UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LIC. QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO.

¨DIAGNÓSTICO MOLECULAR¨

SEMESTRE:

6° “B”

TEMA:

CUESTIONARIO VINCULADO A LA EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO.

INTEGRANTES:

DAVID CÁRDENAS ABREGO

MARICRUZ MACARIO BARRIOS

JOSÉ MANUEL PÉREZ MORALES

KARLA ANDREA VILLATORO ARREOLA

TAPACHULA CHIAPAS A 17 DE AGOSTO DE 2018.

 INTRODUCCIÓN

Es uno de los métodos comúnmente usados y útiles para el aislamiento de ADN, la

extracción con fenol/cloroformo es seguida por la precipitación con alcohol (etanol
e isopropanol). El fenol usado en este protocolo es amortiguado para evitar que los
productos oxidados del fenol dañen a los ácidos nucleicos. Se debe tener cuidado
ya que el fenol puede producir severas quemaduras en la piel y puede dañar la ropa.
En la mayoría de los casos, esta mezcla provee una buena desnaturalizaciones las
proteínas y una fuerte interface entre la fase acuosa y la fase orgánica. Durante la
precipitación con etanol, las sales y otros solutos como residuos de fenol y
cloroformo se mantienen en solución mientras que los ácidos nucleicos forman un
precipitado blanco que puede ser fácilmente colectado por centrifugación.
 TECNICA TSNT

FUNDAMENTO:

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN

basándose en las características fisicoquímicas de la molécula. El procedimiento
general de extracción de ácidos nucleicos consiste en tres etapas consecutivas:
disgregación de las células o tejidos (lisis celular), inactivación de las nucleasas
intracelulares y en separación de los ácidos nucleicos de los demás componentes
celulares.

El ADN puede obtenerse de varias fuentes como sangre periférica, tejidos frescos,
congelados, células en cultivo, líquidos corporales, etc.

La técnica TSNT es uno de los métodos de extracción de ADN más empleados en

biología molecular. Cuyo nombre se debe a su composición:

 T= Triton (2%)
 S= SDS (1%)
 N= Sales (100mM NaCl)
 T= 10 mMTris-HCl pH=8

El primer paso consiste en lisar las células de sangre periférica (leucocitos) por
acción desnaturalizante de los detergentes (SDS y Tritón).

 EL SODIO DODECILO SULFATO

Desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria (pero
sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada
proteína en proporción a su masa). Su acción es desnaturalizarlas en una
conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. La gran mayoría de las
proteínas se une aproximadamente a una molécula de SDS por cada dos residuos
aminoacídicos, formando complejos con características comunes. En esos
complejos la unión del SDS provoca la desaparición de las interacciones no
covalentes que mantienen la estructura de las proteínas, que se desenrollan y
adoptan una forma de cadenas extendidas semirrígidas que sólo difieren en su
longitud, acorde con el tamaño de cada una. Como cada molécula de SDS
proporciona una carga negativa (del grupo SO4-), las cargas propias de las
proteínas quedan anuladas y los complejos proteína-SDS están cargados
negativamente de forma uniforme. Así, estos complejos se comportan como
polianiones que tienen la misma forma alargada y la misma densidad de carga (o
relación carga/masa), que además tiene un valor muy alto.

 TRITON X
Surfactante no iónico, intermedio por lo tanto rompe las interacciones entre lípidos
y proteínas. Detergente que olubiliza proteínas y membranas. (ej. EDTA, Ácido
Etileno Amino tetra Acético, molécula quelante) tiene cuatro grupos carboxilo y dos
grupos amino, cuya forma completamente de-protonizada puede unirse a cualquier
complejo metálico en solución, quitando los cationes de la solución para
desestabilizar e inhibir a las DNAasa.

Sales como el NaCl forman una capa iónica suave que recubre al DNA
protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; y el para mantener el pH de la
solución estable; manteniéndolo entre 7 y 8.

 TRIS-HCL
Protege la degradación por acción enzimática. Es un agente quelante, que captura
los iones metalicos y evita que se activen las enzimas ADNasa. Es un tampón bioló-
gico, cuya función es mantener el pH de la solución cons-tante Regulación del pH.
(pH 7.0 - pH 8.0). Molécula responsable del tamponamiento.

 EDTA

(Ácido Etilendiaminotetraacético): Es un agente quelante de iones metálicos como

Ca++ y Mg++. quelante de cationes divalentes, cuya función es secuestrar Mg2+,
con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden el ADN de la
muestra, ya que la mayoría de las nucleasas requieren de Mg2+ como cofactor
inhibiendo la acción de las nucleasas y así protege al ADN.

 FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMILICO (SEVAG)

Este protocolo permite la purificación del ADN mediante la adición de
fenol/cloroformo que da lugar a la aparición de dos fases: una fase acuosa superior
que contiene los ácidos nucleicos y una fase orgánica que contiene las proteínas
disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo. Para la purificacion del
ADN el fenol debe tener un pH de 7-8.

 ETANOL AL 100%
Posteriormente se precipita de la fase acuosa con etanol absoluto o isopropanol, el
ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en presencia de sal (NaCl)
porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. Los cuales
tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite
disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de
la molécula. El etanol forma la capa en la superficie por ser menos denso que la
solución acuosa, limpia el ADN de otras biomoléculas por un proceso llamado
precipitación. En este proceso, el etanol hace que el ADN se deshidrate, las
moléculas de alcohol rodean el DNA impidiendo que interactué con las moléculas
de agua propiciando que precipite, es decir, pierde contacto con las moléculas de
agua y lo aísla de la solución acuosa para dejarlo libre de impurezas, se rompe la
capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se
favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre
las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite y se lava con etanol al
70% para bajar la concentración y evitar la deshidratación de la molécula además
de eliminar sales y restos fenólicos que podrían estar aun presentes en la muestra.

Por último, hidratar el ADN para mantenerlo en solución tampón apropiado, es

preferible utilizar la solución amortiguadora Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un
pH de 8.0 (TE) para almacenar el material. En caso de que no exista la solución, se
puede utilizar agua milli-Q, agua ultrapura libre de enzimas (como, las DNAasas y
RNAasas ) para suspender la muestra. No se debe utilizar agua destilada.

¿POR QUÉ EL FRÍO AYUDA A PRECIPITAR EL DNA?

Esto se debe a que el frio ayuda a mantener el DNA intacto durante el proceso de
extracción. El enfriamiento de la solución ayuda a prevenir la desnaturalización que
podría destruir el DNA si se expusiera al calor de manera prolongada, es decir,
protege el DNA de enzimas que pueden destruirlo como las DNAasas ya que la
refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas.
Por otro lado también tenemos a la solubilidad del ADN, ya que a menor temperatura
menor solubilidad. El ADN es muy poco soluble en etanol, y menos aún en etanol
frio, por lo que precipita más rápido.
Sin embargo la conservación de la muestras de ADN no deben ser por periodos
prolongados, ya que aun a -70 °C el material genético se puede degradar. Por
ejemplo, el RNA del VHC se empieza a degradar a -20º C desde las 48 h. este factor
es degradación, así como la temperatura, deben tenerse en consideración
primordial durante el transporte de cualquier muestra biológica hacia el laboratorio
de investigación molecular, principalmente si se pretende realizar una PCR
cuantitativa.
El manejo de una muestra biológica para extracción de DNA suele ser menos
complicado que para RNA. Por ejemplo, el DNA se obtiene a partir de linfocitos, los
cuales se pueden conservar a -4º C durante periodos breves de tiempo. El DNA se
obtiene de restos de diversas muestras biológicas.
 ¿CUALES SON LOS REQUISITOS QUE DEBE TENER UN ACIDO NUCLEICO
PARA HACER UN BUEN DIAGNOSTICO MOLECULAR?

 Pureza:
La pureza de la muestra está relacionada con el valor de máxima absorbancia de
los ácidos nucleicos detectada a una longitud de onda de 260 nm.
La relación de las absorbancias A260/A280 permite conocer si el ADN obtenido está
contaminado por la presencia de compuestos aromáticos ya que éstos absorben a
una longitud de onda de 280 nm. Esta relación es muy estable y en general se
considera que el ADN es de calidad óptima cuando la relación 260/280 es mayor de
1.8. Una relación A260/280 > 2.1 es indicativa de una presencia considerable de
ARN en la muestra. Por el contrario, si esta relación es baja (A260/280 < 1.6) la
muestra está contaminada por proteínas o fenoles.

 Integridad:
La electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v), permite la valoración de la
integridad de la muestra de ADN. Si una muestra es íntegra presentará una banda
de ADN única perfectamente definida en la parte superior del gel de agarosa. Una
muestra de ADN degradada presentará un estela o “smear” a lo largo del gel que
será más pronunciada cuanto mayor sea la degradación de la muestra.

 Funcionalidad:
El hecho de que una enzima de tipo ADN polimerasa pueda actuar sobre una
muestra de ADN como molde de la reacción de PCR es indicativo de que la pureza
de la muestra es óptima. Además, dependiendo del tamaño del fragmento
amplificado se puede evaluar el grado de integridad de la muestra.
 CONCLUSIÓN

La extracción de ADN es un procedimiento importante de la biología molecular, es

utilizado para determinar la etiología y las características genéticas de diferentes
patologías.

El método utilizado (TSNT) es una técnica cacera que permite extraer buenas
cantidades de ADN, pero de menor calidad, además de que se requiere de preparar
soluciones y la extracción puede tomar varias horas o hasta días por los numerosos
pasos a realizar. Hoy en día existen kits que permiten optimizar el proceso de
extracción, ya que reducen el numero de pasos de procedimiento y bajo las
recomendaciones de cada proveedor, garantizan la obtención de una muestra de
alta pureza, ya que tanto la recuperación como la eliminación de contaminantes son
eficientes.

BIBLIOGRAFIA

Panduro, A. (2000). Biología Molecular en la Clínica. México, D.F: McGRAW-HILL

INTERAMERICANA EDITORES, S.A DE C.V . Pp. 90-92

Orfao, A & Morent, M. (2011). Protocolo de Extracción de Ácidos Nucleicos Red

Nacional de Biobancos Instituto de Salud Carlos III. Madrid.
 ANEXO

Etapas de la extracción del ADN. La homogeneización y lisis celular son similares

en ambos protocolos. Protocolo tradicional: separación de proteínas y lípidos con
solventes orgánicos (1A); precipitación del ADN mediante etanol y sales (1B) y
Redisolución del ADN (1C).

Alejo, L; Aragón, M & Martínez, A. Extracción y purificación de ADN. Herramientas

moleculares aplicadas en ecología