TEMA 7.

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE 

 

La Tecnología del DNA Recombinante se fundamenta en: 

 
● La existencia de enzimas capaces de cortar, pegar y replicar el DNA, así como de 
transcribir DNA en RNA y retrotranscribir en RNA en DNA. 
● En las técnicas de transferencia e hibridación de ácidos nucleicos. 
● En las técnicas de clonación de fragmentos de DNA. 
● En las técnicas de secuenciación de DNA. 
● En la capacidad de amplificar segmentos específicos de DNA mediante la técnica 
de PCR 
 
INTRODUCCIÓN 
 
En  la  actualidad  tenemos  el  potencial  de  poder  cambiar  las  propiedades  biológicas  de 
los  organismos.  Hemos  aprendido  a  trabajar  con  las  moléculas  informativas  y a hacer, 
mediante  herramientas  técnicas,  lo  que  ha  hecho  la  evolución  durante  años:  ​extraer  y 
alterar  las  moléculas  informativas​.  En  la  naturaleza  existe  una  serie  de  enzimas  con 
unas  enormes  capacidades  de  actuar  sobre  las  moléculas  informativas  y  podemos 
modificarlas de muchas maneras. 
 
Tenemos  la  capacidad  de trabajar con los ácidos nucleicos siguiendo el mismo proceso 
que  ocurre  en  los  núcleos  celulares.  Podemos  ​transferir  las  moléculas  de  unos 
organismos  vivos  a  otros  o  entre  diferentes  soportes  experimentales,  y  extender  este 
trabajo gracias a técnicas de identificación de secuencias específicas. 
Podemos  también  emplear  técnicas  de  clonación  de  DNA,  entendiendo  la  palabra 
clonación  desde  términos moleculares. "Clonación" viene de "clon", que desde el punto 
de  vista  biológico  es  un  conjunto  de  organismos  que  tienen  exactamente  la  misma 
información  genética​.  En  la  naturaleza  existen  muy  pocos  clones  propiamente  dichos 
entre  los  organismos  superiores,  remontándonos  sólo  a  los  gemelos  univitelinos.  No 
obstante,  un  organismo  como  puede  ser  una  bacteria  crea  un  clon  cada  vez  que  se 
duplica.  Por  extensión,  en  bioquímica  se  emplea  la  palabra  clon  para  denominar  a  las 
copias obtenidas de un fragmento de DNA manipulado. 
 
Los  grandes  avances  científico-tecnológicos  han  impulsado  este  aspecto  de  la 
bioquímica  y  la  investigación  ha  encontrado  apoyo  en  nuevos  descubrimientos  como 
las  ​técnicas  de  secuenciación  masiva  o  el  ​PCR​,  el  cual  ha  significado  un  enorme 
desarrollo en la replicación de moléculas de DNA en muy pocas horas. 
 
  No  hay  otra  fuente  de  información  sobre  una  célula  u  organismo más importante que 
su  propio  DNA.  La  tarea  de  extraer  esta  información  ha  dado  lugar  a  sofisticadas 
tecnologías  basadas  en  el  DNA, que cuentan con una base bioquímica. Las técnicas de 
localización,  aislamiento,  preparación,  clonación  y  estudio  han  hecho  posible  la 
genómica moderna. 
 
Toda  esta  tecnología  está  basada  en  la  existencia  de  una  serie  de  enzimas  que 
aparecen  en  los  seres  vivos  y  son  utilizados  para  trabajar  con  las  moléculas 
informativas: 
 
● Endonucleasas  de  restricción​:  fragmentan  el  DNA en sitios específicos (dianas 
de restricción). Reconoce y corta DNA foráneo. 
○ Tipo  I  (Endonucleasa  + metilasa)​: cortan el DNA al azar, en lugares que 
pueden  encontrarse  a  1000  pares  de  bases  de  la  secuencia  de 
reconocimiento. Necesita ATP. 
○ Tipo  II​:  son  más  sencillas,  no  necesitan  ATP.  Catalizan  la  rotura  de 
enlaces fosfodiéster en secuencias específicas de base. 
○ Tipo  III  (endonucleasa  +  metilasa)​:  cortan  el  DNA  a  unos  25  pares  de 
bases después de la secuencia de reconocimiento. Necesita ATP. 
● DNA  ligasas:  pueden  unir  fragmentos  de  DNA,  o  sintetizar  DNA  bicatenario  a 
partir de DNA parcialmente monocatenario. 
● Retrotranscriptasas:​ sintetizan DNA a partir de RNA. 
● Transferasas:​ añaden nucleótidos a una cadena de ácido nucleico. 
● Fosfatasas:  más  o  menos  inespecíficas,  pueden  quitar  residuos  fosfatos  de  la 
parte final de la cadena de DNA.  
● Polimerasas:​ sintetizan DNA. 
 
 

Nota​: La tabla no es exhaustiva, 

hay centenares de enzimas que 
se pueden utilizar, todos con sus 
especificidades. Para trabajar 
con DNA recombinante, todos 
estos enzimas tienen que estar 
puros​, que se pueden comprar 
ya que están comercializados y 
se venden a precios elevados. 
 
Aquí  se  presentan  algunas  de  las  secuencias  de  reconocimiento  más  usadas  para  la 
endonucleasa  tipo  II.  Estas  secuencias  suelen  tener  una  longitud  de  4  a  6  pares  de 
bases y son palindrómicas. 
Cuando se manipula DNA, una de 
las  cosas  a  tener  en  cuenta  es 
que  se  trabaja  con  cantidades  de 
pares  de  bases  muy pequeñas en 
comparación  con  un  genoma 
completo.  Una  de  las  claves  de la 
manipulación  de  las  moléculas 
informativas  son  las  moléculas 
transportadoras,  que  permiten 
transferir,  precipitar,  modificar 
con enzimas… el DNA. 
Esas moléculas portadoras se denominan V ​ ECTORES​, moléculas pequeñas que suele 
ser circular y posee determinados sitios de restricción que nos permiten abrirlo usando 
enzimas de restricción específicos.Se utilizan para portar moléculas de ADN. Los 
vectores han evolucionado mucho desde los comienzos de la tecnología del DNA 
recombinante. Los más simples son los ​plasmídicos​ (molécula ADN circular 
5000-40000 pared de bases que tiene independencia funcional, replicativa e 
informativa del cromosoma bacteriano circular situado en el nucleoide y contienen 
información para codificar enzimas resistentes a antibióticos. Fácil entrada en la célula 
y manipulación bioquímica) 
 
A la hora de describir un vector, es importante tener en cuenta que: 
 
● El DNA es ​bicatenario circular​, por lo que nos referimos sólo a la h
​ ebra 
codificante​. El primero que hemos podido utilizar como vector fue el plásmido. 
● A la hora de situar genes o dianas de restricción, haremos referencia a la 
posición de los nucleótidos entre los que se comprendan​, entendiendo que el 
primer nucleótido se sitúa a las ​12 en punto​ y el número aumenta en el ​sentido 
de las agujas del reloj​.  
● Además existen unos mapas del vector donde podemos ver sus lugares de 
restricción y los pares de bases. 
 
VECTOR + DNA = VECTOR DE CLONACIÓN  

Mapa de restricción​: Indica el tamaño del DNA y el lugar que ocupan las dianas 
de restricción. Nos permite obtener pequeños fragmentos de DNA e identificar 
una secuencia determinada en función de los lugares de restricción adyacentes. 

Además de las dianas de restricción, se nos indica más información: 

 
● Sitio múltiple de clonación​: secuencia artificial de 30,40,50 nucleótidos que 
contiene múltiples dianas de restricción. 
● ORI (​ origen de replicación): el punto de partida para la replicación del DNA que 
es reconocido por las proteínas que llevan a cabo el proceso. 
● G​ en lac Z:​ codifica a una beta-galactosidasa. 
 ● Gen lac Y:​ relacionado funcionalmente con el anterior. Ambos suelen estar 
presentes en los vectores plasmídicos a causa de la propia manipulación, no 
porque se codifiquen ahí naturalmente. 
● Gen que codifica para proteínas resistentes a la ampicilina​: las resistencias a 
los antibióticos se encuentran en los plásmidos, no en el genoma bacteriano. 
Éstos se transmiten con mucha facilidad de unas bacterias a otras por ser 
elementos genéticos muy pequeños. En el laboratorio, la resistencia a los 
antibióticos es útil para determinar la presencia de DNA recombinante,como se 
verá en un experimento más adelante.  
 
Puede aparecer otro fragmento, como comentó Lazo en clase, que se llama gen Scal 
que codifica resistencia a un antibiótico concreto, de manera que pueden usarse para 
crear proteínas que son capaces de inhibir antibióticos.  
 
Los v​ ectores​ son elementos genéticos pequeños que contienen propiedades naturales 
y elementos artificiales añadidos. Contienen una pequeña secuencia de nucleótidos 
que consiste en una serie dianas de restricción (una por nucleótido). Éste es el sitio 
múltiple de clonación, secuencia artificial. Para la inserción posterior de otros DNA 
resulta útil la inserción de un fragmento de DNA sintético que contiene una secuencia 
de reconocimiento para una endonucleasa de restricción distinta de la usada para 
generar los fragmentos. Dicho fragmento de denominada ​linker​. Los fragmentos de 
DNA sintético que contienen secuencias múltiples de reconocimiento para 
endonucleasas de restricción se denominan ​polilinker​.  
Un vector se linealiza con una endonucleasa que actúe sobre una diana específica 
(situada normalmente en el polylinker) y, en el hueco que queda, se integra un 
fragmento adicional de DNA. Posteriormente se cierra con una DNA ligasa. 
 
Hoy en día existe la capacidad de sintetizar de sintetizar hebras de DNA 
monocatenario con una secuencia de nucleótidos determinada. Éste conocimiento se 
aplica para construir un polylinker para un 
vector bicatenario: primero se sintetiza la 
hebra codificante con las dianas de restricción 
deseadas y, a continuación, se sintetiza la 
complementaria. 
En este ejemplo, quedan 4 nucleótidos 
desapareados en cada extremo de la cadena, 
formando un extremo cohesivo o un s​ ticky 
end. A
​ continuación abrimos el vector de 
clonación y los extremos del polylinker se 
emparejan con los del plásmido gracias a la 
DNA ligasa.  
 
 
 
 
El DNA del polylinker no tiene por qué haberse obtenido de la fragmentación de 
una  cadena  bicatenaria.  H​oy  en  día  existe  la  capacidad  de  sintetizar  de  sintetizar 
hebras  de  DNA  ​monocatenario  con  una  secuencia  de  nucleótidos  ​determinada​.  Este 
conocimiento  se  aplica  para  construir  un  polylinker  para un vector bicatenario: ​primero 
se  sintetiza  la  hebra  codificante  con  las  dianas  de  restricción  deseadas  y,  a 
continuación, se sintetiza la complementaria. 

Existe la posibilidad de trabajar con dos tipos de extremos a la hora de realizar los 
cortes: 

● Extremo cohesivo o s​ ticky end:​ ​la endonucleasa de restricción realiza un corte 

identado en el que quedan nucleótidos desapareados en cada extremo de la 
cadena. Pueden aparearse entre sí o con otros extremos cohesivos de otro 
fragmento de DNA. Pueden obtenerse mediante la combinación de la 
exonucleasa del bacteriófago λ y la transferasa terminal. 
● Extremo romo o ​blunt end​:​ no quedan nucleótidos desapareados en los 
extremos porque la endonucleasa corta en los enlaces fosfodiéster opuestos. 
Menos restrictivos a la hora de formar nuevo DNA. 

Los extremos del polylinker se emparejan con los del plásmido gracias a la DNA ligasa, 
siempre y cuando sean compatibles. Siendo el extremo cohesivo el que aporta una 
unión más eficiente. 

A veces quedan no quedan extremos cohesivos sino romos, y por ello podemos 
transformarlos en cohesivos para que se adapten a los extremos del vector. El 
procedimiento consiste en: 

1. Sintetizar artificialmente pequeñas moléculas DNA monocatenario con la 

secuencia deseada. 
2. Sintetizamos su complementaria, de forma que obtenemos a partir de las dos 
cadenas una secuencia palindrómica con un sitio de restricción. 
3. Ponemos las dos cadenas en condiciones adecuadas para formar la doble 
hélice. 
4. Usamos una ligasa para unir el oligonucleótico bicatenario artificial (linker) 
obtenido con el DNA a insertar en el plásmido. 
5. Tratamos el ADN con endonucleasa de 
restricción que romperá el oligonucleótido 
dando lugar a los extremos cohesivos 
complementarios al vector. 

CLONACIÓN 
 
Una vez introducidos y aclarados los conceptos de 
vector y polylinker, podemos presentar el siguiente 
paso en la manipulación del DNA: la clonación. A la 
hora de clonar, el objetivo principal es obtener el 
mayor número de copias en el menor tiempo 
posible. Por consiguiente, los vectores se introducen en bacterias, organismos que 
tienen una tasa de reproducción muy elevada. 
En el momento que obtenemos el DNA recombinante, ya se denomina clon, pues 
sabemos que tenemos el potencial de introducirlo en los seres vivos y obtener 
verdaderos clones. 
Estos procesos se han hecho siempre en bacterias: 
● Los vectores plasmídicos son de origen bacteriano 
● Una célula bacteriana crece a una enorme velocidad 
Las células superiores nos presentan más dificultades frente a estos procesos. 
Si yo quiero clonar un fragmento de DNA eucariótico tengo que obtener el fragmento 
(1,2,3 kb). Cuando tenemos un vector y un DNA fragmentado con extremos 
compatibles ya tenemos un DNA recombinante. 
Para los bioquímicos al propio vector recombinante ya se le reconoce como clon. En el 
mayor número de casos se ha hecho este tipo de experimentos con bacterias ya que 
crecen muy rápido y se pueden obtener clones fácilmente y los plásmidos son 
naturalmente de origen bacteriano. 
La ​recombinación​ es un fenómeno natural que se basa en un proceso de intercambio o 
mezcla de material genético como ocurre en la meiosis 1 y 2. El D ​ NA recombinante​ es, 
por tanto, un fragmento de DNA que tiene 2 orígenes: 
● El vector portador 
● El fragmento de DNA exógeno 
 
El objetivo es conseguir que la molécula portadora realice m
​ iles y miles de copias 
idénticas a la original. 
Generalmente,  la  clonación  de  DNA  perteneciente  a  cualquier  organismo  consta  de 
cinco etapas: 

● Cortar  y  ​linealizar  el  DNA  diana  en 

lugares  determinados  mediante 
endonucleasas​ de restricción. 
● Selección  de  una  pequeña  molécula de 
DNA capaz de autorreplicarse (​vector​). 
● Unión  covalente  del  vector  de 
clonación  y el DNA a clonar (conector o 
polylinker​)  mediante  el  enzima  DNA 
ligasa​.  El  polylinker  y  el  vector 
linealizado  deben  de  haberse  obtenido 
mediante la misma endonucleasa. 

El  resultado  es  una  molécula  de  ​DNA 

recombinante:  una  molécula  informativa 
compuesta  por  fragmentos  provenientes 
de dos o más fuentes. 

● Traslado del DNA del tubo de ensayo a una​ célula huésped.​ A la hora de 
clonar, el objetivo principal es obtener el mayor número de copias en el menor 
 tiempo posible. Por consiguiente, los vectores se introducen en b
​ acterias​, 
organismos que tienen una tasa de reproducción muy elevada. 
● Selección  o  identificación  ​de  las  células  huésped  que  contienen  DNA 
recombinante. 

Recordatorio  y  resumen:  ¿Cómo  construir  un  DNA  recombinante?  ¿Cómo  introducir 

el polylinker? 
 
● Abrir  el  vector  con  endonucleasas  de  restricción:  el  DNA  a  clonar  estará 
fragmentado 
● Mezclar  en  disolución  en  presencia  de  DNA  ligasa:  los  extremos  deben  ser 
compatibles 
○ Extremo cohesivo 
○ Extremo romo 
● Introducir el vector en la célula portadora 
 
La  ​clonación  direccional  es  aquella  en  la  que  decido la dirección en la que se insertará 
el  DNA.  Luego  se  incorporará  el  plásmido  en  células  portadoras  y  se  seleccionarán 
aquellas que tras el proceso incorporen funcionalmente ese ADN. 
 
Existen tres tipos de métodos para introducir el vector en la célula portadora: 
 
● Químicos​:  
○ Preparación  de  sales  cálcicas:  es  el  más  común.  El  DNA  cálcico  entra 
en contacto con la célula y entra dentro a través de la membrana celular. 
○ Liposoma​:  un  liposoma  es  una  vesícula  artificial  formada  por  una  o  2 
membranas  lipídicas  en  el  cual  se  inserta  el  DNA  recombinante.  Éste 
entra  a  la  célula  mediante  la  fusión  de  membranas  del  liposoma  y  de la 
membrana plasmática. 
 
 ● Físicos: 
○ Electroshock​/​Electroporación​:  se  aplica  una  gran  diferencia  de 
potencial  en  muy poco tiempo, que abre unos poros momentáneos en la 
membrana  celular  y  permite  la  penetración  del  vector  (electroporación) 
aproximadamente medio segundo se abren los poros. 
● Biológicos​: 
○ Virus​:  tanto  si  el  receptor  es  una  bacteria  como  una  célula  superior,el 
DNA recombinante puede ser introducido en la célula portadora a través 
de  un  virus  ya  que  es  capaz  de  infectar  la  célula receptora produciendo 
los  efectos  del  ADN  incorporado.  No  obstante,  es  particularmente 
peligroso en células humanas. 
 
Con  independencia  del  método usado, pocas células incorporan el DNA plasmídico por 
lo  que  es  importante  contar  con  un método de identificación. La estrategia más común 
es el uso de genes específicos de los plásmidos que actúan como marcadores: 
 
● Marcadores seleccionables​: en unas determinadas condiciones causan: 
○ El crecimiento de la célula: selección positiva 
○ La muerte de la célula: selección negativa 
El plásmido pBR322 suministra ejemplos de ambos tipos de selección. 
 
● Marcadores  detectables:  genes  que  codifican  a  una  proteína  que  hace  que  la 
célula  produzca  una  molécula  coloreada  o  fluorescente.  Las  células  que 
contienen el plásmido son fácilmente identificables y no son dañadas. 
 
EXPERIMENTO:  EJEMPLO  DE 
SELECCIÓN  CLONAL  USANDO  EL 
VECTOR PLASMÍDICO pBR322 
 
La  imagen  representa  un  esquema 
general  del  vector  plasmídico  de 
clonación  pBR322.  El  vector  presenta 
dos ​resistencias ​a antibióticos: 
● A  la  ampicilina,  ampR :en 
naranja 
● A la tetraciclina, tetR : en azul 
 
Ambas  secuencias  contienen  unas 
determinadas  ​dianas  de  restricción  (​PstI,  BamHI  y  SalI).  Si  actúa  sobre  ellas  una 
endonucleasa  de  restricción​,  el gen ya no codifica para la resistencia al antibiótico que 
contenga  dicha  diana.  La  proteína  codificada  no  se  codificaría  o, en el más improbable 
de  los  casos,  se  vería  alterada.  ​Esto  último  ocurriría  de  manera  que  la  proteína  se 
sintetizaría bien hasta llegar al primer nucleótido del DNA exógeno. 
 
Usamos la endonucleasa PstI: 
Se fragmenta el gen de la resistencia a la ampicilina para introducir el fragmento de 
DNA exógeno. A continuación, el DNA recombinante se introduce en bacterias y éstas 
se siembran en placas petri. Nos encontramos ante tres tipos de bacterias, sobre las 
que realizaremos la s​ elección clonal: 
 ● Bacterias que n​ oh
​ ayan recibido DNA 
recombinante ni el vector plasmídico. 
● Bacterias que hayan recibido el v​ ector 
plasmídico pero éste no contenga el 
DNA recombinante ya que la ligasa 
haya unido los dos extremos del vector 
entre sí en vez de unirlos al DNA 
exógeno. 
● Bacterias que hayan recibido el v ​ ector 
de ​DNA r​ ecombinante. Normalmente 
se recibe un sólo vector por célula. 
 
Procedemos a la siembra y selección: 
La suspensión celular se siembra en una placa 
petri con agar-agar (nutriente) y una 
concentración letal de tetraciclina. 
De esto deducimos que: ​sólo las bacterias 
que contienen el vector, ya sea de DNA recombinante o no, sobreviven. ¿​ Por qué? 
pBR322 contenía una secuencia de resistencia a la tetraciclina, por tanto, las bacterias 
que hayan adoptado el vector poseerán resistencia al susodicho antibiótico. 
A  partir  de  la  placa  petri  inicial,  se  crean  dos 
placas  petri  idénticas,  una  de  las cuales servirá 
como ​control​. 
Con  ayuda  de  una  aguja  estéril,  se  “pica”  en  la 
placa  petri  original  y  se  van  sembrando 
simultáneamente  colonias  ordenadas  en 
ambas  placas,  guardando  un  registro  de  las 
colonias. 
Se  crea  un  medio  proliferante  con 
concentraciones  letales  de  tetraciclina que sólo 
permite la vida de aquellas bacterias que hayan 
incorporado  el  plásmido, portador del gen de la 
resistencia al antibiótico. 
Se  añade  posteriormente  ​ampicilina  ​a  uno  de 
los  dos  medios,  manteniendo  uno  sólo  con 
tetraciclina que hará las veces de control. 
 
¿Cuál es el resultado esperado? 
Sólo  aquellos  plásmidos  que  no  hayan 
incorporado  el  DNA  exógeno  mantendrán 
íntegro  el  gen  de  resistencia  a  la  ampicilina.  Por  tanto,  comparando  las  posiciones  de 
las  colonias  en  ambas  placas,  sabremos  qué  colonias  contenían  el  vector  de  DNA 
recombinante (las que han muerto). 
 
Este  proceso  es  denominado SELECCIÓN CLONAL POR INACTIVACIÓN (un gen que 
aporta  resistencia  a  un antibiótico concreto es inactivado) POR INSERCIÓN ​(se inserta 
un factor en la zona de resistencia)​. 
 
 
 
CICLO BIOLÓGICO DEL BACTERIÓFAGO λ 

El  bacteriófago  tiene  un  mecanismo  muy 

eficiente  para  introducir  sus  48.502  pares 
de  bases  de  DNA  en  la  bacteria,  y  puede 
ser  usado  como  vector  para  clonar 
fragmentos  de  DNA  algo  mayores.  Vienen 
del  genoma  de  virus  bacteriófagos.  Su 
utilidad  se  basa  en  dos  características 
principales:  

1.   Alrededor  de  un  tercio  del  genoma  de  ​λ  no  es  esencial  y  puede  ser 
reemplazado ​por DNA foráneo. Ésta es la r​ egión reemplazable​. 
2.   El  DNA  se  empaqueta  en  partículas  de  fago  infecciosas  só​lo  si  su  tamaño  se 
encuentra  entre  40.000  y  53.000  pares  de bases, limitación aprovechable para 
lograr que solamente se empaquete el DNA recombinante.  

Se  han  desarrollado  vectores  derivados  del  bacteriófago  ​λ  que  se  pueden  cortar 
fácilmente  en  tres  trozos,  dos  de  los  cuales  contienen  ​genes  esenciales​,  que  totalizan 
sólo  unos  ​30.000  pares  de  bases.  El  tercer  trozo,  o  DNA  “de  relleno”,  es  ​descartado 
cuando  el  vector  se  usa  para  la  clonación.  Por  tanto,  debe  introducirse  DNA  adicional 
entre  los  dos  segmentos  esenciales 
para  generar  moléculas  ligadas de DNA 
suficientemente  largas  para  producir 
partículas de fago viables. 

En  efecto,  el  mecanismo  de 

empaquetamiento  selecciona 
eficazmente  los  DNA  víricos 
recombinantes.  Los  vectores  del 
bacteriófago  ​λ  permiten  la  clonación  de 
fragmentos  de  DNA  de  hasta  ​23.000 
pares  de  bases,  ​nada  que  ver  con  el 
DNA clonado en los plásmidos. 

Una  vez  los  fragmentos  del 

bacteriófago  ​λ  han  sido  ligados  con 
fragmentos  de  DNA  foráneo de tamaño 
adecuado,  los DNA recombinantes resultantes se pueden ​empaquetar ​en partículas de 
fago  siendo  ​añadidas  a  bacterias​.  Esta 
operación  recibe  el  nombre  de 
empaquetamiento in vitro​.  

Todas  las  partículas  de  fago  viables 

contendrán  un  fragmento  de  DNA 
foráneo.  La  ​transmisión  ​ulterior  del 
DNA  recombinante  a  células  de  ​E.  coli 
es  muy  eficiente​.  Lo  que  ocurrirá  a 
continuación puede seguir dos vías, ambas representadas en el siguientes esquema: 

● Vía lítica​: 

Se irán sintetizando el genoma y las proteínas para la cápsida del virus. Se 
ensamblarán miles de copias que causarán ​lisis celular​ y ésto provocará la liberación 
de un gran número de bacteriófagos. 

● Vía lisogénica​: 

El  ​virus  se  pega a la pared de la ​bacteria e introduce su ​ácido nucleico en su interior. El 

DNA  vírico  se  recombina  con el DNA bacteriano y permanece inactivo. Esta forma viral 
se denomina p ​ rófago ​y la célula infectada se denomina célula l​ isogénica​. 1​  
Esta  célula  se  puede  mantener  así  indefinidamente  e  incluso  puede  llegar  a 
reproducirse.  Un  cambio  en  el  medio  celular,  va  a  llevar  consigo  un  cambio  celular  y 
con  él, la liberación del prófago, convirtiéndose en un virus activo que continuará con el 
ciclo infeccioso o ciclo lítico. 
 
VECTORES BAC RECOMBINANTE 

Éstos son vectores plasmídicos especiales que han sido desarrollados en respuesta a la 
necesidad  de  clonar  ​segmentos  de  DNA 
de  gran  tamaño​,  como  ocurre  en  la 
secuenciación  de  grandes  genomas.  Estos 
grandes  fragmentos  constan 
habitualmente  de  entre  100 y 300 kb. Una 
vez  se  introduce  el  DNA  exógeno,  los 
vectores  son  demasiado  grandes  como 
para considerarlos cromosomas, por lo que 
se  les  denomina ​cromosomas bacterianos 
artificiales  o  BAC  (​bacterial  artificial 
chromosome​). 

Contenido de un BAC: 

Tienen  orígenes  de  replicación  muy 

estables  ​que  mantienen  una  o  dos  copias 
por  célula.  Ésto  limita las posibilidades de que ocurran reacciones de recombinación no 
deseadas. 

Generalmente  incluyen  marcadores  detectables  (o  seleccionables),  tales  como  la 

resistencia al ​cloranfenicol​. 

Genes  ​par​,  que  codifican  proteínas  que  regulan  la  correcta  distribución  de  los 
cromosomas  en  la  división  celular.  Ésto  aumenta  la  probabilidad  de  que  toda  la 
descendencia contenga una copia del BAC. 
Ejemplo: 

Nos  encontramos  ante  un  vector  BAC 

con: 

● Origen  de  replicación  ​muy 

estable  que  mantiene  una  o 
dos  copias  del  plásmido  por 
célula. 
● Genes  par  procedentes  de otro 
plásmido concreto (plásmido F) 
● Gen lac Z para la producción de 
β-galactosidasa  (hidroliza  los 
β-galactósidos  como  la  lactosa)  en  la  región  de  clonación:  recordamos  que,  al 
igual  que  en  el  experimento  anterior,  un  polylinker  introducido  en  medio  de  un 
gen,  inactivará  un  gen  y  nos  permitirá  llevar  a  cabo  la  selección  clonal  por 
inactivación. 
● Gen  de  resistencia  a  cloranfenicol  CmR ,  ​que  permite  la  ​selección  positiva  ​de 
las bacterias poseedoras de DNA recombinante. 

Procedimiento: 

Los  fragmentos  de  DNA  de  varios  centenares  de  miles  de  pb  se  clonan  en  vectores 
BAC.  Estas  grandes  moléculas  de  DNA  circular  son  introducidas  en  las  bacterias 
huésped  por  ​electroporación​.  Estas  bacterias  tienen  mutaciones  que  afectan  la 
estructura  de  la  pared  bacteriana  para  facilitar  la  incorporación  de  las  grandes 
moléculas de DNA.  

La β-galactosidasa cataliza la conversión de la molécula incolora X-gal en un producto 
azul. De lo que deducimos: 

● Las  colonias  azules  presentan el gen intacto: la DNA ligasa unió los fragmentos 

del vector sin incorporar el DNA exógeno. 
● Las  colonias  blancas  han  visto  su  gen  interrumpido:  contienen  el  DNA 
recombinante 

VECTOR YAC RECOMBINANTE 

Mientras  que  dentro  de  las  bacterias  la  más  utilizada es la ​E. coli​, cuando hablamos de 

levaduras​,  seres  eucarióticos  unicelulares,  pensamos en ​Saccharomyces cerevisiae​. Su 
genoma  contiene  más  de  3  veces  el  genoma  de  dicha  bacteria,  elevándose  hasta  las 
14.oookb,  una  secuencia  perfectamente  conocida.  Se  han  construido  vectores 
recombinantes  de  levaduras  aplicando  los  principios  usados  en  los  vectores  de  E. coli. 
Algunos  de  estos  vectores  presentan  el  avance  de  contener  más  de  un  origen  de 
replicación  (para  especies  distintas),  lo  que  los  convierte  en  vectores  lanzadera 
(​shuttle​):​   pueden  propagarse  en  células  de  dos  o  más  especies  diferentes,  aquellas 
cuyo origen de replicación esté presente en el plásmido. 
El  trabajo  con  grandes  genomas  hizo  que  la experimentación con plásmidos resultase, 
en  algunas  ocasiones,  insuficiente.  Ésto  llevó  a  la  creación  de  vectores  de  gran 
capacidad:  ​cromosomas  artificiales  de levadura o YAC (​yeast artificial chromosome​).​  
Los YAC contienen: 

● Origen de replicación de levadura 

● Dos marcadores seleccionables: X e Y 
● Secuencias especializadas necesarias para la estabilidad y segregación correcta 
de los cromosomas en la división celular: 
○ CEN​: derivada del centrómero 
○ TEL (​ 2x): derivadas de los telómeros 

Construcción de un cromosoma de levadura artificial 

1. El  vector  es  propagado  en  forma  de 

plásmido circular bacteriano​. 
2. Se  produce  la  ​digestión  ​con  una 
endonucleasa  de  restricción  (BamHI), 
que  elimina  un  trozo  de  DNA  ​entre  dos 
secuencias  teloméricas  (TEL)​,  dejando 
los  telómeros  en  los  extremos  del  DNA 
linealizado. 
3. Se  corta  de  nuevo  en  un  sitio  interno 
(mediante  EcoRI),  dividiendo  el  vector 
en  dos  fragmentos  de  DNA, 
denominados  ​brazos  del  vector​,  cada 
uno  con  un  ​marcador  seleccionable 
distinto y un ​telómero​. 
4. Aparte,  se  prepara  el  DNA  genómico  por 
digestión  parcial  y  luego  se  separan  los 
fragmentos  por  ​electoforesis  en  gel  de 
campo  pulsante​,  que  permite  la  separación 
de trozos de DNA muy grandes. 
5. Los  fragmentos  de  DNA  de  tamaño 
apropiado  (hasta  2000kb)  se  mezclan  y  se 
ligan con el vector. 
6. Las  células  de  levadura  son  eucariotas pero 
tienen  pared  celular  rígida,  de  diferente  composición  a  la  bacteriana. Por tanto, 
las  levaduras  que  se  quieran  transformar  son  tratadas  para  ​digerir  su  pared 
celular​.  El  resultado  es  un  ​esferoplasto  de  levadura,  ​sensible  a  los  cambios 
osmóticos​. 
7. Las  células  de  levadura  serán  cultivadas  en  un  medio  propicio  para  X  e  Y,  y 
serán seleccionadas respecto a estos marcadores. 
8. Las  células  de  levadura  supervivientes,  las  recombinantes,  propagarán  el 
inserto de DNA. 
La  ​estabilidad  ​de  los  clones  YAC  aumenta  con el tamaño hasta un determinado límite. 
Los  que  poseen  insertos  de  más  de  150.000  pares  de  bases  son  casi  tan  estables 
como  los  cromosomas  celulares  normales,  mientras  que  aquellos  con  insertos  de 
menos  de 100.000 pares de bases van perdiéndose paulatinamente durante la mitosis. 
Los  YAC  que  carecen  de  un  telómero  en  cualquiera  de  los  extremos  son 
rápidamente degradados. 

El  DNA clonado en un YAC presenta la ventaja de que puede modificarse para estudiar 
la  función  de  secuencias  especializadas  en  el  metabolismo  de  los  cromosomas,  los 
mecanismos  de  regulación y expresión génica y muchos otros problemas de la biología 
molecular eucariótica. 

No  se  usan  marcadores  de  selección  de  antibióticos,  sino  que  se  crea  una  autotrofía. 
Se  introducen  los  genes  de  síntesis  de  un  aminoácido que no tenga normalmente y de 
esa  forma,  en  un  medio  sin  el  aminoácido,  sólo  las  que  tengan  el  YAC  recombinante 
crecerán. 

LA  EXPRESIÓN  DE  GENES  CLONADOS  Y  LA  PRODUCCIÓN  DE 

PROTEÍNA 
En  muchas  ocasiones,  el  interés  principal  en  la  tecnología  del  DNA  recombinante 
reside  no  en  los  genes  en  sí  mismos  sino  en  el  producto:  las  proteínas.  Las  proteínas 
pueden  tener  valor  comercial,  terapéutico  o  para  la  investigación.  Cuando  son 
purificadas, se utilizan para varios propósitos: 

● Estudio de la función proteica 

● Estudio de los mecanismos de reacción 
● Obtención de anticuerpos contra las proteínas 
● Reconstitución de actividades celulares complejas en el tubo de ensayo a partir 
de componentes purificados 
● Examen de las propiedades de unión de las proteínas 

La  tecnología  del  DNA  recombinante  permite  manipular  el  genoma  de las células para 
estudiar  sus  productos  proteicos.  Normalmente  se altera la secuencia del gen deseado 
para inducir la sobreexpresión de cierta proteína, lo que facilita su purificación. 

Todos  los  genes  necesitan  mecanismos  de  control  y  regulación  para  su  correcta 
expresión.  No  obstante,  estos  mecanismos  no  son  idénticos  en  eucariotas  y 
procariotas.  De  esta  manera,  un  vector  recombinante  que  vaya  a  ser  usado  en 
organismos procarióticos necesita incorporar sus mecanismos reguladores: 

● Promotores​: secuencias que indican a la RNA polimerasa dónde debe unirse 

● Sitios  de  unión  a  ribosomas​:  secuencias  que  permiten  la  traducción de mRNA 
a proteínas 
● Otras secuencias reguladoras adicionales 
Todas  estas  secuencias  han  de  ser  insertadas  en  la  posición  correcta  del  DNA  vector 
en relación con el gen eucariótico. 

En  ciertos  casos,  los  genes  clonados  se  expresan  tan  eficientemente  que  el  producto 
proteico  representa  hasta  el  10%  del  total  de  la  célula.  No  obstante,  hay  que  ser 
precavido  y  limitar  la  expresión  del  gen  a  unas  pocas  horas,  ya  que  unas 
concentraciones  tan  altas  de  proteínas  foráneas  pueden  matar  a  la  célula  huésped, 
normalmente E. coli. 

Estos  vectores  que  contienen  las señales de transcripción y traducción necesarias para 

regular  la  expresión  de  un  gen  clonado  se  denominan  vectores  de  expresión.  La 
velocidad de expresión del gen. 

SISTEMAS PARA EXPRESAR PROTEÍNAS RECOMBINANTES 

Ya  que  todos  los  organismos  vivos  tienen la capacidad de expresar su DNA genómico, 
se  han  usado  todo  tipo  de  células  con  este  propósito,  presentando  cada  una  sus 
ventajas y desventajas. 

BACTERIAS 

Las  bacterias,  en  concreto E.coli, son las huéspedes más comunes para la expresión de 

proteínas.  

Ventajas 

● Sus  secuencias  reguladoras  son  muy  conocidas  y pueden aprovecharse para la 

expresión de proteínas en grandes cantidades. 
● Son fáciles de almacenar y cultivar 
● Utilizan medios de bajo coste 
● Se dispone de medios eficientes para la inserción y la extracción del DNA 
● Pueden cultivarse en grandes cantidades en fermentadores industriales 

Inconvenientes 

● Algunas  proteínas  heterólogas  no  se  pliegan  correctamente  cuando  se 

expresan en bacterias 
● Muchas  no  sufren  las  modificaciones  covalentes  o  los  cortes  proteolíticos 
necesarios para su actividad 
● Ciertas  características  de  una  secuencia  génica  pueden  presentar  dificultades 
en la expresión del gen en bacterias: 
○ Las  regiones  intrínsecamente  desordenadas  son  más  comunes  en 
eucariotas 
○ Muchas  proteínas  eucarióticas  se  agregan  y  forman  precipitados 
insolubles (cuerpos de inclusión) 

Como  resultado, muchas de las proteínas eucarióticas no se expresan en bacterias o se 
expresan  pero  la  proteína  resultante  es  inactiva.  Constantemente  se  están 
 desarrollando  nuevos  métodos para contribuir a 
la  resolución  de  estos  problemas,  como  nuevas 
cepas  bacterianas  huésped  que  incorporan 
mejoras  como la presencias de chaperonas para 
proteínas  eucarióticas  o  enzimas  que  modifican 
las proteínas inactivas. 

La  imagen  muestra  las  secuencias  de  DNA  en 

un  ​vector  de  expresión  ​típico  de  ​E. coli​. Éste es 
su funcionamiento: 

1. Se  inserta  el  gen  que  se  desea  expresar 

en  uno  de  los sitios de restricción del ​polinector 
o  polylinker.  El  extremo  del  gen  que  codifica  el 
aminoácido terminal de la proteína debe estar posicionado cerca del promotor. 
2. El ​promotor (P)​ posibilita una transcripción eficiente del gen insertado.  
3. El ​operador (O),​ mediante la unión a un represor, permite la regulación. 
4. El  ​sitio  de  unión al ribosoma contiene las señales para una traducción eficiente 
del mRNA derivado del gen. 
5. El  ​marcador  seleccionable  permite  la  selección  de  las  células  que  contienen  el 
DNA recombinante. 

Control de la expresión de una proteína recombinante en bacterias 

Sistemas especializados: operón lactosa 

El  promotor  y  las  secuencias  reguladoras  asociadas  al 

operón  lactosa  a  menudo  se  unen  al  gen  que  debe 
expresarse  para  controlar  la  transcripción,  de  forma que 
el  mecanismo  de  expresión  de  la  proteína  recombinante 
sea  el  mismo  que  el  de  la  ​β-galactosidasa  (primero 
mecanismo de control de la expresión génica). 

En la imagen superior (a) se ilustra este mecanismo​: 

Los  genes  del  operón  lac  se  activan  en  presencia  de  la 
lactosa  porque  se  encargan  de  su  degradación  paso  a  paso.  En  el  laboratorio  es 
posible  activar  esta  vía  de  degradación  mediante  el  uso  de  un  símil  sintético  de  la 
lactosa,  el IPTG (isopropiltiogalactósido), que difiere de la lactosa en que no es digerido 
por los enzimas del operón lac. 

En  ausencia  de  IPTG,  el  gen  lacZ  no  se  transcribe;  en  su  presencia,  se  transcribe  el 
mRNA  que  se  traducirá  a  la proteína ​β-galactosidasa. Como el IPTG no es degradado 
y  está  siempre  presente,  se  crea  una  “activación  permanente”  y  se  sintetizan  grandes 
cantidades de la proteína. 
Si  intercambiamos  el  gen  lacZ  por  un  gen  que  codifique  una  proteína  que  deseemos 
sintetizar  y  lo  colocamos  tras  el  promotor  lac,  el  proceso  que  vendrá  a  continuación 
será idéntico al anterior. 

En  la  imagen  (b)  se  sustituye  el  gen  lac  Z  por  un  cDNA:  G-CSF,  un  factor  estimulante 
de colonias de granulocitos, que da lugar a una proteína humana con el mismo nombre. 
Tras  la  transformación  de  E. coli, podemos observar como la G-CSF sólo se expresa en 
presencia  del  IPTG,  ya  que  es  el  que  induce  la  activación  del  promotor.  Esta  técnica 
puede utilizarse, por ejemplo, con la insulina. 

Sistema especializado alternativo: promotor + RNApol del bacteriófago T7 

El  gen  que  codifica  la  proteína  RecA,  ligado  a  un  promotor  del 
bacteriófago T7, se clona en un vector de expresión. 

En  condiciones  de  crecimiento  normales,  sin  inducción,  no  se 

sintetiza la proteína RecA. 

Cuando  se  induce  en  la  célula  la  RNApol  de  T7,  se  expresa  el  gen 
recA  y  se  producen  grandes  cantidades  de  la  proteína,  como 
podemos observar en la electroforesis en gel. 

LEVADURAS 

Ventajas 

● La  ya  mencionada  levadura  ​Saccharomyces  cerevisiae  es  el  organismo 

eucariótico mejor conocido y uno de los más fáciles de cultivar y manipular en el 
laboratorio. 
● Puede cultivarse en medios baratos. 
● La  expresión  de  proteínas  heterólogas  procedentes  de  otros eucariotas es más 
eficiente que en las bacterias. 
○ El  plegamiento  y  la  modificación  de  los  productos  pueden  también  ser 
más precisos. 

Inconvenientes 

● Posee  una pared celular muy resistente difícil de alterar para introducir vectores 
de DNA, haciendo este proceso más difícil que en bacterias. 
● Las proteínas heterólogas no pueden plegarse correctamente: 
● La levadura puede carecer de los enzimas necesarios para su activación. 
● La  expresión  de  las  proteínas  puede  verse  comprometida  por  ciertas 
características de las secuencias génicas. 

Por  lo  tanto,  el  vector  de  levadura  ​se  propaga  inicialmente  en  bacterias​, que resultan 
más  adecuadas  para  la  mayor  parte  de  la  ingeniería  genética  y  el  mantenimiento  del 
vector. Se han desarrollado varios excelentes ​vectores lanzadera​ con este propósito. 
Los  principios  subyacentes  a  la  expresión  de  proteínas  en  levaduras  son  los  mismos 
que  en  las  bacterias.  Los  genes  clonados  deben  unirse  con un promotor que garantice 
un elevado nivel de expresión. 

Ejemplo: GAL1 y GAL10 

Estos  genes  de  levadura  están  regulados de forma que se expresan cuando las células 

de  levadura  se  cultivan  en  un  medio  con  ​galactosa​,  pero  se  reprimen  en  medios  de 
glucosa. Este proceso se denomina “represión catabólica”: los genes que codifican a las 
proteínas  para  la  utilización  de  azúcares  distintos  a  la  glucosa  se  reprimen  en 
presencia  de  ésta,  ya  que  ésta  es  el  azúcar  preferente  para  el  funcionamiento  del 
metabolismo. 

Por  lo tanto, si se clona un gen heterólogo bajo el control de las secuencias promotoras 
reguladoras  de  GAL1  y  GAL10,  podríamos controlar su expresión mediante la elección 
del medio de cultivo (Presencia/ausencia de glucosa y galactosa). 

INSECTOS Y VIRUS DE INSECTOS 

Los  ​baculovirus  ​son  virus  de  insectos  con genomas de DNA de doble cadena. Cuando 

infectan  las  larvas  de  sus  insectos  huésped,  se  comportan  como parásitos y matan las 
larvas  para  convertirlas  en  factorías  de  producción  de virus​. Hacia el final del proceso 
infeccioso,  los  virus  producen  grandes  cantidades  de  dos  proteínas  (p10  y  poliedrina) 
que  no son necesarias para la producción de virus en células de insectos en cultivo. Por 
tanto,  los  genes  de  ambas  proteínas  pueden  sustituirse  por  genes  de  proteínas 
heterólogas. 

El baculovirus más utilizado es el AcMNPV. 

Ventajas 

● Las proteínas heterólogas se sintetizan a menudo en cantidades muy grandes. 

● Se  dispone  de  una  amplia  variedad  de  sistemas  comerciales  basados  en 
bácmidos. 
● Las  células  de  insecto  son  a  veces  capaces  de  reproducir  los  patrones  de 
modificación  de  proteínas  de  los  eucariotas  superiores  y  producir  proteínas 
eucarióticas activas correctamente modificadas. 

Inconvenientes 

● Tiene  un  genoma  de  gran  tamaño  (134kpb),  demasiado  grande  para  la 
clonación directa. 
● La purificación es muy laboriosa. 
● Los sistemas de baculovirus no dan buenos resultados con todas las proteínas. 

Estos  problemas  se  han  resuelto  con el desarrollo de los ​bácmidos​: grandes moléculas 

de  DNA  circular  que  contienen  el  genoma  completo  del  baculovirus  más  secuencias 
que permiten la replicación del bácmido en E ​ . coli​. 
 

Ejemplo: construcción de un vector típico 

1. El  gen  estudiado  se  clona  en  un  pequeño  plásmido  entre  dos  sitios  (att) 
reconocidos por una recombinasa específica de sitio. 
2. Se introduce el vector de baculovirus por recombinación específica. 
3. El  DNA  circular  obtenido  se  usa  para  infectar  las  células  de  una  larva  de 
insecto. 
4. El gen estudiado se expresa durante el ciclo infectivo bajo el control de un 
promotor que normalmente expresa una proteína de la cápsida del baculovirus 
a niveles muy elevados. 

En  la siguiente fotografía podemos observar 
dos  larvas,  una  de  las  cuales  ha  sido 
infectada  con  el  baculovirus  y  la  otra  no 
(larva  control).  El  vector  recombinante  del 
baculovirus  expresa  una  proteína  de  color 
rojo,  por  lo  que  la larva infectada es roja y la 
larva  wild-type  mantiene  su  coloración 
natural verde. 

CÉLULAS DE MAMÍFERO EN CULTIVO 

La  manera  más  conveniente  para  introducir  genes  clonados en células de mamífero es 

mediante virus. 

Ventajas 

● Este  método  aprovecha  la  capacidad  natural  de  los  virus  para  introducir  su 
DNA o RNA en una célula y, a veces, en el cromosoma celular. 
● Se  dispone  de  un  gran  número  de  virus  de  mamífero  modificados  que  pueden 
actuar como vectores, incluyendo adenovirus humanos y retrovirus. 
 ● Las proteínas pueden expresarse de dos maneras distintas: 
○ Transitoria​:  si  el  DNA  se  mantiene  separado  del  genoma  y  es 
finalmente degradado. 
○ Permanente​:  si  el  DNA  vírico  se  integra  en  el  genoma  de  la  célula 
huésped. 

EXPRESIÓN TRANSITORIA Y PERMANENTE: ¿CÓMO SE CONSIGUE? 

 
Expresión transitoria del cDNA (obtenido a partir de una retrotranscriptasa). DNA 
recombinante no integrado 
 
El  vector  de  expresión  contiene  un  promotor 
(leaky)  y  un  origen  de  replicación  viral  que 
permitirá su replicación dentro de las células. 
Se  procede a la transfección del cultivo mediante 
tratamiento  lipídico  o  electroporación.  Como  el 
cDNA  no  se  integra  en  el  genoma  y  las  células 
contienen  mecanismos  para  degradarlo,  sólo 
algunas  células  del  cultivo  expresarán  la 
proteína,  aquellas  que  conserven  el  vector  de 
expresión. 
 
Expresión permanente a partir de un DNA recombinante integrado 
 
El  vector  de  expresión  contiene  en  esta  ocasión 
un  gen  de  resistencia  a  antibióticos.  En  el 
ejemplo  representado  se  trata de resistencia a la 
neomicina (gen  neoR ), un antibiótico para células 
superiores.  Se  transfectan  los  cultivos  mediante 
una  de las dos técnicas citadas anteriormente en 
un  medio  con  una  forma  sintética  de  neomicina 
(G-418).  A  continuación  se  selecciona  a  las 
células supervivientes. 
Todas  las  células  seleccionadas  expresarán  la 
proteína  del  experimento,  pues  el  vector  se  ha 
incorporado  a  su genoma y forma ya parte de su 
acervo genético. 
 
De esta forma hemos obtenido organismos transgénicos. 
 
Podríamos decir que el primer experimento se realiza in vivo y el segundo in vitro. 
 

Inconvenientes 

● El mantenimiento de las células eucarióticas en cultivo es muy costoso. 

 ● Esta  tecnología  no  es  adecuada  para  la  producción  de  proteínas en cantidades 
industriales. 

El  gen  utilizado  se  clona  de  manera  que  su expresión esté controlada por un promotor 

viral.  El  virus  utiliza  sus  mecanismos  de  infección  naturales  para  introducir  el  genoma 
recombinante en las células, donde se expresa la proteína clonada. 

Es  importante  elegir  una  célula  huésped  adecuada,  que  asegure  la  correcta 
modificación post-traduccional para la obtención de la forma activa de la proteína. 

VIRUS Y RETROVIRUS 
RETROVIRUS 

Los retrovirus se caracterizan porque su material 
genético  es  RNA,  en  lugar  de  DNA.  Para  poder 
integrar  su  genoma  en  el  de  la  célula  huésped 
requieren  de  la  acción  de  una  enzima  llamada 
retrotranscriptasa  o  transcriptasa  inversa,  la  cual 
es  una  polimerasa de ADN dependiente de ARN, 
que  pasa  la  información  genética  del  virus 
codificada  en  forma  de  ARN  a  ADN.  Tienen  la 
particularidad  de  que  infectan  únicamente  a 
células  en  división,  lo  cual  limita sus aplicaciones 
terapéuticas.  Sí  integran  su  genoma  en  el  de  la 
célula  huésped,  por  lo  que  dan  lugar  a  una 
expresión  a  largo  plazo  del  gen  introducido. 
Como desventaja está la posibilidad de ocasionar 
mutaciones  debido  a  que  dicha  integración  es  al  azar.  Son,  además,  virus  patógenos, 
por  lo  que  existe  el  riesgo  de  infección  por  recombinación  y  la  posibilidad  de  que  se 
asocien  a  otros  retrovirus  y  oncogenes.  Por  otra  parte,  su  manipulación  es  bastante 
sencilla  y,  actualmente,  se  encuentra  muy  bien  descrita,  lo  que  permite  la  eliminación 
precisa de todos aquellos genes conocidos que puedan provocar esos problemas.  

VIRUS DE LA LEUCEMIA AVIAR 

Se inserta el DNA dentro de la célula hospedadora. Es más fácil trabajar con DNA 
que con la forma nativa del genoma del retrovirus. Le quitaremos algunos o todos los 
genes que codifican las proteínas que llevana cabo sus funciones infecciosas. Ya que 
la mayoría de los retrovirus son altamente peligrosos, se trabaja con virus defectivos, 
deficientes. 
 
PRODUCIR UN RETROVIRUS  
Introducimos DNA en la célula y hacemos una co-infección con un segundo virus 
que tiene todas las propiedades que le faltaban al virus recombinante más partículas 
víricas con DNA recombinante que no se forman sin este segundo virus. Por este 
 motivo, el segundo virus es denominado Virus Helper. 
Este proceso requiere de condiciones altamente restrictivas: 
● Trajes especiales 
● Presión atmosférica menor 
● Campanas con muchos filtros 
 
CUIDADO CON LOS VIRUS 
La siguiente tabla indica algunos de los virus que pueden ser usados como virus 
recombinantes; todos ellos conllevan riesgo biológico, pues son portadores de 
oncogenes. 
Virus del papiloma humano, adenoma… 
A pesar del uso de virus defectivos, un error puede llevar a la aparición de tumores 
en pacientes tratados con terapia génica. 
 
FUNCIONES PROTEINAS RECOMBINANTES 
Proteínas que se están produciendo mediante la tecnología del DNA recombinante. 
Sirven para curar problemas de coagulación, inmunodeficiencias, enanismo, 
diabetes… y muchos otros trastornos más. 
 

VECTORES VÍRICOS 

Un  vector  viral  es  un  virus  modificado  que  hace  de  vehículo  para  introducir  material 
genético  exógeno  en  el  núcleo  de  una  célula.  En  terapia  génica,  el  uso  de  virus  como 
vector  requiere  la  eliminación  de  los  genes  que  dotan  al  virus  de  su  capacidad 
infecciosa  y  patógena,  dejando  únicamente  aquellos  que  participan  en  la  inserción del 
material  genético,  y  su  sustitución  por  el  gen terapéutico de interés. Los virus que más 
se  han  utilizado  en  terapia  génica  como  vectores  han  sido  los  retrovirus  y  los 
adenovirus,  ampliándose posteriormente a virus adenoasociados, lentivirus, virus pox y 
virus  del  herpes.  Todos  estos tipos difieren en el tipo de células que pueden infectar, la 
eficiencia  con  la  que  introducen  el  material  genético  en  la  célula  huésped,  si  dicha 
introducción es temporal o permanente y en la forma y lugares de inserción.  

Procedimiento:  

1. Partimos  de  un  genoma  de  retrovirus  típico:vgaf,  pol,  env,  LTR,  necesario  para 
la integración de DNA retrovírico en el genoma del huésped. 
2. El  ARN  del  genoma del retrovirus se convierte en ADN mediante la acción de la 
transcriptasa  inversa  para  que 
pueda  ser integrado posteriormente 
en el genoma de la célula huésped. 
3. Los  genes  gag,  pol  y  env  son 
reemplazados  por  ADN  foráneo 
obteniendo  así  un  ADN 
recombinante  defectivo,  ya  que 
carece  de los genes necesarios para 
la  replicación  y  el  ensamblaje de las 
partículas  víricas.  Para  conseguirlo, 
 el  ADN  retrovírico  recombinante  precisa  de  la  acción  de  un  virus  coadyuvante 
que  se  encuentra  en  las  células  de  cultivos  tisulares  y  que  sí  contiene  genes 
necesarios para producir partículas víricas. 
4. Transfectamos  el  vector  a  las  células  del  cultivo,  poniéndose  en  marcha  la 
maquinaria de replicación y transcripción. 
5. En  el  interior  de  las  células  del  cultivo  el  ADN  recombinante  se  transcribe  a 
mRNA 
6. El  ARN  resultante  se  empaquete  obteniendo  así  partículas  víricas  con  RNA 
retrovírico recombinante junto con las enzimas transcriptasa inversa e integrasa 
producidas por el virus coadyuvante.  
7. Así  se  puede iniciar el ciclo vital del virus: Mediante la retrotranscriptasa inversa 
el  ARN  recombinante  se  transforma  a  ADN,  que  se  circulariza  y  al  tener  una 
secuencia  que  aumenta  su  capacidad  de  recombinación  se  integra  en  el  ADN 
celular  de  forma  estable.  Este  ADN  de  origen  retrovírico  se  replicará, 
transcribirá  y  traducirá  dando  lugar  a  muchas partículas víricas que provocarán 
la  muerte  celular  y  para evitarlo la 
partícula  v´roca  ha  de  estar 
debilitada. 

El  virus  del  herpes  se  caracteriza  por 

poseer  un  genoma  de  ADN  bicatenario 
rodeado  por  una  envuelta  icosaédrica  de 
naturaleza  lipídica  de  entre  110  y  200 
nm  de  diámetro.  Los  vectores  víricos 
derivados  a  partir  del  virus  del  Herpes 
presentan  una  serie  de  características 
únicas  entre  las  que  destacan  la 
capacidad  de  infectar  a  un  amplio 
espectro  de  tipos  celulares,  tanto 
quiescentes  como  en  división.  Permite, 
además,  grandes  insertos  de  ADN  (hasta 
30 kb).  

HPV  ​son  los  papilomas  humanos.  Se 

pueden  usar vectores de DNA bicatenario 
para  probar  aunque  son  tan  peligrosos 
que  deben  ser  siempre  virus 
DEFECTIVOS,  es  decir  que  les falten proteínas o elementos para realizar sus funciones 
vitales.  

CONSTRUCCIÓN DE UNA GENOTECA DE DNA GENÓMICO 

Una ​genoteca ​es una colección de clones en la que cada uno contiene un fragmento de 
DNA  de  una  célula.  Entre todos reúnen muestras de todo el genoma del organismo. Se 
utiliza para secuenciar, descubrir nuevos genes o realizar estudios génicos. 
Genoteca de DNA genómico 

Contiene  todo  el  DNA  de  un  organismo  en 

vectores de clonación. Pocedimiento: 

1. Digestión  parcial  del  DNA  con 

endonucleasas de restricción. 
2. Se  eliminan  los  fragmentos  demasiado 
grandes o pequeños. 
3. La  endonucleasa  corta  los  vectores 
necesarios y se ligan con el DNA. 
4. El  DNA  recombinante  se  introduce  en 
bacterias o levaduras. 
5. Cada célula huésped forma un clon. El conjunto de clones es la genoteca. 

Las  genotecas  pertenecen a organismos superiores e incluyen el DNA ​codificante y no 

codificante. 

Ejemplo 

El  genoma  humano  consta  de 300 millones de pares de bases. Dividido en fragmentos 

de  10.000  pares  de  bases,  son  necesarios  300.000  fragmentos  para representar todo 
el  genoma.  Por  cuestiones  de  seguridad,  ya  que  puede  que  algún  fragmento  no  se 
clone  correctamente,  se  estima  que  se  necesitarían  500.000  fragmentos  de  10kb  de 
DNA  para  poder  almacenar  todo  el  genoma  humano.  Para  buscar  un  gen  concreto 
utilizamos la h​ ibridación​. 

Hay  que  tener  en  cuenta  que  el  genoma  humano  es  siempre 
constante.  Sin  embargo,  su  expresión  no  es  siempre  la  misma 
(como ya hemos aprendido de la epigenética) 

Una genoteca de cDNA 

Incluye  sólo  aquellas  secuencias  que  se  expresan:  los 

exones​. Procedimiento: 

1. Aislar mRNA mediante cromatografía. 

2. Utilizar  la  transcriptasa  inversa  para  sintetizar 
DNA complementario (cDNA). 
3. Obtener cDNA bicatenario mediante la DNApol. 

Con  este  cDNA  podremos  crear  genotecas  de  la 

expresión  del  DNA  en  circunstancias  concretas.  Por 
ejemplo,  es  posible  hacer  genotecas  del  cDNA 
pancreático  en  condiciones  de  ayuno,  tras  la  ingesta, 
varias  horas  tras  la  ingesta,  con  diferentes  dietas...
  

Resumen características de las genotecas de cDNA: 

● Representan mRNA maduros 

● Representan  la  expresión  génica  en  un  tejido  en  circunstancias  concretas 
(deben especificarse) 
● Deben ser cuantitativas. 
● Son más pequeñas en número que las del DNA genómico. 

Genoteca diferencial 
Incluye los genes que son diferentes entre dos genotecas de cDNA. 
 
Genoteca de expresión 
Incluye los genes expresados por un vector de expresión, empleando también cDNA. 
 
 
LA  ALTERACIÓN  DE  LOS  GENES  CLONADOS  PRODUCE 
PROTEÍNAS MODIFICADAS 
Las  técnicas  de  clonación  pueden  usarse  tanto  para  obtener  grandes  cantidades  de 
proteínas  como  para  producir  proteínas  poco  o  muy  alteradas.  Es  posible  cambiar 
aminoácidos  individuales  mediante  la ​mutagénesis dirigida​. Las mutaciones obtenidas 
pueden ser de tipo inserción, delección o puntuales cambiando un solo nucleótido. 
Esta  técnica  permite  la  introducción  de  cambios  específicos  en la estructura primaria y 
la  examinación  de  los  efectos  que  estos  cambios  tienen  sobre  el  plegamiento  de  las 
proteínas, la estructura tridimensional y la actividad. Por consiguiente, es un método de 
estudio de​ la estructura y la función de las proteínas​. 
Los  cambios  de la secuencia de aminoácidos se introducen mediante la alteración de la 
secuencia  del  gen  clonado.  Gracias  a  la  presencia  de  sitios  de  restricción  apropiados, 
se  puede  sustituir  un  segmento  de  DNA  por  otro  sintético  que  proporcione  el  cambio 
deseado. 
Ejemplo: dos procesos de mutagénesis dirigida y resultados 
● A 
Se  sintetiza  un  segmento  de  DNA  que  se  utiliza  para  reemplazar  un  fragmento  de 
DNA previamente eliminado mediante un corte con una endonucleasa de restricción. 
 ● B 
Se localiza el gen diana y se desnaturalizan las dos hebras de DNA del plásmido. 
Se  sintetizan  un  par  de  oligonucleótidos  sintéticos  y  complementarios,  portadores  de 
un cambio específico (mutación) de la secuencia en una posición. 
Cada oligonucleótido se hibrida con una hebra de DNA y servirá como cebador. 
Una DNApol sintetizará a partir del cebador sintético “mutante”. 
Las  hebras  parentales  estarán  metiladas  (ver  tema  de  replicación  y  reparación)por  lo 
que, mediante una nucleasa específica de metilación, se digieren las hebras parentales. 
Se aparean las hebras parentales y se obtiene un plásmido mutagénico. 
Las  copias  del  plásmido  se  utilizan  para 
transformar células. 
● Resultados 
Como  ejemplo  se  muestran  las  gráfica 
obtenida  mediante  un  secuenciador 
automático. 
La  gráfica  superior  se  corresponde  con  el 
gen  recA  de  tipo  salvaje,  que  contiene  la 
secuencia  original  AAA  que  codifica  la 
lisina.  El  gráfico  inferior  representa  el gen 
recA  mutante,  que  ahora  contiene  en  la 
posición  72  la  secuencia  CGC  que 
codifica la arginina. 
 
EL SISTEMA CRISPR/CAS DE MODIFICACIÓN DE GENOMAS 
CRISPR​:  agrupación  de  cortas  repeticiones 
palindrómicas regularmente espaciadas 
(Clustered  Regularly  Interspaced  Short 
Palindromic Repeats) 
Cas​:  proteína  asociada  a  las  secuencias 
CRISPR.  Endonucleasa  que  trocea  el  DNA 
foráneo  y  modifica  el  genoma.  Reconoce  las 
secuencias palindrómicas. 
(CRISPR Associated Proteins​) 
 
 
 
 
La  tecnología  CRISPR/Cas9  es  una  herramienta  molecular  utilizada  para  ​“editar”  o 
“corregir​”  el  genoma  de  cualquier  célula,  incluidas  las  humanas.  Son  unas  tijeras 
moleculares  capaces  de  cortar  cualquier  molécula  de  DNA  de manera muy precisa y 
controlada.  Eso  le  permite  modificar  su  secuencia,  eliminando  o  insertando  nuevo 
DNA. 
 
¿Cómo surgió? 
 
En  1987  se  publicó  un  artículo  que  describía  cómo  algunas  bacterias  se  defendían 
de  las  infecciones  víricas:  tienen  unos  ​enzimas  ​que  son  capaces  de  ​distinguir  ​entre 
el  material  genético  de  la  bacteria  y  el  del  virus  y,  una  vez  hecha  la  distinción, 
destruyen a ​ l material genético del virus. 
Las  bases  de  este  mecanismo  se  conocieron  cuando  se  mapearon  los  genomas  de 
algunas  bacterias  y  otros  microorganismos.  Se  encontró  que  una  zona  determinada 
del  genoma  de  muchos  microorganismos  estaba  llena  de  repeticiones 
palindrómicas  sin  función  aparente,  separadas  entre  sí  mediante  unas  secuencias 
denominadas  “​espaciadores​”  que  se  parecían  a  otras  de  virus  y  plásmidos.  Justo 
delante  de  esas  repeticiones  y  “espaciadores”  hay  una  secuencia  llamada  “​líder​”. 
Estas  secuencias  son  las  que  se  llamaron  ​CRISPR.  ​Muy cerca de este agrupamiento 
se  podían  encontrar  unos  genes  que  codificaban  para  un  tipo  de  nucleasas:  los 
genes cas. 
 
Las  bacterias  que  tienen  este  sistema  de  defensa  tienen  un  complejo  formado  por 
una  ​proteína  Cas  unida  al  ​ARN  ​producido  a  partir  de  las  secuencias  CRISPR. 
Entonces  el  material  génico  del  virus  puede  ​interaccionar  ​con  este  complejo.  Si 
ocurre eso, el material genético viral es i​ nactivado ​y posteriormente d ​ egradado​.  
Las  proteínas  Cas  son,  además,  capaces de coger una pequeña parte del DNA viral, 
modificarlo  e  ​integrarlo  ​dentro  del  conjunto  de secuencias CRISPR. De esa forma, si 
esa  bacteria  (o  su  descendencia)  se  encuentra con ese mismo virus, ahora inactivará 
de forma mucho más eficiente al material genético viral.  
 
¿Cómo  se  edita  el  ADN  con  esta 
tecnología? 
 
Se  diseña  de  una  molécula  de  ARN 
(CRISPR  o  ARN  guía)  que  luego va  a 
ser  insertada  en  una  célula.  Una  vez 
dentro  reconoce  el  sitio  exacto  del 
genoma  donde  la  enzima  Cas9 
deberá cortar. 
 
 
¿Cómo nos va a cambiar la vida? 
 
Con  la  tecnología  CRISPR/Cas9  se inaugura una nueva era de ingeniería genética en 
la  que se puede editar, corregir, alterar, el genoma de cualquier célula de una manera 
fácil,  rápida,  barata  y,  sobre  todo,  altamente  precisa.  En  un  futuro  relativamente 
cercano  servirá  para  curar  enfermedades  cuya  causa  genética  se  conozca  y  que 
hasta  ahora  eran  incurables.  Es  lo  que  denominamos  terapia  génica,  que  ya  trabaja 
con  enfermedades  como  la  Corea  de  Huntington,  el  Síndrome  de  Down o la anemia 
falciforme. 
 
ESTRATEGIAS DE ALTERACIÓN DE LOS GENOMAS 
 
Dependendiendo  de  lo  que  nos  interese a la hora de trabajar con un genoma podemos 
realizar  tres  actividades  diferentes:  ​añadir,  eliminar  o  reemplazar  un  gen​.  La  forma 
más  utilizada  actualmente  es  la  ​adición  ​de  un  gen  de  la  misma  u  otra  especie  dentro 
del  genoma.  En  este  caso  no  nos  es  relevante  que  tengamos  un  gen  propio  del 
individuo  ya  que  no  nos  afectará.  Un 
transgén  ​es  un  gen  añadido  de  otro 
origen  a  un  individuo  de  manera  que 
ambos genes van a coexistir.  
Las  otras  dos  actividades  buscan 
resultados diferentes: 
● Reemplazar  ​un  gen  por  un 
transgén  de  manera  que  sólo 
queremos  que  actúe  el  que 
hemos incorporado. 
● La  eliminación,  que  es  la 
técnica  más  complicada,  quitando  un  gen  concreto  natural  o  incluso  pudiendo 
añadir  un  gen  sin  función  en  ese  lugar  para  no  afectar  la  longitud  del genoma. 
A  estos  genes  sin  función  se  les  llama  ​gen  knockout​.  Por  extensión,  un 
organismo con un gen knockout es un organismo knockout. 
 
En  esta  imagen  se  puede  ver  un  ratón 
transgénico  que  se  ha  obtenido  a  partir  de 
cortar  unos  3  mm  de  cola  de  la  madre  para 
extraer  su  genoma.  A  continuación  se  han 
hecho  varias  copias  del  gen  que  codifica  la 
hormona  de  crecimiento  y  se  ha  introducido 
en el genoma, de manera que al nacer el ratón 
lo  que  podemos  ver  es  que  se  ha insertado el 
gen  para  la  hormona  por  el  diferente tamaño, 
pero no podemos saber el lugar concreto donde se ha insertado el gen de la hormona.  
 
En  esta  imagen  podemos  ver  un  óvulo  recién  fecundado con dos núcleos. Usando una 
micropipeta  introducimos  mediante  una  microinyección  ADN en uno de los pronúcleos 
que  podemos  observar.  Cuando  esté  inyectado, 
introducimos  el  óvulo  en  la hembra en estado receptivo 
tras  una  previa  hormonación  con  el  fin  de  llevar  a cabo 
la  gestación.  Al  desarrollarse  el  embrión,  y  este  tenga 
descendientes,  buscamos  los  que  tengan 
correctamente  incorporado  el  transgén  que  hemos 
introducido en su genoma. 
 
ANIMALES TRANSGÉNICOS 
Tipos de inserción para animales transgénicos: 
 ● Complejos  de  lípidos:  el  DNA  atraviesa  la  membrana  plasmática  por fusión de 
vesículas lipídicas que lo contienen en su interior. 
● CaPO4/DNA:  esta  mezcla  hace  que  el  DNA  precipite  y  que  sea fagocitado por 
las células pasando al interior celular 
● Micro-inyección​:  inyectamos  una  disolución  de  DNA  en  el  interior  de  la  célula 
con una micro-pipeta o micro-jeringuilla. 
● Disparos​:  preparamos  unas  bolitas  de  resina  que  contienen DNA en su interior 
y que son disparadas hacia la célula usando una micro-pistola. 
● Virus​: inyectan su genoma en el de la célula con una eficacia cercana al 100%. 
Si  introducimos  DNA  en  una  célula  germinal  se  generará  un individuo completo con el 
DNA  recombinante  que  hemos  introducido,  el  transgen,  es  decir  un  animal 
transgénico. Procedimiento: 
1-  Se  extraen  ovocitos  fertilizados 
pero  con  los  pronúcleos  aún  sin 
fusionar. 
2-  Con uno de los métodos anteriores 
introducimos  DNA  en  el  pronúcleo 
masculino. 
3-  Una  vez fusionados los pronúcleos 
se  coloca  el  ovocito  completo  en  el 
útero  de  una  hembra  tratada 
hormonalmente. 
4-  El  ovocito  se  desarrolla  con  ese 
genoma. 
5-  En  el  momento  del  nacimiento 
podemos  comprobar  si  se  ha 
integrado  o  no en el genoma nuestro 
transgen  y  medir  cuantitativamente 
la cantidad de ADN incorporado. 
6-  A  partir  de  los  animales  a  los que 
hemos  incorporado  DNA 
recombinante  en  sus  células 
germinales  podemos  obtener  una 
línea transgénica. 
 
ORGANISMO KNOCK-OUT 
El  objetivo  es  modificar  el  genoma  del  animal  suprimiendo  el  gen  normal  y 
sustituyéndolo  por  otro  que  hemos  inactivado.  Para  ello  se inocula una única copia del 
gen  inactivado,  en  el  que  habremos  añadido  además  una  secuencia  de  resistencia  a 
antibiótico.  La  copia  introducida  se  recombinará  con  el  genoma  al  azar  en  un  99%  de 
los  casos.  Solo  en  un  1%  se  incorporará  al  genoma  justo  donde  se  encuentra  su zona 
homóloga  en  el  ADN,  es  decir,  la  que  queremos  sustituir.  En  este  último  caso  puede 
ocurrir  que  el  gen inactivado quede sustituyendo al activo (recombinación homóloga) o 
que  no  haya  sustitución  perdurando ambos genes. En este caso no ocurre nada ya que 
sigue habiendo gen funcional. 
Para  ver  si  el  gen  KO  se  ha  incorporado  se  introducen  las  células  en  un  medio  con 
antibiótico.  Las  que  lo  tengan  sobrevivirán  por  el  gen  de  resistencia  a  antibiótico 
incorporado con el KO. 
Una  vez  seleccionemos  las  células 
con  el  gen  KO  tendremos  que  volver 
a  analizarlas  para  saber  en  cuales se 
ha  producido  recombinación 
homóloga  y  en  cuáles  no.  Podemos 
usar  un  PCR  o  un  southerm.  El  gen 
KO  ha  sido  mutado  por  deleción  por 
lo  que  será  más  corto  de  os  normal. 
Al  hacer  electroforesis  pueden 
aparecer  fragmentos  cortos  y  largos 
(una  recombinación  normal  al  azar 
manteniéndose  ambos  genes)  pero 
si  solo  aparecen  cortos  es  una 
recombinación homóloga y queda solo el gen KO. 
Lo  normal  es  que  se  produzca  la  recombinación  homóloga  en  solo  uno  de  los  alelos 
apareciendo  individuos  heterocigóticos.  La  célula  mutada  la  colocamos  en  células 
totipotenciales  de  un  blastocisto 
mediante  micro-inyección  y  en  un 
útero  de  una  hembra  tratada 
hormonalmente (pseudopreñada).