“AÑO DEL DIALOGO Y LA RECONCILIACION NACIONAL”

FACULTAD DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA

AGROINDUSTRIAL

DOCENTE : ING. NELSON GARCIA GARAY

ASIGNATURA:MICROBIOLOGIA
AGROINDUSTRIAL

TITULO : FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE,

COLORACION GRAM Y LA GALERIA BIOQUIMICA OxNiGLUMoCISKAD

ALUMNO : FRANCISCO LANCHA CHUQUILIN

CODIGO : 75404076

CICLO : IV CICLO

MORALES – SAN MARTÍN

2018
 I. INTRODUCCIÓN.

Existen un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del

intestino del hombre y de los animales representados por bacilos Gram negativo
no esporulado que se encuentran también en excretas, aguas, pastos, suelos,
alimentos y vegetales al estado y en descomposición.

Nos estamos refiriendo a los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo

conocimiento racional y orgánico permite establecer el diagnóstico inmediato de
las enfermedades entéricas, dictar las medidas de orden epidemiológico y
establecer las causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman
un extenso capítulo de la patogenia infecciosa del país.

El conocimiento de estos seres vivos, es obligatoria en los estudios

microbiológicos, no sólo porque algunos géneros y especies ocupan destacada
posición en la patogenia entérica de origen humano animal, sino porque también
es una base fundamental en la sanidad pública y en el diagnóstico bacteriológico
en general. Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora
microbiana del intestino del que se encuentran también en la excretas, aguas,
pastos, suelos, -alimentos y vegetales al estado.
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE, COLORACION GRAM Y LA GALERIA
BIOQUIMICA OxNiGLUMoCISKAD

II. OBJETIVO.

- Hacer que el alumno recuerde las técnicas y procedimientos básicos de

Microbiología General, para poderlos aplicar posteriormente en el control
microbiológico de los alimentos.

III .REVISION BIBLIOGRAFICA

A las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo

esporulados, móviles o inmóviles, provistos de flagelos en perítrico, que
adoptan la forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patológicamente
como huéspedes en el intestino del hombre y de los animales, se les halla en
los alimentos en descomposición, excretas de origen humano y animal, en
las aguas del albañal y emuntorios en general viven saprofíticamente en las
materias orgánicas en descomposición. Gran número de especies que
integran esta familia son patógenas pura el hombre y los animales;
produciendo infecciones graves en forma individual, endémica y epidémica
(Guia de microbiología agroindustrial).

Características de las Enterobacteriaceae

En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios

básicos, adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir
a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que
forman parte de esta familia:

 Son bacterias Gram negativas, la mayoría bacilos, otros

cocobacilos y otros pleomórficos.
 No son exigentes, son de fácil cultivo.
 Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa
positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
 Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
 Son anaeróbicos facultativos.
 Son fermentadores de carbohidratos en
condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en
especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de
substratos en condiciones aeróbicas.
 Clasificacion de la enterobacterias

 Escherichia coli es un habitante intestinal. No es con mucho el más

abundante numéricamente, sino que está por detrás de Bacteroides y
Bifidobacteriurn. No obstante, E. coli se mantiene viable un cierto tiempo
fuera del intestino y es fácilmente demostrable. Por ello es apropiado
utilizarla como demostración de contaminación fecal en las aguas de
bebida.
 Proteus vulgaris pertenece también a la flora intestinal normal pero
asimismo está ampliamente distribuido en el suelo y en las aguas. Esta
bacteria es conocida debido a su tendencia a la modificación de forma
(nombre), su intensa actividad y la tendencia a diseminarse sobre las
superficies de agar y cubrir toda la superficie.
 Enterobacter aerogenes es en cierto modo el hermano gemelo de E.
coli; ambos se designan como "Coliformes". Es muy abundante en los
suelos. Tal como indica su nombre, esta bacteria forma mucho gas. Se
diferencia de E. coli tan s610 par unas pocas características bioquímicas.
 Serratia marcescens (anteriormente Bacterium prodigiosum u "hongo de
las hostias") puede ser considerada como una variante pigmentada de
 Enterobacter. Al género Erwinia pertenecen algunas especies pat6genas
de vegetales, que afectan a los vástagos, las hojas y las raíces y que
desencadenan enfermedades debido a la excreci6n de pectinasas.
 Klebsiella pneumoniae se diferencia de Enterobacter exclusivamente
para la formaci6n de una capsula gruesa y por su falta de motilidad. Se
presenta en algunas formas muy peligrosas de inflamaci6n de los
pulmones.
 Salmonella typhimurium es la bacteria más extendida de entre aqueas
que provocan una gastroenteritis, la Hamada "intoxicación por productos
alimentarios". Esta intoxicaci6n se debe a la liberaci6n de
lipopolisacaridos que desencadena una irritaci6n de las mucosas; no se
da ninguna invasi6n del sistema sanguíneo. S. typhi es el causante del
tifus epidémico.

 Shigella dysenteriae y cepas relacionadas son los causantes de la

disentería y las diarreas.
 Vibrio cholerae es el causante del colera, una enfermedad epidémica.
Este agente causal no pertenece al grupo de las Enterobacteriaceae, pero
desde el punto de vista metabolico y fisiol6gico es muy pr6ximo. V.
cholerae se reproduce en el intestino. Se fija sobre el epitelio intestinal,
pero no penetra en las células. La enterotoxina del co1era es una
proteína, que se fija a las células del epitelio intestinal (unos receptores
específicos) y que determina la salida de iones sodio, bicarbonato y
cloruro, as! como de agua a la luz intestinal.
 Yersinia pestis es el causante de la peste. Yersinia no pertenece al grupo
taxonómico de las Enterobacteriaceae, pero es muy pr6ximo desde el
punto de vista de su modo de vida facultativamente anaer6bico y de su
tipo de fermentaci6n. EI reservorio natural del causante de la peste son
los roedores salvajes, sobre todo ratas. Las bacterias son transmitidas par
pulgas infectadas 0 por otros ectoparásitos hasta el hombre y conducen
a la peste bub6nica o a la peste pulmonar. Mediante una multiplicaci6n
 rápida y la producci6n de una fuerte toxina conducen rápidamente a la
muerte. (Microbiología General Hans. Scheler nueva edición).

II. MATERIALES Y METODOS

A) Coloración Gram a partir de una cepa marcada

- Desengrasar un porta-objeto con alcohol-acetona y algodón.

- Descolgar una gota de agua estéril, suspender en ella una pequeña cantidad
de cepa problema y homogenizar.

- Dejar secar y flamear suavemente la extensión para fijarla.

- Cubrir con una solución del colorante primario. Cristal violeta u otro similar y
dejar en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de caño.

- Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar.

- Decolorar con la solución de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.

- Cubrir con solución de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto

por 30 segundos. Lavar.

- Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersión y observar al

microscopio. Anotar los resultados.

B) Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD para Enterobacteriaceaes

A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioquímicas:

- Reacción de la Oxidasa (Ox)

- Reducción de los Nitratos (Ni)

- Fermentación de la Glucosa (G)

- Fermentación de la Lactosa (L)

- Hidrólisis de la Urea (U)

- Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)

- Asimilación del Citrato (C)

- Formación del Indol (I)

- Formación del Ácido Sulfhídrico (S)

- Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K)

- Transformación de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirúvico APP (A).

C) Fundamento v procedimiento de las pruebas bioquímicas
para la familia Enterobacteriaceae

Constituida por gérmenes de bastón Gram negativo móviles (flagelos en

peritrico) e inmóviles, Oxidasa negativos. Nitratos son reducidos a nitritos. Todas
fermentan la glucosa con o sin producción de gas, la diferencia de estas
bacterias se basan en el comportamiento bioquímico, tratamiento recomendado
por MOSSEL-QUEVEDO y llamado: Ox Ni G L U Mo C I S K A D

Oxidasa (Ox)

Llamada también Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias
que la: poseen, oxidan al tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).

Prueba: En una placa petri colocar un papel de nitro, humedecer este con el
reactivo de Kovacs (solución de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua
destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se
oxida con el aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estría de cultivo
joven (18 a 24 horas de incubación) de más o menos 5 mm de longitud considerar
la prueba como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las
enterobacterias no deben dar esta reacción.

Reducción de Nitratos (Ni)

Las bacterias que poseen las enzimas nitrato-reductasa, tienen la propiedad de

reducir los nitratos a nitritos.

Prueba: Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga

además 1/1000 de Nitrato de Potasio. Después de incubar a 37°/24 horas, añadir
gotas de solución A y de solución B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo
sólido formado por ácido sulfanílico, ácido tartárico, y alfa-naftil -amina.

La prueba es positiva sí aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha
coloración agregar sobre el cultivo que contiene e! reactivo, Zn o Mg en polvo;
observar después de 10 minutos si la coloración es rojiza, considerarla como
negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen el que se ha reducido
en nitratos.
 PRUEBA MEDIO CULTIVO Tº Y TIEMPO REACTIVO A RESULTADO

DE INCUBACIÓN AÑADIRSE POSITIVO

Tetrametil
Ox -.-.- -.-.- Sin coloración
parafenil

endiamina
Ni Caldo nitrato 37ºC X 24-48 H Reactivo gries Color rojizo
G Agar glucosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo
L Agar lactosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo
U Caldo urea 37ºC X 24-48 H Color grosella
intenso
Mo Agar Movilidad 37ºC X 24-48 H Turbidez
C Agar Citrato 37ºC X 24-48 H Color azul
simmons
Reactivo Anillo rojo
I Caldo peptonado 37ºC X 24 H grosella
de kovacs
S Agar kligler 37ºC X 24 H Coloración negra
Agar base + 0.1 Disco blanco en
K ml de CNK 0.5% 37ºC X 18-24 H superficie
A Agar fenilalanina 37ºC X 18-24 H Sal Férrica Color verde
D Agar lisina fierro 35-37ºC X 24-48H Color púrpura

Fermentación de Glucosa, Lactosa y Producción de H S(GLS)

El H;S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desanimación

de aminoácidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos), En el medio, el H 2S formado,
reacciona con la sal de Fe contenido en él y da sulfuro de fierro (FeS) de color
negro. La prueba en condiciones aerobias, es reversible.

Prueba y lectura: Se puede realizar en un sólo medio: Kligler (Hierro dos

azúcares), en el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estría en
la superficie. Incubar a 37°C, por 18 a 24 Horas.

Parte inferior amarilla: Fermentación de Glucosa.

Parte superior amarilla: Fermentación de Lactosa.

Ruptura del medio: Producción gas (Glucosa)

Ennegrecimiento en la puntura de inoculación: H2S positivo, indicador del

medio: Rojo de fenol
Hidrólisis de Ia.Urea (U)

Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea,

alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de
fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva).

Medio de cultivo: Caldo úrea

Prueba: Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-sólido (agar nitratado

que lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por
puntura, introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, sólo en una de
las ramas.

Lectura

Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un

enturbiamiento

Se ertienJe desde la rama cultivada a la otra.

KNO3: Fuente de Oxígeno, necesaria para la movilidad de! germen aerobio.

Asimilación del Citrato (C)

Las enterobitcterias que utilizan el Citrato de Sodio como única fuente de

Carbono, alculinizun el medio agar Citrato de Simona, haciendo virar el indicador
azul de bromo timol, del verde al azul intenso. Para esta prueba hay que tener
las siguientes precauciones:

-Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir
allí los posibles restos de materia orgánica que pudiera contener.

- Realizar siempre la siembra a partir de un medio sólido porque con medio

líquido se arrastraría restos de materia orgánica.

- Realizar la siembra en pequeña cantidad y trazando sólo una línea a lo

largo de la superficie de inclinación.

Producción de Indol(I)

Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminoácido

triptofano. Uno de los productos finales de esta degradación es el Indol.

Prueba: Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptona do,

adicionar el reactivo de Kovacs pura Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la
superficie.
Tolerancia al Cianuro de Potasio (K)

Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente

al OTK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le
ha colocado previamente 0.1 mi. De uní solución al 0.5%. Se usan tubos de 8 x
160 mm-, y se siembran tres usadas de más o menos 6 mm. De diámetro, a partir
de un cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas como máximo.

Lectura:

Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.

Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie

completamente

Transparente, o ausencia total de desarrollo.

Prueba de Ácido Phenil Pirú vico (A)

La fenilalanina, es un aminoácido que determinadas enterobacterias pueden

transformar en ácido phenil pirúvico.

Prueba: Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estrías) aminoácido

en estudio. Después de la incubación a 37ºC por 24 horas, investigar en el medio
la presencia de ácido fenil pirúvico, adicionando unas gotas de sal férrica (Cl2
Fe). Prueba positiva: Aparición inmediata de color verde.

Descarboxilacion de la lisina (D)

Ciertas enterobacterias pueden transformar por desearboxilación la lisina en

Cadaverina, que por desanimación libera grupos amino (NH3), bajo la forma de
NH, alcalinizando e! medio de cultivo.

Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y
púrpura de bromocresol como indicador del medio

Lectura. Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba como

positiva si el Violeta varía al color púrpura.

Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentación de la glucosa.

 III. RESULTADOS

RESULATADOS DE A

Luego de realizar todos los procedimientos de Coloración Gram a partir de una

cepa marcada se obtuvo los siguientes resultados:

*Las positivas retienen el colorante primario la gran negativa no retiene el

colorante primario

*Enterobacterias gran negativas da un color entre rosado y rojo

*Gran negativos da un color violeta

RESULTADOS DE B Y C DE OXNIGLUMOCISKAD PARA

ENTEROBACTERIACEAES

De acuerdo a EDWARDS (1960)

DIV GRUPO Ox Ni G L U Mo C I S K A D

1 Shigela - + + - - - - - - - - -

Alkalencens-Dispar - + + +- - - - + - - - +-

Escherichia
- + +g +- - +- - +- - - - +-

2 Salmonella - + +g - - +- + - - +- - +*

Arizona - + +g -+ - + + - + - - +

Citrobacter - + +g +- - + + - + + - -

Bethesda-Ballerup - + +g - - + + - + + - -

3 Enterobacter - + +g + -+ + + - - + - +-

Hafnia - + +g - -+ - + - -+ + - +

Klebsiella - + +g +- + - + -+ - + - +
 Serratia + +g -+ - + + - - + - -

4 Proteus vulgaris - + +g - + + +- + + + + -

Proteus mirabilis - + +g - + + +- - + + + -

Proteus morgani - + +g - +- + - + - + + -

Proteus rottgeri - + +g - -+ + + + - + + -

Providencia - + +g - - + + + - + + -

Comparación de los resultados de laboratorio con la de literatura

Tratamiento Resultados Resultados de

obtenidos en Gram:A literatura
(Shigela )

Ox - -

Ni + +

G + +

L + -

U - -

Mo - -

C + -

I - -

S - -

A - -

K - -
 D - -

Los resultados después de realzar la practica se determino que las muestras

tuvieron presencia de la entero bacteria de shygella esta a la vez se caracteriza
de no fermentar la lactosa ser inmóvil, no produce lisina tambien podemos
observar en la imagen el microorganismo de forma de bara alrgados,etc
 IV. DISCUCIONES

Según la teoría de EDWARDS (1960) en compararacion a los reultados obtenido en

el laboratorio se pudo notar dos diferencias en L Y C ,se tomo como resultado la
shygela por era la que mas se asemejaba a la teoría y como podemos notar en la
imagen la shigela es negativo en fermentación de lactosa y en cuanto a la asimilación
de citrato es positiva.

V. CONCLUSIONES

- En la práctica se pudo comprobar, de acuerdo a los procedimientos

realizados la presencia de shygela en las muestras debido a la coincidencia
de los datos obtenidos con los de la tabla de diferenciación que nos sirve
para la comparación de los resultados.

VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFIA

-EPIFANIO MARTINEZ MENA 2000. “Manual de Practicas de Microbiología

Aplicada”.Primera reimpresión Tarapoto-Perú

-MADIGAN, Michael T., MARTINKO, John M., ADDISON-WESLEY, “BROCK.

BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS”. 12ª edición. 2009
 VII. ANEXOS

CUESTIONARIO

1) ¿Por qué las bacterias Gram negativas retienen el colorante de

contraste, durante la coloración Gram?

La razón por la cual se da esta característica es porque el yodo forma con el

cristal una molécula soluble por lo que se da una fijación a las bacterias gram
negativas por la permeabilidad de la membrana celular y debido al punto
isoeléctrico menos acido por lo que se demuestra la poca afinidad con los
colorantes básicos.

2) Mencione diferencias entre bacterias Gram negativas y bacterias gram

positivas.

Gram negativas: Gram positivas

- Retiene el colorante de contraste -Complejo CVI se forman dentro de

las bacterias y estas permanecen
-Su coloración es roja violetas
-Sus proteínas tienen un punto -Sus proteínas presentan un punto
isoeléctrico menos acido isoeléctrico más ácido
-Complejo CVI se forma dentro de las -No presentan capa lipídica
bacterias y permanecen violetas

-Presenta capa lipídica

3) Describa a las bacterias entéricas y nombre a los géneros más
representativos, dando características de cada uno de ellos.

Son parásitos de animales y de algunas plantas que son gram negativos y todas
las especies atacan a los carbohidratos ya que en su mayoría reducen nitrato o
nitrito.

Echerichia: Se encuentra en el tracto intestinal de los mamíferos y utiliza como

única fuente de carbono el ácido cítrico. Las especies de Escherichia coli
oportunistas producen infecciones sólo si abandonan el colon. Otros grupos
producen hasta el 90% de las diarreas infantiles y la denominada diarrea del
viajero. Se desarrollan entre 15ºC y 45ºC pero optima de 22ºC con un pH óptimo
de 1, son gram negativos y suelen morir a 60ºC en 30 minutos

4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos géneros de la familia

Enterobacteriaceae.

 Salmonella: Gastro enteritis por salmonella más conocida como

salmonelosis.

 Salmonella thipy: Produce la fiebre tifoidea.

 Shigella: Produce disentería que es una enfermedad aguda o crónica del

intestino grueso del humano.

 Vibrio Cholerae: Produce cólera.

 Echerichia coli: Produce gastro enteritis.