Manual de Guías Laboratorio 2017 - 2

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA

Laboratorio 1: COLECCIÓN DE ESPECÍMENES VEGETALES Y VISITA HERBARIO UNIVERSIDAD ICESI

OBJETIVOS:


Identificar las etapas involucradas en la elaboración de una colección de herbario
 Reconocer las etapas del proceso de creación de una colección de herbario desde el

secado, tratamiento y procesado para almacenaje.
 Identificar y diferenciar las estructuras que hacen parte de la morfología de las plantas.

Esta práctica de laboratorio no tendrá sección experimental en laboratorio, se realizará
posteriormente a las indicaciones del profesor quien evaluará su preparación y lectura antes de
proceder con la visita al herbario.

1. MARCO TEÓRICO

Colección de material vegetal para herbario
Un herbario es una colección científica de plantas secas, debidamente preparadas para garantizar su
conservación de manera indefinida. Sobre el material depositado en los herbarios se basa una parte
importante de la investigación botánica, sobre todo en taxonomía, aunque también es útil para
estudios florísticos, biogeográficos, químicos e incluso moleculares.
El material del herbario es el testimonio de las citas de plantas, de las descripciones de las mismas y
de los materiales utilizados para proponer nuevos táxones. El tipo de una planta (el material sobre el
que se basa un nombre nuevo) es, en la mayoría de los casos, una planta seca, depositada y
conservada en un herbario.
Colección de ejemplares

Una vez en el lugar de colecta, se procede a la recolección de los especímenes. Es conveniente
seleccionar materiales vigorosos, evitando que estén enfermos, dañados por insectos o comidos por
otros animales. Los especímenes deben ser típicos, es decir representativos de la especie, pero
también deben colectarse plantas que exhiban todo el rango de variación de la población. Raíces,
bulbos o cualquier parte subterránea de la planta deben ser cuidadosamente extraídas, tratando de
remover la tierra que queda adherida. Es preferible colectar especímenes con flores y en frutos, dado
que usualmente son necesarios para la futura determinación del ejemplar. Es siempre conveniente
colectar duplicados del material (por ejemplo, si es un arbusto se colectan varias ramas), excepto en

1
el caso de plantas raras o protegidas, para que luego se pueda realizar intercambio de ejemplares
con otros herbarios o para enviar el ejemplar como donación a algún especialista que lo identifique.

Documentación

Una vez coleccionadas las plantas en el campo, se confecciona una etiqueta, donde se consigna la
mayor cantidad de datos posibles del ejemplar y del sitio de recolección, tales como: nombre
científico, nombre vulgar, familia a la que pertenece, localidad de recolección (país, provincia,
departamento, lugar exacto), latitud, longitud, fecha, colector, datos de la vegetación circundante,
datos del lugar en el que crece, color de la planta, flor y fruto, olor, insectos relacionados con la
planta. Además, se registra todo otro dato que el coleccionista considere de relevancia y que no
pueden ser observados con posterioridad, como por ejemplo, el tamaño y aspecto de la planta
entera (si se cogió sólo un trozo), el hábito (si es rastrera, trepadora, bulbosa), su abundancia
relativa, el estado fenológico (si tiene hojas para las plantas de hoja caduca, estado de la floración,
fructificación, etc.), datos de uso y nombres vulgares obtenidos de la gente del lugar

Prensado
Para preparar una planta colectada a campo y destinada al herbario es necesario secarla y
deshidratarla bajo presión lo más rápidamente posible. Este proceso se lleva a cabo mediante el
prensado. Una prensa de campo sencilla consta de dos tableros sólidos unidos por tornillos o correas,
entre los que se introducen los pliegos de papel que contienen las plantas, separados por
almohadillas absorbentes. Las plantas se estiran y acomodan sobre la hoja de papel en el que se van
a prensar, procurando que sus órganos tengan una disposición semejante a la que tenían en vivo. Si
el ejemplar es grande se puede doblar sobre el pliego mientras está fresco. Se empieza por colocar la
parte superior de la planta en paralelo al eje mayor del rectángulo de papel. Llegando a la base de
éste se dobla el tallo de la planta, en un ángulo agudo, de modo de llegar arriba del papel otra vez
con el tallo, y se repite de nuevo el doblés, cuantas veces sea necesario. Este plegado en zigzag es el
más conveniente para que las plantas no se rompan, se ajusten al tamaño del papel y no sobresalgan
por los bordes. Las hojas de las plantas deben estar siempre estiradas, unas mostrando el haz y otras
el envés, para apreciar los caracteres del indumento y de la nerviación por ambas caras. Las hojas de
papel que contengan los ejemplares dispuestos, se separan sobre el papel con almohadillas
absorbentes, o bien un grupo de hojas de periódicos (ver figura 1). De este modo, no es necesario
sacar las plantas de los pliegos donde tan cuidadosamente se han colocado, sino que se reemplazan
las almohadillas húmedas por otras secas cuando sea necesario.

2

Figura 1. Prensado de material vegetal. En orden prensa, lámina de aluminio corrugada que permita
el flujo de los vapores de agua y aire caliente, cartón, periódico y finalmente el material vegetal a ser
prensado
Etiquetado
Una vez que las plantas están prensadas, secas y determinadas se procede a guardarlas en el
herbario. Cada ejemplar debe llevar una leyenda en una etiqueta en la que consten los siguientes
datos: nombre de la especie, datos sobre las preferencias ecológicas del espécimen, lugar donde se
recogió, especificando sus características topográficas, altitud, coordenadas UTM, ciudad o pueblo
más cercano, y provincia; fecha de la herborización; nombre del recolector precedido de legit (se
abrevia leg.) y número de orden de la planta en su inventario; nombre del responsable de la
identificación de la especie (se antepone determinavit (se abrevia det.) al nombre del botánico que
hizo la identificación.
Conservación y montaje
Uno de los métodos para conservar los ejemplares de herbario es el de congelar los especímenes
secos durante 4 días a ‐32 °C de modo tal de matar todos los insectos, larvas y depredadores que
pudiesen destruirlas. El montaje consiste en fijar el ejemplar o ejemplares en un soporte definitivo
junto con su etiqueta. Hay diversos métodos. El más sencillo consiste en fijar las plantas mediante
tiritas de adhesivo de tela (esparadrapo o similar), sobre una cartulina o papel grueso, de color
blanco y de tamaño estándar internacional (23,5cm x 39cm). En primer lugar se pega la etiqueta en el
ángulo inferior derecho del pliego. Luego se dispone la planta (o las plantas) en una posición lo más
natural posible y se sujetan por aquellas partes que no importe tapar, nunca por la base de las hojas
o tocando las flores, salvo que éstas sean muy grandes, sino por el centro de los entrenudos,
pedicelos y pedúnculos. Cuando las plantas son muy pequeñas se montan una o dos y el resto se
mete en un sobre de papel, que se fijará con cola cerca del centro de la cartulina. Las partes que se
hayan desprendido o se puedan desprender, como flores sueltas, hojas o semillas, se meten también
en un sobre de papel que se pegará preferentemente cerca del ángulo superior derecho del pliego. El

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ejemplar así montado se guarda en un pliego doble de papel fino (denominado camisa), en cuyo
borde inferior se anotará a lápiz la familia y la especie (ver figura 2)
Los grandes herbarios tienen miles de ejemplares guardados convenientemente en cajas y armarios.
Figura 2. Colección depositada en él herbario del Jardín botánico de Missouri.

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Almacenamiento y disposición
Los pliegos deben resguardarse del polvo, de la humedad, de la luz directa y de los insectos. A los
ejemplares se les otorga un número de ingreso en la colección, se protege cada pliego con una
camisa de papel consistente, y todos los pliegos de una misma subespecie, especie, sección o género,
se guardan entre dos fuertes cartones que se atan con una cinta. Uno o varios paquetes de pliegos,
dependiendo de su volumen, se guardan en cajas de cartón con el contenido debidamente
identificado en lugar accesible y fácil de leer. Éstas a su vez se colocan en un armario metálico de
cierre hermético que permiten almacenarlas en gran cantidad, en un mínimo espacio y a humedad
constante. Asimismo, el cierre hermético impide la infestación de los materiales del herbario por
insectos, los que podrían acabar en poco tiempo con todos los ejemplares.
Esta sección será discutida con el profesor en la visita guiada al herbario ICESI.
Morfología general de las plantas

Figura 3. Mofología general de las plantas. Figura 4. Estructura de la hoja.

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Figura 5. Morfología foliar.
Actividad extramural.
 Visita al HERBARIO Universidad ICESI
 Recorrido por el campus universitario, reconocimiento de la flora universitaria. Se propone
seleccionar por pareja de laboratorio tres (3) especies que tengan potencial uso
fitofarmacológico, realizar descripción morfológica y química.
6 BIBLIOGRAFIA

 Gattuso, M.A., Gattuso, S.J. Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas en
polvo, UNR Editora, Rosario, 1999..
 Bruneton J. Farmacognosia. Ed. Acribia S.A. 2a edición. Zaragoza (España). 2001
 Trease and Evans.Farmacognosia. 13 Edición.Bailliere Tindall.Mexico.1989.

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Laboratorio 2: RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

OBJETIVO:

 Identificar y clasificar diversos metabolitos secundarios presentes en especies vegetales,

mediante pruebas químicas de coloración y/o precipitación.

1. MARCO TEÓRICO

Los metabolitos secundarios de las plantas constituyen aquellos compuestos químicos que cumplen
funciones no esenciales en ellas, debido a que no intervienen en su metabolismo primario. Estas
sustancias cumplen funciones específicas como atracción de polinizadores, eliminación de
compuestos tóxicos, mecanismos de defensa contra plagas o insectos, hormonas para el crecimiento
vegetal y en muchos casos aún se desconoce la razón por la cual la planta los produce.
A pesar de desconocer muchas de las funciones de los metabolitos secundarios, el interés científico
se ha incrementado vertiginosamente en el último siglo. El estudio de estas sustancias fue iniciado
por químicos orgánicos del siglo XIX y de principios del siglo XX, que estaban interesados en estas
sustancias por su importancia como drogas medicinales, venenos, saborizantes, pegamentos, aceites,
ceras, y otros materiales utilizados en la industria. De hecho, el estudio de los metabolitos
secundarios de las plantas estimuló el desarrollo de las técnicas de separación, la espectroscopia
para elucidar su estructura, y metodologías de síntesis que hoy constituyen el fundamento de la
química orgánica contemporánea.
Los metabolitos secundarios de las plantas pueden dividirse en tres grandes grupos sin tener en
cuenta en el origen biosintético como terpenoides, compuestos fenólicos y compuestos nitrogenados
ó alcaloides.
Sobre el extracto de algunas plantas seleccionadas, realizaremos pruebas químicas cualitativas de
coloración y/o precipitación, para determinar la presencia de los siguientes metabolitos secundarios:
# METABOLITO A IDENTIFICAR MATERIAL VEGETAL
1 Alcaloides Hojas de Catharanthus roseus, Erythroxylum coca.

1
2 Esteroides y/o Triterpenos Semillas de Glycine max, aceite de oliva, raíces de Taraxacum officinale.
3 Saponinas fruto de Solanum quitoense, cristales de Aloe vera
4 Taninos Hojas de Plantago major, hojas de Psidium guajava.
5 Flavonoides Hojas de Garciania madruno y flores de Sambucus nigra
6 Antocianinas Hojas de Brassica oleracea var. capitata
7 Lactonas (α,β‐insaturadas) Hojas de Nerium oleander, hojas de Thevetia peruviana
8 Quinonas Rizomas de Rheum officinale, Rhamnus purshiana
9 Cumarinas Corteza de Brunfelsia uniflora, frutos de Aesculus hippocastanum.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA
2.1 Normas de seguridad
El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.
2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo
 Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.
2.3 Manejo de Residuos químicos
Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos
generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:
1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están
debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y
potencialmente peligrosas.
No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la práctica. Si
tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le indicará la forma
correcta de hacerlo.
3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES

2
Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM Cantidad Unidades
Cartuchos de SPE C18 de 3 mL
5
Mortero con pistilo 1
Beakers de 100 mL 3
Beakers de 250 mL 3
Erlenmeyers de 50 mL 3
Varilla de vidrio 1
Soporte universal 2
Pinza mediana con nuez 2
Erlenmeyer con desprendimiento lateral de 250 mL con tapón plástico 2
Tubos de ensayo 15 mL 20
Gradilla 1
Papel de filtro 10 cm diámetro 3
Pipetas paster plásticas 5
Probeta de 50 mL 1
Pipetas de 1,2 y 5 mL 1
Espátula cuchara 1
Placas cromatográficas de sílica‐gel GF 254 en base aluminio de Merck 2
Capilares volumétricos para cromatografía planar TLC (entregados por
3
el profesor)
Pinzas para tubos de ensayo 2
Frasco lavador 1
Cinta de enmascarar 1
Algodón 1 bolsa
Papel craft 2 m
Tijeras 1

3.3 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
(los reactivos que tienen un asterisco pueden ser entregados por laboratorio o son soluciones que se
preparan preferiblemente por el almacén y que son usados durante todo el semestre)

Reactivos Cantidad Unidades
*Nitrógeno líquido 1 L
*HCl 37% 100 mL
HCl 0,5 N 50 mL
*Tiocinato de Cobalto 1 g
Hexano 500 mL
Ácido 3,5‐dinitrobenzóico 1 g
Etanol 95% 400 mL
Etanol 70% 400 mL
Rutina (flavonoide) 100 mg
*Quercetina (flavonoide) 100 mg

3
Diclorometano 800 mL
Cloroformo 100 mL
Sulfato de Sodio Anhidro 50 g
*Anhídrido acético 10 mL
*Ácido sulfúrico concentrado 100 mL
Ácido sulfúrico 2 mL
0% 100
Solución acuosa tricloruro férrico 10% 200 mL
Reactivo de Gelatina‐sal 10 g
Ácido acético glacial 100 mL
*Magnesio en limaduras 2 g
Acetato de etilo 500 mL
Agua oxigenada 50 mL
Tolueno 20 mL
*Subnitrato de bismuto 1 g
Yoduro de potasio 1 g
2‐aminoetil difenilborinato (reactivo mg
NP/PEG) 100
PEG 4000 1 g
NaCl 100 g
Hidróxido de sodio 5% en agua
Hidróxido de amonio 2% en agua

3.3 MATERIAL VEGETAL

Tabla 3. Listado de material vegetal necesario para el desarrollo de la práctica por pareja.

Reactivos (de cada planta en la lista) Cantidad (c/a) unidades
Hojas de Catharanthus roseus, Erythroxylum coca. 5 g
Semillas de Glycine max, aceite de oliva, raíces de Taraxacum officinale 5 g
fruto de Solanum quitoense y cristales de Aloe vera 5 g
Hojas de Plantago major, hojas de Psidium guajava. 5 g
Hojas de Garciania madruno y flores de Sambucus nigra 5 g
Hojas de Brassica oleracea var. capitata 5 g
Hojas de Nerium oleander, hojas de Thevetia peruviana 5 g
Rizomas de Rheum officinale, Rhamnus purshiana 5 g
Corteza de Brunfelsia uniflora, frutos de Aesculus hippocastanum. 5 g

4
3.4 EQUIPOS

Tabla 4. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Equipos Cantidad
Manifold de 10 puestos para extracción
en fase sólida (incluir bomba de vacío 1
con su respectiva trampa para solventes)
Baño María 1
Plancha de calentamiento 1
Cámara UV 1
Balanza semi‐analítica 1
Ultrasonido de 120 mHz 1
Cámara de elución vertical TLC 1

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Los materiales vegetales serán empleados con un procedimiento de extracción especificado en cada
prueba química. Tenga en cuenta cual es la planta respectiva para la prueba sin que se incurra en
equivocaciones porque puede reportar un resultado negativo cuando al resto de equipos obtiene un
resultado contrario.
4.1. Identificación de alcaloides
Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus respectivas sales
mediante la adición de un ácido diluido y formar precipitados al adicionar los llamados reactivos para
alcaloides. En esta práctica utilizaremos los reactivos de Scott, Mayer y Dragendorff.
Tome aproximadamente 5 g del material vegetal fresco, deposítelos en un mortero y triture
acompañado de nitrógeno líquido. Coloque el material triturado en un beaker o erlenmeyer.
Adicione un volumen suficiente de ácido clorhídrico al 0.5 N que cubra la muestra. Lleve al
ultrasonido (temperatura de 40°C) durante 5 minutos, enfrié y filtre.
Adicione en 4 tubos de ensayo (previamente rotulados con el nombre de cada reactivo a adicionar) 1
ml del filtrado. Agregue a cada tubo, 2 gotas de los reactivos de: Dragendorff, Mayer y Scott. Si se
observa turbidez o precipitado se considera que la muestra contiene alcaloides (Prueba presuntiva),
la prueba de Scott da coloración azul y es exclusiva para alcaloides tropánicos.
4.2. Reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides
Tome 5 g de la muestra vegetal seca y molida, colóquela en un beaker limpio y seco y adicione
diclorometano en cantidad suficiente que cubra la muestra, lleve al ultrasonido por 5 minutos
(NOTA: para asistir la extracción con diclorometano, el baño del ultrasonido debe estar a
temperatura ambiente). Adicione una pequeña cantidad de sulfato de sodio anhidro, para retirar la
humedad que pueda existir y filtre. El filtrado orgánico dividirlo en 4 tubos de ensayo con tapa,
agregar 2 gotas de anhídrido acético a cada tubo y una gota de ácido sulfúrico con pipeta Pasteur a
solo 3 de los tubos para que uno de ellos sirva como control negativo. Una coloración azul o verde =
esteroides; rojo, rosado o violeta = triterpenos; amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados.
4.3. Reconocimiento de saponinas

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Las saponinas corresponden a un grupo de glicósidos solubles en agua que tiene la propiedad de
disminuir la tensión superficial del agua formando espuma y de hemolizar la sangre. Las saponinas se
hidrolizan en carbohidratos y en sapogeninas.
Método de espuma.
Tome aproximadamente 1 g del material vegetal fresco y macere en un mortero, adicione suficiente
cantidad de agua que cubra la muestra. Filtre a través de algodón estéril. Adicione 4 ml del filtrado a
un tubo de ensayo y agite vigorosamente durante un minuto. Si la altura de espuma es <5 mm: (‐), se
considera negativa, no contiene saponinas; alrededor de 5‐10 mm (+) argumenta un contenido
moderado; una altura >15 mm (+++), se le atribuye a un alto contenido de saponinas.
4.4. Reconocimiento de taninos
Los taninos constituyen sustancias de defensa contra los parásitos, se localizan en hojas, ramas y
debajo de la corteza.
Tome aproximadamente 5 g del material vegetal fresco, macere en un mortero hidratando la
muestra para facilitar el rompimiento de los tejidos. Coloque la muestra completamente macerada
en un beaker, adicione cantidad suficiente de agua para cubrir la muestra y sonique por 5 minutos a
40°C. Filtre en caliente y coloque 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Adicione una (1) gota de
solución de tricloruro férrico (FeCl3 al 10%). Si el color es verde oscuro sugiere la presencia de taninos
condensados y si es azul son taninos hidrolizables.
En un segundo tubo de ensayo adicione 1 mL del filtrado y agregue unas gotas del reactivo gelatina‐
sal. La presencia de turbidez o formación de precipitado es prueba positiva para taninos en la
muestra.
Las dos pruebas son necesarias para comprobar la presencia de taninos.
4.5. Reconocimiento de flavonoides, antocianinas y lactonas α,β‐insaturadas
Los flavonoides son compuestos polifenólicos los cuales tienen 15 carbonos representados en 2
anillos bencénicos unidos por una cadena lineal de tres carbonos.
Macere en un mortero aproximadamente 5 g del material vegetal (si el material colectado es fresco
puede asistir la maceración adicionando nitrógeno líquido, exceptuando las hojas de Brassica que no
lo requieren). Una vez macerado deposite el material en un beaker o erlenmeyer de volumen
pequeño y adicione suficiente cantidad de etanol para cubrir la muestra. Sonique a 40°C durante
cinco minutos, enfríe y filtre.
4.5.1.Procedimiento para eliminar interferencias en pruebas colorimétricas (exceptuando la

extracción a partir de hojas de Brassica)
Para las extracciones siguientes se deberá seguir este protocolo. Debido a que normalmente el
material vegetal es obtenido de las partes aéreas de plantas y que estas contienen altas cantidades
de clorofilas, observar los virajes de color es una tarea compleja. Por esta razón se deberá hacer uso
de una herramienta importante de tratamiento de muestra denominada extracción en fase sólida.
Con el apoyo del profesor y/o monitor del laboratorio, realice el montaje del manifold de 10 puestos
para extracción en fase sólida (solid phase extraction ‐SPE), tal como se observa en la figura 1. El
equipo debe tener una bomba de vacío para asistir el procedimiento con muestras que pudiesen ser
viscosas. Sin embargo, debe controlarse el vacío a una velocidad máxima de flujo de 1 gota por

6
segundo (para evitar daños en la bomba, debe también instalarse siempre una trampa en hielo que
evite que los solventes puedan terminar dentro de ella).

Figura 1. Montaje para extracción en fase sólida.
Todos los cartuchos de SPE deben ser sometidos a 4 pasos básicos que determinan el éxito del
procedimiento a realizar. Estas etapas no deben ser omitidas y siempre deberán ser realizadas por los
estudiantes.
1. Adicionar 2 mL de metanol por cada cartucho y permitir que el solvente pase a una velocidad
no superior a 1 gota por segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción solo cuando sea
necesario aumentar la velocidad de flujo a través del cartucho)
2. Una vez el cartucho se encuentre sin solvente, quitar el vacío y adicionar en cada cartucho 2
mL de agua tipo 1 y permitir que el solvente pase a una velocidad no superior a 1 gota por
segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción solo cuando sea necesario aumentar la
velocidad de flujo a través del cartucho)
3. Aplicar 2 mL del extracto con alto contenido de clorofilas y permitir que la muestra pase a
una velocidad no superior a 1 gota por segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción
solo cuando sea necesario aumentar la velocidad de flujo a través del cartucho)
4. Adicionar 2 mL de Metanol permitir que el solvente pase a través del cartucho a la misma
velocidad establecida anteriormente y recuperar en un vial nuevo y limpio. Este es el
extracto con el cual realizarán las pruebas de coloración
El extracto resaltado en rojo de la etapa 3 del procedimiento de SPE, es el obtenido en la extracción
del material vegetal respectivo, una vez se obtiene la muestra de la etapa 4 del protocolo de SPE,
proceder con las pruebas colorimétricas siguientes.
4.5.2. Ensayo para Flavonoides
La identificación cualitativa de polifenoles se realizará por medio de dos métodos diferentes, uno de
ellos se realizará sobre platos de cromatografía y el otro por colorimetría en tubos de ensayo. A
partir del extracto (obtenido después de SPE), realizar por duplicado dos platos de cromatografía

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planar en un sistema de solventes de acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético glacial: agua
(100:11:11:26). Se deben incluir dos carriles en la placa cromatográfica para Rutina y Quercetina
(soluciones estándar cada una de 50 ppm, estas soluciones las debe preparar un estudiante y los
cálculos deben ser reportados por todos los grupos en el cuaderno de laboratorio). Una vez corridas
la placas, llevar a luz UV a dos diferentes longitudes de onda (254‐365nm) para observar compuestos
fluorescentes, posteriormente utilizar el agente revelador FeCl3 al 10% y NP‐PEG. (ver figura 2 acerca
de cómo deben ser rotuladas las placas de cromatografía de cada material vegetal. Antes de
derivatizar con el reactivo, debe tomarse la foto a las 2 longitudes de onda de la cámara UV)
Figura 2. Esquema de los platos de TLC que deben ser elaborados por cada equipo de trabajo.
Para el método colorimétrico tomar 1 mL en un tubo de ensayo y adicionarle unas limaduras de
magnesio y por la pared del tubo, adicione lentamente dos gotas de HCl 37% (este procedimiento
debe ser dentro de la campana de extracción). Después de 5 minutos de pasada la reacción, tomarle
fotos al resultado final para cada material vegetal para el reporte de resultados en el cuaderno de
laboratorio.
4.5.3. Ensayo para antocianinas
Acordando con el profesor, un estudiante deberá preparar de a 100 mL de 4 soluciones acuosas
(correctamente rotuladas) a pH 2, 4, 7 y 9. En 4 tubos de ensayo adicione 2 ml del extracto y
posteriormente adicione en cada tubo de ensayo 2 mL de cada pH preparado previamente, de tal
manera que al finalizar cada equipo de trabajo deberá tener su extracto con 4 diferentes valores de
pH como se muestra en la figura 3. Se debe emplear el 5º tubo de ensayo como control de
reconocimiento de condiciones iniciales. Tomarles fotos a los resultados finales para preparación del
reporte en el cuaderno de laboratorio.

8

Figura 3. Cada equipo de trabajo deberá tener 4 tubos de ensayo correctamente rotulados.
4.5.3 lactonas α,β‐insaturadas
En 2 tubos de ensayo por planta, adicionar 1 mL del extracto obtenido de la SPE. Luego adicionar
solo a uno de los tubos de ensayo 1 mL del reactivo de Kedde (ácido 3 dinitrobenzóico al 3% en
etanol). El otro tubo de ensayo tiene como función la de ser testigo de la coloración inicial (ver figura
4)

Figura 4. Esquema de reacción para determinación de lactonas en Nerium oleander y Thevetia peruviana.
4.6. Reconocimiento de quinonas (Naftoquinonas y/o Antraquinonas):
Las naftoquinonas y las antraquinonas, corresponden al grupo de quinonas que se encuentran
frecuentemente en las plantas superiores, aun cuando también se han aislado de microorganismos y
líquenes. Las quinonas naturales, se forman en la planta a través de la ruta biosintética del acetato y
químicamente corresponde a (o)‐quinonas y (p)‐quinonas, son de color amarillo, café o anaranjado,
pero cuando existen como sales de hidroquinonas, son de color verde, azul o purpura.
Pese aproximadamente 500 mg de material vegetal en polvo en un erlenmeyer de 50 mL, adicione 20
mL de etanol al 95% y lleve al sonicador a 45°C por 5 minutos, filtre en caliente, tome 5mL del
filtrado y adicione aproximadamente 3 mL de H2SO4 al 20% y 2 mL de agua oxigenada de 20
volúmenes; caliente en baño maría durante 15 minutos hasta ebullición para producir la hidrólisis;
deje enfriar la muestra y realice la extracción de las quinonas con 5 ml de tolueno (usar el tolueno
bajo campana extractora). Agite suavemente sin emulsionar. Tome 2 ml de la fase orgánica en un
segundo tubo de ensayo, adicione aproximadamente 1 ml de NaOH al 5% y 1 mL de hidróxido de
amonio al 2%. Luego de agitar se obtiene un color rojo cereza en la capa acuosa, lo que indica
presencia de quinonas en la muestra. Tomar fotos de los tubos con el resultado final para el reporte
en el cuaderno de laboratorio.
4.7. Reconocimiento de coumarinas

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Macere 500 mg de material vegetal y colóquelo en un tubo de ensayo grande, adicione 5 mL de
etanol al 70%. Asista el procedimiento de extracción con ultrasonido por 5 minutos y luego observe
bajo la luz UV a 365 nm. No olvide tomar fotos para el reporte del cuaderno del laboratorio.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ASPERSIÓN Y PRECIPITACIÓN

 Dragendorff: Solución A: Disuelva 0.85 gramos de subnitrato de bismuto en 10 mL ácido
acético glacial y 40 mL de agua con agitación y bajo un leve calentamiento (50°C). filtre de ser
necesario. Solución B: disuelva 8 g de yoduro de potasio en 30 mL de agua. Prueba: mezclar
0.5 mL de Solución A con 0.5 mL de Solución B y adicionar 2 mL de ácido acético glacial y 20
mL de agua.
 Scott: Solución 1: disuelva 0.5 g de tiocianato de cobalto en 25 mL de agua y adicione 25 mL
de glicerina. Solución 2: Ácido clorhídrico concentrado. Solución 3: Cloroformo. Prueba:
Adicione dos gota de la solución 1 (hay aparición de precipitado color azul) con 1 gota de la
solución 2 y agite vigorosamente. Finalmente adicione la solución 3 y agite hasta recuperar la
coloración azul en la capa orgánica.
 Mayer: Solución 1: disuelva 1,36 g de HgCl2 en 60 ml de agua. Solución 2: disuelva 5 g de KI en
10 ml de agua. Prueba: a 6 mL de la solución 1 se le adiciona 1mL de la solución 2 y lleve a un
volumen de 10 mL en una probeta. Se utiliza sobre soluciones aciduladas. Las soluciones no
deben contener ácido acético ó etanol, porque disuelven el precipitado. Se deben agregar
solo unas cuantas gotas del reactivo, porque algunos alcaloides son solubles en el exceso de
reactivo.

5 PREGUNTAS
 De cada planta empleada en el laboratorio deberá dibujar una estructura química
representativa que identifique el grupo químico analizado. Esta molécula debe haber sido
reportada en la planta.
 En el cuaderno de laboratorio debe de argumentar para qué sirve la SPE y cuáles son las
principales áreas de aplicación (en la literatura científica cada grupo debe referenciar al
menos 1 artículo científico reciente ‐2005 en adelante, donde hayan empleado SPE en algún
área farmacéutica.

7. BIBLIOGRAFIA

Fitoquímica Orgánica: Segunda Edición 2002. Deanna Marcano, Masahisa Hasegawa (Biblioteca
Universidad Icesi)

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Laboratorio 3: TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE COMPUESTOS
BIOACTIVOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES

OBJETIVO:

 Separar e identificar los Carotenoides presentes en el material vegetal asignado, utilizando
técnicas cromatografícas de columna y capa fina.

 Seleccionar el ó los eluentes adecuados, con el fin de aislar compuestos puros y caracterizarlos
por métodos de coloración, cromatográficos y espectrofotométricos.

1. MARCO TEÓRICO

Los métodos cromatográficos son los procedimientos separativos más utilizados en la investigación
de productos naturales. Se emplean para separar y purificar los componentes presentes en los
extractos de origen vegetal o animal.
Cromatografía planar
La cromatografía de capa fina o cromatografía planar, es uno de los métodos más ampliamente
utilizados para separar, identificar los componentes de una mezcla proveniente de extractos
naturales o activos obtenidos mediante reacciones de síntesis.
En la cromatografía planar, la fase estacionaria está constituida por una capa uniforme de
adsorbente sólido (sílica gel o alúmina) sostenida en una placa de vidrio o de aluminio, sobre la cual
se aplica con un capilar la muestra del compuesto o mezcla a separar. La fase móvil (eluente) está
constituida por un disolvente o mezcla de disolventes adecuados. El solvente asciende por
capilaridad sobre la fase estacionaria, permitiendo la separación de los componentes por afinidad
con la fase estacionaria y la fase móvil.
A continuación, se presenta una foto de un resultado cromatográfico:

1

Los compuestos separados se localizan en la placa directamente, en el caso de ser derivatizados, o
con ayuda de un revelador UV, o de un reactivo de coloración específico. Los componentes ascienden
por la capa de adsorbente a diferentes velocidades. La movilidad relativa se conoce como Rf el cual
puede ser definido por la siguiente ecuación:
Donde Zi, Zf y Z0 son:
La cromatografía planar como método cualitativo o cuantitativo, se requiere un estándar de
referencia para comparar su valor de Rf con el de la muestra.
Cromatografía en columna (CC)
Es una técnica de separación en la que la fase estacionaria (sílica gel o alúmina) se encuentra
soportada en una columna de vidrio. La muestra es aplicada en forma líquida sobre la parte superior
de la columna.

2
En la CC clásica el sistema más empleado es la adsorción, teniendo en cuenta que las fuerzas de
atracción son diferentes para los distintos componentes, estos fluyen de arriba hacia abajo con
velocidades diferentes. Esta separación dependerá en gran medida de las características
fisicoquímicas de material de empaque. Parámetros físicos del material de empaque como tamaño
de partícula, tamaño de poro, distribución promedio de tamaño de partícula harán grandes
modificaciones a los tiempos de retención y resolución de las separaciones. Convencionalmente el
tamaño de la columna depende de la cantidad de muestra que se va a separar, se acostumbra usar
en proporción 30:1 de peso de adsorbente: peso de muestra.
Carotenoides
El grupo de Carotenoides están conformados por cientos de moléculas tetraterpénicas conformadas
por la unión en cadena de ocho unidades isoprénicas. Los Carotenoides son los responsables de la
gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en las especies vegetales, esto
se explica por la presencia en sus estructuras de grupos cromóforos característicos (por lo menos
diez dobles enlaces conjugados) y de un buen número de ramificaciones de grupos metilo, situados
en posiciones constantes.
Se habla de caroteno cuando la estructura de la molécula está constituida solamente por carbono e
hidrogeno (por ejemplo, el ß‐caroteno, el licopeno, etc.). Cuando existen grupos hidroxilo se habla de
Xantofila (por ejemplo, la luteína). A los Carotenoides generalmente se les denomina con nombres
comunes que incluyen las variaciones estructurales de los anillos laterales, en especial la posición del
enlace doble. El β‐caroteno, hoy es denominado β,β‐caroteno, para indicar que los dos anillos de los
extremos tienen el enlace doble en la misma posición relativa. El α‐caroteno, ahora se denomina β,ε‐
caroteno. En general para los carotenos se usa el sufijo caroteno, y para las xantofilas el sufijo ina. Es
conocido que los Carotenoides de las frutas y verduras de la dieta son la principal fuente de vitamina
A. La molécula de β‐caroteno se parte en dos moléculas de vitamina A (retinol), en un proceso que
ocurre en el intestino y en el que participa un complejo enzimático dioxigenasa. Cualquiera de los
Carotenoides que posean el anillo β no sustituido, característico del β‐caroteno, es precursor de la
vitamina A, por ejemplo α‐caroteno, β,α‐ caroteno‐5,6‐epóxido y β‐criptoxantina. El uso biomédico
de los carotenoides está fundamentalmente dirigido a la producción de Vitamina A, sin embargo,
actualmente se investiga el potencial del licopeno, la luteína y la Zeaxantina, en la prevención de
enfermedades como el cáncer y la enfermedad coronaria.
Estructuras de algunos carotenos de mayor ocurrencia en plantas y alimentos

3

Absorción de luz
El sistema de enlaces dobles conjugados constituye el cromóforo que absorbe luz que caracteriza a
los colores atractivos de los carotenoides y le provee de un espectro de absorción visible que es
usado con frecuencia para su identificación. Normalmente la pérdida o los cambios de coloración
durante sus análisis son una indicación inmediata de su degradación o modificación estructural. Estos
colores permiten fácilmente su seguimiento a través de cromatografía planar o en columna y por
este motivo fueron seleccionados en esta práctica de laboratorio.
La mayoría de los carotenoides absorben máximo a tres longitudes de onda (ver espectro de licopeno
obtenido del tomate).

4

Espectro visible del Licopeno en hexano obtenido del tomate rojo
A mayor número de enlaces dobles mayor es el número de máximos de absorción, es por esta razón
que los 11 enlaces dobles intermedios del licopeno hacen que tenga tres máximos de absorción. Un
número mínimo de siete enlaces dobles son necesarios para que el compuesto tenga un color
perceptible (ver tabla siguiente).
Carotenoide Solvente λ max

Cloroformo 430 ‐ 456 ‐ 484
Anteraxantina Etanol 422 ‐ 444 ‐ 472
Hexano, Éter de petróleo 422 ‐ 445 ‐ 472

Acetona 480
Benceno, cloroformo 485
Astaxantina
Etanol 478
Éter de petróleo 468

Acetona 381 ‐ 402 ‐ 427
Auroxantina Cloroformo 385 ‐ 413 ‐ 438
Etanol, Éter de petróleo 380 ‐ 400 ‐ 425

Cloroformo 433 ‐ 470 ‐ 502
Bixina Etanol 429 ‐ 457 ‐ 484
Éter de petróleo 432 ‐ 456 ‐ 490

Cloroformo 482
Cantaxantina
Etanol 474

5
Éter de petróleo 466

Etanol 476
Capsantina
Éter de petróleo (450) ‐ 475 ‐ 505

Capsorubina Éter de petróleo (455) ‐ 479 ‐ 510

Acetona 424 ‐ 448 ‐ 476
Cloroformo 433 ‐ 457 ‐ 484
α‐Caroteno
Etanol 423 ‐ 444 ‐ 473

Acetona (429) ‐ 452 ‐ 478
Cloroformo (435) ‐ 461 ‐ 485
β‐Caroteno
Etanol (425) ‐ 450 ‐ 478
Hexano, Éter de petróleo (425) ‐ 450 ‐ 477

β‐Caroteno‐ 5,6‐epóxido Etanol 423 ‐ 445 ‐ 474

β‐Caroteno‐ 5,8‐epóxido Etanol 407 ‐ 428 ‐ 452

β‐Caroteno‐ 5,6,5',6'‐diepóxido Etanol 417 ‐ 440 ‐ 468

β‐Caroteno‐ 5,8,5',8'‐diepóxido Etanol 388 ‐ 400 ‐ 425

Cloroformo 440 ‐ 470 ‐ 503
δ‐Caroteno

Acetona 439 ‐ 461 ‐ 491
Cloroformo 446 ‐ 475 ‐ 509
γ‐Caroteno
Etanol 440 ‐ 460 ‐ 489

Etanol 377 ‐ 399 ‐ 425
ζ‐Caroteno

Cloroformo 413 ‐ 435 ‐ 462
Crocetina Etanol 401 ‐ 423 ‐ 447

Cloroformo (435) ‐ 459 ‐ 485
β‐Criptoxantina Etanol (428) ‐ 450 ‐ 478
Éter de petróleo (425) ‐ 449 ‐ 476

Equinenona Acetona 460

6
Cloroformo 471
Etanol 461
Éter de petróleo 458 ‐ (482)

Cloroformo 435 ‐ 458 ‐ 485
Luteina Etanol 422 ‐ 445 ‐ 474

Cloroformo 433 ‐ 453 ‐ 483
Luteina‐5,6‐epóxido Etanol 420 ‐ 441 ‐ 470

Acetona 448 ‐ 474 ‐ 505
Cloroformo 458 ‐ 484 ‐ 518
Licopeno
Etanol 446 ‐ 472 ‐ 503

Cloroformo 437 ‐ 468
Mutatoxantina Etanol 409 ‐ 427 ‐ 457

Acetona 416 ‐ 440 ‐ 470
Cloroformo 423 ‐ 448 ‐ 476
Neoxantina
Etanol 415 ‐ 439 ‐ 467

Cloroformo 424 ‐ 451 ‐ 480
Etanol, hexano 416 ‐ 440 ‐ 470
Neurosporeno

Fitoeno Hexano, Éter de petróleo (276) ‐ 286 ‐ (297)

Fitoflueno Hexano, Éter de petróleo 331 ‐ 348 ‐ 367

Cloroformo 439 ‐ 474 ‐ 509
Rubixantina Etanol 433 ‐ 463 ‐ 496

Cloroformo 426 ‐ 449 ‐ 478
Violaxantina Etanol 419 ‐ 440 ‐ 470

α‐Zeacaroteno Hexano 398 ‐ 421 ‐ 449

7
β‐Zeacaroteno Etanol, hexano, Éter de petróleo 406 ‐ 428 ‐ 454

Acetona (430) ‐ 452 ‐ 479
Cloroformo (433) ‐ 462 ‐ 493
Zeaxantina
Etanol (428) ‐ 450 ‐ 478
Éter de petróleo 8424) ‐ 449 ‐ 476
















correcta de hacerlo

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES

ITEM Cantidad
Erlenmeyer de 250 mL
1
Columna cromatográfica vidrio larga
1

8
Papel de filtro
X
Capilares volumétricos (entregados por el
profesor) X
Tubos de ensayo
10
Placas cromatográficas preparativas
10
Algodón o gasa X
Embudo de caña corta 1
Soporte universal 1
Pinza y nuez para sostener la columna 2
Gradilla para tubos de ensayo 1
Beaker de 100 mL 1
Embudo de separación 125 mL 1
Aro para embudo de separación 1
Espátula delgada 1
Gotero largo para aplicar muestra 1

3.2 REACTIVOS

Reactivos Cantidad Unidad
Etanol 100 mL
Diclorometano 60 mL
NaCl 50 G
Sulfato Sodio Anhidro 50 G
n‐ hexano 150 mL
Acetato etilo 150 mL
Éter 25 mL
Sílica gel para columna 100 G
Platos de sílica gel GF254 1
Platos de TLC preparativos en
1
base de vidrio
Cloroformo 50 mL
Metanol 50 mL

9


Reactivos Cantidad
Zanahoria
Pimentón verde‐rojo
Hojas de espinaca
Pimentón rojo
Tomate rojo
Pasta de tomate
Salsa de tomate

3.4 EQUIPOS


Equipos Cantidad
Baño María 1
Rota evaporador 1
Licuadora 1
Espectrofotómetro UV‐VIS 1
Cámara reveladora UV 1

4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 Deshidratación

Triture la muestra del material vegetal fresco seleccionado. Coloque 30 g de este material en un
erlenmeyer de 250 mL, adicione un volumen suficiente de etanol al 95%, de tal forma que cubra el
material vegetal. Caliente a ebullición en un baño maría por un tiempo de 5 minutos.
Filtre en caliente utilizando un algodón de tal manera que la masa semisólida quede libre de
solvente. Deseche el filtrado.
4.2 Extracción

10
Al semisólido separado, adiciónele un volumen de diclorometano o cloroformo (aproximadamente
15 mL) de tal manera que cubra el material vegetal, para ello utilice la campana de extracción. Agite
con una varilla de vidrio con el fin de ayudar a la extracción de los compuestos.
Filtre el extracto. Repita la adición de solvente al residuo dos veces más con el fin de obtener mayor
rendimiento. Reúna los extractos filtrados y llévelos a un embudo de separación, si es necesario
adicione unos mililitros de una solución saturada de cloruro de sodio solo en el eventual caso de que
se formen emulsiones, separe la fase orgánica e inmediatamente fíltrela con una pequeña cantidad
de sulfato de sodio anhidro para desecarla. Concentre el filtrado hasta un volumen aproximado de 5
mL utilizando el rotaevaporador. Tape el extracto obtenido, guárdelo y manténgalo protegido de la
luz.
4.3 Selección de fase móvil y desarrollo de la cromatografía en CCF

Analice el extracto de Carotenoides utilizando la cromatografía de capa fina, utilizando la siguiente
serie eluotrópica:
 n‐hexano
 n‐hexano:acetato de etilo 4:1
 Acetato de etilo

4.4 Revelado
Para el revelado de las bandas utilice los siguientes reveladores en el orden establecido y describa
todas las observaciones:
 A luz visible
 Luz UV 254 nm
 Luz UV 366 nm

4.5 Fraccionamiento cromatográfico y análisis espectrofotométrico.

Luego de seleccionar el mejor sistema de solventes, realice la separación utilizando la cromatografía
en columna (CC), para lo cual debe utilizar mayor cantidad del extracto. Adicione la fase móvil y
colecte las fracciones coloreadas. El montaje de esta parte experimental deberá ser guiada por el
profesor.
Otra parte del grupo realizará el aislamiento y purificación empleando placas de cromatografía
planar preparativas de Merck. Empleando el mismo sistema de solventes seleccionado, se hará una
aplicación mayor de la muestra sin generar saturación y las bandas que presenten mejores
resoluciones y que se observen en mayores concentraciones serán seleccionadas para su extracción.
Con una espátula se deberá marcar toda la banda seleccionada y la sílica deberá ser retirada del
soporte y recuperada en un papel limpio. En un embudo de filtración y con una mota de algodón
prensada al comienzo del tallo se realizarán lavados con cloroformo hasta extraer por completo la
molécula de la sílica. Este solvente será colectado en un en tubo de ensayo y llevado al

11
espectrofotómetro para tomar el respectivo espectro, el cual deberá ser comparado contra la tabla
de máximos de absorción al inicio de esta guía de laboratorio.

5. PREGUNTAS

5.1 Investigue el nombre científico de cada una de las especies vegetales utilizadas
durante la práctica.

5.2 Analice cada uno de los máximos de absorción de sus compuestos contra los datos
expuestos en la tabla de absorción ultravioleta de los carotenoides más comunes y trate
de identificar el tetraterpeno aislado.

6. BIBLIOGRAFIA

Fitoquímica Orgánica: Segunda Edición 2002. Deanna Marcano, Masahisa Hasegawa (Biblioteca
Universidad Icesi)

12


Laboratorio 4. RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES
APROBADAS EN COLOMBIA (TLC)

OBJETIVO:

 Realizar el reconocimiento de diferentes especies vegetales aprobadas en Colombia, mediante
la utilización de la cromatografía planar.

 Lograr la caracterización de sustancias propias de cada especie analizada.

1. MARCO TEÓRICO

La cromatografía planar permite la separación de componentes químicos, los cuales contribuyen a la
identificación de un material vegetal. Estas sustancias se encuentran en mayor o menor proporción
dependiendo de la parte vegetal (droga) que se analiza.
Realizaremos procesos extractivos, mediante los cuales podremos obtener fracciones en las cuales se
encontrarán las sustancias características para cada especie, posterior a ello realizaremos la
separación e identificación comparando los valores de retención denominados “Rf” obtenidos con los
reportados en la literatura.

1
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su intercambio
con los demás compañeros de laboratorio.

tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le indicará la forma correcta
de hacerlo

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES


ITEM Cantidad
Balones para rotaevaporación de 100 mL 2
Columna cromatografía en columna pequeña 1
Cámara para cromatografía 1
Erlenmeyer de 250 mL con desprendimiento lateral y tapón
de plástico perforado 1
Probeta de 100 ml 1
Beaker de 200 mL 3
Embudo de filtración 1

2
Erlenmeyer de 50 ml 4
capilares 10
Embudo de separación de 250 ml 1
Aro metálico 1
Soporte Universal 2
Pinzas medianas con nuez 2
Algodón y papel craft
Espátula delgada 1

3.2 REACTIVOS


Metanol 200 mL
Plato sílica gel GF 254 2
Anhídrido acético 50 mL
Silica gel 60 para cromatografía en columna de 40‐60 μm 30 g
Cloroformo 200 mL
Ácido sulfúrico 40 mL
Acido fórmico 20 mL
Ácido acético 20 mL
Agua tipo 3 3 L
Aminoetil difenil borico 1 G
Polietilenglicol 4000 10 G
tolueno 100 mL
Vainillina 3 G

3
NaCl 5 g
KOH 10 mL
Anisaldehido 5 mL
HCl 20 mL



Hojas de albahaca (Ocimum basilicum) 20 G
Flores de manzanilla (Matricaria chamolilla) 20 G
Hojas de romero (Rosmarinus officinalis) 20 G
Raíces de valeriana (Valeriana officinalis) 20 G
Hojas de Ginkgo (Ginkgo biloba) 20 G
Raices de Ginseng (Panax ginseng) 20 G
Raíz de Castaño de Indias (Aesculus hippocastanum) 20 G

3.4 EQUIPOS


Equipos Cantidad
Lámpara ultravioleta 1

4.1 Reconocimiento de Albahaca, Ocimum basilicum (Lamiaceae)
La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0,1 ‐ 0,45% de aceite esencial. El aceite
esencial contiene principalmente metilchavicol hasta 55% y linalool.
4.1.1 Extracción
 Pese 1 g de droga pulverizada y adiciónele 10 mL de diclorometano, agite durante 15
minutos. Filtre y evapore le filtrado obtenido a sequedad. El residuo disuélvalo en 1 ml de
Tolueno, y se aplica 10 ‐50 μL en la placa cromatográfica.

4
4.1.2 Sistema cromatográfico
Fase estacionaria: Silica gel 60
Fase móvil: Tolueno: Acetato de Etilo 93: 7
Revelador: Vainillina‐ Acido sulfúrico

4.1.3 Rf de las bandas observadas

Rf SUSTANCIA COLOR
0,3 Linalool Azul intenso
0,9 Metilchavicol Rojo violeta

Cromatoplaca de Ocimum basilicum tomada de: Plant Drug Analysis, 2009.

4.2 Reconocimiento de Manzanilla Matricaria chamomilla (Asteraceae)

La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 ‐1.5% de aceite esencial. El aceite esencial
a su vez contiene chamazuleno 0 ‐15%, bisabolol 10 ‐25%, bisabolol óxidos A y B (ambos 10 ‐25%),
poliínas 1 ‐40%, farneseno 15%.
4.2.1 Extracción


Fase estacionaria: Sílica gel 60
Fase móvil: Tolueno: Acetato de Etilo 93 : 7
Revelador: Vainillina ‐Acido sulfúrico

4.2.3 Rf de compuestos a observar
Rf SUSTANCIA COLOR
0,2 I Oxidos A y B bidabolol Amarillo/verde
0,25 II Alcohol terpenoide Violeta
0,35 III Bisabolol Violeta
0,5 ‐0,6 IV Poliinas Pardo
0,95 V Azuleno Rojo‐violeta

5
0,99 VI Farneseno Azul‐violeta
Cromatoplaca de flores de manzanilla tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. T1 es el óxido A de
bisabolol, T2 es bisabolol (Rf 0.35) y azuleno (Rf 0.85) y T3 es el óxido A de bisabolol y bisabolol

4.3 Reconocimiento del Romero, Rosmarinus officinalis (Lamiaceae).
Las hojas contienen 1 ‐2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 –cineol 15‐30%,
borneol 10‐20%, acetato de bornilo, camfeno 5 ‐10%, alfa‐ y beta‐pineno.
4.3.1 Extracción


Fase móvil: Tolueno: Acetato de Etilo 93 : 7
Revelador: Vainillina ‐ Ácido sulfúrico


Rf SUSTANCIA COLOR

6
0,25 Borneol Azul oscuro
0,45 Cineol Azul intenso
0,7 Acetato de bornilo Azul intenso
0,99 Alfa beta‐pineno Violeta
Cromatoplaca de Rosmarinus oficinalis. Tomada de “Plant Drug analysis” 2009. T1 y T2 son Cineol y
borneol respectivamente.
4.4 Reconocimiento de raíces de Valeriana, Valeriana officinalis (Valerianaceae)
La droga la constituyen las raíces o rizomas que contienen los valepotriatos como:
valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentración cambia de una
variedad a otra. Además contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene
valerenal, valeranona y ácido valerénico.
4.4.1 Extracción
Realice la extracción con 0.2 g de droga pulverizada con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a
asistiendo con ultrasonido (Nota: el baño del ultrasonido debe operarse sin aplicación de
temperatura). Filtre el extracto y lávelo con otros 2 ml de diclorometano. Evapore los extractos
combinados a sequedad, y el residuo disuélvalo en 0.2 ml de acetato de etilo. Es necesario no
excederse en el volumen y cantidad de siembra en la placa.
Fase estacionaria : Sílica gel 60
Fase móvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25
Revelador: HCl concentrado: Acido acético glacial 2:8


7

Rf SUSTANCIA COLOR
0,73 Valtrato/Isovaltrato Azul
0, 65 Dihidrovaltrato Pardo
0,55 Acelvaltrato Azul
0,4 IVDH_Valtrato Azul
< 0,4 Valtrahidrinas Azul
Origen Productos de degradacion
Cromatoplaca de raíces de valeriana de diferentes procedencias. Tomada de “Plant Drug analysis”,
2009. T1, T2, y T3 son valtrato, acevaltrato y dihidrovaltrato respectivamente. La característica
principal de un buen material vegetal de raíces de valeriana son las altas cantidades de valtrato
4.5 Reconocimiento de Ginkgo, Ginkgo biloba (Ginkgoaceae)
La droga la constituyen principalmente los flavonoides que están presentes en las hojas entre 0.5 y
1% (alrededor de unos 20 compuestos) principalmente glicósidos de quercetina, kaempferol e
isoramnetina. También contiene biflavonoides como amentoflavona y bilobetina. No obstante, los
principales marcadores quimiotaxonómicos son los diterpenos lactónicos llamados ginkgólidos cuyo
porcentaje está entre 0.01 y 0.04% representados principalmente por bilobálido y Ginkgólido B, A, C.
4.5.1 Extracción

 Extracción de flavonoides: 1 g de hojas secas y molidas son extraídas con 20 mL de metanol
asistiendo con sonicación y sin temperatura. Realice filtración del material y lleve a sequedad
a través del rotaevaporador. Redisuspenda el contenido en 2 mL de metanol y siembre de 10
a 20 μL en la placa de TLC.

8
Extracción de Ginkgólidos: partir de 50 g de material vegetal en un erlenmeyer de 250 mL.
Adicione la suficiente cantidad de agua para cubrirla y sumergír el erlenmeyer a un baño
maria en ebullición por 20 minutos, retirarla y todavía con el erlenmeyer en ebullición
someterlo a sonicación por 5 minutos (realizar este procedimiento 2 veces). Filtrar en
caliente y el filtrado llevarlo a una columna cromatográfica que tenga silica gel 60 de 40‐60
μm (aproximadamente 30g). Permita que el agua pase en su totalidad y tratar de secar con
vacio. Adicionarle a la columna 100 mL de acetato de etilo y dejarlos pasar a través de la
columna, una vez recuperados transfiéralos a un balón de rotaevaporación y lleve a
sequedad. Redisuspenda en 1 mL de acetato de etilo y siembre alrededor de 10‐20 μL en la
placa cromatográfica.


Fase estacionaria: Silica gel 60
Fase móvil flavonoides: Acetato de etilo: ácido acético glacial: ácido fórmico: agua (100:11:11:26)
Fase móvil Ginkgólidos: Tolueno: acetona (70:30)
Revelador Flavonoides: Productos naturales (aminoetil difenil bórico y polietilenglicol 4000)
Revelador ginkgolidos: Reactivo de anhídrido acético


Ginkgólidos
Rf SUSTANCIA COLOR
0.5 Bilobálide Verde
0.45 Ginkgolido A Azul
0.4 Ginkgolido B Verde
0.3 Ginkgolido C Azul verdoso
Flavonoides
Rf SUSTANCIA COLOR
0.75 Isoquercitrina, astragalin, dihidrokaempferol‐7‐o‐glicósido Verde amarillo
0.6 Quercitrina Naranja amarillo
0.5 Kaempferol y quercetin ramnósido Azul claro (celeste)
0.45 Narcissina e isoramnetina rutinósido Verde amarillo
0.4 Rutina, quercetina y kaempferol isoramnetin glucopiranosido Amarillo y naranja verde

9
0.25 Flavonoides con tres azúcares Amarillo verde y naranja

Cromatoplaca de hojas de Gingko. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Para análisis refiérase a las
tablas

4.6 Reconocimiento de Ginseng, Panax ginseng (Araliaceae)
La droga la constituye los rizomas de Panax ginseng cuyos principales metabolitos son los triterpenos
tetracíclicos glicosilados denominados ginsenósidos. Derivados de 20‐S‐proto‐panaxadiol y 20‐S‐
proto‐panaxatriol.
4.6.1 Extracción
 Realizar extracción a 2 gramos con 10 mL de etanol al 90%. Concentrar en rotaevaporador
hasta unos 5 mL
 los 5 mL anteriores son extraídos con 5mL con n‐butanol. La fase de n‐butanol es separada y
concentrada alrededor de 1 mL con el cual se hace la siembra en la cromatoplaca de TLC.

Fase estacionaria: Sílica gel 60F ‐254
Fase móvil: Cloroformo : Metanol : Agua (70 : 30 : 4)
Revelador: vainillina ácido sulfúrico


Rf SUSTANCIA COLOR
0.05 – 0.15 Ginsenódio Rc Rojo claro

0.05 – 0.15 Ginsenódio Rb2 Rojo claro
0.05 – 0.15 Ginsenódio Rb1 Rojo claro
0.25 Ginsenódio Rd Rojo claro
0.25 Ginsenódio Re Rojo claro

10
0.4 Ginsenódio Rg1 Rojo claro
0.55 Ginsenódio Rh1 Rojo claro

Cromatoplaca de hojas de Ginseng. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Los compuestos 1 a 7 son
Rc, Rb2, Rb1, Rd, Re, Rg1, y Rh1 respectivamente
4.7 Reconocimiento de Castaño de Indias, Aesculus hippocastanum (Hippocastanaceae)
La droga la constituyen las semillas, las cuales contienen 3 al 6% de glicósidos de triterpenos
pentacíclicos. El principal metabolito (alrededor del 15% total de glicósidos) son las aescinas, una
mezcla compleja de diésteres de la β‐amirina penta y hexahidroxilada. Los azúcares principales son el
ácido glucurónico y glucosa
4.7.1 Extracción
 Realizar extracción a 2 gramos con 10 mL de etanol al 70%. Concentrar en rotaevaporador
hasta unos 5 mL
 los 5 mL anteriores son extraídos con 5mL con n‐butanol. La fase de n‐butanol es separada y
concentrada alrededor de 1 mL con el cual se hace la siembra en la cromatoplaca de TLC.
Fase móvil: Cloroformo: ácido acético glacial: Metanol: Agua (60:32:12:8)
Revelador: Anisaldehido‐Ácido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR

11
0.2 a 0.45 Aescinas Negro‐violeta
0.45 Aescin Negro‐violeta

Cromatoplaca de hojas de Castaño de Indias. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Los compuestos
T1 y T2 son Aescina y ácido primula resxpectivamente. Los carriles 1,2 y 3 son tintura, y dos
variedades de raíces de Aesculus.
5 BIBLIOGRAFIA

 British Pharmacopoeia, 2012.
 USP 35, 2012.
 Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998
 Plant Drug Analysis. Hildebert Wagner and Sabine Bladt. 2009

12


Laboratorio 5. Extracción y análisis de las fracciones volátiles de plantas
OBJETIVOS:
 Obtener aceites esenciales de plantas seleccionadas y su detección por cromatografía en

planar.

 Extraer aceites esenciales a partir de Matricaria chamomilla L. y Elettaria cardamomum
L en planta semi‐piloto.
 Identificar los compuestos volátiles por patrones de reconocimiento en la literatura
empleando reacciones de derivatización.

1. MARCO TEÓRICO
La familia de las umbelíferas, actualmente denominadas Apiáceas (apiaceae), abarca más de 3000
especies de plantas dispersas por todo el mundo, son plantas muy conocidas como condimentos
(especias) o por su valor medicinal, debido a la gran cantidad de aceites esenciales que contienen,
otras como la cicuta constituyen venenos muy potentes.

Los aceites esenciales o esencias son productos constituidos por mezclas de sustancias orgánicas
volátiles y olorosas provenientes de vegetales. Dadas sus características aromáticas estas sustancias
han sido utilizadas como fuentes naturales de fragancias y perfumes. Entre los componentes de los
aceites esenciales, encontramos hidrocarburos alicíclicos y aromáticos, alcoholes, esteres, aldehídos,
cetonas, derivados oxigenados, sustancias nitrogenadas y azufradas. Los componentes más
frecuentes derivan del acido mevalónico y corresponde a monoterpenoides (C10) y sesquiterpenoides
(C15).
Un aceite esencial puede localizarse un órgano determinado del vegetal: flores, hojas, frutos y raíces
o en toda la planta. La composición puede ser igual o diferente. La composición de una esencia
puede cambiar con la época de recolección, el lugar geográfico, o por pequeñas alteraciones
genéticas. Las principales especies que contienen aceites esenciales se encuentran en gimnospermas
y angiospermas distribuyéndose en unas 60 familias aproximadamente. Son particularmente ricas en
esencias las pináceas, lauráceas, mirtáceas, labiáceas, umbelíferas, rutáceas, y compuestas.
El más antiguo y sencillo método para obtener aceites esenciales es la destilación con arrastre con
vapor, para lo cual se utiliza material vegetal lo más fresco posible. Las modernas plantas industriales
poseen muchas ventajas sobre las antiguas destilerías, en las que con frecuencia se producía la
carbonización y descomposición de la esencia. En la moderna destilería de aceites esenciales, la
materia prima está contenida en cestos o bandejas perforados. El destilador contiene agua en el
1
fondo, la cual se calienta mediante serpentines por los que circula vapor, o también haciendo pasar a
su través vapor de agua a presión.
Las esencias utilizadas en perfumería, se pueden extraer por arrastre con vapor, pero algunos
requieren de otro tipo de tratamiento, como son el enflorado, digestión en grasas calientes, métodos
neumáticos o por medio de disolventes.













correcta de hacerlo

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES


ITEM Cantidad
Equipo para destilación con arrastre de vapor
1
Mangueras
2
2
Núcleos de ebullición
X
Embudo de separación de 250 mL
1
Embudo de filtración (caña corta)
1
Erlenmeyer de 125 mL
2
Placas de cromatografía en capa fina
X
Capilares para cromatografía
5
Erlenmeyer de 250mL
2
Soportes
3
Aros
2
Vidrio de reloj
1
Espátula
1

ITEM Cantidad
Pipetas 1mL
5
Mortero con pistilo
2
Matraz volumétrico 25 mL
X
Beaker 10 mL
1
Beaker 250 mL
1
Probeta 25 mL
2
Placas cromatográficas de sílica gel FG 254
20
20x20

Placas cromatográficas de sílice preparativas
10
Capilares para cromatografía
5
Balón de fondo redondo 250 mL
2
Agitador de vidrio
3
Cámara para cromatografía
2
Vidrio de reloj
1

3

3.2 REACTIVOS

Xileno 20 mL
H2O 1 L
Sulfato de sodio anhidro 20 G
Tolueno 10 mL
HCl 20 mL
2,4‐dinitrofenilhidrazina 3 G
Acido sulfúrico‐vainillina 5 mL
Hexano 400 mL


Tabla 3. Listado de material vegetal necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
Reactivos Cantidad
Elettaria cardamomum L. (semillas) 1000g
Coriandrum sativum 50g
Pimpinella anisum L. (semillas) 50g
Cominum cyminum (semillas) 50g
Anethum graveolens L. 50g
Petrosenilum crispum 50g
Zingiber officinale 50g
Matricaria chamomilla L. 1000g

4
3.4 EQUIPOS
Equipos Cantidad
Plancha de calentamiento
1
Lámpara ultravioleta
1


4.1 Destilación con Arrastre de Vapor

Coloque aproximadamente 500mL de agua en el matraz Nº 1 (generador de vapor) y agregue núcleos
de ebullición (Figura 1). En el matraz número 2 adicionar 50 g del material vegetal asignado, cortados
en trozos pequeños. Coloque la plancha de calentamiento en el matraz # 1 y caliente hasta
ebullición, con el fin de generar vapor el cual pasará al matraz Nº 2, el vapor realizará la extracción de
los aceites esenciales, que inmediatamente serán arrastrados con el agua en un proceso de
codestilación.

Figura 1. Montaje del equipo de destilación por arrastre con vapor.
Suspenda el calentamiento cuando el volumen del destilado sea de 200 mL aprox. De éste destilado
extraiga totalmente el aceite esencial: adicione en el embudo de separación la mitad del destilado y
realice 2 extracciones con 50 mL de diclorometano cada una. Agregue una solución saturada de NaCl
si se forma emulsión.

Las fases acuosas se desechan y los extractos orgánicos se colectan en un Erlenmeyer de 250 mL.
Adicione una pequeña cantidad de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente.
Decante el extracto seco y colóquelo en un balón de 250mL para rotaevaporar Evapore hasta un
volumen de 5 mL. Con esta muestra siembre 6 placas cromatográficas de 5 cm x7,5 cm.

4.2 Aceite esencial por maceración y decantación.

5

Moler las semillas en el mortero, cubrirlas con hexano y dejar reposar el extracto durante 30 min.
Decantar y concentrar el extracto en equipo rotaevaporador y realizar (2) TLC utilizando como fase
móvil tolueno: acetato de etilo 93:7. Sacar las placas de la cámara, marcar inmediatamente con el
lápiz la distancia recorrida por la mezcla eluyente y dejarlas secar. Observar las placas bajo luz UV y
marcar las bandas cromatográficas.
Derivatizar la primera placa con el revelador vainillina‐ácido sulfúrico, calentar a 100°C durante 10
minutos para desarrollar color. Derivatizar la segunda placa con el revelador 2,4‐dinitrofenilhídrazina
(DNP) y observar las bandas de color naranja, alternativamente la placa se puede asperjar con el
revelador de anisaldehído‐ácido sulfúrico, calentando a 100°C por 10 minutos para desarrollar color.
4.3 Extracción de aceite esencial a partir hojas de Matricaria chamomilla L. y Elettaria
cardamomum L. en planta semi‐piloto de extracción.
Figura 2 Planta semi‐piloto de extracción.
Se realizará extracción de aceite esencial de Matricaria chamomilla L. o Elettaria cardamomum L.
(aprox 1Kg de hojas pulverizadas o semillas respectivamente) a través de un prototipo experimental
(planta semi‐piloto) ( Figura 2) de extracción sólido‐líquido utilizando
el principio de percolación emulando el funcionamiento de un Soxhlet. El equipo permite manipular y
controlar las variables principales del proceso como tamaño de partícula del sólido, tipo de solvente,
nivel de agitación, temperatura de extracción, relación sólido‐solvente, tipo de operación, presión en
la etapa de concentración y velocidad de agitación.
La planta de extracción sólido‐líquido PSE está compuesta por el sistema de calentamiento, el
sistema de extracción, el condensador, el sistema de concentración del extracto, los tanques
colectores de solvente, el sistema de vacío, y el tablero de control. El equipo permite realizar el
proceso de extracción, la concentración del extracto y la recuperación del solvente, tanto en
6
operación por lotes como en continuo. El equipo es robusto, durable, construido en acero inoxidable
304 con acabado brillante. Puede ser utilizado para una gran diversidad de aplicaciones de extracción
con solventes y para actividades de docencia, investigación, y extensión.
 Operación:
 Abrir la válvula de salida de vapor del percolador (V‐12), la válvula de entrada al condensador
(V‐24), y la válvula de entrada al visor de condensación (V‐27).
 Verificar que las válvulas de salida del visor de condensación (V‐29)(V‐31)(V‐32) y la válvula
del sello hidráulico (V‐30) se encuentran cerradas.
 Abrir la válvula de alivio del visor de condensación (V‐28)
 Verificar que el aceite ha llegado al set point.
 Abrir la válvula de entrada de aceite a la chaqueta del percolador (V‐09) y la válvula de
retorno del aceite térmico al tanque de fluido calefactor (V‐08).
 Abrir la válvula de entrada de aceite a tanque de fluido calefactor (V‐04), la línea de carga
de aceite térmico al percolador (V‐06), y cerrar la válvula de recirculación al tanque de
fluido calefactor (V‐05).
 Encender el motor del agitador y regular la velocidad de agitación deseada. Una vez se
observe acumulación de condensado en el visor abrir la válvula de recirculación de solvente
(agua) (V‐29).
 Permitir que el equipo se estabilice, controlando la temperatura de operación. Continuar la
operación de extracción hasta que se realice la recuperación requerida.
 El seguimiento a la operación se puede realizar a través del muestreo del extracto. Para ello,
se abre muy lentamente la válvula de muestreo del percolador (V‐13), se toma la cantidad de
muestra necesaria de acuerdo al método de análisis y se cierra la válvula.
Para detener el proceso de extracción:
 Detener el agitador oprimiendo la tecla STOP (botón de color rojo) en el variador de velocidad del
agitador y esperar a que se detenga por completo
 Apagar el agitador desde el tablero de control con el botón correspondiente.
 En caso de que se trabaje con reflujo de solvente fresco, esperar a que el sistema se enfrié por
debajo de la temperatura de ebullición del solvente y que no haya condensados en el visor
de condensación.
 Cerrar la válvula de recirculación de solvente (V‐29), la válvula de salida de vapor del percolador
(V‐12) y la válvula que conecta el percolador al condensador (V‐24)
 Abrir la válvula que conecta el concentrador al desflemador (V‐22) y el desflemador al
condensador (V‐23).
7
 Abrir la válvula de alivio del percolador (V‐11) y la válvula de alivio del concentrador (V‐18) Abrir
la válvula que va del percolador al concentrador (V‐15) y cerrarla una vez se ha vaciado el
percolador.
 Purgar el líquido del percolador abriendo la válvula (V‐14).
 Tras finalizar la purga del sistema, dejar las válvulas de descarga del percolador (V‐ 14) abierta
con un recipiente colector debajo de ella para recoger residuos de material que puedan
escurrirse luego de la purga.
 Cerrar la válvula de alivio del concentrador (V‐18).
4.4 Análisis por Cromatografía de planar
Disuelva el extracto de aceites esenciales obtenidos por los dos métodos en unos pocos mililitros de
diclorometano y realice el análisis por CCF, utilizando los siguientes eluentes:
a) Diclorometano
b) Tolueno: acetato de etilo (93:7)

Derivatice cada una de las cromatoplacas obtenidas con los siguientes reveladores:
a) Luz ultravioleta (254 nm y 375 nm)
b) 2,4‐dinitrofenilhidrazina (0,4 g en 100 mL HCl 2N)
c) Vainillina/ácido sulfúrico

Con base en los resultados obtenidos, seleccione el sistema de solventes donde se observe mayor
resolución cromatográfica.
4.4.1 Fraccionamiento por Cromatografía planar

Aplique el aceite esencial solubilizado en el eluente que presentó mejor separación y aplíquelo en
una placa cromatográfica de silica gel, eluya con el sistema de solventes escogido. Los componentes
principales se observan con la utilización de la luz ultravioleta a 254 nm.
4.4.2 Extracción de los componentes por Cromatografía planar preparativa.

Recupere los componentes mayoritarios de las cromatoplacas con la ayuda de una espátula y la luz
ultravioleta. La sílice retirada del soporte de vidrio del plato preparativo, es reunida sobre un papel
evitando que pueda perderse por el viento o una mala manipulación. Relice un montaje de filtración
en un embudo de tallo corto y con una mota de algodón presionada en el inicio del tallo para realizar
la filtración (ver figura 3). Haga pasar lentamente metanol (2 mL aprox.) hasta recuperar toda la
molécula adsorbida por la sílica y concentre si es necesario en el rotaevaporador para tubos de
ensayo (Rapid‐Vap). Finalmente tomar un espectro ultravioleta del compuesto purificado y
exportarlo en PDF para el posterior reporte del cuaderno de laboratorio.
8

Figura 3. Montaje para filtración de la sílica‐gel proveniente del plato de cromatografía preparativo
con la banda mayoritaria.
4.4.3 Análisis del componente puro

Realícelo por el siguiente método:
Análisis espectral: al componente puro determínele el espectro ultravioleta y compárelo contra datos
de la literatura y bases de datos.
ACTIVIDAD:
 Consultar los usos tradicionales y principales constituyentes mayoritarios de cada una de las
especies vegetales propuestas para la práctica.
5. BIBLIOGRAFIA

 British Pharmacopoeia, 2012.
 USP 35, 2012.
 Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998

9


Laboratorio 6. Valoración de capsaicinoides en muestras de fruto fresco de
ají, salsas picantes, pasta y oleoresina por HPLC‐SPE‐DAD

OBJETIVO:

 Aplicar las técnicas para la extracción de metabolitos secundarios y emplear una

metodología oficial AOAC para la determinación de Capsaicinoides en muestras

vegetales y alimentos procesados.

1. MARCO TEÓRICO

Capsicum Spp. es un género originario de América del sur y es conocido ampliamente por su
propiedad organoléptica de pungencia atribuida a los capsaicinoides. La Capsaicina y la
Dihidrocapsaicina son las moléculas más representativas de este grupo y son responsables de más
del 90% del estímulo del Receptor de Potencial Transitorio Tipo 1 (TPRV1) el cual es también
estimulado por el calor.

2. NORMAS DE SEGURIDAD

Normas de seguridad
Equipos de protección personal
Manejo de Residuos químicos
 Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales
están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
 Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no
controladas y potencialmente peligrosas.
 No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo
3. METODOLOGÍA

Cada grupo deberá aportar para la práctica uno de los siguientes materiales.
A. 50 g de Fruto fresco de ají, sin importar el grado de maduración.
B. Una unidad de Pimentón Rojo.
C. Salsa picante de venta comercial.
D. Una unidad de Parche León®.
E. Pasta de ají (suministrada por el Profesor).
F. Oleoresina de Capsicum (suministrada por el Profesor).
‐Un grupo seleccionado aleatoriamente debe realizar la preparación del estándar siguiendo las
indicaciones del punto C.
‐Un grupo Seleccionado aleatoriamente debe preparar la fase móvil y el solvente de lavado de
acuerdo con el punto D.
4. MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la sesión experimental por tres personas
2

ITEM Cantidad
Probeta graduada de 20 mL 1
Erlenmeyer 25 mL 1
Beaker 25 mL 5
Erlenmeyer con desprendimiento lateral de 250 mL 1
Algodón csp
Embudo con tapón de neopreno 1
Cartuchos de SPE C18 2
Puntas micropipeta 1000μL 10
Jeringas plásticas de 5 mL 2
Filtros de jeringa de 0.22 μm 3
Micropipeta de 1000 μL 2
Viales de HPLC (Waters) 5

5. REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la sesión experimental por tres personas

Reactivos Cantidad
Metanol HPLC 1000 mL (para todo el grupo)
Acetonitrilo HPLC 400 mL (para todo el grupo)
Agua tipo 1 (HPLC) 2000 mL (para todo el grupo)
Ácido fórmico (HPLC) 10 mL (para todo el grupo)

6. EQUIPOS

Tabla 4. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la sesión experimental

Equipos Cantidad
Ultrasonido 120 MHz 1
Manifold de 10 puestos para extracción

en fase sólida
Columna Kinetex 2.6 µm C18 100 Å 1
Tamaño=100 x 4,60 mm
HPLC‐PDA 1
Rapid Vap 1


a. Extracción a partir de fruto fresco, pasta de ají o Parche León®.
3
Macerar 5 g de Llevar la muestra al
Adicionar 10 mL de ultrasonido a 60°C
muestra en un metanol y llevar a
mortero (para el por 10 minutos
un beaker de 25 mL
parche León
cortarlo con tijeras)
Filtrar la mezcla
Filtrar la solución empleando empleando algodón
filtros de jeringa (nylon) de 0,22 en (ver figura 1.0)
un vial de HPLC
Reconstituir con 5mL
metanol, sonicar y llevar Tomar 5 mL del
3 mL a SPE Secar filtrado y llevar a un
completamente el tubo de ensayo apto
solvente (180 mbar para el rapidvap (15
a 50°C por 25 min) mL)
en RapidVap

Figura 1.0 Montaje de filtración empleando algodón sobre embudo.

b. Extracción a partir de oleoresina.
Pesar 50 mg de Llevar 3 mL de la
oleoresina en un solución a SPE
Filtrar 0.22 um en
beaker de 25 mL y (cartucho
un vial de HPLC
adicionar 5 mL de previamente
metanol acondicionado)

Extracción en fase sólida. Procedimiento de tratamiento de muestra para cromatografía líquida
Debido a las muestras de fuentes naturales son complejas porque poseen una gran diversidad de
compuestos, el tratamiento de muestra se convierte en una alternativa barata que elimina
interferencias y aumenta la concentración del analito problema. Con el apoyo del profesor y/o
monitor del laboratorio, realice el montaje del manifold de 10 puestos para extracción en fase
sólida (solid phase extraction ‐SPE), tal como se observa en la figura 1. El equipo debe tener una
bomba de vacío para asistir el procedimiento con muestras que pudiesen ser viscosas. Sin
embargo, debe controlarse el vacío a una velocidad máxima de flujo de 1 gota por segundo (para
evitar daños en la bomba, debe también instalarse siempre una trampa en hielo que evite que los
solventes puedan terminar dentro de ella).
4

Figura 1. Montaje para extracción en fase sólida de muestras de ají para análisis por HPLC‐DAD
Todos los cartuchos de SPE deben ser sometidos a 4 pasos básicos que determinan el éxito del
procedimiento a realizar. Estas etapas no deben ser omitidas y siempre deberán ser realizadas por
los estudiantes.
1. Adicionar 2 mL de metanol por cada cartucho y permitir que el solvente pase a una
velocidad no superior a 1 gota por segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción
2. Una vez el cartucho se encuentre sin solvente, quitar el vacío y adicionar en cada cartucho
2 mL de agua tipo 1 y permitir que el solvente pase a una velocidad no superior a 1 gota
por segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción solo cuando sea necesario
aumentar la velocidad de flujo a través del cartucho)
3. Aplicar 2 mL del extracto con alto contenido de carotenos y permitir que la muestra pase a
una velocidad no superior a 1 gota por segundo (el vacío deberá ser empleado a discreción
4. Adicionar 2 mL de Metanol permitir que el solvente pase a través del cartucho a la misma
velocidad establecida anteriormente y recuperar en un vial nuevo y limpio. Este es el
extracto con el cual realizarán las pruebas de coloración
El extracto resaltado en rojo de la etapa 3 del procedimiento de SPE, es el obtenido en la
extracción del material vegetal respectivo, una vez se obtiene la muestra de la etapa 4 del
protocolo de SPE, proceder con su flitración (filtros de jeringa de nylon de 0.22 µm) para posterior
inyección en el cromatógrafo.
5
c. Preparación de Estándar para HPLC.

1. Información general:

Fórmula molecular Masa Molar Pureza relativa
Dihidrocapsaicina C18H29NO3 307,43 g/mol 90%
Capsaicina C18H27NO3 305,43 g/mol 95%

2.
Preparación: a partir de la información anterior, el grupo asignado deberá preparar 20 mL de
solución metanólica que contenga ambos estándares a una concentración de 500 ppm (partes por
millón) y filtrarla por 0,22 µm.

Nota: Recuerde utilizar material volumétrico y una balanza con una sensibilidad mínima de 10 mg, además
debe considerar la pureza relativa de cada uno y calcular la corrección en peso necesaria.

d. Parámetros cromatográficos
HPLC System LaChrom Elite®
Tipo de separación Fase reversa isocrático

Columna Kinetex 2.6 µm C18 100 Å Tamaño=100 x 4,60 mm
Fase móvil 40% ACN al 0,05% con ácido fórmico (1L)
Solvente de lavado Solución acuosa de Metanol al 30% (500mL)
Detección PDA @ λ=280nm
Flujo 0,8 mL/min
Volumen de inyección 10 µL
Tiempo de corrido 15 minutos
6
e. Orden de elución: Capsaicina 6,4 minutos y luego dihidrocapsaicina a 10,4 minutos. Antes de
capsaicina se encuentra la nordihidro‐capsaicina pero no será tenida en cuenta para la
valoración. Adjunto se encuentra el espectro de absorción UV de la capsaicina.

f. Cálculo de unidades Scoville (SHU)
Esta medida es un parámetro internacional aceptado para comparar el grado de pungencia de
cada especie diferente de ají. Para calcular el valor Scoville Heat Units se tomará la siguiente
relación: 1 ppm de capsaicina o dihidrocapsaicina es igual a 15 SHU. Por tanto, para conocer el
valor ppm de las muestras deberá relacionar las unidades de absorbancia de cada una con el valor
en ppm del estándar, realizar los cálculos de acuerdo a las cantidades y expresar el valor en
unidades scoville. Cada grupo deberá tener el reporte obtenido en el EzChrome donde estén las
integraciones de los picos, de manera que les permita a los estudiantes hacer los cálculos de su
muestra.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Capsaicin and Dihydrocapsaicin Determination in Chili Pepper Genotypes Using Ultra‐Fast
Liquid Chromatography. Usman et. al. Molecules 2014, 19, 6474‐6488;
doi:10.3390/molecules19056474
 AOAC Official Method 995.03. Capsaicinoids in Capsicums and Their Extractives Liquid
Chromatographic Method
7


Laboratorio 7: Obtención del ácido shikímico a partir de semillas de Illicium verum (anís estrellado).

OBJETIVO:

 Purificar, aislar y caracterizar el Ácido Shikímico a partir de Illicium verum (anís

estrellado) a través de técnicas analíticas de extracción.

1. MARCO TEÓRICO

El ácido shikímico se aisló por primera vez en 1885 de la planta japonesa “SHIKIMI‐NOKI” Ilicium
religiosum por Eijkman. A partir de entonces se convirtió en un compuesto muy importante, ya que,
este da lugar a la síntesis de diversos compuestos, entre los que se pueden encontrar aminoácidos
aromáticos (fenilalanina y tirosina), indol (derivados del indol y el aminoácido aromático triptófano),
muchos alcaloides y otros metabolitos aromáticos, taninos, flavonoides, y lignina. Hoy en día, tras
una serie de estudios, se ha concluido que este ácido se puede encontrar como metabolito de
muchas plantas y organismos no mamíferos, a los que otorga un patrón de oxigenación.
La Organización Mundial de la Salud alertó, en abril del 2009, la existencia de una nueva cepa del
virus de la influenza, denominado AH1N1, y en junio del mismo año, debido a su propagación global,
la declaró como pandemia.
El fármaco que se utiliza para combatir dicha enfermedad es el oseltamivir, comercialmente
conocido como Tamiflu, cuya materia prima es el ácido shikímico. Dicho ácido es importado de
diversos lugares por los laboratorios Roche.
En la actualidad el ácido shikímico se obtiene a partir del anís estrella chino; sin embargo, su escasez
ante el incremento de su demanda, a partir del año 2005 a consecuencia de la pandemia H5N1, y el
consiguiente aumento de su precio, el cual se ha quintuplicado en los últimos meses, conlleva a la
búsqueda de fuentes alternativas de la materia prima requerida en la síntesis del fármaco
oseltamivir. [1]

1



correcta de hacerlo

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES


ITEM Cantidad Unidades
Mortero con pistilo
1
Beakers de 100 mL
3
Sistema de Extracción Soxhlet
6
Matraz de fondo redondo 250mL
7
Varilla de vidrio
7

2
Soporte universal
3
Pinza medina con nuez
3
Beaker 250 mL
14
Columna de cromatografía 250 mL
7
Carbón activado 500 g
Papel de filtro 10 cm diámetro 3
Pipetas paster plásticas 7
Probeta de 50 mL 1
Pipetas de 1,2 y 5 mL 1
Espátula cuchara 1

3.2 REACTIVOS


Reactivos Cantidad Unidades
Etanol 95% 1 L
Formaldehído 37‐40% 50 mL
Hexano 1L L
Resina de Intercambio iónico G
(Amberlite IRA‐400) 50
Solución ácido acético 25% 1 L
Metanol 500 mL
Tolueno 100 mL



Reactivos Cantidad unidades
Semillas de anís estrellado. 50 G

3.4 EQUIPOS

3


Equipos Cantidad
Baño María 1
Plancha de calentamiento 1
Cámara UV 1
Balanza semi‐analítica 1


 Tomar 25 gramos de anís estrellado Illicium verum, triturarlo y extraer mediante sistema
Soxhlet con etanol 95% (125 mL) durante 2h.
 Evaporar el disolvente de la muestra extraída en el equipo de rotaevaporador hasta obtener
un aceite de coloración verde, posteriormente redisolver la muestra en 145mL de agua
destilada tipo I y calentar a 80ºC.
 Eliminar la capa aceitosa formada con la solución acuosa por medio de una pipeta Pasteur.
 Calentar durante 5 minutos (ebullición), adicionar a la solución de trabajo aproximadamente
5 gotas de una solución de formaldehído (37‐40%) y dejar enfriar.
 Desechar el precipitado formado, la solución restante disponerla para ser eluída a través de
una columna de intercambio iónico (Amberlite IRA‐400).
 Lavar la columna con 100 mL de agua tipo I.
 Eluir la columna con (185 mL de solución ácido acético al 25%), el eluyente amarillo será
colectado y sometido en un rotaevaporador con el fin de remover el ácido acético presente,
hasta obtener un sólido de color naranja.
 Disolver el sólido en metanol, adicionar carbón activado (20g) y calentar. Filtrar y eliminar el
disolvente en el rotaevaporador.
 Recristalizar el sólido con metanol y tolueno y así obtener un sólido cristalino blanco
brillante. [2]
 Tomar espectros UV y FTIR y comparar contra la biblioteca espectral y reportar los resultados
obtenidos.

5 PREGUNTAS

5.1. Describir nuevas fuentes de obtención de ácido shikímico en la naturaleza.
5.2 Cuál es la relación existente entre el ácido shikímico y la influenza AH1N1?
5.3 Explicar el por qué el uso de formaldehído, ácido acético y carbón activado en el
procedimiento de extracción.

6 BIBLIOGRAFIA
[1] C. Rius, “OBTENCIÓN DE ÁCIDO SHIKÍMICO A PARTIR DE,” no. May, 2014.
[2] M. Edmonds and R. Payne, “Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed,” J. Chem. Educ., vol.
82, no. 4, p. 599, 2005.

4

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5 Flavonoides Hojas de Garciania madruno y flores de Sambucus nigra

6 Antocianinas Hojas de Brassica oleracea var. capitata

7 Lactonas (α,β‐insaturadas) Hojas de Nerium oleander, hojas de Thevetia peruviana

9 Cumarinas Corteza de Brunfelsia uniflora, frutos de Aesculus hippocastanum.

4.5.1.Procedimiento para eliminar interferencias en pruebas colorimétricas (exceptuando la

Carotenoide Solvente λ max

Diclorometano 60 mL

n‐ hexano 150 mL

Acetato etilo 150 mL

Éter 25 mL

Cloroformo 50 mL

Metanol 50 mL

2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

2.3 Manejo de Residuos químicos

Anhídrido acético 50 mL

Cloroformo 200 mL

Acido fórmico 20 mL

Acetato de etilo 300 mL

Diclorometano 200 mL

tolueno 100 mL

KOH 10 mL

HCl 20 mL

0,3 Linalool Azul intenso

0,9 Metilchavicol Rojo violeta

0,2 I Oxidos A y B bidabolol Amarillo/verde

0,25 II Alcohol terpenoide Violeta

0,35 III Bisabolol Violeta

0,5 ‐0,6 IV Poliinas Pardo

0,95 V Azuleno Rojo‐violeta

0,45 Cineol Azul intenso

0,7 Acetato de bornilo Azul intenso

0,99 Alfa beta‐pineno Violeta

0,73 Valtrato/Isovaltrato Azul

0, 65 Dihidrovaltrato Pardo

0,55 Acelvaltrato Azul

0,4 IVDH_Valtrato Azul

< 0,4 Valtrahidrinas Azul

Rf SUSTANCIA COLOR

0.5 Bilobálide Verde

0.45 Ginkgolido A Azul

0.4 Ginkgolido B Verde

0.3 Ginkgolido C Azul verdoso

Rf SUSTANCIA COLOR

0.75 Isoquercitrina, astragalin, dihidrokaempferol‐7‐o‐glicósido Verde amarillo

0.6 Quercitrina Naranja amarillo

0.5 Kaempferol y quercetin ramnósido Azul claro (celeste)

0.45 Narcissina e isoramnetina rutinósido Verde amarillo

0.4 Rutina, quercetina y kaempferol isoramnetin glucopiranosido Amarillo y naranja verde

0.05 – 0.15 Ginsenódio Rc Rojo claro

Xileno 20 mL

Tolueno 10 mL

Acetato de etilo 100 mL

HCl 20 mL

Hexano 400 mL

Tipo de separación Fase reversa isocrático

Formaldehído 37‐40% 50 mL

Metanol 500 mL

Tolueno 100 mL

Acetato de etilo 100 mL

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