UNIVERSIDAD AGRARIA LA MOLINA

INFORME PRÁCTICO N° 2:

¨CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA

FINA Y SOBRE PAPEL ¨

ALUMNOS:

- Vásquez Zúñiga, Patricia (20140998)

- Pinto López, Xiomara (20140077)
- Lázaro Corcuera, Enrique (20141315)
- Reyes Vergara, Josef (20130389)

ASIGNATURA: Laboratorio – Química Orgánica

PROFESOR: Carlos Alvarado

Fecha de entrega: 25 de Mayo de 2015

 1. FUNDAMENTOTEÓRICO

INTRODUCCIÓN

En estapráctica utilizaremos el método de lacromatografíauno de los principales métodos

para la separación de especies químicas estrechamenterelacionadas en mezclas complejas. La
cromatografía es un método físico de separación basado en ladistribución de los componentes
de una mezclaentre dos fases inmiscibles, unafijao estacionariay otra móvil.

En todas las separaciones cromatografías lamuestrase disuelveen unafase móvil, que puede
serun gas un líquido o un fluido supercrítico. Estafase móvil se hace pasara través de una fase
estacionariainmiscible, lacual se mantienen fija en unacolumnao sobre una superficiesólida.
Las fases se eligen de tal formaque los componentes de lamuestrase distribuyen de modo
distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con
más fuerzaporla fase estacionariase mueven lentamente con el flujo; porel contrario los
componentes que unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuenciade ladistintamovilidad, los componentes de lamuestrase separan en bandas
discriminadas que pueden analizarse cualitativay cuantitativamente.

MARCO TEORICO

La cromatografíase utilizaparalograr la separación de los componentes de unamezclacomo

para medirlaproporción de cada elemento en lamezcla.

Fases de la cromatografía

Las cromatografías se hacen en dos fases. Una estáticay otra móvil.

En la fase estática o estacionaria, lamezclase colocasobre un soporte fijo, porejemplo papel.
En estafase tenemos yala mezclasobre un soporte, en nuestro ejemplo un papel.
En la fase móvil se hace moverotra sustanciasobre lamezclaque ya estásobre el soporte de la
fase estática, porejemplo un líquido que se mueveporel papel con lamezcla. En la fase móvil
empezaráel proceso de separación de los componentes de lamezclaal moverse a distintas
velocidades porel líquido los distintos componentes de lamezclasobre el papel.

Cromatografía en columna

Es utilizado paralaseparación, a lavez que para lapurificación, de diferentes compuestos

orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido.
En la cromatografía en columnalaseparación se consigue haciendo fluir lamezclaatravés de
una columnade adsorbente. Los compuestos emergen de lacolumnaatiempos diferentes, y
pueden serrecogidos en fracciones separadas.

En una columnacromatográficase deben teneren cuentalos siguientes términos:

 Matriz de lacolumna. Sustanciaque estáempapadade solvente y que se empaqueta

en la columna. También se denominael lecho de lacolumna.
 Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaquetalacolumna.
 Volumen de lacolumna. Volumen total de gel que se empaquetaen unacolumna
cromatográfica.
 Volumen muerto de lacolumna. Cantidad de solvente que tieneque atravesarla
columnapara asegurarque se ha reemplazado completamente.
Comúnmente se suele usarcomo adsorbente alúminao sílice. Las fases móviles se usan en
función de lapolaridad de los compuestos aseparar.

Cromatografía en papel

Es un proceso muy utilizado en los laboratorios pararealizaranálisis cualitativos yaes sencilla

de implementary no requiere de equipamiento sofisticado. En estatécnicalafase estacionaria
estáconstituidasimplementeporunatira o circulo de papel de filtro. La muestrase deposita
en un extremo colocando pequeñas gotas de unasolución de lamuestray evaporando el
disolvente luego de cadaaplicación. Luego el disolvente o mezclade disolventes empleada
como fase móvil (eluente o eluyente) se hace ascenderporcapilaridad. Paraesto se colocauna
porción del papel en contacto con la fase móvil dentro de un recipienteque lacontiene
(cámara de desarrollo). Después de unos minutos, cuando el disolvente dejade ascendero ha
llegado al borde extremo del papel, se retirael papel y seca. Es importante que lacámara de
desarrollo permanezcabien tapadadurante el proceso de ascenso capilarde la fase móvil
(desarrollo cromatográfico), pues de lo contrario no se alcanzael equilibrio necesario entre el
líquido (fase móvil) y el vapordel líquido. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias
tienen colorpropio se deberán vermanchas de distinto colorseparadas a lo largo del papel.
Cuando los componentes no tienen colorpropio el papelse somete aprocesos de revelado. La
cromatografía es un sistemade separación dinámica, porque continuamente se producen
equilibrios entrelos componentes de lamezclaaseparary las fases móvil y estacionaria. El
proceso de separación se produce a causa de las interacciones entrelos componentes de la
mezclacon la fase móvil y la fase estacionaria; lo cual causa la distribución de los componentes
de la mezclaentre las dos fases. A este proceso se le denominapartición de los componentes.
Las interacciones mencionadas pueden tenersu origen en dos fenómenos : 1. La adsorción,
que es un fenómeno de interacción superficial porel cual átomos, iones o moléculas son
retenidas en la superficiede un material. Puede serde dos tipos: a) Fisisorción, debidaa
fuerzas atractivas débiles, generalmentefuerzas de Van der Waals; es la forma más simple de
adsorción. b) La quimisorción ocurre cuando se formaun enlace químico 2. La absorción, es un
fenómeno de retención que incluye lapenetración de unaespeciequímicaen todo el volumen
del material porlo cual se la consideracomo un fenómeno másico y no superficial. Un ejemplo
de absorción es la disolución de unaespecieen un disolvente.

Etapas en la realización de una cromatografía

Cromatografía en columna

1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.

1.1.- Equilibrado de lacolumna.

2.- Aplicación de lamuestra.

3.- Elución:
a) Lavado de componentes no retenidos.
b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dichade los componentes
retenidos.

4.- Recolección de fracciones o análisis delefluente en continuo.

5.- Análisis, cuantificación o revelado.

6.- Regeneración de la fase estacionaria.

Cromatografía plana (papel o capa fina)

1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.

2.- Aplicación de lamuestrasecado.

3.- Desarrollo de lacromatografía.

4.- Secado de la placa.

5.- Revelado y cuantificación en su caso.

2. OBJETIVOS:

A. OBJETIVOS GENERALES:

- El objetivo de este experimento es lograr aplicarlatécnicade cromatografía para la

separación de sustancias de maneraeficiente.

B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

EXPERIMENTO N° 1

a) Trabajar con placas de cromatografía en capa finay de papel de dimensiones

particularmente menores. Paraun análisis más directo y poderobservarel
comportamiento en estatécnica.

b) Diferenciarlacromatografíaen papel de lacromatografía en capa fina.

Interpretarlos valores de Rf.

EXPERIMENTO N°2

a) Aplicarlacromatografía en columnapara separaruna mezclade azul metileno - naranjade

metilo.
b) Observarque compuestos de lamezclase desplazan amayor velocidad.
3. APARATO Y REACTIVOS:

LISTA DE MATERIALES:

EXPERIMENTO N°1: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y SOBRE PAPEL.

- Mezcla - 3 capilares - Capa fina

- Azul de metileno - Silicagel
- Anaranjado de - 2 Cámaras
metileno - Cinta de papel

EXPERIMENTO N°2: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

- Mezcla - Gotero
- Etanol - Aguaacidulada
- Algodón - Columna
- Silicagel cromatográfica

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N°1: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y SOBRE PAPEL.

Para realizarel experimento nos asignaron los materiales

descritos en el punto 3.
Procedimos a colocar en cada capilarlas muestras.

Luego procedimos arealizar lasiembra uno de

cada uno tanto en lacapa finay en el papel;
previo a haberrealizado un trazo de una línea
a 1cm de la parte inferiordel papel y lacapa
fina.
Por último los colocamos acada uno en las cámaras y
dejamos reposarhastanotar que el solvente estuviera a
punto de llegaral borde superiorde laplaquita.

EXPERIMENTO N°2: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

 Para realizarel experimento nos asignaron los materiales descritos en el punto 3.

Procedimos a introducirun trozo de algodón hastael fondo de la

columna.
Adicionamos etanol y se agregó la suspensión de silicagel y se
agitó

Luego para la siembrase agregó la mezclay se abrió la llave hasta

que todo el colorante fue absorbido.

Se fue agregando etanol para que el colorante se desplace más

rápido.

5. RESULTADOS

EXPERIMENTO N°1: CROMATOGRAFÍA EN

CAPA FINA Y SOBRE PAPEL.

- Obtuvimos que el Rf del anaranjado de

metileno vario mucho en comparación al
azul metileno y lamezcla, estos dos últimos
estuvieron en unaproporción muy cercana.

EXPERIMENTO N°2: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

- El primercompuesto en bajarfue el anaranjado de

metileno mientras que el azul de metileno se quedó en la
columna.

6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES:
 Respecto de las conclusiones podemos señalarlo siguiente:

EXPERIMENTO N°1: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y SOBRE PAPEL.

 Con esta técnica de cromatografía en capa fina nos ayuda a comprobar que existen
diversos tipos de un solo compuesto.
 Se pone en una camara una placa fina con tres compuestos que son sembrados.
 La camara contiene 1-propanol: butanona: agua en proporcion 4:1:1
 Los compuestos sembrados son unamezcla, metilo-azul, y anaranjado de metilo-azul)
 Al analizar se obtiene que el anaranjado de metilo avanzo más, en segundo lugar la
mezcla y por ultimo el azul-metilo
 Los coeficientes de reparto obtenidos fueron para la mezcla (0,27 cm), para el
metileno (0,24 cm) y para el anaranjado de metilo (0,94 cm)

EXPERIMENTO N°2: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

 Se procede a mezclar agua acidulada y etanol en proporción 1:1

 Se pone algodon en el fondo y se le agrega silicagel.
 Con el tiempo los colores empiezan a diferenciarse en la parte superior se aprecia un
color naranja y en la superficial un morado.
 Esto ocurre por las diferentes polaridades de los compuestos observados.

7. CUESTIONARIO:

CUESTIONARIO CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y PAPEL:

1) ¿Qué se entiende por RX?

Cuando el desplazamiento delsoluto es muy pequeño respecto al del disolvente y es necesario

pasar mucha fase móvil paraque se desarrolle el cromatograma, es preferible medirla
distanciarecorridaporel soluto frente aotra sustanciatomada como referencia. En este caso
el factor se denomina RX

Distanciarecorridapor el frente de la sustanciaproblema

Distanciarecorridapor el frente de la sustanciapatrón

2) ¿Cuáles son las diferencias entre lacromatografía en capa fina y la de papel?

La diferenciaes el soporte donde se hace la separación cromatográfica.

La de papel, como su nombre indicaes un papel, donde ponemos el formalíquidalos
compuestos que queremos separary luego lo metemos en unacámara (cubetade desarrollo)
de vidrio, con una atmosferade un disolvente o mezclade ellos que, unavez acabado el
desarrollo (el líquido sube porel papel separando los compuestos) y los revelamos (hacemos
visibles los compuestos tiñéndolos con un espray fluorescente o aplicación de ácidos) nos
muestras los componentes separados adistintas alturas del papel (coeficiente Rf).
En la de capa fina, el soporte es unaplacade vidrio o aluminico con una"finacapa" de
producto sólido adherido a lamisma. El proceso es el mismo que el papel, pero laventajaes
que como aplicamos un producto para crear la capa, este puede serel que más nos interese. El
más común es la sílice.

3) Cite algunas aplicaciones de la cromatografía en su especialidad

Las aplicaciones prácticas de lacromatografía se encuentran porejemplo en laproducción,

donde se usa lacromatografía para la limpiezay aislamiento de sustancias. Porotro lado, en la
analíticaquímica se usa la cromatografíapara separarmezclas en compuestos homogéneos. La
cromatografía juegaun papel importante en muchos sectores, como laquímicaorgánica, la
bioquímica, laquímicainorgánica, laquímicaambiental y laquímica alimenticia.

4) Interprete los valores de Rf 0.05, 0.6 y 0.98

5) Introducirá algún cambio cuando se tiene un Rf de 0.05 ¿Por qué?

6) Explique algún método para localizar las bandas de adsorción cuando se trabaja con
sustancias incoloras en una columna

Aunque los compuestos incoloros pueden formarbandas bien definidas en unacolumnade

adsorción cromatograficase necesitalautilización de métodos especiales paralalocalización de
las bandas de los productos adsorbidos y parapodersepararlos convenientemente. Parala
localización de las bandas de los productos adsorbidos se empleageneralmente unalámpara
ultravioleta

7) ¿Qué es la electroforesis y cual es su principal aplicación en los compuestos

biológicos?

El ADN, propio de cada individuo, se encuentraen todas las células de nuestro cuerpo y se
puede obtenerfácilmente de las células de lamucosadel interiorde nuestraboca. La
electroforesis es unatécnicade laboratorio paralaseparación de moléculas en función de dos
factores: carga y masa. Al aplicaruna corriente eléctrica, un electrodo repele las moléculas de
igual carga, mientras que el polo opuesto atrae esas moléculas. Porotraparte, actúa la fuerza
debidaala fricción: las moléculas más pesadas avanzan más lentamente.

CUESTIONARIO CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

1) ¿Cuál es la principal utilidad de la cromatografía en columna?

La utilidad de lacromatografíaen columnase basa en el análisis, la separación o purificación

de sustancias o mezclade éstas a través de ciertas técnicas y métodos muy eficientes usados
en los actuales laboratorios de química.
2) ¿Qué fenómenos fijos intervienen en unacolumna cromatográfica que utilice Silicagel
comofase fija?

Los fenómenos físicos presentes son laadsorción y desorción, el primero consiste en que las
moléculas de unasustancia(adsorbato) se adhieren en la superficie de un sólido finamente
dividido (adsorbente, Silica Gel) y el segundo es la separación de las moléculas adsorbidas en la
superficie delsolido.
 3) ¿Cuáles son las principales diferencias entre un HPLC y una columna cromatográfica
simple?

Las principales diferencias derivan en que las columnas de HPLC el solvente o fase móvil circula
con gran dificultad (porsu empaquetamiento mucho mas compacto),porloque debeserimpulsadoa
altapresión(mediantebombasdealtapresión) ylascolumnassuelenestarconstruidasenmaterialesmuy
fuertescomo el acero inoxidable. Además, para lograr la máxima eficiencia de los
solventesusadosenHPCLdebentenerunmayorgradodepurezayel eluatoal salir de lacolumnapasaa
través de un detectorpara monitorearlapresencia delmaterial.

4) ¿Cuál es el factor que hace que la HPCL sea mucho mas eficiente que unacolumna
cromatográfica simple?

La mayor eficiencia de esta técnica se debe a que la fase estacionaria esta formadade
partículas esféricas muy pequeñas y de tamaño uniforme. Usándose micro esferas con un
tamaño de 5 a 10 micrones.

5) Estamos operando una columna cromatográfica usando como adsorbente

Silicagel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que noes
eluidoconestesolvente ¿Quécambiosintroduciríaparapodereluirlo?

Se tiene que cambiarde adsorbente generalmente lamezclade dos o tres adsorbentes de

distintapolaridad resultan más eficientes que absorbentes puros.

6) ¿Cómo es posible trabajar con unas sustancias incoloras en una columna

cromatográfica, sinoesposiblelocalizarlassustanciasdentrode unacolumna?

Se realizael análisis del eluato porcromatografíaen capa finao sobre papel. Como este
proceso es largo suele recibirse el eluato en muchos matraces o tubos de ensayo de
volúmenes similares, anotándoseen cadauno un número o cogidos que indique su orden de
salidade la columna(utilizando un colectorde fracciones el proceso se vuelve casi
automático).
Luego se juntan las fracciones que tienen igualo similarcontenido y se eliminao recuperael
solvente (pordestilación o usando un rota vapor) obteniéndose el residuo de cadafracción.
Posteriormente se pueden aplicarotros procesos de purificación (cristalización, destilación,
etc.) o de identificación de sustancias (puntos de ebullición, espectro IR, etc.

7) ¿Qué tipo de cromatografía utilizaría para eliminarlas sales minerales que están
contaminandounamuestrade cafeína?

Cromatografía en capa fina

8) ¿Qué es un colector de fracciones y cual es su principal utilidad?

La cromatografíaen columnaconstade tres etapas: llenado de columna, aplicación de

muestras y elusión. Durante laelusión se procuraque las primeras porciones delsolvente
sirvan para lavar las paredes de lacolumnay que toda la muestraseaadsorbidaporla fase fija.
Cuando se hace un análisis generalmenteporcromatografíaen capa finao sobre papel, este
suele serun proceso muy lento y suele recibirel solvente en muchos matraces que indican su
orden de salidade la columna. Es en estaparte que se usa el colectorde fracciones parallevar
el proceso de forma automáticaaprovechando lamayorcantidad de tiempo posible.
 9) ¿Qué diferencias encuentras entre la cromatografía de gases y la cromatografía de
columna?

Criterio Cromatografíade columna Cromatografíade gases

Fasefija liquido Liquido
Fasemóvil solido Gaseoso
Fenómenofísicopredominantey Adsorciónypartición Partición
estadofísicode lasfases
involucradas
Complejidadrelativa simple Complejo
Eficienciarelativa menor Mayor
Costorelativo barato Costoso
Automatización Casiautomática Automática

10) ¿Qué son “Resinas de Intercambio iónico” y cuál es su utilidad?

Las resinas sintéticas de intercambio iónico consisten en unamatriz poliméricareticuladapor

la acción de un agente entrecruzante y derivatizadacon grupos inorgánicos que actúan como
grupos funcionales. Son los materiales más habituales en las aplicaciones de intercambio
iónico en la industria.

8. BIBLOGRAFÍA:

Material de internet:

 http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna
 http://es.scribd.com/doc/14172697/6-Cromatografia-en-Columna#scribd