Modul de recoltare, prelucrare, transport si

stocare a probelor de sange

Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:

Pregatirea pacientului
Este foarte important ca pacientului sa i se explice procedura la care va fi supus si sa se
obtina intreaga lui complianta.
1. Recoltarea probelor se face cu pacientul in conditii bazale, inaintea oricarei proceduri
diagnostice sau terapeutice (ideal intre orele 7 si 9 dimineata, in conditii ”à jeun”- pe
nemancate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomanda ca recoltarea sa se
efectueze dupa 12 ore de la ultima masa.
2. Cand probele de sange nu sunt recoltate in conditii bazale, trebuie tinut seama de efectele
aditionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar si efortul fizic moderat poate determina
o crestere a glucozei, acidului lactic, proteinelor serice, CK), precum si a starii emotionale
sau ritmului circadian care poate afecta anumiti parametri.
3. Recoltarea probelor biologice se poate face sub forma unei probe unice (de exemplu,
pentru determinarea glicemiei bazale) sau sub forma probelor multiple (de exemplu, testul
de toleranta la glucoza sau recoltarea urinii din 24 ore).
4. Asigurati-va ca pacientul sta intr-o pozitie comoda (in pozitie sezanda sau in decubit
dorsal).
5. Verificati cu mare atentie ca toate datele demografice ale pacientului sa fie corect scrise
pe formularul cu care este insotit acesta la punctul de recoltare a sangelui si etichetati corect
recipientul de recoltare.

Vom descrie in continuare procedurile de recoltare a sangelui venos si a celui capilar.

Flebotomia
In laboratoarele Synevo, pentru recoltarea sangelui venos se folosesc 2 sisteme inchise de tip
vacutainer:
A. S-Monovette, Sarsted;
B. cu holder, Becton-Dickinson.

A. Pentru sistemul S-Monovette exista 2 tehnici diferite de recoltare:

1. sistem seringa: prin controlul vitezei de recoltare nu exista riscul de colabare a venei;
2. sistem vacuum: tubul este vidat in momentul imediat anterior recoltarii, eliminandu-se
riscul pierderii de vid; proportia de sange recoltat-aditiv ramane constanta, fapt ce conduce
la rezultate corecte.

1. Instructiuni (sistem seringa):

- Inainte de punctionarea venei, introduceti acul in tubul de recoltare, fixati-l prin rotire
usoara in sensul acelor de ceasornic.
- Punctionati vena, slabiti garoul si trageti incet pistonul, pana la oprirea fluxului sanguin.
- Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceas; acul ramane in vena!
- Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform
instructiunilor de mai sus.
- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!

2. Instructiuni (sistem vacuum):

- Fixati pistonul la baza tubului, apoi indepartati-l.
- Inaintea inceperii recoltarii, acul trebuie sa fie in vena.
- Slabiti garoul si fixati tubul in acul aflat deja in vena, rotindu-l in sensul acelor de
ceasornic.
- Asteptati oprirea fluxului sanguin.
- Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceasornic; acul ramane in vena.
- Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform
instructiunilor de mai sus.
- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!
B. Probele de sange sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

Inaintea recoltarii sangelui, desfaceti acul prin rasucirea capacului sigilat. Inlaturati capacul
si expuneti partea filetata (1), avand grija sa nu indepartati teaca sterila in care se gaseste
acul (2). Asamblati acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi acum umplute unul dupa altul
in concordanta cu instructiunile de mai jos:
a. Aplicati un garou pe antebratul pacientului si intepati pielea din plica cotului, ajutandu-
va de degetul mare si indexul mainii drepte.
b. Inversati pozitia mainilor cat mai curand posibil dupa ce acul a penetrat vena; apasati
vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul si degetele mijlocii sustinandu-l.
c. Sangele este atras de vacuumul din vacutainer si curge in tub cu viteza proprie; eliberati
garoul din jurul bratului pacientului imediat ce sangele a aparut in vacutainer, ajutandu-va
cu mana stanga, sustinand in continuare holderul.
d. Retrageti vacutainerul cu mana dreapta, apasand usor cu degetul mare pe una dintre
marginile holderului.
e. Pentru a asigura optima omogenizare a sangelui cu anticoagulantul, efectuati 8-10
miscari de inversiune a tubului.
f. Daca se recolteaza mai mult de un vacutainer, inserati cel de-al doilea tub si repetati pasii
descrisi mai sus (a-e).
Indiferent de sistemul de recoltare folosit, respectati urmatoarele manevre:
- utilizati manusi sterile, de unica folosinta pentru fiecare pacient caruia i se recolteaza
probe;
- evitati punctionarea in zonele in care exista leziuni cutanate;
- dezinfectati zona aleasa pentru punctionare cu ajutorul unui tampon steril imbibat in
solutie apoasa de izopropanol 70%, prin miscari circulare, din interior spre exterior, pentru
a indeparta contaminantii;
- dupa tamponare, lasati sa se usuce zona inainte de a trece la punctionare (daca zona este
umeda, poate fi indusa hemoliza probei);
- la sfarsitul punctionarii, aplicati imediat un tampon compresiv pentru a asigura hemostaza
si a evita formarea hematomului (durata recomandata a compresiei 5 mininute); la sfarsit
acoperiti zona cu un pansament steril;
- acul de punctie nu va fi reintrodus in teaca (pentru a evita inteparea), indoit sau taiat, ci va
fi depus intr-un container de plastic rezistent la reziduuri intepatoare sau taietoare.
 Aditivi
Pentru a impiedica procesul de coagulare a sangelui integral, unele vacutainere contin
substante anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA, citrat), fie
prin inhibarea trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudina).
Pentru a nu exista nici o confuzie in identificarea tubului de recoltare, capacele
vacutainerelor sunt colorate diferit, in functie de aditivul folosit.
Codurile de culoare pentru substantele anticoagulante sunt descrise in ISO/DIS 6710:
1. Capac mov/roz - foloseste ca anticoagulant EDTA-ul si are utilitate in hematologie,
biologie moleculara, unele teste imunochimice (ex. ACTH).
2. Capac bleu/verde - contine Citrat 9+1 si se foloseste pentru analiza coagularii.
3. Capac negru/mov - contine Citrat 4+1 si se foloseste pentru VSH.
4. Capac verde/portocaliu - contine Heparinat si se utilizeaza plasma pentru testele de
chimie.
5. Capac rosu/incolor - este un tub fara anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de
chimie, imunologie si serologie.

Unele vacutainere destinate obtinerii serului contin un activator de coagulare (care

accelereaza formarea cheagului) si un gel separator, care permite mentinerea serului dupa
centrifugare in tuburile primare, in cursul fazei preanalitice (transport catre laborator),
analitice si postanalitice (stocarea probelor in laborator).
Tuburile de recoltare folosite in laboratoarele Synevo sunt:
1. Tuburi Beckton- Dickinson:
- capac mov - EDTA;
- capac rosu - tub simplu, fara anticoagulant sau gel separator;
- capac incolor - tub fara anticoagulant, cu gel separator;
- capac bleumarin - EDTA (pentru metale);
- capac negru - citrat 4+1;
- capac bleu - citrat 9+1.

2. Tuburi Sarsted:
- capac roz - EDTA;
- capac incolor - tub simplu, fara anticoagulant sau gel separator;
- capac maron - tub fara anticoagulant, cu gel separator;
- capac portocaliu - heparinat de litiu (pentru metale);
- capac mov - citrat 4+1;
- capac verde - citrat 9+1.

Ordinea recoltarii tuburilor

In cazul in care este nevoie sa se obtina mai multe probe dintr-o singura flebotomie, se
recomanda sa se respecte urmatoarea ordine de recoltare a tuburilor:
1. recipientele pentru hemocultura;
2. tuburile fara aditivi;
3. tuburile ce contin citrat;
4. tuburile ce contin heparina;
5. tuburile ce contin EDTA.

Volumul optim de proba

Una din erorile cel mai des intalnite este trimiterea la laborator a unei cantitati insuficiente de
proba. Pentru a va asigura ca exista un volum adecvat de proba, recoltati intotdeauna sange
intr-o cantitate de 2 ori si jumatate mai mare decat volumul necesar efectuarii unui anumit
test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sau plasma necesar procesului
analitic).
In acelasi timp, trebuie sa se evite recoltarea excesiva de sange, in special la varstnici, copii
mici, pacienti internati in sectiile de terapie intensiva.
In cazurile frecvente, in care pacientilor le sunt indicate mai multe teste, tineti cont de
urmatoarele volume de sange recomandate in cazul folosirii analizoarelor automate actuale:
- 4-5 mL sange pentru efectuarea unui profil de investigatii biochimice uzuale;
- 1 mL sange pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Recoltarea sangelui capilar

Este utila in special in cazul pacientilor pediatrici si pentru efectuarea frotiurilor de sange.
Cele doua locuri de electie pentru recoltare sunt suprafata palmara a falangei distale a
degetului si suprafata plantara laterala sau mediala a calcaiului. Se obtine un amestec de
sange provenit din arteriole, venule si capilare care la randul sau poate fi diluat cu lichid
interstitial si intracelular.
Compozitia relativa a sangelui depinde de fluxul sanguin existent in patul vascular cutanat in
momentul recoltarii; astfel, incalzirea locului de punctionare inaintea recoltarii faciliteaza
arterializarea sangelui din teritoriul cutanat respectiv.
!Nu se va recolta niciodata din pulpa degetului la nou-nascuti deoarece exista riscul de a leza
osul falangei.
Exista o relatie direct proportionala intre volumul de sange recoltat si adancimea incizei
efectuate. Astfel tipul lantetei trebuie ales in functie de locul punctionarii si cantitatea de
sange necesara.
Adancimea inciziei constituie un element critic la nou-nascuti; daca aceasta depaseste 2,4
mm exista riscul de a leza osul calcaneu.
Riscul de a efectua o incizie prea adanca poate fi evitat prin utilizarea unor lantete
semiautomate de unica folosinta.

Instructiuni:
- dezinfectati locul punctionarii cu ajutorul unui tampon steril imbibat in solutie de alcool si
asteptati sa se usuce zona inainte de a efectua incizia (trebuie evitata folosirea altor
dezinfectanti deoarece acestia pot induce valori fals crescute pentru acid uric, fosfor sau
potasiu);
- prindeti ferm zona adiacenta locului punctionarii si efectuati rapid incizia, apasand pe
butonul lantetei;
- indepartati prima picatura de sange cu ajutorul unei mese de tifon, deoarece aceasta poate
contine lichid interstitial;
- prin miscari de apasare usoara, fara a masa zona din jur, colectati picaturile de sange care
curg liber intr-un microtainer etichetat;
- daca picaturile nu curg liber in microtainer, percutati usor tubul;
- in cazul microtainerelor care contin anticoagulant, efectuati 8-10 miscari usoare de
inversiune a tubului pentru a asigura amestecul optim al sangelui cu anticoagulantul;
- la sfarsitul recoltarii aplicati un tampon steril compresiv care va fi mentinut pana la oprirea
sangerarii; nu aplicati bandaje adezive la copii, deoarece pe langa faptul ca pot produce
iritatii, exista riscul de a fi inghitite atunci cand se largesc;
- depuneti lanteta intr-un container rezistent la punctionare.
Prelucrarea probelor de sange dupa recoltare
Componentele sangelui:
In medie, un adult de 70 kg are aproximativ 4,75 - 5,6 L sange, din care aproximativ 60%
sunt plasma si 40% celule sanguine.
Celulele sanguine (hematii, leucocite si trombocite) sunt suspendate in plasma (formata din
apa si constituenti dizolvati: hormoni, anticorpi, enzime, ce sunt transportate catre tesuturi,
iar produsii lor de excretie sunt transferati apoi catre plamani si rinichi).
Prin centrifugare se pot separa atat plasma, cat si ser. Diferenta dintre plasma si ser este ca
plasma retine fibrinogenul, care este inlaturat din ser.
Sangele pacientului, recoltat intr-un tub fara substante anticoagulante, cu sau fara gel
separator, este lasat sa sedimenteze/sa coaguleze, dupa care va fi centrifugat si se separa serul,
care contine 2 tipuri de proteine: albumina si globuline.
Plasma este obtinuta din sangele recoltat intr-un tub cu anticoagulant si apoi centrifugat.
Anticoagulantul inhiba formarea coagulului. Plasma contine trei tipuri de proteine: albumina,
globuline si fibrinogen.
Pentru anumiti analiti exista diferente semnificative intre rezultatele obtinute la testarea din
ser si cea din plasma: potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat etc.
Diferentele dintre valorile obtinute din ser si din plasma se datoreaza unor factori ca:
- analitul poate fi consumat in timpul procesului de coagulare: fibrinogen, trombocite,
glucoza;
- analitul poate fi eliberat din celule in timpul coagularii: potasiu, LDH, fosfor, lactat;
- anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare in cazul GGT, Li.

Plasma Versus Ser

1. Avantaje:
- Procesare accelerata: etapa formarii coagulului este eliminata; timpul de centrifugare se
poate scurta prin cresterea vitezei de rotatie.
- Cantitate mai mare: dintr-o proba de sange se obtine aprox.15-20% mai multa plasma decat
ser.
- Lipsa interferentelor legate de coagularea post-centrifugare: in ser se mai pot produce
coaguli dupa o centrifugare precoce; acest lucru nu apare niciodata in plasma.
- Rezultatele obtinute la testarea analitilor din plasma exprima mai fidel statusul in vivo al
pacientului comparativ cu cele din ser.
- Risc mai mic de aparitie in plasma a hemolizei si trombocitolizei decat in ser.
2. Dezavantaje:
- Electroforeza proteinelor este alterata in plasma de prezenta fibrinogenului (pseudo-peak
in regiunea g, ce poate mima un component M).
- Anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare.
- Interferenta cationica: cand se foloseste plasma heparinizata, litiul sau amoniul din
anticoagulant pot interfera cu metodele de determinare a acestora.

Faza precentrifugare
Serul sau plasma trebuie separate fizic de celulele sanguine cat mai repede posibil, pentru a
nu exista riscul producerii unor rezultate eronate; se recomanda astfel o limita maxima de 2
ore din momentul recoltarii probei.
Un contact mai redus cu celulele sanguine (<2 ore) este recomandat pentru potasiu, ACTH,
cortizol, catecolamine, acid lactic si homocisteina.
Studiul efectuat de Laessig si colaboratorii sai a indicat faptul ca 17 analiti nu au fost afectati
de un contact prelungit al serului cu celulele sanguine (timp de 48 ore la temperatura
camerei): albumina, fosfataza alcalina, ALT, bilirubina, calciu, colesterol, CK, creatinina,
magneziu, fosfor, proteine totale, trigliceride, T3, T4, uree, acid uric. Pe de alta parte,
rezultatele au fost semnificativ alterate in cazul urmatorilor analiti:
- timp de contact ~ 2 ore: glucoza (scade), potasiu (creste), LDH (creste);
- timp de contact ~ 8 ore: sideremie (creste).
Intr-un studiu mai recent, Zhang si colaboratorii sai au evaluat stabilitatea a 63 analiti in
serul care a ramas timp de 24 ore in contact cu celulele sanguine. S-a stabilit ca serul trebuie
separat in 3 ore pentru glucoza, potasiu si fosfor si in 6 ore pentru albumina, bicarbonat, clor,
peptid C, HDL colesterol, sideremie si proteine totale. Ceilalti analiti au fost stabili timp de 24
ore in serul separat. Acest studiu demonstreaza faptul ca laboratoarele trebuie sa revizuiasca
stabilitatea analitilor testati, pentru a reduce numarul respingerilor nenecesare de probe, in
cazurile in care transportul de la punctele de recoltare este prelungit.
Refrigerarea probelor de sange inhiba metabolismul celulelor sanguine si stabilizeaza anumiti
constituenti termolabili. Nu se recomada ca probele de sange integral sa fie refrigerate decat
daca exista recomandari specifice in acest sens. Astfel, este contraindicata refrigerarea in
cazul probelor pentru determinarea potasiului, deoarece temperatura scazuta inhiba glicoliza
si favorizeaza eliberarea potasiului din celule, obtinandu-se astfel rezultate fals crescute. Pe
de alta parte, probele din care se vor testa ACTH, PTH, acid lactic, catecolamine si gastrina vor
fi racite prin plasarea intr-un recipient ce contine un amestec de apa cu gheata.
Centrifugarea
Centrifugarea probei in vederea obtinerii serului trebuie efectuata numai dupa ce se constata
ca sangele a coagulat complet. In mod normal coagularea se produce dupa cca. 30 minute,
insa in cazul pacientilor care primesc tratament anticoagulant sau prezinta defecte de
coagulare aceasta se produce cu intarziere.
Centrifugarea probelor pentru obtinerea de ser sau plasma se efectueaza in general la 3000 g
timp de 5 minute. Pentru obtinerea unei plasme deplachetate este nevoie ca proba sa fie
centrifugata timp de 15-30 minute la 2000-3000 g.
Dupa separarea serului sau plasmei, probele nu vor mai fi recentrifugate (pentru a obtine un
volum suplimentar de proba); de asemenea este contraindicata recentrifugarea in cazul
probelor recoltate in vacutainere cu gel separator.
Transferul probelor in tuburi secundare trebuie efectuat cu mare atentie, pentru a evita
contactul cu un material potential infectant.
Programul de intretinere al centrifugilor include verificarea periodica, cu ajutorul unui
tahometru, a vitezei de centrifugare obtinute in urma unei setari specifice.
In cazul tuburilor cu gel se va verifica obligatoriu integritatea acestuia la sfarsitul
centrifugarii. Anumite teste (ex.: hemoglobina glicozilata, plumb) necesita o proba de sange
anticoagulat si neseparat; in aceste cazuri probele nu vor fi centrifugate.

Transportul probelor
Timpul de transfer al probelor catre laborator poate fi:
- scurt, cand locul de recoltare/clinica este in acelasi loc cu laboratorul;
- mediu, cand locul de recoltare/clinica este in aceeasi localitate cu laboratorul, dar nu in
acelasi loc;
- lung (24 ore sau mai mult), cand locul de recoltare/clinica este in alta localitate decat
laboratorul si se trimit probele prin posta sau curieri. Aceasta situatie se intalneste mai des in
cazul trimiterii probelor pacientilor de la studiile clinice, cand toate probele se colecteaza
intr-un laborator de la pacientii situati in centre diferite, localizate geografic diferit.
Exista mai multe tipuri de transport al probelor, in functie de natura produsului si de
stabilitatea analitilor care trebuie testati:
- transport in conditii ambientale;
- transport la rece (probe refrigerate);
- transport in gheata carbonica (probe congelate).
Reguli generale:
- in cazul unui timp de transfer scurt sau mediu, toate probele de sange vor fi transportate
ambiental in containere sau pungi speciale (daca nu exista recomandari specifice de
refrigerare a probelor);
- in cazul transferului la distanta, in special prin curieri sau posta, trebuie evitat a fi
transportat sange integral;
- probele transportate ambiental trebuie protejate de temperaturi extreme, prin ambalarea in
materiale izolante (containere de polistiren);
- probele refrigerate trebuie plasate in apropierea pungilor cu gheata si nu direct pe acestea;
- in cazul probelor congelate se va verifica daca dimensiunile containerului permit sa fie
introdusa o cantitate suficienta de gheata carbonica care sa reziste pe durata transportului;
- vor fi folosite dispozitive de monitorizare a temperaturii pe durata transportului.
S-a demonstrat ca anumiti parametri biochimici, ca electrolitii sau enzimele, nu sunt afectati
de transportul prin posta sau curier, care poate dura de la 24 ore la 4 zile. Este valabil si
pentru concentratia hemoglobinei sau numarul eritrocitelor. Diferente majore se observa insa
in cazul hematocritului, volumului eritrocitar mediu (VEM) sau bilirubinei. Foarte important
este ca prepararea frotiului de sange venos sa fie facuta in maximum 3 ore de la recoltarea
sangelui. De asemenea sangele recoltat pe citrat (pentru testele de coagulare) la pacientii care
nu sunt heparinizati este stabil timp de 8 ore la temperatura camerei pentru determinarea
timpului de protrombina, timpului de trombina, APTT, proteinei C si factorului V al
coagularii. Nu este valabil insa pentru determinarea factorului VIII si proteinei S care au o
stabilitate mult mai redusa.
In cazul pacientilor heparinizati sangele poate fi pastrat la temperatura camerei sau la
frigider timp de 4 ore din momentul recoltarii probelor. Daca acest lucru nu este posibil,
probele se stocheaza la –20ºC.
Transportul la distanta al plasmei, in vederea efectuarii testelor de coagulare, se va face
numai in gheata carbonica; decongelarea probelor in cursul transportului genereaza rezultate
eronate.

Stocarea probelor in laborator

Dupa incheierea procesului analitic, o parte din probe vor fi pastrate o anumita perioada de
timp, in conditii bine stabilite, astfel incat sa permita confirmarea rezultatelor, verificarea
identitatii probelor sau efectuarea unor teste suplimentare.
Reguli generale:
- procedura de stocare a probelor trebuie sa tina cont de stabilitatea analitilor;
- probele trebuie intotdeauna sa fie pastrate in tuburi inchise (pentru a evita evaporarea
acestora);
- probele pot fi arhivate in frigidere in tuburile primare, cu conditia ca acestea sa contina gel
separator;
- in congelatoare probele sunt pastrate de obicei in tuburi secundare; este posibila arhivarea
si in tuburile primare care contin gel, daca producatorul specifica acest lucru;
- se va evita pe cat posibil stocarea sangelui integral; oricum sangele integral destinat
obtinerii serului/plasmei nu trebuie pastrat in frigider;
- intervalul de pastrare a probelor este cu atat mai mare cu cat temperatura de arhivare este
mai scazuta (exceptii: probele pentru electroforeza lipoproteinelor si determinarea de
apolipoproteine A1 si B nu trebuie pastrate la congelator);
- dupa decongelare proba trebuie omogenizata prin miscari de inversiune a tubului, fara a se
produce spuma; evitati decongelarea – recongelarea.

In laboratorul Synevo exista urmatoarea procedura de arhivare a probelor:

1. Probele pentru hematologie contin sange pe EDTA, pot fi arhivate 24 ore la 2-4º C;
2. Probele pentru biochimie si imunochimie (exceptie fac probele mentionate mai jos) contin
ser, se pastreaza 1 saptamana la 2-4º C;
3. Probele pentru determinarea PSA contin ser si se pastreaza 2 saptamani la -20º C;
4. Probele pentru screeningul prenatal al anomaliilor fetale, profil TORCH, serologie sifilis la
care s-au obtinut rezultate pozitive contin ser si se pastreaza 1 luna la -20º C;
5. Probele alergologice si cele pentru boli autoimune contin ser si se pastreaza 2 saptamani la
-20º C.
Probele de plasma destinate determinarii incarcaturii virale B si C, precum si probele de
toxicologie (metale) sunt consumate de obicei aproape integral in procesul analitic, de aceea
nu vor mai putea fi disponibile pentru retestari (se va solicita repetarea recoltarii).