Microbiologia General FAIN ~ ESTQ - 2018 COLORANTES Y COLORACIONES 1. INTRODUCCION En general, las células son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exdmenes se realizan en preparados en fresco. Por eso para distinguirlos de! medio es necesario hacer una coloracién o utlizando microscopios especiales como el de contraste de fases, la mezcla de tinciones simples también Sirve para contrastar o reaizar distintas caracteristicas morfolégicas o estructurales de las células (tinciones diferenciales), Los preparados en fresco 0 en seco, son métodos de andlisis que nos van a permitr, gracias ‘al microscopio y otras herramientas de laboratorio, la visualizacién de una complejidad de elementos que a simple vista no son captados por el ojo humano. Los colorantes son cuerpos o sustancias capaces de transmitir su color a otros cuerpos. ‘A. Por su origen: @) Naturales: Son aquellos que se obtienen de organismos naturales o vegetales, tales como: *Carmin, Tornasol, indigo, Azafrén, Orceina, Hematoxilina, Hemateina, Brasilina b) Artificiales: Llamados también sintéticos, son aquellos que se obtienen como productos detivados dela destilacién fraccionada de la hulla, generalmente se les conoce como anilina 8. Por suafinidad tintorea: Ehrlich los divide en colorantes dcidos, basicos y neutros. ) Colorantes Acidos: Son aquellos que tienen por afinidad especial colorear el citoplasma, por lo que se les llama también colorantes citoplasmaticos. Los més usados son: ‘*Eosina, Fucsina dcida, dcido picrico, Naranja G, Azul de anilina, Safranina. 'b) Colorantes Basicos: Son aquellos que tienen afinidad especial por colorear la cromatina nuclear, llaméndoseles por eso colorantes nucleares. Entre los més usados estén: ‘*Hematoxilina, Azul de metileno, Fucsina bésica, Azur “A”, Azur “B", Violeta de Genciana, Thionina, Azul de toluidina, Hemateina. = ©) Colorantes Neutros: Llevan en su constitucién una parte acida y otra bésica que colorean. Ejemplos: * Eosinato azul de metileno, Wright, Leishman, May Grunwald * Indiferentes: Sudan tll Los tipos de coloranies més usados son los BASIC@S que consistent en un cation coloreado unido @ un anién incoloro, Tiflen estructuras acidas de la oélula (acidos nucleicos y polisacdridos dcidos), Ej: azul de metileno, fucsina bésica, cristal violeta, hematoxilina, etc. ACIDOS tienen catién incoloro_unido @ un anién Coloreado, Tifien estructuras citoplasmaticas de células eucariotas (Rx bésicas), No tifen oélule bacteriana, pueden usarse como color de contrasts (coloracién negativa). E]; eosina, la fucsina acida y el rojo Congo Una coloracién es el proceso mediante el cual, un cuerpo toma color bajo la accién de otro cuerpo © sustancia llamada colorante y, que no se decolora con lavados de agua 0 cualquier otra sustancia empleada como disolvente. Entre los colorantes se pueden agrupar: Los tipos de coloraciones son: SIMPLES, cuando se usa un solo colorants, DIFERENCIAL cuando se usa mas de un colorante y ESPECIALES como la tincién negativa que colorea el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin ter. Los pasos generales de una coloracién: a) Realizar la extensién de la muestra en una lémina Portaobjetos, b) Realizar la fijacién de la muestra: adherir firmemente la preparacién sobre la lémmina. Se empleando calor suave de mechero o el alcohol éter; este ultimo es indispensable para muestras serosas, c) tincién de la muestra con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos, d) Realizar el lavado con chorro tenue, e) Realizar el secado de la muestra. Puede utilizarse el calor suave de un mechero o el aire a presién, 4) Realizar la observacién de la muestra usando el objetivo de inmersi6n de un microscopio compuesto. ll, OBJETIVO: * Conocer los tipos de colorantes y las técnicas basicas de coloracién + Realizer las técnicas de preparados en fresco y en seco de diferentes muestras biolégicas + Establecer las semsjanzas y diferencias entre las células vegetales, animales y bacterianas. * _Observar organisms protisias y distinguir sus estructuras propias. Ml, MATERIALES: * Material de laboratorio: Microscopio compuesto, Porta y cubreobjetos, gotero con bulbo, navaja de rasurat nueva, pinzas, Hisopos estériles, torundas de alcohol, Ligadura, pipeta Pasteur Material biolégico: Bulbo de cebolla, Sengre, Yogurt, levadura, agua eslencada, etc. Reactivos: SSF, Azul de metileno a! 1%, Colorante de Wright, Buffer de fosfatos, Aceite de inmersionIV. PROCEDIMIENTO 4.1 COLORACION SIMPLE ‘A. Material y Reactivos: - Muestra ~ Colorantes basicos - Alcohol de 70" ~ Agua corriente, agua destilada = Colorantes cidos ~ Microscopio compuesto B. Procedimiento: © Realizar una extensién o frotis de la muestra sobre un portaobjetos. © Realizarla fijacién de la muestra (alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente, etc.) © Agregar un colorante (écido o basico) y dejar actuar por 1a $ minutos. Lavar la muestra con agua corriente, a chorro tenue. © Dejar secar la muestra al medio ambiente o a calor moderado. © Observar la muestra, empleando el objetivo de inmersi6n {100X) 4.2 COLORACION DOBLE A. Material y Reactivos: Los mismos de la coloracién anterior, especificando que se utiliza como colorante dcido la Eosina y como colorante basico. B. Procedimiento: ‘+ Realizar una extensién o frotis de la muestra sobre un portaobjetos. Realizar la fijacién de la muestra (alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente, etc.) Agregar un colorante bésico y dejar actuar por 3 a 5 minutos. Colocar el preparado en agua destilada, de 1a 2 minutos. Luego agregar el colorante dcido, hasta que cubra la muestra. Dejar actuar por 5 a 10 min y lavar. Secar y observar en el microscopic con el objetivo de inmersién 4.3 COLORACION GRAM * Hacer un frotis de le suspensién bacteriana (puede usarse sarro dentario, pus 0 esputo). © Agregar el colorante violeta de genciana o la de Hucker, por 2 a 3 minutos. Cubrir la muestra con lugol y dejar actuar por 3 minutos. Posteriormente decolorar completamente con alcohol acetona). Lavar el portaobjeto con chorro de agua tenue, Contrastar con el colorante de safranina y dejar actuar por 1 a 2 minutos. Lavar, secar y observar a inmersion. 4.4 COLORACION DE DIFERENTES GRUPOS DE CELULAS. ‘A. Observacién de Hongos © Recolectar muestras de alimentos con hongos * De estas muestras, con la ayuda de una cinta adhesiva transparente hacer que estos hongos se impregnen ‘+ Colocarlo sobre un portacbjetos que contiene una gota de azul de metileno diluido y observar en 1 microscopic con los objetivos secos de menor a mayor aumento, + Distinguir os diferentes tipos y formas celuleres. B. Observacién de células protozoarios y algas ‘+ Recolectar muestras de aguas de riachuelo, de agua estancada, o de raspados de las paredes de Un acuario, y depositarlas en frascos de boca ancha + De estas muestras, con la ayude de un gotero, colocar una gota de agua sobre un portaobjeios, * Colocar un cubreobjetos para observar a microscopio con objetives secos de menor a mayor aumento. ‘+ Distinguir los diferentes tipos y formas celulares, V. RESULTADOS VI. DISCUSION Vil. CONCLUSIONES ix. BIBLIOGRAFIA