UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA II

OBSERVACION Y CULTIVO DE HONGOS LEVADURIFORMES

Práctica 9

1. Introducción
Los hongos constituyen un conjunto de seres vivos que incluye desde organismos
unicelulares hasta organismo pluricelulares macroscópicos. Están formados por células
eucariotas con una pared rígida, y se caracterizan por ser inmóviles, presentar nutrición
heterótrofa por absorción y reproducción sexual y asexual. Los hongos unicelulares
son microscópicos, poseen forma redondeada y se denominan levaduras. La mayoría
de los hongos poseen un papel importante en la naturaleza, en la que se hallan
ampliamente distribuidos, degradando y reciclando materia orgánica muerta.
Algunos hongos microscópicos pueden causar diversas enfermedades
denominadas micosis; sin embargo, son escasas las especies adaptadas estrictamente
al hombre y la mayoría de las que producen enfermedad tienen su reservorio natural en
el medio ambiente.
En general las células micóticas se observan bien por microscopia convencional,
aunque pueden requerir tinciones especiales para facilitar su visualización. Crecen
fácilmente en los medios de cultivo convencionales dando lugar a colonias visibles
macrocópicamente, con morfología bien diferenciada según estén formadas por
levaduras y hongos filamentosos. Candida albicans es la levadura más frecuente en
Guatemala y se caracteriza porque crece en agar sangre y agar nutritivo de forma
similar a bacterias pero también en agar Sabouraud.

2. Objetivos
Que el estudiante:
 Explique la importancia de la realización de un adecuado diagnóstico.
 Diferencie levaduras de bacterias, en medios de cultivo utilizados en análisis de
rutina.
 Identifique la especie Candida albicans.

3. Alcance
En esta práctica el estudiante diferenciara macroscóica y microscópicamente
bacterias y hongos levaduriformes e identificar a Candida albicans.

4. Antecedentes
Entre los hongos levaduriformes los géneros más importantes en patología son
Candida albicans y Cryptococcus, ambos de distribución universal. Las infecciones por
Candida son, junto con las causadas por dermatofitos, las infecciones fúngicas más

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frecuentes en nuestro medio y prácticamente las únicas que se producen en personas

sanas.
El género Candida está formado por diversas especies (C. albicans, C. tropicalis, C.
krusei, C. parapsilosis, C. guillermondi y otras) que se hayan ampliamente distribuidas
como saprofitas en la naturaleza, y como comensales en la piel, tubo digestivo y vagina.
Presentan una forma ligeramente ovalada y un tamaño de 5 a 7 micrómetros,
claramente observables con tinción de gram. Las especies de Candida crecen bien en
medios bacteriológicos usuales y en el medio de Sabouraud. Entre las 48-72 horas dan
lugar a colonias macroscópicamente visibles. La especie C. albicans se identifica por
su capacidad para producir tubos germinales en poco tiempo al inocularla en suero
sanguíneo. Las diversas especies de Candida pueden producir infecciones por un
factor predisponerte o general, por lo que puede considerarse a Candida como un
género oportunista. Los procesos localizados afectan a las mucosas oral y vaginal, piel
en las zonas húmedas y de roce, vía urinaria en pacientes con sondas y tratados con
antibacterianos. Es muy característica la candidiasis esofágica en los enfermos con
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Durante muchos años, la especie más frecuente ha sido C. albicans, sin embargo
debido al creciente número de pacientes inmunodeprimidos, se ha identificado muchas
especies más como agentes etiológicos de diversas infecciones.
Candida albicans puede asumir patogeneidad provocando la candidiasis; en ese
caso se presenta como una afección vaginal (vaginitis), de la cavidad oral (muguet),
del intestinoo de la piel.
En un físico debilitado, inmunodeprimido o convaleciente de un larga cura
antibiótica, la Candida se multiplica en modo anómalo y, atraviesa el intestino, para
entrar al torrente sanguíneo, donde libera sus propias toxinas provocando
la candidemia.
Los tubos germinales son una prueba útil para diferenciar entre C.albicans de otras
especies de Candida. Se realiza a partir de una colonia fresca (24-48 h de crecimiento)
utilizando plasma fresco o suero humano con glucosa incubando a 37 °C por máximo 2
horas. El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento
en su sitio de unión con la blastoconidia, que da lugar a hifas verdaderas. Sólo C.
albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras
especies como C. tropicalis pueden producir seudohifas de aspecto similar a los tubos
germinales pero con blastoconidias más grandes que las de C.albicans. Para considerar
una prueba como positiva deben observarse más de 5 tubos germinales.

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Figura. Tubos germinales

5. Materiales y equipo
 Microscopio óptico  Gotero con aceite de inmersión
 Porta objetos limpio y  Guantes de latex
desgrasado
 Papel mayordomo
 Cubre objetos limpios
 Torundas de algodón (1/A)
 Marcador indeleble para vidrio
 Beackers con cloro
 Varillas de vidrio para
 Asas en argolla
coloración
 Colorantes para gram
 Cajas de Staphylococcus sp. y
Candida sp. identificados
únicamente con números.
 Cajas de agar sangre, agar
nutritivo y agar sabouraud.
 Tubos con 1.0 ml de suero
sanguíneo
 Papel limpia lentes
 Lentes de protección
 Pizeta con alcohol al 70%
 Pizeta con cloro al 5%
 Pizeta con agua destilada
 Gotero con cristal violeta
 Gotero con lugol
 Gotero con alcohol-acetona
 Gotero con de safranina

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6. Procedimiento
 Identificar las láminas portaobjetos a utilizar.
 Con un marcador trazar una línea dividiendo en dos partes iguales cada una de
las cajas de medios de cultivo e identificarlas.

PARTE I. Prueba de tubos germinales

 Trabajar frente al mechero.
 Escoger una colonia bien aislada de la caja de aislamiento sospechosa de
Candida.
 Rozar la colonia por arriba con un asa en argolla e inocular en un tubo de rosca
con 1 ml de suero sanguíneo.
 Incubar el suero a 37 C durante dos horas.

PARTE II. Inoculación de medios de cultivo

En cada mesa encontrara cajas con dos tipos diferentes de microorganismos
(bacterias y levaduras).
 Elija una colonia, muy bien aislada d la caja de un tipo de microorganismo.
Destape con cuidado la caja de petri, roce la colonia elegida con la punta del
asa en argolla estéril e inocule en la mitad correspondiente del agar nutritivo.
Estriando como se indica en el dibujo.
 Elija una colonia, muy bien aislada de la caja del otro tipo de microorganismo.
Repita el procedimiento anterior, inoculando en la otra mitad del agar nutritivo.
 Repetir los incisos b y c en el agar sangre.
 Repetir los incisos b y c en el agar sabouraud.

PARTE III. Preparación del frotis y tinción de Gram

 Colocar una gota de agua en un portaobjetos previamente identificado.
 Elegir una colonia de una de las cajas con crecimiento y rozarla suavemente.
Preparar con mucha precaución un frotis.
 Elegir una colonia de la otro caja con crecimiento y rozarla suavemente y
agregar el frotis del paso anterior, procurando dejarlo homogéneo y finalmente
extendido.
 Dejarlo secar a temperatura ambiente.
 Fijar a la llama del mechero.
 Cubrir los frotis con solución de Cristal Violeta y dejar por un minuto.
 Lavar con agua d chorro y escurrir.

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 Cubrir con solución de Lugol durante un minuto.

 Lavar suavemente con agua de chorro y escurrir.
 Gotear alcohol acetona sobre la preparación hasta que deje de soltar color
violeta.
 Cubrir la lámina con solución de Safranina, durante un minuto.
 Escurrir el colorante y lavar suavemente la lámina con agua de chorro.
 Colocar una hoja de papel mayordomo doblada en dos sobre la mesa de
trabajo y colocar allí las láminas, ligeramente inclinadas para que terminen de
escurrir y sequen a temperatura ambiente.

PARTE IV. Preparación de tubos germinales

 Limpie y desgrase 1 lámina portaobjetos.
 Prepare una cámara húmeda (caja de Petri, con algodón, humedecido con
agua destilada)
 Agite suavemente el tubo que contiene el suero inoculado con Candida sp.
 Extraiga una gota de la muestra, con ayuda de una pipeta Pasteur y deposítela
sobre la lámina ya numerada.
 Descarte la pipeta Pasteur, en el Beacker que contiene cloro (pero no la perilla
de goma).
 Coloque un cubre objetos sobre la preparación.

PARTE V. Observación al Microscopio

 Lleve al microscopio las preparaciones y observe. (tubos germinales con
objetivo de 10X y 40X, Gram con objetivo de 100X).
 Fotografíe o dibuje.
 Reporte las estructuras observadas

PARTE VI. Lectura de cajas.

 Leer las cajas 48 horas después de inoculadas.
 Observar y describir la morfología, superficie, bordes, color y apariencia de las
colonias en cada tipo de medio de cultivo.

7. Bibliografía de referencia
Torres M. 1999 “Manual práctico de Bacteriología Medica. 2da Edición. Editorial
Serviprensa C.A Guatemala, Guatemala.

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Bernard, John. 1991 “Todd- Sandford-Davidsohn Diagnóstico y Tratamiento Clínicos

por el Laboratorio”. 8ª Edición. Editorial Salvat. Barcelona España.
Koneman y Col. 1992 “Diagnostico Microbiologico”. 3ª Edición. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
Tangarife V. (s.n) Tubos germinales. Escuela de Microbiología
Universidad de Antioquia. Recuperado de
http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/resource/view.php?inpopup=tru
e&id=100778. Fecha de consulta 18 de junio de 2014

8. Cuestionario
a. Indique al menos 3 pruebas microbiológicas para la identificación de Candida
albicans y C. dubliniensis, ya que ambas son positivas para la prueba de tubos
germinales

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b. ¿Qué patologías puede producir C. albicans a nivel cutáneo, mucocutáneo y

sistémico? Mencione el tratamiento para cada caso.

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c. Defina que es un hongo oportunista.

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d. Realice la ficha técnica de micología de Candida albicans

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