico)
Micro pipetas
Pipetas volumétricas (1, 2, 3, 4,5) ml
Matraz Erlenmeyer
Embudo
Papel filtro
Centrifuga
Frascos para almacenamiento
Espectrofotómetro
Computadora con programa DATALYSE

IV) PROCESO EXPERIMENTAL

Conexión de espectrofotómetro a computadora

Encender el espectrofotómetro
Conectar el espectrofotómetro con la computadora

Iniciar el programa DATALYSE

Buscar la compatibilidad del programa con el espectrofotómetro: Dar clic en el menú DEVICE

Dar clic en el botón CHOOSE DEVICE, y aparecerá un menú:

Luego de aparecer dicho menú buscar GENESIS 10 VIS AND UV/VIS y dar clic en OK

Medición de estándares y preparación de reactivos

Una vez conectado el espectrofotómetro en la pc y tener listo el equipo para la calibración se
procede a preparar las diferentes diluciones de los reactivos que participaran en la calibración
del espectrofotómetro, el mismo que se detalla a continuación:
En cuatro matraces volumétricos de 10 ml colocamos deferentes cantidades de solución de
DPPH y todas ellas se enrazaran con 10 ml de etanol
Matraz
Vol.
Node DPPH /vol. Etanol ml
1 1 /10
2 2 / 10
3 4 / 10
4 5 / 10
Luego de preparadas las diluciones procedemos a colocarlas en las celdas del
espectrofotómetro

Cubeta No. Dilución a colocar

B Etanol
1 1 / 10
2 2 / 10
3 4 / 10
4 5 / 10
5 DPPH

Una vez colocadas las celdas en los cubículos respectivos cerramos la tapa del
espectrofotómetro y presionamos el botón medir estándares

0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

En el programa DATALYSE hacer clic en el botón GENESIS 10 y luego en el botón

MEASURE ONE WAVELENGTH
Una vez dado clic aparecerá el siguiente menú

Configurar la ventana para las opciones

Cell number 0
Wavelength 517
No. Of meas. 10
Time/ meas. 0
Presionar OK y dar clic en la opción STAR

Automáticamente el espectrofotómetro se calibrara formando una línea recta en el eje de las X

Luego dar clic en la opción ZERO VALUE

Medición de la capacidad antioxidante de la muestra

Colocar en una cubeta 2 ml de solución DPPH y la dosis de extracto a analizar
Colocar la cubeta en la celda No. 1 del espectrofotómetro
En el programa DATALYSE hacer clic en el botón GENESIS 10 y luego en el botón
MEASURE ONE WAVELENGTH

Una vez dado clic aparecerá el siguiente menú

Configurar el menú para los siguientes parámetros

CELL NUMBER 1
WAVWLENGTH 517
No. OF MEAS 30
TIME/meas 30

Luego presionar OK seguido de la opción STAR

Automáticamente el espectrofotómetro empezara a realizar la curva de medición en un tiempo

estimado de 50 minutos
El objetivo es tener una curva “estabilizada” que significa que el grafico se forma una línea
recta de lo contrario la gráfica no está estabilizada, y se realizara un tanteo de la dosis a analizar
hasta estabilizar la curva
 Estabilizada

No estabilizada

V) CÁLCULOS
Muestra: Harina de Quinua de Control
no. conc. Mg/lt abs 517 nm
1 0,1 0,01
2 0,2 0,054
3 0,4 0,112
4 0,5 0,145
5 1 1,182

abs 517 nm
1.4
1.2
1
0.8
0.6 abs 517 nm
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
t/s ABS
0,063 1,026
ABS
30,001 0,965
60,054 0,966 1.03

90,007 0,986 1.02

120,005 0,985 1.01
150,011 0,985
1
180,018 0,986
210,018 0,985 0.99

240,003 0,984 0.98

270,043 0,984 0.97
300,01 0,983
0.96
330,053 0,984
360,02 0,982 0.95
0 200 400 600 800 1000
390,044 0,983
420,035 0,982
450,06 0,982
480,019 0,981
510,03 0,981
540,044 0,981
570,05 0,983
600,041 0,981
630,035 0,981
660,039 0,981
690,05 0,981
720,056 0,982
750,052 0,981
780,05 0,984
810,005 0,985
840,024 0,984
870,037 0,984

𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 1.026−0.984

% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼𝑂𝑁 = 𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑋 100 = 1.026
𝑋 100 =4.09356%

Muestra #2: Maqui

no. conc. Mg/lt abs 517 nm
1 0,1 0,01
2 0,2 0,054
3 0,4 0,112
4 0,5 0,145
5 1 1,182
 abs 517 nm
1.4
1.2
1
0.8
0.6 abs 517 nm
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5

t/s ABS
0,062 0,652
30,003 0,147
60,027 0,139
90,02 0,139
120,021 0,137
150,032 0,141
180,034 0,143
210,049 0,154
240,051 0,163
270,005 0,165
300,02 0,167
330,033 0,165
360,025 0,167
390,022 0,163
420,022 0,16
450,02 0,153 ABS
480,024 0,152 0.7
510,038 0,142 0.6
540,039 0,14
570,052 0,14 0.5

600,055 0,138 0.4

630,059 0,136
0.3
660 0,134
690,023 0,142 0.2
720,03 0,129
0.1
750,03 0,137
780,024 0,134 0
0 200 400 600 800 1000
810,033 0,123
840,029 0,12
870,031 0,121
 𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 0.652−0.121
% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼𝑂𝑁 = 𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑋 100 = 0.652
𝑋 100 = 81.441%

Muestra 3: Harina de Quinoa Jerminada. Lote 1

no. conc. Mg/lt abs 517 nm
1 0,1 0,01
2 0,2 0,054
3 0,4 0,112
4 0,5 0,145
5 1 1,182

abs 517 nm
1.4
1.2
1
0.8
0.6 abs 517 nm
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5

t/s ABS
0,062 0,579
30,052 0,501
60,011 0,469
90,039 0,411
120,058 0,357
150,06 0,352
180,036 0,35
210,005 0,347
240,039 0,345
270,014 0,345
300,018 0,343
330,03 0,343
360,026 0,34
390,028 0,34
420,018 0,34
450,024 0,339
480,02 0,338
510,018 0,338
 0 200 400 600 800 1000

540,022 0,337
570,031 0,337
600,044 0,336
630,059 0,336
660,059 0,336
690,01 0,335
720,03 0,335
750,045 0,335
780,035 0,335
810,043 0,334
840,052 0,334
870,056 0,334

𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 0.579−0.334

% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼𝑂𝑁 = 𝑋 100 𝑋 100 =42.314%
𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 0.579

Muestra 4: Harina de Quinua Germinada. Lote 2

no. conc. Mg/lt abs 517 nm
abs 517 nm
1 0,1 0,01
1.5
2 0,2 0,054
3 0,4 0,112
1
4 0,5 0,145
abs 517 nm
5 1 1,182 0.5

0
0 0.5 1 1.5
t/s ABS
0,062 1,209
30,013 0,973
60,01 0,964
90,032 0,942
120,035 0,923
150 0,919
180 0,91 ABS
210,004 0,903 1.4
240,057 0,897
270,004 0,893 1.2

300,007 0,892 1
330,014 0,889
0.8
360,014 0,888
390,053 0,883 0.6
420,061 0,881
0.4
450,013 0,879
480,017 0,876 0.2
510,021 0,876 0
0 200 400 600 800 1000
 540,003 0,875
570,002 0,872
600,028 0,871
630,042 0,87
660,047 0,871
690,055 0,869
720,008 0,868
750,018 0,866
780,036 0,867
810,044 0,866
840,02 0,865
870,043 0,864

𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 1.209−0.864

% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼𝑂𝑁 = 𝑋 100 𝑋 100 =28.5359%
𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 1.209

Muestra 5: Chocolate
ABS 517 NM
no. conc. Mg/lt abs 517 nm
1 0,1 0,01 abs 517 nm
2 0,2 0,054 1.5
3 0,4 0,112
4 0,5 0,145 1

5 1 1,182
0.5

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
t/s Abs
30,049 1,278
60,048 1,007
90,05 0,891
120,049 0,776
150,048 0,729
180,049 0,675
210,05 0,623
240,049 0,579
270,049 0,535
300,047 0,502
330,049 0,472
360,049 0,447
390,049 0,425
420,05 0,396
450,049 0,38
480,049 0,36
510,012 0,348
540,006 0,332
 abs
1.4
570,01 0,319
600,016 0,306 1.2
630,016 0,296
1
660,016 0,286
690,016 0,273 0.8
720,017 0,278
0.6
750,017 0,259
780,016 0,253 0.4
810,017 0,248 0.2
840,016 0,239
870,039 0,235 0
0 200 400 600 800 1000
900,058 0,232

𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 1.278−0.232

% 𝐼𝑁𝐻𝐼𝐵𝐼𝐶𝐼𝑂𝑁 = 𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑋 100 = 1.278
𝑋 100 = 81.846%

VI) CONCLUSIONES
 Se llega a concluir que el chocolate y el Maqui tiene mayor número de
antioxidantes y por tal motivo su grafica va a ser diferente a las otras sustancias.
 Se debe colocar de forma muy veloz el DPPH en la cubeta dentro del
espectrofotómetro y cerrarlo inmediatamente caso contrario aumentara los
porcentajes de error.
 El DPPH sirve para saber los antioxidantes de las diferentes sustancias y se
hicieron 30 muestras con una duración de 30 segundos cada una.
 Se utilizó un volumen de 100 μ para realizar todo el proceso experimental.
VII) RECOMENDACIONES
 Utilizar guantes al momento de usar el espectrofotómetro.
 Tener cuidado con el metanol especialmente en los ojos.
 Mantener al DPPH en el congelador y solo utilizarlo cuando se lo colocara en
la muestra y después volverlo a colocar en el congelador.
 Utilizar correctamente la micropipeta