PROYECTO

EVALUACIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE PHA

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales a utilizar

• Material de Laboratorio:
Ø Matraz Erlenmeyer. Ø Mechero Bunsen.
Ø 3 Vasos de precipitados. Ø Autoclave.
Ø Varilla de agitación. Ø Horno incubador.
Ø 4 Placas de Petri estériles. Ø Algodón hidrofóbico.
Ø Pesa sustancias. Ø Papel aluminio.
Ø Asa en loop. Ø Etanol 95%.
Ø Probetas. Ø Agua destilada.
Ø Pipetas. Ø Agar-Agar.
Ø Propipeta. Ø Tubos con bacterias.

• Material para preparación de 1 [L] de medio de cultivo:

o Parte I
• Glucosa 10 [g] • NaCl 5 [g]
• Na2HPO4 128 [g] • NH4Cl 1 [g]
• KH2PO4 30 [g] • Agua destilada 1 [L]

o Parte II
§ Solución A (micro elementos):
• MgCl2·6H2O 10,75 [g] • CoCl4·6H2O 0,28 [g]
• ZnSO4·7H2O 1,44 [g] • H3BO3 0,06 [g]
• CuSO4·5H2O 0,25 [g] • CaCO3 2 [g]
• MnSO4·4H2O 1,12 [g] • HCl concentrado 30 [mL]
• Agua destilada 1[L]
 § Solución B: § Solución C:
• MgSO4·7H2O 246 [g] • FeSO4·7H2O 10,01 [g]
• Agua destilada 1 [L] • Agua destilada 1 [L]

• Material para Tinción de Rojo de Nilo: • Cepas bacterianas:
Ø Acetona. Ø Escherichia Coli.
Ø Rojo de Nilo. Ø Pseudomonas Aeruginosa.
Ø Transiluminador. Ø Actinobacterias.


Métodos

Preparación de Medio de Cultivo con Rojo de Nilo
1. Preparar las soluciones A, B y C en una relación 2:1:1 para un volumen de 2,5[mL].
2. Agregar los componentes de la Parte I para un volumen de 100 [mL].
3. Pesar 15 [g] de agar-agar en un pesa sustancia sobre la balanza.
4. En una probeta medir 897,5 [mL] de agua destilada.
5. Prender un mechero, y poner sobre él una rejilla.
6. En un matraz Erlenmeyer y con una varilla de agitación, mezclar el agar con el agua
destilada.
7. Esperar que hierva un minuto, con agitación cada cierto rato. Agregar los
componentes preparados en los puntos 1 y 2, seguir calentando evitando que el
medio se pegue en el vidrio y se queme. Una vez que hierva tener precaución que
no se suba.
8. Tapar el matraz con un algodón hidrofóbico y luego con papel aluminio.
9. Autoclavar el matraz por 15 minutos.
10. Agregar al matraz un 0,002% [v/v] de Acetona con 5 [µg/mL] de Rojo de Nilo.
11. Vaciar 20 [mL] del contenido del matraz sobre cada una de las placas, ya
esterilizadas y frías en condiciones lo más estériles posibles.




Proceso de siembra
1. Limpiar con alcohol el mesón de trabajo.
2. Encender un mechero y trabajar cerca de este.
3. Esterilizar un asa en loop, directamente sobre la llama hasta que se ponga al rojo
vivo.
4. Tomar el tubo que contiene al microorganismo, destaparlo y flamear (pasar por
sobre el mechero) la boca del tubo una vez. 

5. Ingresar el asa al tubo y enfriarla dando golpes con ella en las paredes del tubo. 

6. Recoge una muestra de microorganismos con el asa pasándolo suavemente por
sobre los microorganismos. 

7. Flamear el tupo y tapar. 

8. Sin alejarse del mechero ni hablar para no contaminar la muestra, tomar el medio
a sembrar y destapar la placa al lado del mechero. 

9. Sembrar sobre la superficie del medio en línea recta utilizando el asa con cuidado
de no romper el medio. Tapar las placas. 

10. Una vez terminado el proceso volver a esterilizar el asa en el mechero antes de
volver a dejarla sobre el mesón. 


Proceso de Incubación
1. Incubar en una estufa calefactora a 37 [°C] por un tiempo de 24 a 48 [h], teniendo
en consideración que las placas de Petri se deben dejar incubando boca abajo para
que las gotas de condensación no caigan sobre el medio de cultivo e interfieran con
el crecimiento de las colonias bacterianas.

Proceso de detección de presencia de PHA
1. Utilizando un Transiluminador, exponer las placas de Petri con el cultivo a luz
ultravioleta para detectar acumulación de PHA. Observar en períodos de 24 [h]
después del tiempo de incubación de las bacterias.