Cátedra de Quimica Biológica

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

Universidad Nacional de Córdoba

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DOCENTES

Profesora Titular: Dra María Angélica Perillo (Inv.Independiente CONICET))

Profesores Adjuntos: Dr. Daniel A. García (Inv.Adjunto CONICET)
Dr. Raúl H. Marín (Inv.Adjunto CONICET)
Jefes de Trabajos Prácticos
Dra. Julieta María Sanchez (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Anahi del V. Turina (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Verónica Nolan (Inv. Asistente CONICET)
Biól. Eduardo M. Clop (Becario doctoral CONICET)
Biol. Jackelyn M. Kembro (Becaria doctoral CONICET)
Biol. Benjamín Caruso (Becario doctoral CONICET)
Biol. Mariela E. Sánchez (Becaria doctoral SeCyT-UNC)
Becarios
Biol.Pedro D.Clop (Becario doctoral Foncyt)
Biol.Gabriela Reiner (Becaria doctoral CONICET)
Biol. Natalia Corvalan (Becaria doctoral CONICET)
Adscripto
Biol. Leonardo Fruttero
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PROGRAMA ANALÍTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA.

1. La lógica molecular de la vida
Diversidad biológica y unidad bioquímica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtención,
almacenamiento, liberación y utilización de la energía. Ubicación subcelular de la actividad metabólica;
fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Macromoléculas y ensambles supramoleculares:
caracterización; papel del agua, efecto hidrofóbico e importancia de las interacciones débiles (puente de
hidrógeno, van del Waals) en su estructura y función. Propiedades coligativas de disoluciones acuosas.
Superpoblación molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad y difusión de los
solutos.

2. Evolución Bioquímica
Composición química de la materia viva. Evolución prebiótica. Ribozimas. Evolución: desde la información
unidimensional de la secuencia (ADN) a la información tridimensional de la función (proteína).
Transferencia de información biológica a nivel molecular (ADN- ARN- Proteína; gradientes de carga y de
materia) y de la dinámica estructural (cambios conformacionales en proteínas, catástrofe microtubular, el
citoplama celular como una matriz de percolación de dimensión fractal). Evolución de la estructura:
molécula, agregados supramoleculares, compartamentalización, aparición de gradientes y de bombas.
Mecanismos de transducción de energía y de señales. Evolución de la complejidad. Patrones
bioquímicos: metabolones.

3. Estructura y función de las Proteínas

Equilibrios ácido-base en aminoácidos. Unión peptídica. Proteínas: estructura primaria, secundaria (α-
hélice, hoja β, giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificación estructural) y cuaternaria.
Plegamiento: cooperatividad, estabilización progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y
actividad. Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas (precipitación selectiva, cromatografías
de intercambio iónico, filtración molecular y de afinidad). Electroforésis: determinación de la masa
molecular, número de protómeros y localización de puentes disulfuro. Ultracentrifugación. Secuenciación
de proteínas. MALDI-TOFF. Inmunodetección y cuantificación, ELISA, “Western blot”. Síntesis en fase
sólida. Determinación de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY), dicroismo circular,
fluorescencia, difracción de Rayos X. Cuantificación de proteínas.

4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética

Estructura química de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimídicas. Nucleósidos y nucleótidos:
nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de
los ácidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicación del
ADN, Transcripción de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Código genético.
Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicación. Virus oncogénicos. El
bacteriofago λ: mecanismo de integración al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides.
Plásmidos.

5. Investigación en genética
Ingeniería genética: aplicaciones y obtención del gen: por corte del ADN con endonucleasas de
restricción, por síntesis orgánica en fase sólida y a partir del ARNm. Secuenciación por interrupción
controlada de la replicación. Amplificación: PCR. Tecnología del DNA recombinante: Unión de segmentos
de ADN de distinto origen: método de las colas homopoliméricas. Vectores: plásmidos semisintéticos y
derivados del bacteriofago λ: características deseables. Introducción del vector a la célula huésped
(transformación). Selección del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulación de genes de
eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresión génica, chips de genes
(microarrays). Animales transgénicos. Mutagénesis dirigida para producir proteínas nuevas.

6. Investigación en evolución
Relaciones evolutivas a partir de secuencias de proteínas. Homologías de secuencias: secuencias
alineadas, significación estadística (“shuffling”), matriz de sustitución, bancos de datos para detectar
secuencias homólogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Gráfico autodiagonal (autoalineamiento)
para detectar secuencias repetidas. Relación estructura/función: evolución divergente y convergente.
Construcción de árboles evolutivos. Evolución molecular en el laboratorio.

7. Bioenergética
Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropía y vida. Bioenergética: cambios de energía libre de
una reacción. Relación entre la constante de equilibrio y el cambio de energía libre estandar. Cálculo del
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cambio de energía libre estandar y el cambio de energía libre de una reacción redox. Reacciones
acopladas. Energética del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato:
factores que influyen en el cambio de energía libre estandar durante la hidrólisis.

8. Enzimología
Enzimas clasificación y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definición: estructura química y
clasificación. Coenzimas de oxido-reducción: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima Q (CoQ) y ácido
lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que
transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilación: piridoxal fosfato y biotina.
Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas liposolubles,
estructura y función. Estrategias catalíticas.

9. Cinética Enzimática
Mecanismo de la actividad enzimática. Cinética. Reacciones monosustrato: el modelo de Michaelis-
Menten; determinación de la Km y Vm por el método deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos
de inhibición. Análogos del estado de transición. Anticuerpos catalíticos (reconocen el estado de
transición). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias
reguladoras: enzimas alostéricas (cinética y modelos), isozimas, modificación covalente, escisiones
proteolíticas.

10. Glúcidos y Lípidos

Glúcidos: Monosacáridos, carbohidratos complejos, glicoproteínas, lectinas.
Lípidos: lípidos de membranas, balance hidrofílico-hidrofóbico, estructuras de autoagregación.

11. Biomembranas
Estructura y función de la membrana biológica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de
células eucariotas. Membranas de células procariotas. Tipos de movimientos de las moléculas
constituyentes. Difusión (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropía) y curvatura. Efectos de factores físico-
químicos y de la composición. Proteínas de membrana: extrínsecas, ancladas, intrínsecas. Predicción de
secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias señalizadotas de
direccionamiento de proteínas. Fusión de membranas.

12. Transporte
Difusión: Difusión facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y
contratransporte. Antibióticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis. Potenciales
de acción. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Nexus o uniones íntimas.

13. Transducción de la información

Receptores de superficie. Curvas de saturación. Receptores ionotrópicos. Receptores 7TM. Segundos
mensajeros. Conversación cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teoría química de la
transmisión nerviosa. El potencial de membrana. Liberación, recaptación y degradación de los
neurotransmisores. Unión mioneural. El receptor nicotínico de acetilcolina: inhibidores. La acetil
coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores.

14. Metabolismo
Metabolismo: visión de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energía libre.
Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilación. Motivos recurrentes en las vías
metabólicas. Transportadores activados. Evolución de las vías metabólicas.
Oxidaciones biológicas. Enzimas de oxido-reducción: Clasificación y ejemplos. Metabolismo del
superóxido. Glucólisis : reacciones, consumo y generación de ATP a nivel de sustrato. Generación de
NADH. Balance energético. Destinos del piruvato: formación de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Entrada
de fructosa y galactosa. Gluconeogénesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del lactato.

15. Ciclo de Krebs

Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos (TCA): reacciones, formación de coenzimas reducida y ATP
a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interacción de los metabolismos de glúcidos , lípidos
y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidación total de glucosa. Ciclo del glioxalato.

16. Fosforilación oxidativa.

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Fosforilación oxidativa. Ubicación submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de
formación de ATP. La hipótesis quimio-osmótica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergética.
Regulación de la fosforilación oxidativa. Inhibidores.

17. Metabolismo de glúcidos

Via de las pentosas-fosfato. Biosíntesis del ácido ascórbico. Degradación intracelular del almidón y del
glucógeno: reacciones. Digestión. Interconversión de hexosas. Biosíntesis del glucógeno, almidón y
celulosa: reacciones. Regulación del metabolismo del glucógeno via AMPc. Biosíntesis de disacáridos.

18. Fotosíntesis
Fotosíntesis: ecuación global. Ubicación del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reacción de Hill. Las
reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formación de ATP y
NADPH. Bioenergética. Mecanismo de formación de ATP. Reacciones enzimáticas: ciclo de Calvin.
Eficiencia de la fotosíntesis.

19. Metabolismo de lípidos

Biosíntesis y degradación de los triglicéridos, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Biosíntesis del colesterol
a partir de acetato. Formación de colecalciferol y ácidos biliares
Metabolismo de los ácidos grasos, degradación por -oxidación de ácidos grasos saturados de cadena
par e impar y de ácidos grasos insaturados. Balance energético. y oxidación. Ubicación subcelular.
Biosíntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial.

20. Metabolismo de amino ácidos

Metabolismo de los aminoácidos. Ciclo de fijación del nitrógeno. Degradación de los aminoácidos:
reacciones de tipo general: desaminación por transaminación, desaminación oxidativa, desaminación no
oxidativa y descarboxilación, ejemplos. Transporte del amoníaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los
aminoácidos como precursores de otras biomoléculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina,
histidina y glutamato. Glutatión. Porfirinas. Biosíntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la
hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadción
de la hemoglobina. Formación de pigmentos biliares.

21. Metabolismo de ácidos nucleicos

Síntesis de novo de pirimidinas. Biosíntesis de bases púricas y desoxiribonucleótidos. Síntesis de NAD+,
FAD, Coenzima A. Uratos. Replicación, recombinación y reparación del DNA, polimerasas,
topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Síntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular,
telomerasa. Síntesis y maduración del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular.

22. Metabolismo de proteínas

Biosíntesis de proteínas. Codigo genético: características. Formación de aminoacil-ARNt. Mecanismo de
la síntesis de proteínas: etapas de iniciación, elongación y terminación. Modificaciones post-
traduccionales. Antibióticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones.

23. Integración metabólica y control de la expresión génica

Regulación metabólica. Control de la expresión genética en procariotas. Ooperón lac y operón trp:
inducción y represión. Control en eucariotas. Regulación por modificación de la actividad de la enzima:
activación por precursor e inhibición por producto final. Regulación hormonal. Hormonas de mamíferos:
bases moleculares del mecanismo de acción. Receptores de hormonas de estructura esteroide, peptídica
y derivada de aminoácidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de insectos.

24. Inmunoquímica
Inmunoquímica. Inducción de anticuerpos específicos. La unión Ag-Ac. Heterogeneidad de los
anticuerpos. Estructura química de las inmunoglobulinas. Teorías sobre la formación de anticuerpos.

25. Bioquímica de sistemas sensoriales

Olfato, gusto, visión, audición y tacto, aspectos bioquímicos. Receptores y mecanismos de transducción
de señales involucrados.

26. Motores moleculares

NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contracción muscular, asociación cíclica de la actina y miosina.
Microtúbulos, tubulina, quinesina y dineína. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.
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PROGRAMA SINTÉTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA .
1. La lógica molecular de la vida
2. Evolución Bioquímica
3. Estructura y función de proteínas
4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética
5. Investigación en genética
6. Investigación en evolución
7. Bioenergética
8. Enzimología
9. Cinética Enzimática
10. Glúcidos y lípidos
11. Biomembranas
12. Transporte
13. Transducción de la información
14. Metabolismo
15. Ciclo de Krebs
16. Fosforilación oxidativa
17. Metabolismo de glúcidos
18. Fotosíntesis
19. Metabolismo de lípidos
20. Metabolismo de amino ácidos
21. Metabolismo de ácidos nucleicos
22. Metabolismo de proteínas
23. Integración metabólica y control de la expresión génica
24. Inmunoquímica
25. Bioquímica de sistemas sensoriales
26. Motores moleculares

TRABAJOS PRACTICOS
TP 1: Espectrofotometría.
TP 2: Purificación, cuantificación y análisis estructural de proteínas
TP 3, 4 y 5. Cinética Enzimática
TP 6: Fotosíntesis.
TP 7: Mecanismos de transducción de energía

OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA.

Al terminar el curso el estudiante deberá:
• Adquirir una clara comprensión del metabolismo celular a la luz de conceptos de:
- Mecanismos de transducción de energía y de información.
- Termodinámica, cinética y catálisis de reacciones bioquímicas
- Importancia de la compartamentalización en la generación de gradientes químicos y
electroquímicos.
- Modulación dinámica de la estructura y función de biomembranas, proteínas y de la organización
compleja del citoplasma
- Vías metabólicas fundamentales y su integración
- Patrones bioquímicos y su evolución
• Desarrollar del pensamiento crítico.
• Adquirir destreza en el uso de metologías del laboratorio bioquímico

BIBLIOGRAFIA
Bioquímica General
- Blanco, A. Química biológica, Ed.El Ateneo, 2006.
- Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*.
- Harper, H.A, Manual de Química Fisiológica. Ed. El manual moderno 1980*
- Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioquímica. Ed.Pentice Hall,
Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*.
- Lehninger, Albert L.. Principios de bioquímica . 2ºEd., Omega, Barcelona, 2001.
 7
- Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioquímica .3º Ed., Omega, Barcelona, 2001.
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, 5º Ed., Reverté SA, España, 2003.
- Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*.
- Voet D., Voet JG, Pratt C.W. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular, Ed. Médica
Panamericana. 2006.
- Walker, J. M.. Biología molecular y biotecnología .2º Ed. Acribia, Zaragoza, 1997.
Problemas
- Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Química. Ed. Alhambra. 4a. España. 1976.
- Holme, David J. . Resolución de problemas de bioquímica analítica, Acribia, Zaragoza, 1996.
- Segel I.J. Cálculos en Bioquímica. Acribia. Saragoza. España. 1972.

Bibliografía de consulta sobre temas específicos

Química General, Química Orgánica y Química-Física
- Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoquímica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana.
México.
- Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991
- Brown, T. L., LeMay, H. E. y Bursten, B.E.. Química, La Ciencia Central. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A., Quinta Edición. 1993.
- Morris, J.G. Fisicoquímica para biólogos. Ed. Reverté. Barcelona. 2002.
- Whitten, W.K y K.D Gailey. Química General. Ed. Interamericana. México. 1986.
Biofísica-Química y Biología Celular
- Alberts, B. . Biología molecular de la célula , 3º Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002.
- De Robertis, E.M.F.. Biología celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12º Ed., El Ateneo,
Buenos Aires, 1998.
- Estrada Cerqueda, C.. Cinética del transporte a través de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976.
- Grigera, J.R. Introducción a la biofísica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976.
- Maggio B. Introducción a la biofísico-química. Ed.Gonzalez Truccone. Córdoba, Argentina. 1987*.
- Vicente Córdoba, C.. Biofísica, Ed.Síntesis, Madrid, 1992
Cinética enzimática
- Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme
systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*.
- Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI
Fotosíntesis
- Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
- Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
- Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
Análisis Bioquímico e Instrumental
- Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
- Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Química Clínica: Bases y Técnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims.
Barcelona. España.1980*.
- Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Métodos Instrumentales de Análisis. Ed. CECSA. México. 1974.
- Skoog D.A. y West D.M.. Análisis Instrumental. Ed.Interamericana. México. 1975.
- D'Ocon Navaza, María Carmen. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico, Paraninfo, Madrid,
1999.
Bibliografía especializada
- Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular
Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*.
- Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*.
- Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio, 2001.

La bibliografía citada está disponible en la Biblioteca “Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC.
* disponibles en la Cátedra de Química Biológica.
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CRONOGRAMA

CLASES TEÓRICAS: Comienzan: 11de marzo Finalizan: 26 de junio

TRABAJOS
CLASES TEÓRICAS
Aulas 219 o 218 PRÁCTICOS
Semana

Laboratorio 13
Miércoles Viernes 1o Semana 2o Semana
1215-1415 hs TEMA 10-12 hs TEMA Comisiones Comisiones
Aula 219 Aula 218 1-3-5 2-4-6
La lógica molecular de la Metabolismo.
1 11/03/09 13/03/09
vida Evolución Bioquímica
TP 1
2 18/03/09 Proteínas 20/03/09 Proteínas Espectrofoto
metría
TP 1*
Investigación en
3 25/03/09 Ácidos nucleicos 27/03/09 Espectrofoto
genética
metría
Investigación en evolución TP 2*
4 01/04/09 03/04/09 Cinética Enzimática
/ Bioenergética Proteínas
Feriado TP2
5 08/04/09 Cinética Enzimática 10/04/09
(Semana Santa) Proteínas *
TP3
6 15/04/09 Enzimología 17/04/09 Glúcidos / Lípidos
Cinética I
TP3
7 22/04/09 Biomembranas 24/04/09 Transporte
Cinética I
Feriado (Día de TP4
8 29/04/09 Transducción de señales 01/05/09
Trabajador) Cinética II *
Glicólisis Interconversión de TP4
9 06/05/09 Gluconeogénesis 08/05/09 hexosas; Vía de las Cinética II
Glucógenolisis pentosas
TP5
Ciclo de Krebs PRIMER EXAMEN
10 13/05/09 15/05/09 Cinética III y
Cadena Respiratoria PARCIAL
Seminario 1
TP5
Fotosíntesis / Ciclo de
11 20/05/09 Fotosíntesis 22/05/09 Cinética III y
Calvin
Seminario 1
Metabolismo de TP6
12 27/05/09 Metabolismo de lípidos 29/05/09
lípidos Fotosíntesis
Metabolismo de TP6
Biosíntesis de ácidos
13 03/06/09 aminoácidos/ Biosíntesis 05/06/09 Fotosíntesis
nucleicos
de Nucleótidos
TP7
Regulación de la Transducción
14 10/06/09 Biosíntesis de proteínas 12/06/09
expresion génica de energía y
Seminario 2
TP7
Integración metabólica / Bioquímica de Transducción
15 17/06/09 19/06/09
Inmunoquímica sistemas sensoriales de energía y
Seminario 2
SEGUNDO EXAMEN Recuperatorio TP
16 24/06/09 26/06/09
PARCIAL y FIRMA REGULARIDAD
Recuperatorio
01/07/09
Ex.Parciales
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CONDICIONES PARA EL CURSADO
Correlativas regularizadas: Química Orgánica y Física I.

TRABAJOS PRÁCTICOS
Concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, calzado adecuado (cerrado) y cabello recogido.
No podrá realizar el TP aquel alumno que concurra sin estos elementos mínimos de seguridad personal.

ASISTENCIA:
Clases Teóricas: no obligatoria
Trabajos Prácticos: 80% obligatoria

ACTIVIDADES
Clases teóricas: Exposición.
Discusión de problemas teóricos.

Trabajos prácticos: Resolución de problemas.

Trabajos de laboratorio.
Seminarios de discusión de trabajos científicos.

EVALUACIONES
I. Trabajos Prácticos:
a) Evaluación oral durante el desarrollo del TP. Se tendrá en cuenta: desempeño, destreza, atención, participación,
puntualidad, y la presentación de Trabajos Científicos (cuando corresponda).
b) Una evaluación escrita al final de cada TP. El resultado de la evaluación estará disponible en el TP siguiente.

II Exámenes Parciales:
Se tomarán 2 (dos) exámenes parciales sobre temas desarrollados en clases teóricas y prácticas.
Los alumnos deberán inscribirse para rendir estos parciales durante la semana previa al parcial (al final de las clases
teóricas). La inscripción no es personal.

CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIÓN

Desempeñarse satisfactoriamente durante los TP (item a) y aprobar el 80% de los TP (6 de las 7 evaluaciones escritas
de los Trabajos Prácticos (item b). Las evaluaciones de los TP se aprueban con el 60% de las respuetas correctas o
alcanzando el 60% de los contenidos de TP.

CONDICIONES PARA LA PROMOCIÓN:

Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Química Orgánica y Física I
Aprobar el 80% de los TP
Alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos Exámenes.Parciales, con una nota no inferior a 4 puntos.

RECUPERATORIOS (al final del cuatrimestre)

Se podrá recuperar:
- Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas más arriba.
En caso de inasistencia, podrá recuperarse el TP, sólo por causa debidamente justificada, en alguna Comisión donde
el mismo aún no se hubiera dictado. En el caso de inasistencias no habrá recuperatorio al final del cuatrimestre..
- Un examen parcial (por cualquier razón: inasistencia, reprobado o para aumentar nota).

FIRMA DE REGULARIDADES
Se realizará el mismo día y horario del recuperatorio de TP. La firma de libretas se realizá unicamente ese dia.
El trámite no es personal.
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NORMAS BASICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS1

INDICE
Pág.
1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO 11
2. HABITOS PERSONALES 11
3. MANIPULACIÓN EN LABORATORIOS. 12
4. MEDIOS DE PROTECCIÓN 14
4. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES 14
5. TELÉFONOS IMPORTANTES 15

TEMAS

1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO

• La organización del laboratorio, debe ser estudiada a fondo y procurar que sea adecuada para
el mantenimiento de un buen nivel preventivo.
• No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio fuera de horas habituales, por la
noche o en operaciones con riesgo.
• Cuando se realicen operaciones con riesgo, incluso las personas que no intervengan en ellas
deben estar informadas de las mismas.
• Deberá trabajarse en las campanas extractoras siempre que se manipulen productos tóxicos,
inflamables y/o que se desprendan en el proceso. En éstas deberá comprobarse
periódicamente el funcionamiento del extractor, su estado general, el cumplimiento de los
caudales mínimos de aspiración, que su uso sea el adecuado, etc.
• La programación de trabajos con productos químicos, deberá ir acompañada de la adopción de
medidas preventivas que se requiera en cada caso.
• Deberá comprobarse la ventilación general del laboratorio.
• Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en
estanterías altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. No
deberá haber botellas con líquidos inflamables, incluso las botellas empezadas o los reactivos
preparados con mezclas de productos inflamables. Ha de controlarse que las botellas una vez
utilizadas, se cierren correctamente.
• Está prohibido fumar, beber y comer en los laboratorios.
• Los envases para recuperar se enjuagarán y colocarán, sin taponar, para el posterior proceso
de lavado.
• No se permitirá la presencia de personas no autorizadas y debidamente informadas de los
riesgos inherentes en el laboratorio.

2. HABITOS PERSONALES
• Mantener en todo momento guardapolvos, camisas y vestidos abrochados.
• No abandonar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas.
• No comer o beber en los laboratorios.
• No guardar alimentos ni bebidas en las heladeras del laboratorio.
• No fumar en los laboratorios.
• Llevar recogidos los cabellos.
• No llevar pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en
los montajes.
• Los guardapolvos no deberán llevarse a lugares de asistencia común como son las bibliotecas,
cafeterías, salas de reuniones, comedores etc.

1 Extraído de “Seguridad y condiciones de trabajo en los laboratorios” del CSIC-España.

 11
• No es aconsejable guardar la ropa de calle en la mesada del laboratorios, para lo cual deberá
disponerse de armarios o lugares específicos fuera del área de trabajo.
• Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipule con productos químicos
líquidos de cualquier tipo en ebullición.
• Si la naturaleza del trabajo lo requiere, el personal del laboratorio deberá utilizar los medios de
protección adecuados.
• No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por salpicaduras
de productos químicos o sus vapores, al pasar por detrás de las lentes, podrían provocar
lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de gafas graduadas.
• Si un producto químico salpica a los ojos, utilizar inmediatamente un lavaojos y lavarlos durante
15 minutos sin interrupción. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una
corriente de alta presión directamente al ojo porque podria lesionarse. Es necesario mantener
los ojos abiertos con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los párpados.
• Lavarse las manos: antes de abandonar el laboratorio, siempre que se quiten los guantes
protectores y después de toda operación que haya comportado el posible contacto con material
irritante, cáustico, tóxico o infeccioso.
• Para secarse las manos, en vez de toallas es preferible el uso de papel desechable o
secadores de aire.
• La persona que al término de la jornada sea la última en abandonar el laboratorio deberá
asegurarse que los procesos que no queden en funcionamiento, las conducciones de agua y
gas estén cortadas, la energía eléctrica desconectada y que el local se encuentra en un estado
que excluya el riesgo de incendio.

3. MANIPULACIÓN EN LOS LABORATORIOS

Laboratorios con riesgo químico
• Toda persona que manipule un producto químico, deberá tener conocimiento de sus
características físico-químicas y toxicológicas.
• Deberán conocerse, como mínimo, las frases de riesgo y seguridad (R y S ) de los productos.
• Como norma general, cualquier manipulación de una sustancia química deberá realizarse
dentro de las vitrinas de laboratorio.
• No llenar los tubos de ensayo más de la mitad de su volumen total.
• Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando las pinzas.
• Utilizar en todo momento gradillas y soportes.
• Tomar los tubos de ensayo con los dedos, nunca con las manos.
• No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos.
• No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la
abertura en dirección contraria a uno mismo y a las demás personas cercanas.
• Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de
roturas.
• No oler productos químicos si no se está debidamente informado .
• No tocar con las manos ni probar los productos químicos.
• En caso de producirse una contaminación se limpiará la zona y no podrá utilizarse
hasta tener seguridad de su descontaminación utilizando los productos adecuados en cada
caso y que deben conocerse previamente.
• No tocarse ninguna parte del cuerpo, material o instrumental con los guantes contaminados. En
el caso de que esta circunstancia hubiera ocurrido, limpiar con los productos adecuados y
eliminar los elementos utilizados en la limpieza, como residuos tóxicos.
• No efectuar pipeteos con la boca. Se realizará con peras de goma para pipetas o pipetas de
seguridad.
• No trabajar separado de la mesa.
• Para el encendido de mecheros, utilizar encendedores piezoelectricos; no emplear fósforos
ni encendedores de bolsillo.
• Los mecheros no deberán dejarse encendidos sin vigilancia.
• Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos
 12
para tomarlos.
• Al finalizar una tarea u operación, recoger materiales, reactivos, equipos, etc, evitando las
acumulaciones innecesarias y dejando la zona de trabajo en las debidas condiciones de
limpieza.
• Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexión de los aparatos, agua, gases, etc.
• Emplear y almacenar sustancias inflamables en las cantidades imprescindibles.
• Deberá ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente después de
su utilización.
• No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapón.
• Siempre que sea posible se trabajará en bandejas con el fin de confinar un posible
derrame. Será muy conveniente forrar con papel de filtro dichas bandejas.
• Siempre que sea necesario, deberán utilizarse guantes específicos para los productos que
se manipulan.
• Los guantes y todo material contaminado con productos tóxicos y /o infecciosos deberán
descontaminarse y/o esterilizarse antes de ser eliminados. Cuando no se utilicen guantes en la
manipulación de sustancias químicas, las manos deberán lavarse frecuentemente. Al finalizar la
sesión de trabajo, es aconsejable un lavado cuidadoso antes de abandonar el laboratorio.
• Las puertas de los laboratorios deberán permanecer cerradas durante la jornada de trabajo.
• Deberá mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento.
• Deberán mantenerse libres los espacios de trabajo, así como las zonas de paso y salida de los
recintos.
• No utilizar nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
• Antes de comenzar un experimento asegurarse de que los montajes y aparatos están en
perfectas condiciones de uso. Ante cualquier mínima duda consultar con el responsable del
trabajo.
• Los trapos o materiales ensuciados con aceite o sustancias inflamables deberán colocarse en
recipientes cerrados que deberán vaciarse diariamente y su contenido será neutralizado.
• Las instalaciones, aparatos e instrumentos destinados a reparación, deberán enviarse limpios,
sin trazas de sustancias químicas nocivas.
• Antes de utilizar sustancias inflamables deberemos asegurarnos de que no hay cerca
mecheros encendidos, calentadores etc.
• No debe dejarse sin vigilancia ningún tipo de reacción química.
• Al finalizar un experimento los productos deberán etiquetarse y colocarse en lugar seguro.
• Las sustancias cuya disolución sea exotérmica, deberán disolverse por porciones, agitando y
enfriando continuamente.
• Durante la destilación de sustancias inflamables de bajo punto de ebullición, deberá controlarse
la llegada de agua al refrigerante y alejar del aparato cualquier otra materia inflamable.
• Cuando se derrame alguna sustancia combustible se procederá a:
- Apagar el mechero, si ha lugar.
- Cortar la corriente eléctrica en el exterior del laboratorio.
- Asegurar una ventilación eficaz.
- Se absorberá el líquido con un cuerpo poroso que posteriormente se depositará en
un lugar sin peligro.
- Se eliminará como residuo tóxico.
• Las sustancias químicas deberán estar colocadas en recipientes con materiales adecuados y
etiquetados debidamente. Los recipientes deberán estar cerrados.
• Los recipientes que contengan líquidos deberán estar protegidos contra la acción directa de los
rayos solares o contra el calentamiento.
• Los metales alcalinos como sodio o potasio deberán conservarse con una capa protectora de
un solvente con un punto de ebullición elevado (petróleo, aceite de parafina) y el fósforo blanco
con una capa de agua.
• Los productos incompatibles deberán guardarse separadamente.
• Los recipientes que contengan productos agresivos no deberán almacenarse a una altura
superior a sesenta y cinco cm. Y serán recipientes de pequeña capacidad para su fácil manejo.
 13

4. MEDIOS DE PROTECCIÓN
• El trabajo en laboratorios requiere la utilización de guardapolvos, que en trabajos con riesgo
deberá considerarse el tejido de los mismos.
• Los guardapolvos deberán tener los puños ajustados a las muñecas. Asimismo, deberán estar
cerrados en la parte delantera y en el cuello.
• Tener siempre a disposición las gafas de seguridad. Es recomendable el uso permanente de
las mismas. Estas serán de uso personal.
• Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas.
• Conocer la protección brindada por los distintos equipos de protección individual para las
vías respiratorias.
• Conocer la aplicación de los productos de primeros auxilios del botiquín y los
mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores.
• Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos.
• Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores.

5. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES

5.1 Derrames
. Líquidos inflamables
Absorber con carbón activado productos específicos.
Alejar cualquier foco de calor.
. Ácidos
Neutralizar con bicarbonato o emplear productos específicos comercializados para su
neutralización o absorción.
Si por casualidad se ha producido un derrame sobre la piel, el remedio inmediato sería exponer
la zona afectada al chorro de agua del grifo durante cinco o diez minutos.
Las duchas de emergencia serán utilizadas en los casos en que la zona afectada del cuerpo sea
grande. Es necesario quitar la ropa contaminada de la persona afectada mientras esté bajo la
ducha. Si se produjesen quemaduras se precisará la asistencia médica.
No utilizar cremas ni pomadas grasas en las quemaduras graves.
.Bases
Emplear productos específicos comercializados para su neutralización y absorción.
.Otros líquidos no corrosivos ni inflamables
Absorber con aserrín.

5.2. Salpicaduras.
En piel y ojos
Deben lavarse con abundante agua (si es en los ojos, mediante un lavaojos).
No intentar neutralizar. Acudir al médico con prontitud.
En la ropa
Debe quitarse rápidamente la ropa, lavándola , o colocarse bajo la ducha, según la magnitud de
la impregnación.
Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada y acudir al médico.

5.3. Cortes
Se deberán lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mínimo. Si son
pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, Lavar con agua y jabón y taparlos con una venda
o apósito adecuados. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia médica
inmediata.

5.4. Ingestión
Si es un ácido o una base. Beber abundante agua, salvo que la sustancia ingerida reaccione con
ella.
No provocar el vómito, salvo indicación expresa.
 14
Disponer de información sobre los productos que se manipulan, consultando a un servicio de
información toxicológica cuando sea posible.
Si la persona está inconsciente, Ponerlo en posición inclinada con la cabeza de lado y estirarle
la lengua hacia fuera. Taparlo para que no coja frío.
Acudir al médico con una etiqueta del producto.

5.5. Inhalación
Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco.
Al primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca.
Tratar de identificar el vapor tóxico.

5.6. Incendio
Dar la alarma inmediatamente
Apagar los fuegos pequeños tapándolos sin utilizar agua.
Escoger adecuadamente el tipo de extintor, recordando el modo de empleo y la duración de la
carga. No utilizar nunca sobre una persona.
Si prende fuego la ropa: -Tenderse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las
llamas. No correr ni intentar llegar a una ducha de emergencia salvo que esté muy cercana.
-Se le cubrirá con una manta apagafuego, llevarle a una ducha de
emergencia o hacerle rodar por el suelo. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona
tendida procurando que no coja frío y proporcionarle asistencia médica.
Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir.

.Comportamiento ante un incendio en un local donde existan botellas de gases

La elevada temperatura provoca un aumento de la presión interna de la botella pudiendo
explotar.
Las botellas que puedan activar el fuego no deberán abrirse, cerrando las que estén en servicio.
Siempre que se pueda se desalojaran de la zona del incendio y si se han calentado se
refrigeraran con chorro de agua fría para disminuir la presión interna, avisando de ello al
suministrador.
En caso de intervenir el Cuerpo de Bomberos se les advertirá de la presencia de éstas
indicándoles, cuantas son, donde están y contenido.

6. TELÉFONOS IMPORTANTES
En todos los laboratorios debe haber un listado telefónico con los Centros de URGENCIA que
enumeramos a continuación, el cual será de conocimiento general.

ECCO (visitantes y alumnos) 44666666 4686868

BOMBEROS 100
SEGURIDAD INTERNA

ART (Docentes y Becarios SeCyT) EMI 4149093

(Becarios CONICET) La Caja 0-800-8880200
Taxi 4650303
 15

NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN

LABORATORIOS

He leído las NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN

LABORATORIOS incluidas en la Guía de Trabajos Prácticos de Química Biológica
(Ciencias Biológicas-Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-Universidad
Nacional de Córdoba) y estoy al tanto de las medidas de seguridad de trabajo en el
laboratorio.

Nombre y Apellido: ……………………………………………………………..

DNI: ……………………………….

Nº de Matrícula: ……………………………………

Firma: ……………………………………………………………..

Completar, firma, cortar y entregar al Jefe de Trabajos Prácticos en la

primera clase práctica.

Los contenidos serán objeto de evaluación en el primer TP.

16
 17

TRABAJO PRACTICO Nº 1
ESPECTROFOTOMETRÍA

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS:
- Conocer los fundamentos teóricos y las aplicaciones de la espectrofotometría.
- Comprender las propiedades que deben reunir los métodos experimentales de análisis.
- Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro.
- Valorar la importancia del dominio de técnicas auxiliares para poderlas aplicar con criterio ante los problemas
planteados.

TEMAS PARA REPASAR:

- Disoluciones.
- Estequiometría.
- Luz. Teoría ondulatoria. Teoría cuántica.
- Ondas electromagnéticas. longitud, frecuencia,
período de una onda y unidades en que se miden.
Relación entre velocidad, longitud de onda y
frecuencia. Energía de ondas electromagnéticas.

PROPIEDADES DE LOS MÉTODOS QUÍMICOS DE ANÁLISIS

Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinación de la

exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Expresa la corrección de una
medición.
Precisión: es el error debido al azar, la variación de los resultados obtenidos con una técnica cuando la
misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medición. Cuanto menor sea
la variación observada, mayor es la precisión.
Sensibilidad: es la variación mínima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la
mínima cantidad significativamente diferente del blanco.
Especificidad: es la propiedad del método de medir sólo la especie química en estudio, sin la
interferencia de otras que puedan estar presentes. Todo método exacto es preciso, pero un método
preciso no es necesariamente exacto.

ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO

Error: es la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la combinación del error sistemático y el
error debido a la falta de precisión. Los errores pueden dividirse en dos clases: 1) errores determinados, 2)
errores indeterminados.

Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse:

a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumétricos,
material de vidrio calibrado, reactivos, etc.;
b) errores operativos: son de naturaleza física, asociados con manipulaciones en un análisis.
c) errores personales: errores operativos del analista.
d) errores del método: tienen origen en las propiedades químicas y fisicoquímicas del sistema analítico.

Errores indeterminados o aleatorios: son pequeñas fluctuaciones en los sucesivos valores de una
cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por métodos
 18
estadísticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por
errores aleatoreos y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analítico.

ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría es una técnica que permite medir la absorción de radiación electromagnética,

ultravioleta y visible de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas, para su análisis cuali y
cuantitativo.
Las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas. Tanto la longitud de onda de la
radiación absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de:

• la estructura de la molécula y
• el medio en que se halla.

En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, lo que da
lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior:

h.ν
A A*

A = molécula absorbente
A* = molecula absorbente en estado de excitación energética.
h.ν = energía de un fotón

donde h= Constante de Planck y ν : frecuencia de radiación.

Los estados excitados de los átomos o moléculas son de vida media corta (10-9 s) y, en
consecuencia, la molécula en estado excitado vuelve rápidamente al estado fundamental. Comunmente,
la energía es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie química excitada puede sufrir
un cambio (reacción fotoquímica) o emitir parte de la energía absorbida como radiación electromagnética
de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia).

LEYES DE LA ABSORCION

Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida. La proporción de luz
transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera:

T = I / I0

Donde I = la intensidad de luz transmitida por la muestra

I0 = la intensidad de luz incidente

La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como porcentaje si se multiplica por 100 y
sus valores están en el rango de 0-100%:

%T = (I / I0 ) x 100

La relación (I / I0 ), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida. En ese
caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra.
La Absorbancia es adimensional, varía en el rango de 0 - ∞ y se define como:

A = log 1/T = log10 (I0 / I)

 19
Por sustitución se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia están relacionados
mediante la siguiente expresión:
A = log (100 / %T)
A = 2 - log( % T)

LEY DE LAMBERT:
¨La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad
de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a travez
de él¨.
Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso óptico
en la muestra, que puede ser expresado matemáticamente como sigue:

Log10 (I0/I) = A = K b

Donde b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y K es una constante del medio,
que fue descifrada por Beer.

LEY DE BEER:
¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de cromóforo que la
luz atraviesa¨.
La constante K, es proporcional a la concentración de cromóforo (c) : K = a c , donde a es
la absortividad o coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí misma.
La absortividad a es una constante que depende de:
• la longitud de onda de la luz incidente,
• la identidad de la sustancia analizada y
• del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con otras sustancias)

La constante a representa la probabilidad de absorción a una longitud de onda determinada

La LEY DE LAMBERT Y BEER queda resumida entonces, en la expresión:

Log10 (I0/I) = a c b

A=acb

Cuando el paso óptico está expresado en cm y la concentración en M, la absortividad se denomina

¨coeficiente de extinción molar o absortividad molar¨ (ε), entonces sus unidades son M cm .
-1 -1

Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad óptica (DO)

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO EN UNA SOLUCIÓN

Dadas una disolución de concentración desconocida a la que llamaremos “problema” y otra

disolución de concentración conocida a la que llamaremos “testigo”, aplicando la ley de Lambert y Beer a
cada disolución se obtienen las siguientes expresiones:

Ap=a.b.cp At=a.b.ct

Dado que el “problema” y el ”testigo” son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores de
absorbancia se determinan a la misma λ , los valores de absortividad serán iguales. Además, dado que se
utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b también serán iguales.
En consecuencia:
 20
Dividiendo m.a.m.
a.b.cp Ap.ct
Ap/ At = __________ podemos simplificar a y b, y al despejar queda: cp=
a.b.ct At

donde Ap= absorbancia del problema. cp = concentración del problema.

At= absorbancia del testigo. ct = concentración del testigo.

CURVA DE CALIBRACIÓN
Una curva de calibración es un gráfico de A o %T en función de la concentración de soluto; su
empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del
absorbente. En general se grafica A en función de la concentración (Fig.1a) pero, hay instrumentos que
sólo miden %T (Fig.1b). En éste caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A, mediante
el empleo de la ecuación A = 2 - log( % T).
Alternativamente, puede trazarse el gráfico de %T en función de la concentración en papel
semilogarítmico (Fig.1c). De otro modo, resultaría difícil utilizando un número limitado de puntos obtenidos
experimentalmente, comprobar gráficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer .
Papel semilogarítmico
a b c

%T
%T
A

Concentración (mg/ml) Concentración (mg/ml) Concentración (mg/ml)

Fig.1: Curvas de Calibración

Por consideraciones del error fotométrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores
de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma más exacta posible al trazar la gráfica.
Las escalas del sistema de registro del aparato son: lineal para %T y logarítmica para A: por éste
motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual no ocurre con la A. Sin
embargo, debido a que A y concentración se relacionan proporcionalmente, en la práctica se lee A.
En equipos con visores digitales, es posible trabajar con disoluciones con 0,1>A>1,0, como se indica más
arriba. En los equipos donde los valores de A se determinan de acuerdo a la posición de una aguja que se
mueve sobre una escala (galvanómetro), la aplicación de esta técnica se limita a muestras que produzcan
lecturas comprendidas entre 0,1 y 0,3, dado que en este rango de valores aún es posible interpolar datos
en la escala logarítmica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del equipo y, a
valores mayores, las menores divisiones de la escala son muy pequeñas y la apreciación de las lecturas
resulta poco precisa.

ESPECTRO DE ABSORCIÓN
Las soluciones absorben energía preferentemente en una ó más regiones del espectro
electromagnético, siendo la absorción inferior o nula en las demás regiones. Se denomina Espectro de
absorción a la representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la longitud de onda.
El espectro de absorción se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda para
establecer la longitud de onda de máxima absorción (λ max).
En el siguiente ejemplo, la λ max es aproximadamente 420nm (indicada por la fecha).
 21

0.20

0.15 Fig. 2. Espectro de Absorción

Absorbancia
0.10

0.05
λmax
0.00
300 350 400 450 500

Long onda (nm)

ESPECTROFOTÓMETRO
Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotómetro, que básicamente consta
de una fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente
para contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro (Fig. 3).

Sistema de
Registro

Fig. 3. Esquema de un espectrofotómetro

MEDICION DE LA ABSORBANCIA
1) Si tenemos una solución coloreada de concentración desconocida, la denominamos tubo problema.
Podemos conocer su concentración midiendo la absorbancia en el fotocolorímetro o espectrofotómetro a
una longitud de onda apropiada.

2) Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de absorbancia con un tubo que contiene
solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco. Este tubo puede contener varias sustancias,
además de disolvente, a la misma concentración en que se encuentra en el tubo problema, excepto la
sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema se encuentra disuelta en
agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendrá NaCl al 1% e KOH al 2% en agua,
sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar la absorción de sustancias
que no sean específicamente la sustancia problema y así poder medir la absorbancia propia de la
sustancia en estudio.

3) Un tercer tubo que denominamos testigo corresponde a una solución de concentración conocida de la
sustancia en estudio. Se prepara disolviendo una cantidad conocida de soluto en un volumen conocido de
solvente conteniendo las mismas sustancias que la solución problema: por ej. NaCl al 1% e KOH al 2%
para el caso que se está analizando. Se lee al espectrofotómetro, llevado previamente a cero de
 22
absorbancia con el blanco, de la misma forma que se hizo con el tubo problema. Finalmente, la
concentración del tubo problema se puede calcular mediante la interpolación del valor de absorbancia en
una curva de calibración (para lo cual es necesario la preparación de varios tubos testigos) o mediante la
comparación con un testigo.

4) Lo descripto en los puntos anteriores es válido para medir la concentración de sustancias incoloras
siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reacción
coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentración de la sustancia en
estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deberá ser tratado de forma
similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendrá los mismos reactivos y se los procesará de forma
similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber la luz
ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la absorbancia a
una λ comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).

GUIA DE ESTUDIO

1. Observe el esquema del espectro electromagnético de la Fig.4 y compare c (velocidad), λ (longitud de

onda), ν (frecuencia) y energía de la radiación electromagnética indicada.
2. Defina luz blanca y luz monocromática.
3. ¿Qué tipos de monocromadores conoce ?
4. ¿Qué efecto produce la absorción de la luz por una molécula?
5. ¿Existe alguna restricción con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede
absorber?
6. ¿Cuál es la utilidad de un espectro de absorción?
7. Concepto de ley de Lambert y Beer.
8. Definición de absorbancia y transmitancia.
9. ¿Cómo se preparan y qué utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema?
10. ¿Cómo construye y qué utilidad tiene una curva de calibración ?
11. ¿Cómo elige la longitud de onda de trabajo?
12. ¿Cuál es el fundamento químico del método de Biuret para cuantificar proteínas?

Fig. 4: Espectro Electromagnético

 23
7 ν(Hz) x 10-17 c
Color λ(m) x 10 E = h.ν ν =
7.69 – 6.59 λ
Violeta 3.90 – 4.55
Azul 4.55 – 4.92 6.59 – 6.10 h.c
E=
Verde 4.92 - 5.77 6.10 – 5.70 λ
Amarillo 5.77 – 5.97 5.70 – 5.03
Naranja 5.97 – 6.22 5.03 – 4.82
Rojo 6.22 – 7.80 4.82 – 3.84

PROBLEMAS

1- Una disolución de proteínas de concentración desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A
partir de esta dilución, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta última dilución dió por método
Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentración = 4 mg/ml, dió 0,25 de absorbancia).¿Cuál es
la concentración de la solución original de proteínas? R = 28,8 mg/ml.

2- Una solución de proteínas de concentración desconocida, dió por método de Biuret una A = 0,09
(testigo de concentración 4mg/ml dió A = 0,25 ).De dicha solución se desea tomar 100 ug. ¿ Qué
volumen de dicha solución se debe pipetear? R = 69 µl.

3- Interprete el significado de las sig. curvas de calibración para la cuantificación de proteínas por el
método de Biuret. ¿ Cuál de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?

2
1
Absorbancia

Concentración (mg/ml)

4- Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solución de flunitrazepam 25 µM en etanol 3% V/V y
en tris HCL 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:

λ 210 220 250 260 270 280 290 320 330 340 350 360 370
A 0.2 0.604 0.446 0.407 0.320 0.286 0.272 0.250 0.190 0.120 0.070 0.040 0.020

a)Grafique el espectro de absorción y coloque el título correspondiente.

b)¿Qué longitud de onda elegiría para realizar una curva de calibración?
c)¿ Cómo se preparó el tubo blanco?
d)¿ Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R.

5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificación de ADN en base a su contenido de

desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.
 24

Blanco Testigo Problema

NaCl 1M 1ml

ADN 100µg/ml 1 ml
en Nacl 1M
ADN [ ] desc en
NaCl 1M
difenilamina 2ml

Volumen final

a) Complete los espacios en blanco.

b)¿ Por qué coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco?
c)¿ Cómo realizaría una curva de calibración si sólo cuenta con una solución de ADN de 100 µg/ml?
d)¿ Qué precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos?
e)¿ Cómo corregiría este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y 2-
la absorbancia del problema sea << 0,1 ?
f)¿ Por qué deben tener todos los tubos igual volumen final?

6- Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia:
a) 0% b) 0,2% c) 0,8% d) 1,52% e) 68%.

7- Calcule el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentración es 11.428 µoles/l,
λ= 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500

8- Se cuantificó una solución de tirosina por absorción al UV. Esta solución dio A = 0,16 ; calcule la
concentración nM de tirosina considerando que dicha solución había sido diluida primero 3 veces y
luego 2 veces más. ε = 14.000 l.mol-1 . cm-1 , λ = 274 nm. R = 6,85.10-5 M.

9- Una solución de una sustancia de PM 600 a una concentración de 40 µg/ml tiene A = 0,3 a 540 nm,
medida en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcule el coeficiente de extinción molar. R = 4.500

10- Una solución contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar
ambos sin una purificación previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y 420 nm sus
espectros se superponen, por lo tanto la cuantificación de cualquiera de ellos interfiere con la del otro.
A longitudes de onda superiores a 420 nm sólo absorbe F1. Calcule la concentración molar de F1 y
F2 en ésa solución sabiendo que:

Testigo de F1 Testigo de F2 Solución problema (mezcla de F1/F2)

F1 c1 = 15 µM c2 = 15 µM c1 = ? c2 = ?
A350 = 0,105 A350 = 0,195 A350 = 0,25
Absorbancia

A450 = 0,293 A450= 0,3

F2

Respuesta:
-5
• concentración de F1=1,54.10 M.
0 • concentración de F2=1,09.10-5 M.

250 300 350 400 450 500

Longitud de onda (nm)
 25
EJERCITACION ADICIONAL

1- Calcule el número de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40).

2- ¿Qué cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solución 0,05 M?
R = 1,8 g.

3- ¿Qué volumen de una solución 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,6 ml.

4- Si tiene 3 litros de una solución de Na(OH) 0,5 M, ¿Cuántos moles y que concentración molar poseen
los siguientes volúmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro.
R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M

5- ¿Qué molaridad tiene una solución que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro? R: 1.5 M.

6- ¿Qué cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solución 2.5 M ? R: 300gr.

7- Una solución de ácido sulfúrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, ¿qué molaridad tiene? R: 18
M.

8- ¿Cuál será la molaridad de una solución de ácido clorhídrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es
1.19 g/cm3?. R: 12 M

9- ¿Cómo procedería para preparar 2 litros de una solución de ClK 10 mM a partir de una solución 3 M ?
R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada.

10-Se quieren preparar 6 litros de una solución 0.25 M de ácido sulfúrico a partir de una solución 63% P/P
3
(densidad=1.7 g/cm ). ¿Qué volumen debe tomar?. R: 137,28 ml.

11-Los siguientes son los resultados de la cuantificación de H2SO4 en una misma muestra realizado por
un método "A" por cuatro analistas diferentes:
a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml
b- 70,00 % P/V
c- 7,00 M
d- 7100 mM

De acuerdo al enunciado anterior diga:

a-¿Cómo procede para comparar los resultados anteriores?
b-¿Que puede decir acerca de la precisión del método empleado en la cuantificación?
DATOS: PM H2SO4 = 98,08

12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situación de
"stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote Nº1 (experimental) es
inyectado con una solución de flunitrazepam 67µM en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solución
fisiológica).
a) ¿Cómo procede para preparar 100 ml de dicha solución ?
b) ¿Cuál es la utilidad del segundo lote de ratas? ¿Con qué inyecta esas ratas? ¿Cómo prepara esa
solución?
c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 µg/kg de peso corporal, ¿qué
volumen debe inyectar a cada animal?.
DATOS: flunitrazepam = droga sólida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23

13- En el siguiente gráfico se muestran espectros de absorción de varias sustancias. ¿Cuál de las
longitudes de onda indicadas elegiría para luego trabajar con un fotocolorímetro y cuál para trabajar
 26
con un espectrofotómetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotómetro o con un
fotocolorímetro? Podria obtener un espectro como el B si sólo dispusiera de un fotocolorómetro para
analizar su muestra?

0.4

0.3

Absorbancia
B

0.2 A

0.1 C

0.0
300 450 600 750

Long Onda (nm)

14- La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estándares de albúmina sérica bobina:

[Albúmina] (Mx103) A a)¿ Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo de

0.2 0.033 concentraciones?
0.5 0.081 b) Si no fuera así.¿ Cuál es el límite superior de concentración
del rango lineal?
1.25 0.195
c) Determinar la concentración de albúmina cuya absorbancia
3.12 0.440
medida en las mismas condiciones experimentales es 0,116.
7.81 0.703

15- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre después de la administración por vía oral de
0,5 g de dicho compuesto. Se trabajó con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio
300 g. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la ingestión y se
determinó en suero la cantidad de glucosa por un método fotocolorimétrico, expresó como el valor
promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tomó otro grupo de
20 ratas con las mismas características y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una
hora antes del experimento fueron inyectadas por vía endovenosa con 200 µl de una solución 20 µM
de Glucagón (el glucagón es una hormona pancreática que incrementa el nivel de glucosa por la
estimulación de la degradación de glucógeno en higado) (Tabla 5).
a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R
b) Grafique los resultados y coloque título a los mismos.
c) Indique la ecuación matemática a la que se ajustan los datos.

TABLA 4 TABLA 5
mg % p/v glu/sangre tiempo min mg % p/v glu/sangre tiempo min
70 0 140 0
105 30 175 30
122 45 195 45
140 60 210 60
175 90 260 90
210 120 290 120

16- Postule dos modelos de experimentación donde pueda identificar variables dependientes e
independientes.
 27
PARTE PRACTICA

CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA POR EL MÉTODO DE BIURET

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE BIURET (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766):
Las sustancias que contienen dos -CONH2 ; -CH2NH2; -C(NH)(NH2); o -CSNH2, unidos, sea
directamente entre sí, o a través de un átomo de carbono o nitrógeno; y las estructuras peptídicas que
contengan como mínimo dos enlaces peptídicos, en presencia de Cu++y en solución alcalina, forma un
complejo de color violeta, el complejo de Biuret.

O C C O
NH HN
RC H H CR
Cu2+
O C C O
NH HN
RC H H CR

Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado llamado Biuret que se forma cuando
se calienta la urea a una temperatura de unos 180°C, en presencia de Cu++y en medio alcalino.

NH2
NH2

O C
C O
NH HN
NH2
NH2 O C C O
180 ºC O C
2+ NH2
C O
NH
Cu Cu2+ NH2
+ NH2
O C NH2
NH2 NH2

NH2 O C
C O
UREA NH HN
BIURET
O C C O

NH2 NH2

Complejo Cu-Biuret

Esta reacción también es producida, naturalmente, por los enlaces peptídicos de las proteínas y
es el fundamento de la técnica del biuret para la determinación de proteínas en suero u otros líquidos
biológicos.

El método de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y
10 mg de proteínas por mililitros.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300ml de Na(OH) al 10%.
Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico.
Solución testigo: Albúmina bovina a una concentración de 5mg/ml en agua destilada.
 28

Protocolo: En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solución
testigo de albúmina; en el tubo problema colocar 1 ml de la solución problema. Agregar a cada uno de los
tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Con el tubo blanco llevar a cero de absorbancia al fotocolorímetro (550 nm). Luego leer el tubo problema y
el tubo testigo.
En el trabajo práctico se prepararán varios tubos testigos a los fines de construír una curva de calibración

RESULTADOS

Tubo Absorbancia [Proteinas] (mg/ml

T1

T2

T3

P
 29
DISCUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA

- Problemas de Química. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. España.
- Cálculos en Bioquímica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. España. 1972.
- Métodos instrumentales de análisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. México. 1974.
- Análisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. México. 1975.
- Química Clínica: Bases y Técnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona.
España.1980.
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY. USA.2000
- Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
 30

TRABAJO PRACTICO Nº 2

PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS

Los alumnos deberán concurrir con la tarea de investigación (por escrito) sobre técnicas para estudios de
proteínas que les fue asignada por el docente en el TP anterior. Se hará una puesta en común de la
información obtenida por cada grupo. Serán evaluados en forma escrita al final de esta clase.

OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos teóricos de las técnicas utilizadas en la purificación y caracterización de proteínas.
- Valorar la importancia del dominio de diferentes técnicas y del conocimiento acerca de las características
particulares de la proteína a purificar, para poder aplicarlos con criterio.
- Adquirir y aplicar herramientas teóricas para la resolución de los problemas planteados.

TEMAS PARA REPASAR

1- Estructura de Proteínas. Abreviaturas de los nombre de los aminoácidos: código de 1 y 3 letras.
2- Equilibrio Acido-Base de amino ácidos y de proteínas.
3- Coeficiente de sedimentación.
4- Enzimas de restricción.
5- Concepto Actividad específica
6- Tema 3 del programa de la materia.

TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTEÍNAS:

ANALISIS DE ANALISIS DE
PURIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN
ESTRUCTURA ACTIVIDAD
1- Fraccionamiento subcelular 1-Espectrofotometría 1- Espectrofluorimetría 1- Actividad
por centrifugación diferencial y enzimática
por gradiente de sacarosa.
2- Precipitación salina. 2- Espectrofluorimetría 2- Dicroismo circular 2- Unión de
radioligandos
3- Diálisis. 3- Elisa 3- RMN 3-Formación de
complejo Ag-Ac
4- Cromatografía de filtración por 4- FTIR 4- Conductancia
gel. a iones
5- Cromatografía de intercambio 5- MALDI-MS
iónico.
6- Cromatografía de afinidad. 6- Secuenciación
7- Cromatografía líquida de alta 7-Perfil hidropático
presión.
8- Electroforesis en geles. 8-Difracción de rayos X
9-Isolelectroenfoque y 9- Comparación de
electroforesis bidimensional. secuencias.
 31
PROBLEMAS

1- Forma y Dimensión (a) La tropomiosina, una proteína muscular de 70 kDa, está formada por un
superhelicoide de α-hélices con dos hebras. Calcular la longitud de la molécula. (b) Suponer que un
segmento protéico de 40 residuos se pliega en una estructura β-antiparalela de dos hebras con un
giro en horquilla de 4 residuos. ¿Cuál es la longitud máxima de este motivo?

2- La ubicación lo es todo. Las proteínas transmembranas contienen a menudo α-hélices. Teniendo en

cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofóbico, predecir qué tipo de aminoácidos habría
en estas hélices. ¿Porqué una α-hélice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno
hidrofóbico del interior de una membrana?

3- Especies menores. En un aminoácido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolución es la

zwitteriónica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el
ácido carboxílico, calcular la proporción entre la concentración de la forma neutra del aminoácido y
(con el ácido carboxílico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitteriónica a pH 7.

4- Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminoácidos en código de una letra: Leu-Glu-Ala-
Arg-Asn-Ile-Asn-Gly-Ser-Cys-Ile-Glu-Asn-Cys-Glu-Ile-Ser-Gly-Arg-Glu-Ala-Thr.

5- Concentrado en la concentración. Una disolución de una proteína cuya secuencia incluye tres
residuos de triptofano, sin residuos de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280
nm en una celda de 1 cm de paso óptico. Obtener la concentración de la proteína en unidades de
molaridad. Si la proteína tiene una masa molecular de 100 kd, hallar la concentración en miligramos
de proteína por mililitro de disolución.

6- Movimiento lento. La tropomiosina, una proteína muscular de 93 kDa , sedimenta más lentamente
que la hemoglobina (65 kDa). Sus coeficientes de sedimentación respectivos son 2,6 S y 4,31 S.
¿Cuál es la carácteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentación?

7- Esferas que sedimentan ¿Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentación S de una

proteína esférica y su masa? ¿Cuánto más rapidamente sedimentará una proteína de 80 kDa que
una de 40 kDa?

8- Determinación del tamaño. Las movilidades electroforéticas relativas de una proteína de 30 kDa y
una de 92 kDa utilizadas como estándar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y
0,41. ¿Cuál es la masa aparente de una proteína que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?

9- ¿Una asociación nueva? El gen que codifica una proteína que tiene un único puente disulfuro
experimenta una mutación que sustituye un residuo de serina por uno de cisteína. Se quiere
comprobar si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la proteína
original. Proponer un experimento que resuelva esta cuestión.

10- Elegir la columna. El octapéptido AVGWRVKS se digirió con tripsina. a) ¿Sería el intercambio iónico o
la exclusión molecular la técnica más apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer
que el péptido se digiere con quimiotripsina. ¿Cuál sería la técnica de separación óptima? Explicarlo

11- ¿Haciendo más enzima? Durante la purificación de una enzima un investigador realiza un paso de
purificación que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que está
presente en el extracto crudo. Explicar como se puede incrementar la actividad total.
 32
12- Problema de purificación de proteínas. Completar la siguiente tabla

Procedimiento de Proteína Actividad Actividad Nivel de Rendimiento

purificación total (mg) total específica purificación (%)
Extracto puro
20 000 4.000000 1 100

Precipitación con
5000 3.000000
(NH4)2SO4
Cromatografía DEAE-
1500 1.000000
celulosa
Cromatografía de
500 750 000
exclusión molecular
Cromatografía de
45 675 000
afinidad

13- Estructura cuaternaria. Una proteína se purificó hasta la homogeneidad. La determinación del peso
molecular por cromatografía de exclusión molecular da 60 kDa. La cromatografía en presencia de
urea 6 M da una especie de 30 kDa. Cuando se repite la cromatografía en presencia de urea 6 M y β-
mercaptoetanol 10 mM, aparece una especie molecular única de 15 kDa. Describir la estructura de la
molécula.

14- Secuencia de proteínas I. Determinar la secuencia de un hexapéptido basándose en los siguientes

datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminoácidos se separan con una coma.
(ver datos en la Tabla de ruptura específica de los polipéptidos, al final de la guía).

Composición de aminoácidos (2R,A,S,V,Y)

Análisis N-terminal del hexapéptido A
Digestión por tripsina (R,A,V) y (R,S,Y)
Digestión por carboxipeptidasa no hay digestión
Digestión por quimiotripsina (A,R,V,Y) (R,S)

15- Secuencia de proteínas II. Determinar la secuencia de un péptido de 14 aminoácidos en base a los
siguientes datos.

Composición de aminoácidos (4S,2L,F,G,I,K,M,T,W,Y)

Análisis N-terminal del péptido S
Digestión por carboxipeptidasa L
Digestión por tripsina (3S,2L,F,I,M,T,W) y (G,K,S,Y)
Digestión por quimiotripsina (F,I,S) (G,K,L) (L,S) (M,T) (S,W) (S,Y)
Análisis N-terminal del péptido (F,I,S), S
Tratamiento con bromuro de cianógeno (2S,F,G,I,K,L,M*,T,Y) (2S,L,W)
 33
DATOS
1 residuo de α-hélice contribuye con 1.5 Å a la longitud total de la α-hélice.
1 residuo de hoja plegada β contribuye con 3.5 Å a la longitud total de la estructura β.
1 residuo = 110 D

Ruptura específica de los polipéptidos

Reactivo - Ruptura química Lugar de ruptura

Bromuro de cianógeno Lado carboxilo de los residuos metionina

O-Iodobenzoato Lado carboxilo de los residuos triptofano
Hidroxilamina Enlaces asparragina-glicina
2-Nitro-5tiocianobenzoato Lado amino de los residuos cisteína

Ruptura enzimática
tripsina Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina
clostripaína Lado carboxilo de los residuos arginina
Proteasa de Staphylococcus Lado carboxilo de los residuos aspartato y
glutamato (el glutamato solo en ciertas
condiciones)
trombina Lado carboxilo de los residuos arginina
quimiotripsina Lado carboxilo de los residuos tirosina,
triptofano, fenilalanina, leucina y metionina.
Carboxipeptidasa A Lado amino del aminoácido C-terminal (salvo
arginina, lisina y prolina)

BIBLIOGRAFÍA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY.
USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
 34
TRABAJO PRÁCTICO Nº 3
CINÉTICA ENZIMÁTICA I

En la primera semana (Cinética Enzimática I) se discutirán los aspectos teóricos y, en la segunda y tercera
semana (Cinética Enzimática II y III) se desarrollará la parte experimental. Los alumnos serán evaluados al
finalizar cada T.P de cinética (I, II y III) acerca de todos los apectos teóricos del tema y de los fundamentos
de las técnicas utilizadas.
Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas.
- Comprender como influyen el tiempo de incubación, la concentración de enzima, la concentración de sustrato,
temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentración de producto formado en
reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado de las constantes cinéticas KM y Vmax.
- Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtención de resultados confiables.

TEMAS PARA REPASAR

- Soluciones amortiguadoras,
- pH,
- Fotocolorimetría.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza protéica. Una determinada enzima (E) se combina
con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para
dar el producto (P) y enzima libre (E):

E+S ES E+P

La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen
que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rápidamente. Varios factores como a) el tiempo de
incubación; b) la concentración de enzima; c) la temperatura del medio; d) el pH y e) la concentración de
sustrato influyen en el transcurso de la reacción.

a) TIEMPO DE INCUBACIÓN: en la Fig. 1 se observa la variación de las concentraciones de complejo enzima-

sustrato (E-S), de sustrato [S] y de producto [P], en función del tiempo. La velocidad inicial (Vo)
corresponde a la velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que
la cantidad de sustrato consumido sea despreciable respecto a la cantidad de sustrato inicial (en la
práctica menos del 5% del total). La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por
unidad de tiempo (por ej. µmoles/min)

[P] Fig.1. Variación de la concentración de las

especies químicas que participan en una
reacción catalizada por enzimas, en función
[S] del tiempo. [E]: concentración de enzima; [S]:
concentración de sustrato; [ES]: concentración
[E] de complejo enzima-sustrato; [P]:
concentración de producto.
[ES]

tiempo
 35
b) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA: Velocidad en función de la concentración de enzima. La concentración
de enzima óptima se elige un rango de concentración de enzima tal que la velocidad inicial (Vo) sea
directamente proporcional a la concentración de la enzima

V Fig 2. V elocidad de reacción

vs concentración de enzima

E
Concentración
de enzima óptima

c) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN: Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción aumenta

con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10°C y viceversa.
Existe una temperatura óptima, por encima de esta, la velocidad decrece rápidamente por
desnaturalización de la enzima. La temperatura de máxima actividad no corresponde necesariamente a la
temperatura de máxima estabilidad.

Fig.4. Actividad enzimática vs temperatura

% Actividad
máxima

Temperatura

d) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIÓN: Cambios moderados en el pH afectan el estado iónico de la
enzima y con frecuencia también del sustrato. En general , la actividad óptima se encuentra entre pH 5 y
pH 9 como la tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su óptimo a
valores de pH bastante alejados de dichos límites. A valores extremos de pH se produce desnaturalización
de la enzima.

Actividad Actividad

6 8 10
pH 2 4 6
pH
A partir de estos gráficos se puede determinar las constantes cinéticas que caracterizan a una enzima: KM
(constante de Michaelis) y Vmax (velocidad máxima), para un sustrato y en condiciones determinadas.
KM: este valor corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la
mitad de la Vmax
 36
Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima está saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato).

e) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: Variación de la velocidad inicial en función de la

concentración de sustrato. Si aumenta la concentración de S, mientras permanecen constantes las demás
condiciones, V0 crece hasta un valor máximo. La velocidad crece hasta que la enzima es saturada por el S
y se alcanza la velocidad máxima (Vmax).

Vo 1
(a) Vo
(b)
Vmax

1
Vmax
Vmax
2

1
[S] 1 [S]
KM

Fig.6 (a) Curva de Michaelis–Menten de Vo en función de la concentración de S; (b) Gráfico de

Lineweaver-Burk o de dobles recíprocas.

GUÍA DE ESTUDIO

1. Catalizadores.
2. Enzimas. Características. Sitio activo de una enzima: características. Cofactor. Coenzima. Holoenzima.
3. Clasificación de enzimas.
4. Ubicación de las enzimas en la célula.
5. ¿A que se llama sustrato y producto?.
6. Mecanismo de acción de las enzimas.
7. ¿Alteran las enzimas el equilibrio de la reacción?
8. ¿Cómo se mide la concentración de una enzima?.
9. ¿Qué es la actividad específica de una enzima y en qué unidades se expresa?.
10. Factores que influyen en una reación catalizada por enzimas.
11. Función de Michaelis Menten. Representación gráfica.
12. Velocidad inicial. Velocidad máxima. Unidades.
13. ¿Porqué se debe trabajar a velocidad inicial?
14. KM. Unidades. ¿Cómo se determina?
15. Ecuación de Lineweaver-Burk. Representación gráfica.
16. Inhibición reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto.
¿Cómo se diferencian? ¿cómo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en función de la
concentración de sustrato?.
 37
PROBLEMAS

1. Explique el siguiente gráfico

Tiempo

2. a. Grafique velocidad en función de concentración de sustrato

b. Grafique la inversa de velocidad en función de la inversa de la concentración de sustrato.Identifique en
cada una de estas curvas Km y Vm.

3. ¿Qué relación existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?

4. ¿Cuándo la concentración de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial?

5.¿Qué relación exíste entre Km y sustrato cuando la reacción catalizada por la enzima alcanza el 80% de
la Vm?

6. Para medir la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de higado de rata, la preparación enzimática fue
obtenida homogenizando 0.5 g de hígado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparación
enzimática a pH 5 y 37ºC en presencia de Ca++ durante 6' , en un volumen de 0.4 ml, el cual fue diluido a
4 ml para detener la reacción. Calcule los µmoles de producto formado por min. y por mg de tejido,
sabiendo que la absorbamcia fue 0.2, ε: 17500.

7. Se incubaron 200 µl de una preparación enzimática (0,3 mg proteínas/ml) en presencia de 0,5 ml del
sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de
37ºC. La reacción se detuvo por dilución del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1 M.
La absorbancia de esta solución fue 0,215. Calcular los µmoles de producto formado por min. y por mg de
proteínas. Solución testigo 2 µM → Abs. 0,15.

8. La trehalasa cataliza la hidrólisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30ºC). Una

muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 µmol de glucosa formada por minuto por mg de
proteína. ¿Cuál será el valor de Vm para la misma preparación enzimática pero en presencia de de 5
mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml?

9. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la
propionamida.

CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3

los estudios de velocidad inicial en los que se midio la producción de amoníaco a partir de la propionamida
o
a pH 7 y 37 C demostraron que la urea inhibe esta reacción. Examinando los efectos de dos
concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se obtuvieron los
siguientes resultados:
 38

VELOCIDAD INICIAL
[Propionamida] (µmoles de NH3 liberados/min/mg de proteína)
SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR (Urea)

1 mmol/ml 2 mmol/ml

5 160 111 76
6.7 194 140 95
10 263 183 123
20 400 279 188
50 576 400 277

Determinar la Km para las diferentes condiciones. ¿Actúa la urea como un inhibidor competitivo o no
competitivo?

10. A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar a) tipo de inhibición b) KM del
sustrato.

Concentración de S (mM) VELOCIDAD

(µg de producto formado/hora)

Sin inhibidor Con inhibidor 6 mM

2 139 88
3 179 121
4 213 149
10 313 257
15 370 313
 39
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
CINÉTICA ENZIMÁTICA II

PARTE PRACTICA I

ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO

OBJETIVOS
- Medir la formación de producto en función del tiempo de incubación.
- Determinar la variación de la velocidad inicial en función de la concentración de la enzima.

Es decir, se determinarán las condiciones óptimas de tiempo de incubación y de concentración de enzima, las que
serán usadas durante el trabajo práctico siguiente para determinar KM y Vmax.

FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN
La fosfatasa ácida de hígado cataliza la siguiente reacción:

p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + PO43-

HO
P O
O OH O-

OH Enzima OH-
+ Enz + PO4-3 + H2O
H+
O2N O2N
O2N

p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol p-nitrofenolato

El sustrato p-nitrofenilfosfato disódico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado
por esta enzima del hígado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas enzimas. La
reacción es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, el cual se puede medir
mediante fotocolorimetría en un medio alcalino a 410 nm (Coeficiente de extinción molar: 17500) (ref.
Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI).

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de la enzima:
Homogeneizar (en homogeneizador a embolo) 0.25 g de hígado en 15 ml de agua destilada. Dejar en
baño de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los lisosomas que
contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego llevar la suspensión a 30 ml con buffer acético- acetato
de sodio, pH 5, y 0,2 M. La suspensión queda con una concentración de 1 mg de proteína por ml.
 40
Sistema de incubación:
Contiene cantidades variables de los siguientes componentes:
Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12.
Buffer: acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M.
Enzima: homogeneizado de hígado 1 mg de proteína / ml.
Activador: Cl2Ca 11 mM.
Inactivador: NaOH 0,1M
Recomendaciones:
Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el agregado de la
enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante un tiempo que se
indicará en cada caso. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El álcali, por un
lado inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol)
desarrolle color. Es importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubación, este tubo contiene lo
mismo que los tubos problema pero con la enzima agregada después del NaOH. Este tubo se usa como
blanco para el fotocolorímetro.

PROTOCOLO

A) CURVA DE TIEMPO :

sustrato µl Cl2Ca µl buffer µl enzima µl

o
Tubo N tiempo
(min)
1 100 (5 mM) 100 250 100 (0,1 mg 10
prot)
2 100 “ 100 250 100 “ 15

3 100 “ 100 250 100 ” 20

4 100 “ 100 250 100 ” 25

5 100 ” 100 250 100 ” 30

blanco 100 ” 100 250 100 ” 0

Incubar a 37°C. Al cabo del tiempo de incubación frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el
blanco la enzima debe añadirse después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los
µmoles de producto formado.

RESULTADOS

Tubo No Absorbancia µmoles de P µmoles de p/min

5
 41

GRÁFICO

CONCLUSIONES

B- CURVA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

Tubo No Sustrato (µl) Cl2Ca (µl) Buffer (µl) enzima (µl) tiempo (min)
1 100 (5 mM) 100 300 50 (0,05 mg prot) SEGÚN

2 100 “ 100 250 100 (0,1 “ ) LO

3 100 “ 100 200 150 (0,15 ” ) DETERMINADO

4 100 “ 100 150 200 (0,2 ” ) EN: A

5 100 ” 100 100 250 (0,25 ” )

blanco 100 ” 100 100 250 ( ” )

Incubar a 37°C durante el tiempo determinado en A. Frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M.
En el blanco la enzima debe añadirse después del álcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los
µmoles de producto formado.
RESULTADOS
 42
Tubo N o
Absorbancia µmoles de P µmoles de p/min

GRÁFICO

CONCLUSIONES
 43
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
CINÉTICA ENZIMÁTICA III

PARTE PRÁCTICA II

ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO

OBJETIVO
- Determinar los valores de KM y Vmax de la fosfatasa ácida de hígado.

PROTOCOLO
PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE INCUBACIÓN:

Tubo sustrato (µl) Cl2Ca (µl) Buffer (µl) enzima (µl) tiempo (min)

1 50 (2,5 mM) 100 250 SEGÚN SEGÚN

2 100 (5 mM) 100 200 LO LO

3 150 (7,5 mM) 100 150 ESTIMADO ESTIMADO

4 200 (10 mM) 100 100 EN: B EN: A

5 250 (12,5 mM) 100 50

blanco 100 100 200

Incubar a 37°C según el tiempo determinado en A. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En el
blanco la enzima se añade después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los µmoles
de P formado.

ANÁLISIS DE DATOS:
a) Calcular las inversas de la concentración de sustrato indicadas en la tabla.
b) calcular las inversas de µmoles de producto formados en cada tubo.
c) graficar 1/Vo en función de 1/[S]. d) Determinar los valores de KM y Vmax.

RESULTADOS:
Curva de Saturación

Tubo No Absorbancia µmoles de P µmoles de P/min

5
 44

Curva de dobles recíprocas

Tubo No 1/V 1/[S]

5
 45

CONCLUSIONES
 46

DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS

GUÍA DE ESTUDIO.

Trabajo científico:
Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization and in
vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431.

1. Escriba la cita bibliográfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed).
2. Optimización de vías metabólicas: a) ¿cuál es su interés?, b)¿dónde reside su dificultad?, ¿cómo puede
encararse?.
3. ¿Qué son los microarreglos?, ¿en qué contexto se comenzaron a desarrollar?.
4. ¿Cuál es el objetivo del presente trabajo?
5. ¿Cuál es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusión RNA-proteína, polilisina, DNA,
hibridización).
6. ¿Cuáles son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema experimental?.
¿Cuál es la utilidad del DNA marcado con fluoresceína?. ¿Cómo se detecta el producto de estas
reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a punto la técnica (Figs. 1 y 2).
7. ¿Qué es la trehalosa y cuál es su importancia?
8. ¿Cuál es la vía metabólica a cuyo estudio se aplica la técnica desarrollada?
9. Describa la Fig. 3.
10.¿Cuáles son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta vía metabólica? ¿Es
posible generalizar estas conclusiones a otras vías metabólicas?.

BIBLIOGRAFÍA

. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
México, 1995.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.
 47
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6
FOTOSÍNTESIS

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
Deberán entregar un informe escrito de la experiencia práctica en donde se detallen claramente: Objetivos,
Hipótesis, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión.
Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Valorar la importancia de la fotosíntesis como proceso necesario para la vida en el planeta
- Conocer los procesos bioquímicos y termodinámicos involucrados en el proceso.
- Comprobar algunos aspectos de la fotosíntesis por medio de experimentos.

TEMAS PARA REPASAR

- Termodinámica de las reacciones redox.

INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso que puede tener lugar tanto en células de plantas y como de bacterias
verde-azules; por medio de este proceso estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como
fuente de energía para efectuar la síntesis de ciertos compuestos.

La ecuación global de la fotosíntesis es :

Luz
6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2

Puede resolverse en dos procesos caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada uno,
estas son:
• reacciones dependoentes de la luz ( o reacciones claras): la energía luminosa es captada por los
pigmentos y la transforman en ATP y NADPH y simultaneamente se libera oxígeno molecular.
• Reacciones de fijación del carbono (o de fase oscura): llamada así porque no es necesaria la luz para
llevarse a cabo; aquí el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energía y poder reductor,
respectivamente, y se produce la reducción del CO2 y la síntesis de glucosa.

Fotólisis del agua:

Esta reacción se conoce como reacción de Hill:

H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2

El estudio del transporte electrónico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L Hill: "La
iluminación de cloroplastos en presencia de aceptores electrónicos artificiales provocaba el
desprendimiento de oxígeno y la simultánea reducción del aceptor”.
En la fotosíntesis normal el aceptor es el NADP pero en la reacción de Hill se utiliza un aceptor
artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.
 48
GUIA DE ESTUDIO

1. Concepto de fotosíntesis.
2. Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijación del carbono.
3. Formas de captación y transferencia de Energía.
4. Fuerza electrón-motriz.
5. Fuerza protón motriz.
6. Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos.
7. Dadores y aceptores de electrones.
8. Importancia de la reacción de Hill
9. Diferencias entre fosforilación a nivel de sustrato, fosforilación oxidativa y fotofosforilación. Ejemplos.

Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como
ejemplo de transporte electrónico y fosforilación en la fotosíntesis y en la cadena respiratoria.
Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilación oxidativa y la
fotofosforilación. (a) En la fotofosforilación los electrones fluyen desde el agua al NADP+ (b) En la
fosforilación oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompañados por
el movimiento de protones a través de la membrana.

Figura tomada de: Lehninger

Principles of Biochemistry. David
L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
 49

Integración de fotosistemas I y II en el cloroplasto.

Este “esquema en Z” muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la izquierda)
hacia el NADP+ ( a la derecha) en la fotosíntesis no cíclica. La posición en escala vertical de cada portador
de electrones refleja su potencial de reducción estandar. Para elevar la energía de electrones derivados
del agua al nivel energético requerido para reducir NADP+ a NADPH, Los electrones deben ser
impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII (Photosystem II o
Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotón es requerido por un electrón de cada Fotosistema. Luego de
la excitación los electrones de alta energía fluyen corriente abajo a través de una cadena transportadora.
Los protones se mueven a través de las membranas tilacoidales durante la lisis del agua y durante el
transporte de electrones a través del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f) generando un gradiente
de protones que es central para la formación de ATP. La flecha punteada indica la vía cíclica de la
transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan por una vía cíclica al
PSI, en lugar de reducir NADP+ a NADPH.

Dirección del flujo de electrones

Adaptado de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
 50
PARTE PRACTICA

Mecánica del TP:

1º) Determinar el o los objetivos de cada experiencia práctica.
2º) Enunciar la o las hipótesis que se pondrán a prueba con cada una de las experiencias.
3º) Elaborar un protocolo de trabajo tomando en cuenta la información disponible en la Guía de TP.
4º) Desarrolar la experiencia y registrar los resultados.
5º) Discutir y fundamentar adecuadamente los resultados obtenidos. Las preguntas que se encuentran en
la guia deben ser usadas para orientar la discusión de los diferentes aspectos del problema que se
aborda con cada una de las experiencias.
6º) Exponer los resultados y redactar un informe acerca de la experiencia práctica utilizando un lenguaje
adecuado, detallando claramente: Objetivos, Hipótesis, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión.
7º) Evaluación escrita al final del TP.

EXPERIENCIA Nº 1: Fotosíntesis y luz. Liberación de oxígeno y fijación de CO2.

MATERIALES
Material vegetal: un trozo de Elodea
Solución de bicarbonato de sodio al 1% P/V.
Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de diámetro, pipetas de 0,2 ml.
Fuente de luz blanca.
Soportes y gradillas.

PROCEDIMIENTO:
1. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig.1, teniendo en cuenta que desde el tubo de
ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solución de bicarbonato de sodio al
1%.
2. Marcar el nivel del líquido contenido en la pipeta.
3. Medir el pH de la solución de bicarbonato de sodio
4. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea.
5. Controlar el pH de la solución a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig.1

a) Por qué utiliza una solución de bicarbonato de sodio en lugar de agua?

b) Cómo es la reacción de la que participa el dióxido de carbono disuelto en agua?
c) Qué efecto produce el desprendimiento de oxígeno en el sistema?
d) Qué sucedería en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lámpara?
e) Cambió el pH?
 51
EXPERIENCIA Nº 2: Consumo de CO2

MATERIALES:
Material vegetal: Elodea
Dos tubos de ensayo
Solución de rojo de fenol
Fuente de luz blanca.
Papel de aluminio.

PROCEDIMIENTO:
1. Colocar 10 ml de solución de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta
que la solución vire de color rojo a color amarillo.
2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea.
3. Exponer un tubo a la luz y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad).
4. Observar los tubos a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig. 2
CO2

Rojo

a) Qué función cumple el Rojo Fenol?

b) Por qué el color vira a amarillo cuando se insufla dióxido de carbono?
c) Cuál es la fuente de dióxido de carbono?
d) Cambió el pH?
e) Que sucedería en el sistema en ausencia de luz?
 52
EXPERIENCIA Nº 3: Fotólisis del agua. Reacción de Hill.

MATERIALES:
Material vegetal: hojas de Palam-palam o de espinaca (50 g)
Solución de NaCl 0,035 M.
Solución de NaCl 0,35 M.
-4
Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10 M
Licuadora (tanto el vaso de la licuadora como las soluciones deben mantenerse en frío (0-4oC)

Aislamiento de cloroplastos
Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por
gasa doble, recoger en un vaso y mantener en baño de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y
centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar el
sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de
cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en baño de hielo.

PROCEDIMIENTO:

2,6 di-Cl-fenolindofenol

f) Porqué utiliza NaCl 0.35 M para realizar el homogeneizado?

g) Porqué utiliza NaCl 0.035 M para resuspender los cloroplastos?
h) Qué función cumple el 2,6-diclorofenolindofenol?
i) Cómo podría demostrar la producción de oxógeno?
j) Cómo podría mejorar esta experiencia?
 53
PROBLEMAS

1. Interprete el siguiente gráfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la
fotosíntesis:

* Efecto de la intensidad de luz a:

Velocidad 1
de o
1. 25 C y CO2 0,4%
fotosíntesis 2 2. 15oC y CO2 0,4%
3. 25oC y CO2 0,01%
3

Intensidad de la luz incidente

¿Qué indica la zona marcada con *?

2. Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa difosfato) y PGA (ácido
fosfoglicérico) en experimentos de fotosíntesis, cuando varían la intensidad de iluminación y la
concentración de CO2.

1% CO2 0,003% CO2

Luz Oscuridad
Concentración

RUDP
PGA

RUDP PGA
Tiempo (min)
Tiempo (min)

3. Calcular ∆Go´ para la reducción del NADP+ por FRS.

4. Calcular la fuerza electron-motriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una
solución que contiene las siguientes mezclas de NAD+ y NADH a pH=7 y 25oC, con referencia a una
semicelda de 0,00V:
a) NAD+ 1 mM y NADH 10 mM
+
b) NAD 1 mM y NADH 1 mM
c) NAD+ 10 mM y NADH 1 mM

5. Ordenar las siguientes sustancias según su tendencia creciente a ceder electrones:

a)clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo),

6. Ordenar las siguientes sustancia según su tendencia creciente a aceptar electrones:

a)clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP+, d) plastocianina.

7. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporación de una molécula de CO2 en
moléculas de glúcidos por medio de la fotosíntesis, calcule la eficiencia termodinámica en condiciones
estándar, para la síntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada es a) 400 nm y
b) 750 nm. (Energía necesaria= 686 Kcal).
 54
8. Cuál es la diferencia entre las cadena transportadoras de electrones que tienen lugar en
mitocondrias y en cloroplastos? Calcule el ∆G para la transferencia de electrones que ocurre en ambos
casos y justifique los resultados.

9. El aparato fotosintético del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y ficocianina,
además de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorción máxima entre 480 y 680 nm; la ficocianina
a 620 nm. Sugerir la misión de estos pigmentos.

10. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta.

- - - µmoles de oxígeno liberado

___ µmoles de fosfato esterificado

Tiempo

11. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta.

- - - µmoles de oxígeno liberado

___ µmoles de fosfato esterificado

Tiempo

DATOS: Para resolver los problemas.

Agua: +0,82 V NADP+: -0,324 V
Ferredoxina: -0,4 V P700: +0,4 V
P680: +0,95 V P680*: -0,95 V
Feofitina (Pheo): -0.75 V Plastoquinona: +0,1 V
Plastocianina: +0.13V NAD+: -0.32V

BIBLIOGRAFÍA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
. Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
. Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
. Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.
. Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1999.
 55
TRABAJO PRACTICO Nº 7
MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante la discusión del trabajo científico
(evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.

OBJETIVOS
- Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la físicas a los sistemas biológicos.
- Analizar fenómenos biológicas desde un punto de vista termodinámico. Fotosíntesis, respiración y motores
moleculares como ejemplos.

TEMAS PARA REPASAR:

Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reducción; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria;
fuerza proton motriz; motores moleculares.

GUIA DE PROBLEMAS

1- Condiciones estándar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reacción en la glicólisis:

aldolasa
Fructosa 1,6-bifosfato dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehído 3-fosfato

El ∆G 0’ para esta reacción es de + 5,7 kcal.mol-1, mientras que el ∆G en la célula es -0,3 kcal.mol-1.
Calcular la relación entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares.
Utilizando los resultados obtenidos explicar: ¿cómo puede resultar esta reacción endergónica en
condiciones estandar y exergónica en condiciones intracelulares?

2- No siempre es lo mismo. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren según el tipo de célula,
consecuentemente la liberación de energía libre para la hidrólisis de ATP será tambien diferente según
el tipo de célula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular ∆G para la hidrólisis de ATP en las
0
células de músculo, hígado y cerebro. Teniendo en cuenta que el ∆G ’ para esta reacción es de - 7,3
-1
kcal.mol ,

ATP (mM) ADP (mM) Pi (mM)

Hígado 3,5 1,8 5,0
Músculo 8,0 0,9 8,0
Cerebro 2,6 0,7 2,7

3- Fuerza ácida: El pK de un ácido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protónicos.

a) Establecer una relación ∆G 0’ y pK.
0
b)¿Cuál es el ∆G ’ para la iónización del ácido acético, si su pK es de 4,8?
 56
4- Los opuestos se atraen. El gráfico siguiente muestra como el ∆G 0 para la hidrólisis de ATP varía en
función de la concentración de Mg2+ (pMg=log 1/[ Mg2+ ]).
a) ¿Cómo afecta el descenso de [Mg2+] al ∆G para la hidrólisis de ATP?
b) ¿Cómo se puede explicar este efecto?

36
8.4

35 8.2

-∆G (kcal.mol )
-1
34 8.0

-∆G (kj.mol )
-1
7.8
33
7.6
32
7.4
31
7.2

30
2 3 4 5 6 7 8

pMg 2

5- Cambio de divisas. Para una fuerza protón-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). ¿Cuál es
el valor máximo del cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la síntesis de ATP? Calcular el valor de
este cociente de tres maneras, suponiendo que el número de protones translocados por cada ATP
formado es dos, tres, y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25ºC.

6- Cruce de caminos. Es posible determinar el lugar exacto donde actúa un inhibidor de la cadena
respiratoria gracias a la técnica de punto y corte. Britton Chance diseño elegantes métodos
espectroscópicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los
transportadores. Este cálculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de
absorción característico, tal y como se ilustra en el gráfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted
se encuentra en posesión de un inhibidor y descubre que al añadirlo a mitocondrias que respiran, los
transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran más reducidos y los transportadores
localizados entre el fitocromo c y el O2 se encuentran más oxidados ¿en qué punto actúa el inhibidor?
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7- Distancia. Supongamos que la transferencia de energía entre dos moléculas de clorofila a distantes
entre sí 10 Å tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20 Å
manteniendo constantes el resto de los factores. ¿Cuánto tardará en ocurrir la transferencia de
energía?

8- ¿Se dice que es lenta? A su máxima velocidad una molécula de quinesina se desplaza con una
velocidad de 6400 Å por segundo. Teniendo en cuenta que el tamaño de la región motriz del dímero de
quinesina es de 80 Å, calcular su velocidad en unidades de su tamaño por segundo. Según esta
relación ¿cuál sería la velocidad correspondiente de un automóvil que tuviera una longitud de 3
metros?

9- Levantamiento de pesos. Un único dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de
aproximadamente 4 piconewtons (4pN) ¿Cuántas veces puede levantar su peso un dominio motor de
miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s-2). Considerar que la masa
molecular del dominio motor es de 100 kd.

10- Las helicasas como motores. Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de
ADN como guía. En cada ciclo la helicasa se desplaza una base en el sentido 3’-5’. Teniendo en
cuenta que la PcrA en presencia de un molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar
ATP con una velocidad de 50 moléculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la
longuitud de una base de ADN es 3,4 Å. ¿Cómo es esta velocidad comparada con la velocidad de la
quinesina que es de 6400 Å por segundo?¿A qué se puede deber la diferencia de velocidad entre estos
dos motores moleculares?.

11- Nuevamente se mueve. Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante
un período de tiempo suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmóviles se
colocan en un medio ácido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicación teniendo en
cuenta el mecanismo de movimiento del flagelo de una bacteria.

12- Arrastrar cargas. Considérese la actividad de una única molécula de quinesina que transporta una
vesícula a lo largo de un microtúbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partícula esférica de radio
a con una velocidad ν en un medio de viscosidad η es: F= 6 π η a x ν
Supongamos que una esfera de 2 µm de diámetro se transporta con una velocidad de 0,6 µm. s-1 en un
medio acuoso con una viscosidad de η= 0.01 g.cm-1. s-1.
a) ¿Cuánta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s-2)
b) ¿Cuánto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm).
c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 moléculas de ATP por segundo. ¿Cuánta es
la energía asociada a esta hidrólisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el
trabajo realizado.
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DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS

GUÍA DE ESTUDIO.

Trabajo científico:

Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular
Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 1117–1124.

1. ¿Cúal es la función del ATP sintetasa? ¿Cómo es su estructura? ¿Cuál es la función de cada una de las
subunidades?

2. ¿Qué fenómeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que

contiene ATP?

3. ¿Cómo se logra experimentalmente observar la rotación γ del F1-ATPase?

4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b.

5. A cuál de los experimentos que se realizaron en los T.Prácticos de la materia, se asemeja el

experimento del gráfico 2b.

BIBLIOGRAFÍA

. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.