~ Paediatr Croat 2000; 44: 161-165 PRIKAZ SLUCAJA CASE REPORT DK 616.0867 PRIKAZ DVIJE RIJETKE MUTACIJE U CISTICNOJ FIBROZI VIDA CULIC!, LIVIO BALARIN!, HANNELORE ZIERLER®, JADRANKA SERTIC, SRDANA CULIC!, BISERKA RESIC!, BERNARDA LOZIC!, See CLAmtGuin! DRAGAN PRINORAC', MARINO KALITERNA?, TADE TADIC, STIPAN JANKOVIC, KLAUS WAGNER! Cistitnafibroza najtesta je autosomno-recesivno nasljedna bolestepitela egzokrinik tlijeeda. U populaciji je uéestalost hete- roxigota 1:20, olest se javijauoiprilike1:2500 poreda, So se razlkuje medu emickim skupinama. Dijagnoza se temeljina nalacy >povigene koncentracije kiorida u znoju, a rokovana je promjenom u genu koji se nal Ekspresija ovoga gena povezana je s patofiz lator protein” koji se sastoji od 1480 aminokiselina. U genetskom savjetovalistu u Spltu ispitivane su strija. Nadeni su ovi genotipovi: AFS08/3849+1G->A (Exon 19) i izyrdéena u obiteljis genotipom AFSOR/ES85X (Egzon 12). P slike i obitelisko stablo, Istaknut éemo jednu bolesnicu s tes indirekenim putem od zdravih roditelja (heterozigota). PROVODLIIVOSTI-geneska uvop Cistiéna fibroza (CF) najée3éa je auto- somno-recesivna nasljedna bolest epitela ‘egzokrinih 2jezda, a prosjetnom inciden- cijom homozigota (bolesnih) 1:2500, @ heterozigota (nosioca) je 1:20. Usestalost varira w raaligitim etnickim i zemljopi- snim skupinama (1, 2, Kilini¢kom slikom cistiéne fibroze do- ‘minira kroniéna pluéna bolest i malapsor- peija, a dijagnoza se temelji na nalazu poviSenih vrijednosti Klorida u znoju. Kli- nigke promjene nastaju uslijed pore- meéenog elektrolitnog transporta u raz- "inka botnics Split 2 Instn fir Medizinische Biologie und Humange- get, Graz, Austria aiid boli centr Zagreb 4 Rlinigkabolaice Mostar ‘Universi of Connecticut Health Cente, Comee- tient, USA Adress 2a dopisivane ‘Mr or, Vida Cli, Kini bola Split, Klin en aot bokest, Osjek a razvojnu neuroiogs i medicine genetic § laboratorie za humana (cio) genctvn | genetskien savjetovalittmn, Spin {gov |, 21000 Spit, Hrvatska vide cie@stch be nim organima kao Sto su pluca, alijezde -nojnice, guSterata i crijeva. Bolest je po- sljedica ‘pogresnog odgovora ciklitnog ‘AMP-a 2a transport kloridnib jona u epi- telnim stanicama egzokrinih Zlijezda (1, 2 CFTR gen (cystic fibrosis transmem- brane regulator protein) nalazi se na 7 kromosomu (7431.2). Protein se sastoji cod 12 transmembranskin i 3 intracitoplaz- rmatske domene. Transmembranski dio je organiziran v dva puta po 6 alfa uzvojni- ca, koje okru2uju dva kanala u mémbrani, a slude za prolaz Kloridnih jona kroz hi- ddrofobnu struktura membrane. Povesana koncentracija cAMP-a u stanici djeluje kao signal 2a aktivaciju protein kinaze, koja je odgovorna za fosforilaciju CFTR proteina, Konformacijska promjena pro- teina ima 2a posljedicu otvaranje kanala i pasivni prolaz Kloridnih jona iz stanice w ‘vanstaniéni okoliS (1, 2) Cistigna fibrozu uzrokuje mutacija u jednom genu, pa se ona smatra glavnim kandidatom 7a gensku terapiju (3, 4). Otprilike pola opisanih mutacija wu CFTR-u nastaju zamjenom jedne amino Kiseline (missense mutacije). Ostale mu- Mlinigkom slikom dominiraju kroniéna pluéna bolest i malapsorpeija. Cistiéna fibroca u2- lazi na dugom kraku 7. kromosoma (7931.2), @ zauzima 250 kb i sadréava 27 egzona. ‘iologijom bolesti i stvaranjem CFTR-proteina, j. “cystic fibrosis transmembrane regu- dvije obiteljs cistiénom fibrozom, te je genetska analiza izvrena u Grazu, Au- ‘AFSOS/ES85X (Exon 12). Prenatalna dijagnoca uspjesno je rikazat 6emo dva bolesnika s cistiGnom fibrozom, opisati njihove klinitke im fenotipom i rijetkim genotipom (AF SO8/ES85X) koji smo ustanovili Deskriplor:CISTIENA FIBROZA-gevetia; FENOTIP: MUTACUA; CISTICNI FIBROZN! TRANSMEMBRANSKS REGULACDSKI GEN tacije su: nonsense, frame shift (uslijed insercije ili delecije malog broje nukleo- tidnih parova) i splice-site mutacije (6, 7, 11). Glavna intragenska mutacija je dele- cija 508, troslovnog zapisa u desetom eg- zonu (AF508), Koji je odgovoran za ami- rokiselinu fenilalanin. Nalazimo je kod 70% svih bolesnika sa CF, a preostalih 30% pripada drugim, vrlo rijetkim muta- cijama, Genska analiza ovih promjena moguéa je RFLP metodom (restriction fragment length polymorphism) (1, 5,6, 7). ‘Zemijopisna distribucija mutacija nije sluéajna, USestalost mutacija u prvoj cito- plazmatskoj domeni koja veie ATP veca je od uéestalosti u drugo} domeni. Inci- ‘dencija CF varira u razliitim krajevima svijeta i unutarrazligitih naroda. U Buropi { Azifi, u podrugjima koja granite s Euro- ‘pom, postoje razlike u broju bolesnika s ‘AFS08 mutacijom od sjevera prema jug. Najveta uBestalost AF508 mutacije je w ‘Danskoj i Engleskoj, a najmanja u T2raelu i Turskoj (I, 2, 7, 14). U razligtim regija ma Europe otkriveno je do sada oko 55 estih mutacija, Kod manje od 1% bole snika nadeno je 217 rijetkih mutacija 161. Calis isr, rikae die nite mutacje vesting (14), 70% do danas opisanih mutacija u CFTR genu je na AFS08, dok samo 5% od svih CF bolesnika ima mutaciju tipa pre- ‘maturnog stop kodona. U nekim mutaci- jjama mozemo naéi razliite klinigke feno- tipove. Ovdje smo opisali dva bolesnika s ci- sti¢nom fibrozom i rijetkim mutacijama u CFTR genu. Istkli smo obitel} i bolesni cus AFSOS/ES85X mutacijom, a nju smo potvrdiliindirektnom metodom u zdravibh roditelja heterozigota koji su zatrazili sav- jet genctigara Kako nam je poznato ovo je prvi opi- sani sluSaj s genotipom SFSO8/ES8SX, teSkom klinigkom slikor i ranim letalnim ishodom. MATERIAL I METODE. U razdoblju od 1978. do 1994. godine u Klinickoj bolnici Split na Odjelu za djedje bolesti, ijegeno je 15 bolesnika s cistiénom fibrozom. Genotip je utvrden kod samo 3-je bolesnika i njihovih obitel- Sika 1. Originain fibrori, Paediatr Ce 20005 44: 161-165, Ji: AFSO8/AFS08, AFSOS/EI9. i ‘AFSO8/E12, Do danas je prenatalnu dija- gnozu zatrazila jedna od oviby obiteli, Ona je uspjeSno napravljena u obitelji s genotipom AFSO8/E12. Ustanovljeno je da trudnica nosi fenotipski zdravo dijete, koje je heterozigot 7a AFSO8 Sto je nasti- Jedilo od majke. Za gensku analizu i izolaciju DNA ‘upoteebljeni su limfociti iz perifeme krvi roditelja, brata i sestre, te amniociti uzgo- jeni nakon amniocenteze. Ne-APSO8 mu- tacija analizirana je DGGE (denaturing gel electrophoresis) metodom. Egzoni koji su pokazali promjene u elektroforezi tijekom DGGE su sekvencionirani za ot- krivanjemutacije metodom dideoxynu- cleotide chain termination (8, 9, 11). PRIKAZSLUCAIA, Bolesnik 1, APSO8/3849+1G->A (Egzon 19) Bolesnik (proband) musko je dojente koje je prvi puta hospitalizirano u prvom Splice- Mutation 2 |. bolesnika (AFSOM/Exon 9:3849% 1G->8) imjesecu Zivota _sa__gastrointestinalnim simptomima. U dobi od 2,5 mjeseca na- stupaju pluéni simptomi. Do 11. mjeseca iyota nekoliko je puta hospitaliziran u Mostaru, a nakon toga 5 puta wu Splitu ‘Najduda remisija postignuta je izmedu 1. 3, godine Zivola. Uz somatsku retardaci ju, javijaju se simptomi globalne pluéne insuficijencije sa znakovima kroniénog plugnog srca, Umire u 5.-oj godini Zivota, pod slikom Kardiopulmonalne insufici- Jencije Genski smo analizirali cijelu obitelj jo§ 1990, godine, ali zbog komplicirane ‘mutacije kod oca, rezultate iz Graza dobi: li smo tek 1992. godine. Dok se objavljuje nova mutaeija, maj- ka je ponovno trudna, ali zbog rata ne do- lazi na prenatalnu dijagnozu. Rada se Zen- sko dijete s pluénim znakovima CF. Doz~ nnajemo da umire u dobi od 3,5 godine. U naredne dvije trudnoée obitelj je izgubila jo8 dvoje djece. Nisu Zeljeliizvrsiti prena- talno ispitivanie. Mutacija koja je nadena u jednom od 160 ne-AFSO8 kromosoma ispitanih u os? vac oe F500 Exonte: 38061608 pit Wave Raver Wass Sitka BOGE te (11) Grell, Wagner K Rosenkrunc W.ldenifiation of anew splie site mutation (38492 1G->A) nthe intron 19 ofthe CFTR gee, gle je opisana ‘nova mtacijapronadena kod nateg bolernla br Figure 1. Ress of molecular analysis of the ist patent (APSOS/E on 19:3849+1G->A) Figure DGGE from 1) rll. Wagner K Resenkvone W.Fdentifcation ofa new spice ite maazton(38494+1G->A} athe intron 19 ofthe CFTR gene from our patient. 1682Austriji zahvaéa prvi nukleotid u slijedu koji je visoko konzerviran u svim CFTR egzonfintron —granignim — podruéjima, Promjena od G->A dovela je do promjen- {jenog slijeda (splicing mutacija) i stvaran- {ja mutiranog egzona, Sto je uzrokovalo stvaranje nefunkcionalnog CFTR protei- na (slika 1) (6, 11). Bolesnik 2, AFSOS/ESSSX Djevojeica (proband) (11/0, slika 2) drugo je dijete u obitelji mladih zdravih roditelja, Rodena je 1987. godine, prije otkriéa CFTR gena. Tijekom prva dva mjeseca Zivota slabije dobiva na tjelesnoj tein, a prvi je puta hospitalizirana u dobi od 3 mjeseca sa znakovima opstrukeij skog bronhitisa. Nakon pofetnih pluéniht simptoma, nastavljaju predominirati ga steointestinalni simptomi, s poremeéenim vrijednostima jetrenih enzima. U dobi od 2 mjeseca ima tek masu kao na rodenju (3680 grama). Nakon opse2ne klini¢ke i Inboratorijske obrade, uz nalaze visokih ‘rijednosti klorida’ uu znoju (70 mEg/L->100 mEq/L), postavlja se dija- ‘gnoza cistigne fibroze. Tijekom Zivota hospitalizirana je radi ‘gastrointestinalni i pluénih komplikacija {¥.Gulé sur, Pika dvije ithe mutaciew cistitno von. Puedat Croat 2000; 44: 161-165, CF u Splitu i Zagrebu, da bi u dobi od 14 imjeseci, pod slikom kardiopulmonalne insulicijencije i marazma, umrla. Patohi- stoloSki se nade kroniéna fibrozna upala gusteraée i jetr, kronigne upalne promje- ne u bronhima i bronhiolima, obostrana upala pluéa i kroniéni fibrozni sialoadeni- Obitelj je zatradila genetski savjet 1988. godiie u naSem centru. 1989. godi- ne rada se zdrava djevojtica, homozigot (2, slika 2). Prenstalna dijagnoza iavrena je metodom biokemijske enzi- matske analize plodne vode (Prof. Bous, Pari), prije otkriéa genske mutacije na 7 kromosomnu, U posljednoj trudnoéi (1U3, slika 2) 1994. godine, amniocentezom u 16. ted- nu trudnoge (Klinika za Zenske bolesti i porode, Zagreb) iz kulture amniocita izo- lirana je DNA (KBC Rebro, Zagreb, Mo- lekulski laboratorij i Zavod za medicin- sku genetiku), Koja je upuéena u Geneti- sche Beratung und Untersuchungstelle, Graz, Austria. Indirektnom metodom iz, krvi 2dravib roditelja (otac W/l:zdravi he terozigot za E585X mutaciju na 12. egzo- nu; majka U2:zdravi heterozigot za AFS08 mutaciju) i amniocita ploda (IU3:2dravi heterozigot 2a AFSO8 mutaci- ise] grees cme Griese Tene tar eeem tare 3 ia ion ESO _Neneneszaton (GT an Mao Ponen 185) oh Iie Gu tye Gu le Pe Gur eas HEA GAA AEA Gua RTA TTT Ga 2 a2 Sika 2 Obst nal origina recta leuk aie 2. sao epee 171 Ota fenotipssedrav,hererocigot za Exon 12-ES85X 112 Maptafeeripsh edrava,heereigot sa AFSOS WO Proband (rnd. 1986 [WA Djetak (985 ziravihomozigot [U2 Djeojeea (1989) zdrav horigo,rodena maton PD (1988. god.) adredivanlem enc (Pars, Prof Bowe) is plane vode, pre onkriéa CFTR gena U2 Amniocemeza (1994) fenoipsizdrav deta, heteroxgot za AFS0S (naslijedeno od mae) Figue2. Family tree and recut of molecular analysis of second poten? 111 Father phenotype healt, heterozygous Exon I2-ESSSX A Mother phenotypic healthy, heterozygous AF508 10+ Proband bom in 1986) WA 4 Biny (1985) healthy homozygous 124 Gir born in 1989) heathy homozygous, bom ater PD. 1988) ju) bili smo w moguénosti ievrSiti prena- talnu dijagnozu. Retrogradno smo zak- juGili da je proband, djevojtica umrla 1987. godine, nosila kompleksnu mutaci- ju AFSOB/ES85X. 1994. godine rodeno je zdravo musko dijete (IU3, slika 2), hete- rozigot za AFS08 mutaciju koju je naslije- dio od majke. Drugi Elanovi obitelj (brat 1/2 i sestra: II slika 2) genski su potvrdeni kao zdravi homozigoti DISKUSUA Delta F508 najudestalija je mutacija odgovorna za cistitnu fibrozu_u skoro svim ispitivanim populacijama. Ipsk, po- stoji jasan gradijent uéestalosti uw raz Ligitim populacijama (1, 2, 13, 14). Od tri genotipizirana bolesnika s CF iz naieg genetskog savjetovalista, samo jedan je nosio AFSOS/AF508 mutaciju (33%). Od 1978, do 1994. godine na Odjelu za djesje bolesti hospitalizirano je 30 000 djece. Od tog broja, 15 bolesnika lijeteno je s kli- nickom dijagnozom cistiéne fibroze (005%). Samo smo kod 3-je pacijenata 20%) mogli potvrditi mutaciju. Dvije obitelji su zatrazile genetski savjet. Pre- natalna dijagnoza izvrSena je kod jedne az cst 2 xvec 22 wis eggs gee gna 0) NN ONS NF F508 NNoMY NR Exon 12 a2 12 posea’ 1 migroviusth membrana cnjemog eptela 163