02 Cromosomas

2 Alteraciones cromosómicas
Técnicas de diagnóstico molecular para la

detección de anomalías cromosómicas
Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Citogenética molecular
Hibridación fluorescente in situ (FISH)
– FISH en metafase
– FISH en interfase
Cariotipo espectral (SKY)
Hibridación genómica comparada (CGH)
Otras técnicas:
– FISH en hebra (Fiber FISH)
– Mapeo óptico
– Microdisección de cromosomas
Conceptos básicos
Compactación y estructura de la cromatina
Mutaciones y polimorfismos
– genómicas,
– cromosómicas y
– génicas
Cariotipos convencionales
Mapeo de cromosomas: nomenclatura

Técnicas de diagnóstico molecular para la
detección de anomalías cromosómicas
Aplicaciones Tipo de muestra
! Evaluar a una pareja con
antecedentes de abortos o infertilidad
! Evaluar una apariencia anormal del Sangre (o células mucosa

cuerpo que sugiere una anomalía bucal)
genética
! Análisis en casos de leucemia y

Células de la médula ósea
linfomas (el cromosoma Filadelfia está
presente en el 85% de los casos de LMC)
! Diagnóstico prenatal para evaluar Células fetales en líquido

anomalías cromosómicas en un feto amniótico o vellosidades
en desarrollo coriónicas
! Diagnóstico genético preimplantatorio Células embrionarias
en técnicas de reproducción asistida
Biopsia médula ósea
Toma de muestra

Diagnóstico prenatal
Toma de muestras

Diagnóstico preimplantatorio

Genoma humano
Complemento haploide:
2,9 Gbases
250
Millones de pares de bases
200
150
100
50
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Cromosoma

Organización
del ADN
Niveles de enrollamiento:
Doble hélice 2 nm
Nucleosomas 11 nm
Solenoides 30 nm
Bucles de cromatina 300 nm
Cromátide 700 nm

El ADN de una célula “mide” 2 metros
Microfotografía de un cromosoma sin histonas
Lazo de ADN Esqueleto proteico

Organización del ADN
Heterocromatina
– ADN compacto poco accesible a la transcripción
Eucromatina
– ADN más laxo que permite la transcripción

Alteraciones en el ADN
Un cambio heredable en la secuencia de ADN es una

mutación o un polimorfismo.
Mutación: cambio presente en una pequeña proporción de

la población (variante) o del organismo.
Polimorfismo: cambio presente en al menos un 1% de la

población.
No tienen por qué producir efectos en el fenotipo.

Mutaciones
Génicas
– Afectan a un único gen y frecuentemente son cambios
pequeños en el ADN
Cromosómicas
– Afectan a la estructura de uno o varios cromosomas
Genómicas
– Cambios en el número de cromosomas
Anomalías cromosómicas
Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte

del material genético
Numéricas: afectan al número de cromosomas.

Alteraciones cromosómicas
estructurales
Deleción
Duplicación
Inversión
Translocación

Alteraciones cromosómicas
estructurales
Fragmento sin
identificar
CROMOSOMA MARCADOR

Ejemplo de translocación
Esquema de la translocación
(9;22) que da origen al
cromosoma Filadelfia en la
leucemia mieloide crónica

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte

del material genético
Numéricas: afectan al número de cromosomas.
" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)

" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía (4n)

" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)

Aneuploidías
Frequencia de trisomías
en abortos espontáneos
Down
Patau Edwards

Aneuploidías
Riesgo de trisomía 21
con la edad materna

Aneuploidías
Síndrome de Turner:
única monosomía viable
45,X
Falta de desarrollo de
características sexuales
secundarias.
Cuello ancho (doble tejido
conectivo a los lados del cuello)
Pecho ancho “Anormalidades
renales y cardiovasculares.
No afecta el IQ pero existe cierto
grado de inmadurez y
comportamiento infantil.

Poliploidías
" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía
(4n)
Letal
Individuo triploide
Cariotipo 69,XXX

Visualización
Tinciones convencionales tiñen específicamente el ADN
– T. de Feulgen
– T. de Wright
– Hematoxilina
– DAPI (fluorescente)
Existen tinciones que específicamente marcan distintas regiones de los

cromosomas
– bandeo Q
– bandeo G
– bandeo R
– bandeo C
Requisitos para el estudio del cariotipo
Importante: máximas condiciones de esterilidad
! Las células deben estar en

división
! Deben pararse en metafase
! Deben someterse a choque
osmótico para conseguir
buena separación de los
cromosomas
! Hay que fijarlas
! Deben teñirse los
cromosomas para que sean
identificables
Método de estudio del cariotipo
1) Toma de sangre periférica y separación de los glóbulos blancos
(linfocitos T)
2) Incubación en presencia de productos que inducen a la mitosis
(mitógenos) tales como la fitohemoaglutinina
3) Detención de la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, que
interfiere en la polimerización de los microtúbulos del huso mitótico)
4) Paso por un medio hipotónico que hace que las células se hinchen
5) Depositar una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el cual
se hace presión para dispersar los cromosomas)
6) Fijar, teñir y fotografiar los núcleos estallados (10-15; 30 en mosaicos)
7) Antes había que ampliar la fotografía y recortar y ordenar los
cromosomas. Hoy en día existen aparatos de captación y programas de
análisis que elaboran el cariotipo automáticamente.

Cariotipo
Representación ordenada de los cromosomas de un

individuo atendiendo a su número, forma y tamaño
Métodos de tinción
Bandeo Método Características
Q Tinción con quinacrina Bandas fluorescentes brillantes
G Tinción con Giemsa, tras pre- Las bandas G oscuras

tratamiento del cromosoma corresponden a las Q brillantes
con tripsina
R Naranja de acridina, Giemsa Patrón inverso al Q y G, útil
modificado para definir los extremos de
los cromosomas
T Varias técnicas Resaltan las regiones
teloméricas
C Extracción de DNA/proteínas, Resaltan las regiones
tinción con Giemsa centroméricas
NOR Tinción con nitrato de plata Tiñe las regiones organizadoras

del nucléolo
Ejemplos de bandeo

Bandeo G
Más habitual
Se tratan previamente con

tripsina antes del Giemsa
400 bandas por genoma,

cada banda de 5 a 10 Mb
Heterocromatina en las
bandas oscuras.

Cariotipo de alta resolución
Tinción de los cromosomas en profase o en metafase
temprana (más largos y finos).
Permite distinguir el doble de bandas (800).
Se añade metotrexato además de colchicina antes de la

tinción con Giemsa.

Tipos de cromosomas

Tipos de cromosomas
Ejemplos

Ideograma

Nomenclatura
ISCN: International System for Human
Cytogenetic Nomenclature
http://www.iscn1995.org/
P brazo corto (petite) + ganancia
q brazo largo - pérdida
del deleción I,iso isocromosoma
inv inversión r cromosoma en anillo
dup duplicación t translocación
ins inserción tel telómero

Fórmulas cromosómicas
46,XX
46,XY
47,XXY Corrector de sintaxis:

47,XX,+21 http://www.mcndb.org/iscn/index.jsp
46,XY,19p+
46,XX,del(7)(q13)
46,XY,t(5;17)(p13.3;p13)
46,X,i(X)
48,XX,+15,+16 [8]/46,XX [27]

Fluorescent In Situ
Hybridization: FISH
Hibridación in situ fluorescente
Es la detección de sondas fluorescentes

altamente específicas que se han
hibridado a cromosomas en interfase o
metafase.
Las sondas de ADN pueden marcarse

con moléculas fluorescentes (método
directo) o no fluorescentes que se
detectan con anticuerpos fluorescentes
(método indirecto).

FISH
Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.
Después se tiñen los núcleos con un color de

contraste inespecífico (generalmente DAPI).
Finalmente se visualiza en el microscopio.

Protocolo básico
Los portaobjetos con los núcleos fijados:
1 Desnaturalización del ADN (70% en formamida).
2 Se añade la sonda, se cubre y se sella. Se incuba de 2 a

12 horas a 37º.
3 Se quita el cubre y se lava con detergente y sales.
4 Se añade colorante para el fondo.

FISH en metafase
Tipos de sonda:
– Cósmidos
– Satélites alfa
– Sondas completas
(painting probes)

Sondas específicas
Cósmidos:
– Secuencias únicas que
hibridan en segmentos
pequeños
– Se usan en estudios de
microdeleciones
Sonda de 1,4 kb cromosoma 11

Sondas específicas
Sonda específica
para el síndrome
Williams-Beuren
(Elastina: 7q11.23)
y control

Sondas específicas
Sonda específica
(22q11.2) para el
síndrome diGeorge:
microdeleción
cromosoma 22
Control (22q13)

Sondas específicas
Sondas con
secuencia
centromérica y
telomérica del
cromosoma 12

Sondas específicas
Sonda con
secuencia
telomérica del
cromosoma 4q

Sondas específicas
FISH de banda
multicolor

Sondas satélite
Satélites alfa:
– Sonda formada por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de los centrómeros.
– En la mayoría de los casos son específicos para cada cromosoma
– Se usan para determinar aneuploidías o para identificar el origen

de cromosomas marcadores.

Sondas satélite
Sondas para
cromosomas 14 y 22:
se detecta un
cromosoma marcador
dicéntrico

Sondas satélite
Sonda para secuencia Alu

Sondas completas
Sonda para el cromosoma 1
Sonda para el cromosoma 19.

Marca el extremo de otro
cromosoma identificando el
material de un cromosoma
marcador.

Sondas completas
Caso de una translocación

desequilibrada, una porción del
brazo 4 reemplaza el extremo
del cromosoma 1

Sondas completas
sonda sonda
cromosoma 1 cromosoma 4
FISH en interfase
No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para poder

realizar el FISH.
Normalmente cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra

en interfase, con los cromosomas descondensados.
De todas maneras es posible realizar el FISH aunque los resultados no

sean tan específicos. Se utiliza sobretodo para detectar aneuploidías o
grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales
o tumorales

FISH en interfase
18
18
DXZ1 DYZ3 D18Z1
Metafase Interfase

FISH en interfase:
aneuploidías
2ª ronda:
Aneuploidías en células embrionarias
– sonda 18
1ª ronda – sonda X
– sonda 13 – sonda Y
– sonda 21
Feto varón normal*
FISH en interfase:
aneuploidías
Aneuploidías en células embrionarias 2ª ronda:

– sonda 18
1ª ronda – sonda X
– sonda 13 – sonda Y
– sonda 21 Feto femenino con trisomía 21

FISH en interfase:
traslocaciones recíprocas
46,XY 46,XX,t(12;17)(p13;p13)
sondas subteloméricas y centroméricas

FISH en interfase:
Primero se prueban las sondas en linfocitos de ambos
progenitores para comprobar su correcta hibridación
tel 12
tel 17
ctr 17

FISH en interfase:
tel 12
tel 17
ctr 17

FISH en interfase:
traslocaciones recíproca
tel 12
tel 17
ctr 17

FISH en interfase:
tel 12
tel 17
ctr 17

FISH en linfocitos:
186 93%
7 3,5%
5 2,5%
1 0,5%
1 1,5%

FISH en interfase:
traslocaciones robertsonianas
male female
miscarriage
chromosome 13
chromosome 21
Robertsonian translocation
der(13;21)(q10;q10)
Carrier Normal
Down syndrome Carrier Down syndrome Normal

FISH multicolor: SKY
SKY (Spectral Karyotyping) es una técnica que permite

visualizar los 23 pares cromosomas a la vez teñidos con
diferentes sondas fluorescentes.
Se utiliza sobre todo en el estudio de células tumorales. Las

sondas para cada cromosoma es de un color (o
combinación; solo hay 5 colores) distinto.
Se utilizan programas informáticos para analizar las

imágenes y formar el cariotipo.

Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes

Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes

Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
Traslocación entre el 1 y el 11
Trisomía parcial del extremo 4q
(derivativo)



FISH en hebra
Fiber FISH o Halo FISH
Es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el

fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar.
Permite distinguir pequeñas reorganizaciones sin tener que

clonar y secuenciar (habitualmente hasta 20 pb).
Se forman rosarios debido a las roturas de las hebras de

cromatina y el enrollamiento de los extremos.

FISH en hebra
Al extenderse se consigue un 130% de su tamaño teórico

34 µm / 1 kb

FISH en hebra
Se usa bastante para detectar deleciones en

clones o para estimar huecos en los proyectos
genoma
Microdisección de
cromosomas y FISH inverso
Se puede recortar un fragmento de cromosoma por
micromanipulación (láser y micropipetas) teñido con
Giemsa o con una sonda.
Esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva

sonda.
Se utiliza para detectar el origen de un ADN marcador o

fabricar sondas inespecíficas que hibriden con
determinada región.
Microdisección de
1 aislamiento del cromosoma marcador y marcaje

2 hibridación con linfocito de donante sano: es un
fragmento del cromosoma 16 (16)(p13.1!q12.2)
Microdisección de

Búsquedas bibliográficas: Pubmed/ISI Web of knowledge
Artículos / revisiones
Índice de impacto
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CGH
Comparative genomic hybridization
Detecta pérdida o duplicación de regiones genómicas.
Es un FISH de dos colores.
Se utiliza sobretodo para determinar las reorganizaciones

cromosómicas de las células tumorales y predecir la
severidad del cáncer. No requiere cultivo de las células.

CGH
1 El ADN-M del tejido a estudiar se marca con un
fluorescente (usualmente verde; Cy3 550 nm).
2 ADN-C de un tejido con un cariotipo normal se marca con

otro fluorescente (rojo; Cy5 660 nm).
El marcaje se realiza por desplazamiento de mella (nick-

translation )
3 Una misma cantidad de ADN de cada muestra se hibrida

con metafases de células normales (linfocitos).
CGH
1 Si no existe reorganización de la zona la
relación entre ambas sondas será 1:1
2 Si el ADN-M presenta una duplicación habrá

proporcionalmente más sonda marcada y el
cromosoma fijado teñirá de verde.
3 Si el ADN-M presenta una deleción habrá

proporcionalmente menos sonda y el
cromosoma fijado teñirá de rojo
Requiere de software específico y experiencia

del operador.

CGH
DAPI

CGH
Cy3

CGH
Cy5

CGH
Superposición

CGH

CGH

CGH

CGH: una metafase

CGH: 8 metafases

CGH: 8 metafases

CGH: limitaciones
Detecta bien deleciones y duplicaciones.
Es ineficaz para detectar traslocaciones o inversiones.
Depende de la población de células originales, si hay

mosaicismo la detección se verá contaminada por
contaminación (>50%).
La sensibilidad es de alrededor de las 2-20 Mb

Array CGH
La resolución es mucho mayor hasta 150 kb o incluso genes.
Celdillas de fragmentos genómicos conocidos (BAC, cDNA,

oligonucleótidos) inmobilizados sobre una superficie
sustituyen la metafase del CGH. Aumenta por tanto el
número de copias diana.
Puede distinguir con precisión los puntos de corte de las

alteraciones cromosómicas.

Array CGH

Array CGH
Se suele añadir ADN Cot-1
Es ADN de origen placentario de 50

a 300 pb enriquecido en
secuencias repetitivas (Alu o
Kpn).
Se usa para bloquear hibridación

no específica en los microarrays.

Array CGH

Array CGH
Se analizan 120 x 60 = 7200 fragmentos

Array CGH
Los microarrays se
preparan a partir
de clones
genómicos:
BACs o YACs

Array CGH
El tipo de clon nos

va a limitar la
sensibilidad y el
tipo de
resultados

Array CGH
Se suele representar la señal en forma de perfil lineal.

Control normal 46XX

Array CGH
El marcaje de XX sobre XY permite distinguir el doble

cromosoma X

Array CGH
Deleción en 7q11.23 heterocigoto

Flecha indica fluorescencia reducida en 3 BACs
Zona gris indica el centrómero
FISH de confirmación:
sonda verde BAC gen LIMK1,
sonda roja BAC 7q11.21
Aplicaciones clínicas FISH
Preparación del tejido diana FISH SKY CGH CGHa
Metafase + + + +
Interfase + - + +
Cultivo previo -/+ + - -
Aneuploidías + + + +
Traslocaciones eq, inversiones + +/- - -
Microdeleciones/duplicaciones + - - +

Cáncer
Suele haber alteraciones cromosómicas en las células

somáticas. Algunas son heredables entre generaciones y
pueden causar predisposición al cáncer.
Las alteraciones cromosómicasa son marcadores diagnósticos

y de valor pronóstico.
La evaluación citogenética molecular de los cánceres es de

gran importancia.

Cáncer
el cáncer surge tras una acumulación de mutaciones que

confieren a la célula una ventaja selectiva puntual
Muchos tumores exhiben altos niveles de inestabilidad

genómica.
¿Son estas mutaciones cromosómicas causas o efectos del

cáncer?

Cáncer
Existen determinadas traslocaciones asociados a cánceres

específicos
– Sobreexpresión o desregulación de un protooncogen porque se une
a un fuerte promotor o enhancer.
– Generación de una gen quimera que codifica una proteína de

fusión desregulada

Cáncer
Sobreexpresión de BCL2 debido al enchancer IG en un
linfoma folicular

Cáncer
Linfoma de Burkitt
- non Hodgkins
- Cancer agresivo de células B
- también aparece en el
mieloma múltiple
Traslocación IG-MYC

Cáncer
Un FISH con dos sondas específicas es suficiente

para distinguir la traslocación IG-MYC

Cáncer
Esquema de la translocación
(9;22) que da origen al
cromosoma Filadelfia en la
leucemia mieloide crónica

Cáncer
Normal 2+2
Proteína de fusión BCR-ABL
Fusíon 1+1+2
2+2+1
1+1+1

Cáncer
Proliferación
Apoptosis
Estabilidad genómica
Angiogénesis
Invasión
Metastasis

Cáncer

Cáncer
Origen de los cromosomas marcadores de una línea tumoral

de cáncer de mama.
Cáncer
Dos zonas de Traslocación 17;22

amplificación
Perdida del der(17)

Cáncer
Amplificación. Células de un cáncer de mama.

– sonda verde cromosoma 17 (centrómero)
– sonda roja gen HER2/ERBB2 (17q11.2-q12)
Cáncer
Amplificación.
– De 100 a 1000 kb pocas veces incluyen un único gen
– Sobreexpresión y se asocia con mala prognosis o estadío final
– Dos formas:
• Partículas pequeñas (double minutes DMs)
• Regiones de tinción homogénea (homogeneously staining

regions HSR

Cáncer
Amplificación. Glioblastoma (DMs)

– sonda verde cromosoma 17
– sonda roja gen EGFR (17q25)
Cáncer
Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)

– sonda amarilla gen MLL (11q23)
Cáncer
Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)

– sonda amarilla gen MLL (11q23)
IL6R,MCL1, SKI REL MYC
Cáncer
ABL,TAN1 CDK2,GLI,SAS,CDK4,MDM2
IL4R BCL2 SIS,YES2
Las reorganizaciones suelen implicar a genes relacionados con el cáncer.

Linfoma de células B alargadas/difusas
Cáncer
En los estadíos avanzados y de mal pronóstico se acumulan las anomalías

cromosómicas.
GGH de linfoma de Hodgkin
Cáncer
Combinación
restricción
PCR y
array de CGH
para detectar
patrones de
metilación en células
de cáncer de pulmón

Cáncer
El gen
MINT26 está
metilado en
las células de
este tumor

FISH bases de datos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/
Base de datos de resultados de SKY y CGH

FISH bases de datos

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2 Alteraciones cromosómicas

Técnicas de diagnóstico molecular para la

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Cariotipo espectral (SKY)

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Mapeo de cromosomas: nomenclatura

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

! Evaluar una apariencia anormal del Sangre (o células mucosa

! Análisis en casos de leucemia y

! Diagnóstico prenatal para evaluar Células fetales en líquido

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

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Bucles de cromatina 300 nm

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Microfotografía de un cromosoma sin histonas

Lazo de ADN Esqueleto proteico

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Un cambio heredable en la secuencia de ADN es una

Mutación: cambio presente en una pequeña proporción de

Polimorfismo: cambio presente en al menos un 1% de la

No tienen por qué producir efectos en el fenotipo.

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte

Numéricas: afectan al número de cromosomas.

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte

Numéricas: afectan al número de cromosomas.

" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

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Existen tinciones que específicamente marcan distintas regiones de los

! Las células deben estar en

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Representación ordenada de los cromosomas de un

G Tinción con Giemsa, tras pre- Las bandas G oscuras

NOR Tinción con nitrato de plata Tiñe las regiones organizadoras

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas

Se tratan previamente con

400 bandas por genoma,

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Permite distinguir el doble de bandas (800).

Se añade metotrexato además de colchicina antes de la

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q brazo largo - pérdida

del deleción I,iso isocromosoma

inv inversión r cromosoma en anillo

dup duplicación t translocación

ins inserción tel telómero

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47,XXY Corrector de sintaxis: